Mikroskopia przyżyciowa pachwinowego węzła chłonnego
4 kwietnia 2011
Przedstawiono technikę wykonywania mikroskopii przyżyciowej pachwinowego węzła chłonnego (LN). Taka technika pozwala na badanie w czasie rzeczywistym, in vivo , mikrokrążenia i struktury węzłów chłonnych zarówno podczas homeostazy, jak i infekcji. Technikę tę można dostosować do badań nad transportem komórkowym i do innych lokalizacji węzłów chłonnych.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i ocena tętniczego odżywiania pachwinowych węzłów chłonnych in vivo. Osiąga się to poprzez najpierw utworzenie płata skórnego poprzez ostrożne wypreparowanie skóry w okolicy pachwinowej myszy, zakrywającej pachwinowy węzeł chłonny. Następnie odłączana jest tkanka łączna pokrywająca obszar węzłów chłonnych.
Następnie należy usunąć otaczającą tkankę tłuszczową, aby odsłonić unaczynienie tętnicze węzła chłonnego. Wreszcie, zmiany w unaczynieniu węzłów chłonnych są wizualizowane i oceniane za pomocą mikroskopii przyżyciowej P, Chociaż preparat, który zobaczysz dzisiaj, to mikrokrążenie pachwinowych węzłów chłonnych. To, techniki chirurgiczne mogą być stosowane do innych preparatów, takich jak mięsień skośny, a także mózg.
Ogólnie rzecz biorąc, wykonując tę technikę, nowe osoby zmagają się z dwoma głównymi powodami. Po pierwsze, mamy do czynienia z żywym zwierzęciem, a po drugie, ponieważ przeprowadzamy operację na bardzo małym obszarze, wszelkiego rodzaju zakłócenia w samym naczyniu lub jego otoczeniu mogą mieć negatywny wpływ, co byłoby szkodliwe dla eksperymentu, który chcesz przeprowadzić. Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie dla sukcesu.
W grę wchodzi wiele skomplikowanych kroków, które niezbyt dobrze przekładają się z tekstu na faktyczne wykonanie tej techniki. Ważne jest, aby to zobaczyć, aby zrobić to poprawnie. Z dużym powodzeniem.
Mysz jest najpierw znieczulana, a obszar operacyjny golony. Szczegółowe informacje można znaleźć w rękopisie tekstu. Mysz można następnie umieścić na przezroczystej desce chirurgicznej w pozycji leżącej.
Przymocuj mysz do tablicy, przyklejając taśmą każdą podkładkę pod nóżki Dzień przed eksperymentem wymieszaj osłonę 180 4 zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, używając standardowej jednorazowej szalki Petriego jako formy, wlej mieszaninę na głębokość około ćwierć cala i pozwól jej utwardzić się przez noc. Zdejmij osłonę z szalki Petriego i umieść ją na tablicy operacyjnej.
Umieść ogoloną, znieczuloną mysz pod lunetą sekcyjną. Wykonaj nacięcie w linii środkowej wzdłuż brzusznej powierzchni jamy brzusznej za pomocą kleszczy ze stali nierdzewnej numer pięć i prostych ostrzy, nożyczek sprężynowych. Następnie kontynuuj nacięcie w linii środkowej po przekątnej w kierunku kończyn i cofnij skórę w kierunku masywnego kręgosłupa.
Gdy ln będzie dobrze widoczny, przypnij cofniętą skórę za pomocą szpilek do owadów ze stali nierdzewnej i kleszczyków pokrytych żywicą epoksydową inox do cygara. 180 4 postument. Dodaj fizjologiczny roztwór soli fizjologicznej lub PSS do tego obszaru.
Następnie usuń cienką warstwę tkanki łącznej pokrywającą obszar wokół ln. Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś małe kawałki tkanki łącznej i wypreparuj z dala od ln. Za pomocą nożyczek sprężynowych usuń tkankę tłuszczową pokrywającą i otaczającą LN, aż do odsłonięcia łożyska mikronaczyniowego.
Na tym etapie ważne jest, aby uważać, aby nigdy nie kontaktować się z interesującym ich układem naczyniowym za pomocą narzędzi chirurgicznych ani nie uszkodzić naczyń poprzez wywieranie na nie zbyt dużej siły podczas manipulowania otaczającą je tkanką. Tłuszcz najlepiej usunąć z ln poprzez rozluźnienie tkanki łącznej, przytrzymując tłuszcz razem kleszczykami, a następnie delikatnie usuwając tkankę tłuszczową, aż pole widzenia będzie czyste. Po usunięciu tkanki łącznej i tłuszczowej można uwidocznić główny odcinek tętnicy przylegający do LN oraz towarzyszące mu nakładanie.
Gdy interesujący nas segment naczynia zostanie odsłonięty pod lunetą sekcyjną, zabezpiecz preparat pod mikroskopem dożyciowym. Ustawić przewody przesączania i ssące. Podczas tej części zabiegu ważne jest, aby odsłonięta tkanka była zawsze utrzymywana w stanie super połączonym z roztworem Equilibrated PSS.
Superfuzja PSS zachodzi grawitacyjnie. Podaj z początkowego zbiornika do podgrzewanego zbiornika z płaszczem wodnym, który jest perfuzjowany przez 5% dwutlenek węgla równoważy azot, a następnie w dół linii kroplującej z szybkością 10 mililitrów na minutę. Należy użyć przewodu ssącego, aby kontynuować odciąganie super stopionego PSS od preparatu poprzez umieszczenie go na dnie płata skóry, temperaturę kąpieli wodnej krążącej i szybkość superfuzji PSS należy następnie sprawdzić i dostosować do osiągnięcia optymalnej temperatury około 36 stopni Celsjusza.
W trakcie przygotowania należy pozwolić, aby układ krwionośny zrównoważył się z PSS przez co najmniej 60 minut. Upewnij się, że zwierzę nie wpadnie w hipotermię za pomocą termometru doodbytniczego i dostarcz zewnętrzną lampę grzewczą. Podczas gdy PSS jest równy, określ ilościowo średnicę naczynia.
Używanie suwmiarki wideo w wielu punktach czasowych w celu zapewnienia stabilizacji naczynia definiuje się jako rozmiar średnicy pozostający niezmienny w granicach pięciu mikrometrów przez okres 20 minut. Pomiary średnicy są rejestrowane na komputerze za pomocą oprogramowania laboratorium wykresów. Po okresie równoważenia należy ocenić stan naczynia za pomocą agonisty swoistego dla mięśni gładkich, takiego jak fenylefryna, jak pokazano tutaj z fenylefryną.
Dodać agonistę do suse. Na każdym logarytmie należy ocenić osiem agonistów, zwiększając skumulowane stężenie agonisty w miarę dodawania go do losu SUP między podaniem każdego agonisty. Fazę płukania za pomocą PSS należy przeprowadzać przez 30 minut lub do momentu, gdy naczynie powróci do średnicy spoczynkowej.
Oto reprezentatywne wyniki ln pachwinowego po okresie równowagi. Karmienie tętnicy roztworem soli fizjologicznej daje wyraźny obraz, który pozwala na identyfikację zarówno tętnicy pokarmowej wskazanej tutaj przez czerwoną strzałkę, jak i żylnej wskazanej przez zieloną strzałkę, które zaopatrują pachwinowy węzeł chłonny. Wykres przedstawia typową odpowiedź wazoaktywną pachwinowej tętnicy L nfe na skumulowane dodanie fenylefryny skonparowanej z SUP do soli fizjologicznej.
Od stężenia 10 do minus dziewięciu zębów trzonowych do 10 do minus pięciu zębów trzonowych, obecność silnego zwężenia naczyń krwionośnych sugeruje normalną funkcję mięśni gładkich obecnych w tętnicy. Na tym wykresie typowa odpowiedź wazoaktywna na skumulowane dodanie skondensowanej acetylocholiny do soli fizjologicznej. Od stężenia 10 do minus dziewięciu molowców do 10 do minus pięciu molowców.
Obecność silnego rozszerzenia naczyń krwionośnych sugeruje normalną funkcję śródbłonka obecną w tętnicy. Próbując tego przygotowania, jedną z kluczowych rzeczy, o których należy pamiętać, jest zminimalizowanie zakłóceń na statku i otaczającym go obszarze, aby zmaksymalizować sukces. Po tej procedurze można wprowadzić inne metody, takie jak fluorescencja, w celu zbadania innych funkcji komórek, takich jak transport komórkowy.
Opracowanie tej techniki utorowało drogę do połączenia dziedzin immunologii i biologii naczyniowej z nową dziedziną immunologii naczyniowej.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje technikę wykonywania mikroskopii intravitalnej węzła chłonnego pachwinowego, umożliwiającą badanie mikrokrążenia i struktury węzła chłonnego in vivo w czasie rzeczywistym, zarówno podczas homeostazy, jak i infekcji. Metodę tę można dostosować do badań nad migracją komórek oraz badania innych węzłów chłonnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Obrazowanie mikrokrążenia
- Mikroskopia intravitalna
Wstęp
- Mikroskopia intravitalna umożliwia wizualizację żywych tkanek.
- Węzeł chłonny pachwinowy ma kluczowe znaczenie dla badań nad odpowiedzią immunologiczną.
- Zrozumienie unaczynienia węzłów chłonnych jest istotne dla różnych badań biologicznych.
- Techniki te można zastosować w innych tkankach, takich jak mięśnie szkieletowe i mózg.
Cel badania
- W celu wizualizacji i oceny tętnicy doprowadzającej do węzła chłonnego pachwinowego in vivo.
- W celu oceny zmian w naczyniach krwionośnych węzła chłonnego podczas różnych stanów fizjologicznych.
- W celu dostarczenia badaczom szczegółowego przewodnika proceduralnego.
Zastosowane metody
- Wykonanie płata skórnego w celu odsłonięcia węzła chłonnego pachwinowego.
- Disekcja tkanek łącznych i tłuszczowych otaczających węzeł chłonny.
- Zastosowanie mikroskopii intravitalnej do wizualizacji łożyska mikronaczyniowego.
- Podanie soli fizjologicznej w celu zapewnienia optymalnych warunków obrazowania.
Główne wyniki
- Pomyślna wizualizacja naczyń krwionośnych węzła chłonnego pachwinowego.
- Wykazanie prawidłowej funkcji mięśni gładkich w odpowiedzi tętniczej.
- Ilościowa ocena stabilności średnicy naczyń.
- Wyraźna identyfikacja struktur tętniczych i żylnych zaopatrujących węzeł chłonny.
Wnioski
- Technika ta dostarcza kluczowych informacji na temat mikrokrażenia w węzłach chłonnych.
- Demonstracje wizualne ułatwiają zrozumienie złożonych etapów chirurgicznych.
- Metoda ta może zostać dostosowana do różnych projektów doświadczalnych w biologii naczyniowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikroskopia wewnątrzorganizowa węzła chłonnego pachwinowego umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki mikronaczyniowej, która jest kluczowa dla zrozumienia transportu komórek odpornościowych oraz interakcji naczyniowo-immunologicznych. Technika ta wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka w fazie wczesnego odkrywania leków, dostarczając ilościowych, funkcjonalnych odczytów stanu naczyń i ich reaktywności w warunkach fizjologicznych. Łączy ona immunologię z biologią naczyniową, oferując wartość prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych w obszarze stanów zapalnych, infekcji oraz w projektach z zakresu immuno-onkologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację odpowiedzi mikro naczyniowych w czasie rzeczywistym na działanie czynników naczynioaktywnych, co wspiera funkcjonalną walidację punktów uchwycia.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowych pomiarów średnicy naczyń, które służą jako powtarzalne biomarkery funkcji naczyniowej w modelach chorobowych.
- Pewność prognostyczna: Pozwala ocenić funkcję mięśni gładkich oraz śródbłonka, pomagając w redukcji ryzyka w przypadku punktów uchwycia zaangażowanych w regulację naczyniową i rekrutację komórek odpornościowych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez ustalenie bazowej funkcji i stabilności naczyniowej przed testowaniem związków.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację testów dzięki kontrolowanym protokołom superfuzji i kryteriom stabilizacji (średnica w zakresie 5 µm przez 20 min), zapewniając rzetelną ocenę związków.
- Skalowalność: Umożliwia obrazowanie podłużne przez kilka godzin, co ułatwia ocenę odpowiedzi zależnych od czasu w kampaniach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając podłużny monitoring reakcji naczyniowych w modelach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez kwantyfikację funkcjonalności naczyniowej, która jest kluczowym czynnikiem determinującym skuteczność odpowiedzi immunologicznej węzłów chłonnych.
- Zgodność z biomarkerami translacyjnymi: Średnica oraz reaktywność naczyń służą jako translacyjne biomarkery korelujące z migracją komórek odpornościowych i funkcją węzłów chłonnych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania – od testowania hipotez po identyfikację wiodących związków – dostarczając funkcjonalnych odczytów naczyniowych, które pomagają w wyborze celu i zrozumieniu mechanizmów działania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie bezpośredniej obserwacji interfejsów naczyniowo-immunologicznych podczas homeostazy i zaburzeń.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość do przeprowadzania testów dzięki stabilnemu układowi naczyniowemu i wynikom ilościowym (średnica, reaktywność), które pozwalają na porównania pomiędzy różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Analityka: Generuje mierzalne wyniki, w tym zmiany średnicy naczyń oraz odpowiedzi w postaci skurczu i rozszerzenia naczyń, co umożliwia statystyczne porównanie efektów traktowania.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie udziału naczyń w odpowiedzi immunologicznej, co jest istotne dla opracowywania adiuwantów i immunomodulatorów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę obrazowania intravitalnego z możliwością ponownego wykorzystania w wielu lokalizacjach węzłów chłonnych i modelach chorób, co maksymalizuje inwestycje w infrastrukturę.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w interakcjach naczyniowo-immunologicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki kontrolowanej superfuzji, regulacji temperatury oraz kryteriom stabilizacji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczanie funkcjonalnych danych naczyniowych, co redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach programów immunomodulacyjnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o dane dotyczące funkcjonalności naczyniowej, wspierając efektywne kapitałowo postępy w badaniach.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii i obrazowania intravitalnego, aby zminimalizować zaburzenia naczyń podczas przygotowania tkanek.
- Zależne od konfiguracji mikroskopii intravitalnej z liniami do superfuzji i ssania w celu zapewnienia stabilnych warunków obrazowania.
- Wymaga standaryzacji protokołów ilościowego określania naczyń między zespołami (np. pomiar średnicy za pomocą suwmiarki wideo) dla uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania techniki przy zastosowaniu jej w innych węzłach chłonnych lub tkankach, takich jak mięśnie szkieletowe czy mózg.
- Ograniczone przez techniczne trudności w utrzymaniu żywotności naczyń krwionośnych podczas długotrwałego obrazowania, co wymaga starnego zarządzania temperaturą i perfuzją.
