Mikroskopia wewnątrzżyciowa węzła chłonnego pachwinowego
4 kwietnia 2011
Przedstawiono technikę wykonywania mikroskopii intravitalnej węzła chłonnego (LN) pachwinowego. Technika ta umożliwia badanie mikrokrążenia i struktury węzła chłonnego w czasie rzeczywistym, in vivo, zarówno w stanie homeostazy, jak i podczas infekcji. Metoda ta może zostać dostosowana do badań nad migracją komórek oraz do analizy innych lokalizacji węzłów chłonnych.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i ocena tętnicy doprowadzającej do węzła chłonnego pachwinowego in vivo. Osiąga się to poprzez stworzenie płata skórnego poprzez ostrożne rozcięcie skóry w okolicy pachwinowej myszy, obejmujące węzeł chłonny pachwinowy. Następnie oddziela się tkankę łączną pokrywającą obszar węzła chłonnego.
Następnie należy usunąć otaczającą tkankę tłuszczową, aby odsłonić naczynia tętnicze doprowadzające krew do węzła chłonnego. Na koniec zmiany w unaczynieniu węzła chłonnego są wizualizowane i oceniane za pomocą mikroskopii witalnej P. Chociaż preparatem, który zostanie dziś zaprezentowany, jest mikrokrążenie w węźle chłonnym pachwinowym, opisane techniki chirurgiczne można zastosować również w przypadku innych preparatów, takich jak mięśnie szkieletowe czy mózg.
Zazwyczaj osoby początkujące stosujące tę technikę napotykają trudności z dwóch głównych powodów. Po pierwsze, praca odbywa się na żywym zwierzęciu, a po drugie, ze względu na przeprowadzanie zabiegu na bardzo małym obszarze, jakiekolwiek zakłócenia w obrębie samego naczynia lub w jego otoczeniu mogą wywrzeć negatywny wpływ, co byłoby szkodliwe dla planowanego eksperymentu. Demonstracja wizualna tej techniki jest kluczowa dla osiągnięcia sukcesu.
Procedura ta obejmuje szereg skomplikowanych etapów, których opis tekstowy nie oddaje w pełni praktycznego wykonania techniki. Aby przeprowadzić ją prawidłowo, niezbędne jest obejrzenie prezentacji. Życzymy wielu sukcesów.
Mysz zostaje najpierw znieczulona, a obszar operacyjny ogolony. Szczegóły znajdują się w tekście manuskryptu. Następnie mysz można umieścić na przezroczystej desce operacyjnej w pozycji grzbietnej.
Przymocuj mysz do płytki, przyklejając taśmą każdą z poduszek stóp. Dzień przed eksperymentem przygotuj mieszaninę Thes Guard 180 4 zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, używając standardowej jednorazowej szalki Petriego jako formy, wlej mieszaninę do głębokości około one quarter inch i pozostaw do utwardzenia na noc. Wyjmij Thes Guard z szalki Petriego i umieść go na płytce chirurgicznej.
Umieść ogoloną, znieczuloną mysz pod stereomikroskopem. Wykonaj cięcie w linii pośrodkowej wzdłuż brzusznej powierzchni jamy brzusznej, używając stalowych pęsety numer pięć oraz prostych nożyczek sprężynowych. Następnie kontynuuj cięcie w linii pośrodkowej ukośnie w kierunku kończyn i odsunie skórę w stronę kręgosłupa.
Gdy ln stanie się wyraźnie widoczny, przypnij odsuniętą skórę do podstawki typu 180 4, używając stalowych szpilek entomologicznych i szczypiec z powłoką epoksydową inox. Na dany obszar nanieś sól fizjologiczną lub roztwór PSS.
Następnie należy usunąć cienką warstwę tkanki łącznej pokrywającą obszar wokół węzła chłonnego (ln). Za pomocą pęsety ostrożnie chwytamy małe fragmenty tkanki łącznej i odcinamy je od ln. Następnie, używając nożyczek sprężynowych, usuwamy tkankę tłuszczową pokrywającą i otaczającą węzeł chłonny (LN), aż do odsłonięcia łożyska mikronaczyniowego.
W tym kroku ważne jest, aby zachować ostrożność i nie dotykać instrumentami chirurgicznymi naczyń krwionośnych będących przedmiotem badania oraz nie uszkodzić ich, przykładając zbyt dużą siłę podczas manipulowania otaczającą je tkanką. Tłuszcz najlepiej usuwać z okolic ln, rozluźniając tkankę łączną i trzymając tkankę tłuszczową pęsetą, a następnie delikatnie ją usuwając, aż do momentu uzyskania przejrzystego pola widzenia. Po usunięciu tkanki łącznej i tłuszczowej można zwizualizować główny odcinek tętniczy sąsiadujący z LN oraz nadkładającą go towarzyszącą ven.
Po odsłonięciu interesującego fragmentu naczynia pod mikroskopem operacyjnym, należy unieruchomić preparat w mikroskopie intravitalnym. Przygotuj linie superfuzji i ssania. Na tym etapie procedury kluczowe jest, aby odsłonięta tkanka była stale poddawana superfuzji roztworem Equilibrated PSS.
Superfuzja PSS odbywa się grawitacyjnie. Płyn przepływa z rezerwuaru początkowego do rezerwuaru w koszulce wodnej, który jest napowietrzany mieszaniną 5% Carbon dioxide balance nitrogen, a następnie spływa linią kroplową z prędkością 10 milliliters per minute. Należy zastosować linię ssącą, aby stale odprowadzać superfuzowany PSS z preparatu, umieszczając ją u dołu płata skóry; następnie należy sprawdzić i dostosować temperaturę cyrkulującej kąpieli wodnej oraz tempo superfuzji PSS, aby uzyskać optymalną temperaturę wynoszącą około 36 degrees Celsius.
W trakcie przygotowania należy pozwolić na równowagę naczyń krwionośnych z PSS przez co najmniej 60 minut. Należy zapobiegać hipotermii zwierzęcia, monitorując temperaturę termometrem rektalnym i stosując zewnętrzną lampę grzewczą. Podczas wyrównywania PSS należy zmierzyć średnicę naczynia.
Należy użyć suwaków wideo w kilku punktach czasowych, aby upewnić się, że naczynie uległo stabilizacji; stabilizację definiuje się jako utrzymanie stałej średnicy z dokładnością do 5 µm przez okres 20 minut. Pomiary średnicy są rejestrowane na komputerze przy użyciu oprogramowania ChartLab. Po okresie równoważenia należy ocenić stan naczynia, stosując specyficzny agonista mięśni gładkich, taki jak fenylefryna, co pokazano tutaj na przykładzie fenylefryny.
Dodaj agonistę do roztworu. Należy ocenić osiem agonistów przy każdym logarytmicznym wzroście kumulatywnego stężenia agonisty dodawanego do naczynia pomiędzy aplikacjami każdego agonisty. Należy przeprowadzić fazę płukania przy użyciu PSS przez 30 minut lub do momentu, aż naczynie powróci do średnicy spoczynkowej.
Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki obrazowania węzła chłonnego pachwinowego po okresie ekwilibracji. Podanie soli fizjologicznej do tętnicy pozwala na uzyskanie wyraźnego obrazu, który umożliwia identyfikację zarówno tętnicy doprowadzającej (wskazanej tutaj czerwoną strzałką), jak i żyły odprowadzającej (wskazanej zieloną strzałką), które zaopatrują węzeł chłonny pachwinowy. Wykres przedstawia typową odpowiedź naczynioruchową tętnicy doprowadzającej węzła chłonnego pachwinowego na kumulatywne dodawanie fenylefryny do soli fizjologicznej.
W zakresie stężeń od 10⁻⁹ M do 10⁻⁵ M występowanie silnego skurczu naczyń sugeruje prawidłową funkcję mięśni gładkich w tętnicy. Na tym wykresie przedstawiono typową odpowiedź naczyniową na kumulatywne dodawanie acetylocholiny do soli fizjologicznej w zakresie stężeń od 10⁻⁹ M do 10⁻⁵ M.
Wystąpienie silnej wazodylatacji sugeruje prawidłową funkcję śródbłonka w tętnicy. Przygotowując ten preparat, należy pamiętać przede wszystkim o zminimalizowaniu zaburzeń naczynia i obszaru go otaczającego, aby zmaksymalizować szansę na sukces. Po wykonaniu tej procedury można wprowadzić inne metody, takie jak fluorescencja, w celu zbadania innych funkcji komórkowych, na przykład ruchu komórek.
Opracowanie tej techniki utorowało drogę do połączenia immunologii i biologii naczyniowej w nową dziedzinę – immunologię naczyniową.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje technikę wykonywania mikroskopii intravitalnej węzła chłonnego pachwinowego, umożliwiającą badanie mikrokrążenia i struktury węzła chłonnego in vivo w czasie rzeczywistym, zarówno podczas homeostazy, jak i infekcji. Metodę tę można dostosować do badań nad migracją komórek oraz badania innych węzłów chłonnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Obrazowanie mikrokrążenia
- Mikroskopia intravitalna
Wstęp
- Mikroskopia intravitalna umożliwia wizualizację żywych tkanek.
- Węzeł chłonny pachwinowy ma kluczowe znaczenie dla badań nad odpowiedzią immunologiczną.
- Zrozumienie unaczynienia węzłów chłonnych jest istotne dla różnych badań biologicznych.
- Techniki te można zastosować w innych tkankach, takich jak mięśnie szkieletowe i mózg.
Cel badania
- W celu wizualizacji i oceny tętnicy doprowadzającej do węzła chłonnego pachwinowego in vivo.
- W celu oceny zmian w naczyniach krwionośnych węzła chłonnego podczas różnych stanów fizjologicznych.
- W celu dostarczenia badaczom szczegółowego przewodnika proceduralnego.
Zastosowane metody
- Wykonanie płata skórnego w celu odsłonięcia węzła chłonnego pachwinowego.
- Disekcja tkanek łącznych i tłuszczowych otaczających węzeł chłonny.
- Zastosowanie mikroskopii intravitalnej do wizualizacji łożyska mikronaczyniowego.
- Podanie soli fizjologicznej w celu zapewnienia optymalnych warunków obrazowania.
Główne wyniki
- Pomyślna wizualizacja naczyń krwionośnych węzła chłonnego pachwinowego.
- Wykazanie prawidłowej funkcji mięśni gładkich w odpowiedzi tętniczej.
- Ilościowa ocena stabilności średnicy naczyń.
- Wyraźna identyfikacja struktur tętniczych i żylnych zaopatrujących węzeł chłonny.
Wnioski
- Technika ta dostarcza kluczowych informacji na temat mikrokrażenia w węzłach chłonnych.
- Demonstracje wizualne ułatwiają zrozumienie złożonych etapów chirurgicznych.
- Metoda ta może zostać dostosowana do różnych projektów doświadczalnych w biologii naczyniowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikroskopia wewnątrzorganizowa węzła chłonnego pachwinowego umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki mikronaczyniowej, która jest kluczowa dla zrozumienia transportu komórek odpornościowych oraz interakcji naczyniowo-immunologicznych. Technika ta wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka w fazie wczesnego odkrywania leków, dostarczając ilościowych, funkcjonalnych odczytów stanu naczyń i ich reaktywności w warunkach fizjologicznych. Łączy ona immunologię z biologią naczyniową, oferując wartość prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych w obszarze stanów zapalnych, infekcji oraz w projektach z zakresu immuno-onkologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację odpowiedzi mikro naczyniowych w czasie rzeczywistym na działanie czynników naczynioaktywnych, co wspiera funkcjonalną walidację punktów uchwycia.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowych pomiarów średnicy naczyń, które służą jako powtarzalne biomarkery funkcji naczyniowej w modelach chorobowych.
- Pewność prognostyczna: Pozwala ocenić funkcję mięśni gładkich oraz śródbłonka, pomagając w redukcji ryzyka w przypadku punktów uchwycia zaangażowanych w regulację naczyniową i rekrutację komórek odpornościowych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez ustalenie bazowej funkcji i stabilności naczyniowej przed testowaniem związków.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację testów dzięki kontrolowanym protokołom superfuzji i kryteriom stabilizacji (średnica w zakresie 5 µm przez 20 min), zapewniając rzetelną ocenę związków.
- Skalowalność: Umożliwia obrazowanie podłużne przez kilka godzin, co ułatwia ocenę odpowiedzi zależnych od czasu w kampaniach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając podłużny monitoring reakcji naczyniowych w modelach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez kwantyfikację funkcjonalności naczyniowej, która jest kluczowym czynnikiem determinującym skuteczność odpowiedzi immunologicznej węzłów chłonnych.
- Zgodność z biomarkerami translacyjnymi: Średnica oraz reaktywność naczyń służą jako translacyjne biomarkery korelujące z migracją komórek odpornościowych i funkcją węzłów chłonnych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania – od testowania hipotez po identyfikację wiodących związków – dostarczając funkcjonalnych odczytów naczyniowych, które pomagają w wyborze celu i zrozumieniu mechanizmów działania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie bezpośredniej obserwacji interfejsów naczyniowo-immunologicznych podczas homeostazy i zaburzeń.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość do przeprowadzania testów dzięki stabilnemu układowi naczyniowemu i wynikom ilościowym (średnica, reaktywność), które pozwalają na porównania pomiędzy różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Analityka: Generuje mierzalne wyniki, w tym zmiany średnicy naczyń oraz odpowiedzi w postaci skurczu i rozszerzenia naczyń, co umożliwia statystyczne porównanie efektów traktowania.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie udziału naczyń w odpowiedzi immunologicznej, co jest istotne dla opracowywania adiuwantów i immunomodulatorów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę obrazowania intravitalnego z możliwością ponownego wykorzystania w wielu lokalizacjach węzłów chłonnych i modelach chorób, co maksymalizuje inwestycje w infrastrukturę.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w interakcjach naczyniowo-immunologicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki kontrolowanej superfuzji, regulacji temperatury oraz kryteriom stabilizacji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczanie funkcjonalnych danych naczyniowych, co redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach programów immunomodulacyjnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o dane dotyczące funkcjonalności naczyniowej, wspierając efektywne kapitałowo postępy w badaniach.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii i obrazowania intravitalnego, aby zminimalizować zaburzenia naczyń podczas przygotowania tkanek.
- Zależne od konfiguracji mikroskopii intravitalnej z liniami do superfuzji i ssania w celu zapewnienia stabilnych warunków obrazowania.
- Wymaga standaryzacji protokołów ilościowego określania naczyń między zespołami (np. pomiar średnicy za pomocą suwmiarki wideo) dla uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania techniki przy zastosowaniu jej w innych węzłach chłonnych lub tkankach, takich jak mięśnie szkieletowe czy mózg.
- Ograniczone przez techniczne trudności w utrzymaniu żywotności naczyń krwionośnych podczas długotrwałego obrazowania, co wymaga starnego zarządzania temperaturą i perfuzją.
