Name: Mikroskopia przyżyciowa pachwinowego węzła chłonnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Poznaj technikę mikroskopii przyżyciowej pachwinowego węzła chłonnego u myszy. Ta metoda umożliwia wizualizację mikrokrążenia węzła chłonnego w czasie rzeczywistym i badanie odpowiedzi naczyniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca jest finansowana przez Canadian Institutes of Health Research, Canadian Foundation for Innovation, University of British Columbia Centre for Blood Research oraz University of Northern BC.

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
<li>Odczynniki wykorzystywane w całym eksperymencie należy przygotować przed rozpoczęciem protokołu chirurgicznego. Należy pamiętać, że wszystkie roztwory były sporządzane przy użyciu techniki sterylnej.</li>
<li>Sól fizjologiczna (PSS) jest najlepiej przygotowana w dwóch komponentach: podstawowym roztworze soli oraz roztworze wodorowęglanu sodu. Oba roztwory należy przygotować w stężeniu 20X i przechowywać w temperaturze 4°C. Wodorowęglan sodu w stężeniu 20X to 360,0mM NaHCO3 (84,01g/mol), a podstawowy roztwór soli w stężeniu 20X zawiera 2638,0mM NaCl (58,44g/mol), 94,0mM KCl (74,56g/mol), 40,0mM CaCl2•2H2O (147,02g/mol) oraz 23,4mM MgSO4•7H2O (246,48g/mol). Roztwory należy przygotować w dH2O, dodając odczynniki pojedynczo i mieszając do uzyskania klarownego roztworu przed dodaniem kolejnej substancji.</li>
<li>Przygotować 2L PSS poprzez zmieszanie równych objętości wodorowęglanu sodu i podstawowego roztworu soli, a następnie rozcieńczenie do stężenia 1X (aby uzyskać dwa 2L PSS, rozcieńczyć 100mL każdego z roztworów w dH2O).</li>
<li>Kolbę miarową o pojemności 2L zawierającą PSS umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Roztwór należy równoważyć mieszaniną 5% CO2 / reszta azot przez 1h przed rozpoczęciem procedury chirurgicznej.</li>
<li>Substancje wazoaktywne (np. fenylefryna, acetylocholina, nitroprusyd sodu) najlepiej przygotować w stężeniu 1M w dH2O i przechowywać w alikwotach 100μl w temperaturze -20°C.</li> 
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt
<ol>
<li>Wyznaczyć masę ciała myszy i podać dawkę początkową pentobarbitalu sodowego w ilości 90mg/kg poprzez wstrzyknięcie doszpikowe. Przez cały czas trwania procedury należy stale monitorować głębokość anestezji myszy za pomocą ucisku palca stopy oraz uważnej obserwacji częstości oddechów. W razie potrzeby należy podać dodatkowe dawki pentobarbitalu sodowego w ilości 20mg/kg w celu utrzymania poziomu znieczulenia. Chirurgiczny poziom anestezji jest utrzymywany zgodnie z przepisami federalnymi i instytucjonalnymi, zgodnie z protokołem opieki nad zwierzętami zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (ACUC) Uniwersytetu Northern BC.</li>
<li>Usunąć sierść z okolic brzucha oraz boków i bioder za pomocą strzygarki. Pozostałe luźne włosy usunąć za pomocą gazika nasączonego alkoholem i przykładając taśmę do skóry. Jest to wystarczające, ponieważ procedura eksperymentalna ma charakter terminalny.</li>
<li>Umieścić mysz na przezroczystej desce chirurgicznej w pozycji grzbietnej i przymocować ją do deski, przyklejając każdą poduszkę stopy taśmą. Temperaturę ciała utrzymuje się za pomocą zewnętrznej lampy grzewczej i monitoruje za pomocą termometru rektalnego, aby zapobiec wystąpieniu hipotermii w wyniku działania środka znieczulającego.</li> 
</ol>
3. Procedura chirurgiczna
<ol>
<li>Przez cały czas trwania procedury chirurgicznej należy zapewnić stałą perfuzję odsłoniętej tkanki wyrównanym, ogrzanym roztworem PSS. Ważne jest również, aby nie dotykać narzędziami chirurgicznymi badanych naczyń krwionośnych oraz nie uszkadzać ich poprzez wywieranie zbyt dużego nacisku podczas manipulowania otaczającą je tkanką tłuszczową i łączną.</li>
<li>Umieść mysz pod stereomikroskopem. Wykonaj cięcie w linii pośrodkowej wzdłuż brzusznej powierzchni jamy brzusznej i odsunie skórę w kierunku kręgosłupa myszy.</li> 
<li>Po odsunięciu skóry w sposób umożliwiający łatwą widoczność LN, przymocuj skórę szpilkami do podstawki z przezroczystego Sylgard 184.</li> 
<li>Usuń cienką warstwę tkanki łącznej pokrywającej obszar wokół LN.</li> 
<li>Usuń tkankę tłuszczową pokrywającą i otaczającą węzeł chłonny, aż do odsłonięcia łoża mikronaczyniowego. Główny segment tętniczy znajduje się przylegać do LN i jest zazwyczaj przykryty żyłką. Cała operacja trwa około 30 minut.</li>
</ol>
4. Obrazowanie i analiza naczyń
<ol>
<li>Po odsłonięciu interesującego segmentu naczynia pod mikroskopem stereoskopowym, należy zamocować preparat na mikroskopie intravitalnym. Należy pamiętać, że zwierzę pozostaje na przezroczystej desce chirurgicznej w mikroskopie intravitalnym przez cały czas trwania eksperymentu. Temperaturę ciała utrzymuje się za pomocą lampy grzewczej i mierzy termometrem rektalnym, zgodnie z opisem w sekcji chirurgicznej. Poziom znieczulenia jest również monitorowany przez cały czas trwania eksperymentu, jak opisano w sekcji 2.1.</li>
<li>Należy przygotować linie do superfuzji i ssania. Superfuzja PSS odbywa się poprzez grawitacyjne zasilanie z rezerwuaru do podgrzewanego rezerwuaru z płaszczem wodnym (płaszcz wodny jest cyrkulowany i podgrzewany przez łaźnię wodną), który jest przepłukiwany azotem zrównoważonym z 5% CO2, a następnie spływa linią kroplową z prędkością 10ml/min. Linię ssącą należy wykorzystać do ciągłego odprowadzania superfuzowanego PSS z preparatu. Należy pamiętać, że przed eksperymentem linie ssące i płaszcz wodny są dokładnie czyszczone i przechowywane po każdym badaniu. Zapewnia to sterylność przed kolejnym eksperymentem.</li>
<li>Należy sprawdzić temperaturę superfuzowanego PSS. Temperaturę cyrkulującej łaźni wodnej i/lub szybkość superfuzji PSS należy dostosować tak, aby osiągnąć temperaturę ˜37°C w obrębie preparatu.</li>
<li>Należy pozwolić naczyniom na równowagę z PSS przez co najmniej 60 minut i określić średnicę naczynia za pomocą wideo-suwmiarki. Zazwyczaj średnicę naczynia należy wyznaczyć w kilku punktach czasowych (np. w 40, 50 i 60 minucie), aby upewnić się, że naczynie się ustabilizowało.</li> 
<li>Stan naczynia należy ocenić przy użyciu specyficznego agonisty mięśni gładkich (np. fenylefryny, PE) oraz specyficznego agonisty śródbłonka (np. acetylocholiny, ACh). Stężenie agonisty powinno być dostosowane do rodzaju użytego związku, jednak w przypadku PE i ACh naczynie należy oceniać przy każdym stężeniu poprzez kumulatywne dodawanie (od 10-5M do 10-9M) do superfuzatu. Każde zastosowanie agonisty powinno być oddzielone fazą płukania (zazwyczaj 30 minut) za pomocą PSS, aż naczynie powróci do średnicy spoczynkowej.</li>
<li>Po ocenie stanu naczynia można przeprowadzić kolejne eksperymenty z lekami naczynioaktywnymi, znakowaniem fluorescencyjnym i śledzeniem komórek.</li>
<li>Po zakończeniu eksperymentu zwierzęciu podaje się przedawkowaną dawkę pentobarbitalu sodowego. Następnie monitoruje się zwierzę, aby upewnić się, że nie wykazuje reakcji na uciśnięcie palca u nogi oraz że brak jest ruchów oddechowych lub bicia serca. Wówczas przeprowadza się zwichnięcie szyi.</li> 
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Po okresie equilibracji preparat powinien dawać wyraźny obraz, który pozwala na identyfikację zarówno tętniczki, jak i żyłki zaopatrującej węzeł chłonny pachwinowy. Wokół naczyń powinny znajdować się minimalne ilości komórek tłuszczowych, aby ściany tętniczki i żyłki były wyraźnie widoczne, co umożliwi nałożenie wideo-suwmiarki w celu obliczenia średnicy naczynia. Kluczowym elementem prawidłowo przygotowanego preparatu jest bogate ukrwienie światła tętniczki oraz zachowanie znacznego stopnia napięcia naczyniowego (tzn. tętniczka posiada zdolność do skurczu i rozszerzenia pod wpływem odpowiednio agonistów specyficznych dla mięśni gładkich i śródbłonka).
<img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig1.jpg" alt="Tkanka roślinna pod mikroskopem; struktura komórkowa, tkanka przewodząca, ksylem, floem, badanie biologiczne." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Obraz z mikroskopii intravitalnej tętniczki doprowadzającej do węzła chłonnego pachwinowego (czerwona strzałka), zrównoważonej z roztworem soli fizjologicznej, biegnącej wzdłuż głównej żyłki (zielona strzałka).
<img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig2.jpg" alt="Wykres procentowego skurczu naczyń w funkcji stężenia PE; odpowiedź na dawkę; analiza danych; farmakologia." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Normalna odpowiedź naczynioruchowa na superfuzję fenylefryny (PE) przy kumulatywnym dodawaniu do soli fizjologicznej w zakresach stężeń od 10-9M do 10-5M. Wystąpienie silnego skurczu naczyń sugeruje prawidłową funkcję mięśni gładkich w tętniczce.
<img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig3.jpg" alt="Wykres zależności dawka-odpowiedź wiążący stężenie ACh z rozszerzeniem naczynia, przedstawiający dane w formie krzywej sigmoidalnej." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Normalna odpowiedź naczynioruchowa na superfuzję acetylocholiny (ACh) poprzez kumulatywne dodawanie do soli fizjologicznej w stężeniach od 10-9M do 10-5M. Wystąpienie silnego rozszerzenia naczyń sugeruje prawidłową funkcję śródbłonka w tętniczce.

<ol><li>Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteriolar+network+architecture+and+vasomotor+function+with+ageing+in+mouse+gluteus+maximus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 561, 535-545 (2004).</li>
<li>Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+expression+and+conducted+vasodilation+along+arteriolar+endothelium+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).</li>
<li>Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+inhibits+conducted+vasodilation+through+endothelium-derived+NO+production+in+arterioles+of+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle.</a> Faseb J. 18, 280-286 (2004).</li>
<li>Smeda, J. S., Payne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+autoregulatory+and+myogenic+function+in+the+cerebrovasculature+of+Dahl+salt-sensitive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats.</a> Stroke. 34, 1484-1490 (2003).</li>
<li>de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+anatomy+of+the+hamster+retractor+muscle+with+regard+to+its+microvascular+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer.</a> Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).</li>
<li>Domeier, T. L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromechanical+and+pharmacomechanical+signalling+pathways+for+conducted+vasodilatation+along+endothelium+of+hamster+feed+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries.</a> J Physiol. 579, 175-186 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj mikroskopia intravitalna węzła chłonnego pachwinowego umożliwia obrazowanie mikrokrążenia węzła chłonnego in-vivo. W związku z tym ułatwia ona bezpośrednią obserwację w czasie rzeczywistym. Obrazowanie mikrokrążenia węzła chłonnego stanowi unikalną możliwość badania interfejsu między odpowiedzią immunologiczną a układem naczyniowym. Wykorzystując tę metodę, można skupić się konkretnie na odpowiedzi immunologicznej, zmianach w naczyniach krwionośnych lub na oddziaływaniu między tymi dwoma elementami.
Jak w przypadku wszystkich podejść eksperymentalnych, standardowa mikroskopia intravitalna posiada zarówno zalety, jak i ograniczenia1,2,3,4,5,6,7. Standardową IVM, taką jak opisane tutaj przygotowanie, można łatwo zmodyfikować; autorzy wykazali wcześniej, że umożliwia ona mikroskopię epifluorescencyjną poprzez wprowadzenie fluorescencyjnych barwników śledzących lub znakowanych populacji komórek1,2,3,4,5,6,7. Chociaż standardowa IVM nie daje możliwości obrazowania trójwymiarowego i śledzenia, jakie zapewnia mikroskopia dwufotonowa lub angiografia, śledzenie komórek w dwóch wymiarach jest nadal możliwe, co pozwala na obserwację i kwantyfikację interakcji międzykomórkowych oraz interakcji komórek z naczyniami krwionośnymi. W połączeniu z podaniem in-vivo i późniejszym barwieniem przeciwciałami fluorescencyjnymi metoda ta może być wykorzystywana do uzyskiwania danych o ekspresji białek/markerów w czasie rzeczywistym1,2,3,4,5,6,7.
Warto zauważyć, że alternatywne techniki obrazowania wymagają statycznego środowiska; często konieczne jest unieruchomienie obszaru chirurgicznego lub zastosowanie szkiełka nakrywkowe na płaskim preparacie. Ogranicza to, a wręcz uniemożliwia, aktywną perfuzję mediatorów naczyniowych lub innych substancji nad preparatem w celu oceny integralności i fizjologii naczyń itp., a także stosowanie innych technik, takich jak eksperymenty z wazodylatacją w obrębie preparatu IVM2,3,4,6,7. Co więcej, standardowe IVM nie wymaga całkowicie płaskiego preparatu i nie jest podatne na ruchy, np. wywołane oddychaniem zwierzęcia1,2,3,4,5,6,7. Pozwala to na zastosowanie standardowego IVM w większej liczbie obszarów chirurgicznych z lepszą powtarzalnością. Przykładem jest opisany tutaj preparat węzła chłonnego pachwinowego. Ze względu na rozmiar i kształt węzła chłonnego, preparat nie może zostać spłaszczony bez uszkodzenia tkanki, a lokalizacja węzła powoduje znaczne przemieszczenia wynikające z oddychania zwierzęcia. Takie problemy byłyby trudne do pokonania przy użyciu innych metod, lecz są łatwo rozwiązywane dzięki opisanemu standardowemu przygotowaniu IVM.
Podsumowując, opisane powyżej przygotowanie można połączyć z dowolną liczbą innych technik biochemicznych, naczyniowych i/lub immunologicznych, takich jak transfer subpopulacji komórek aktywowanych lub znakowanych, indukcja hipoksji oraz nadekspresja lub deplekcja mediatorów naczyniowych. Jednakże dodatkowe zastosowania są zależne od stanu zdrowia początkowego preparatu. Dlatego kluczowe jest zawsze badanie kondycji naczyń krwionośnych poddawanych obrazowaniu i ocenie. Głównymi punktami pozwalającymi na uzyskanie prawidłowego preparatu są zapewnienie stałej perfuzji zrównoważonym PSS w temperaturze ciała oraz minimalizacja kontaktu i stresu wywieranego na obszar operacyjny podczas zabiegu.

<a href="https://app.jove.com/t/6652">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/2551">10.3791/2551</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/2551">Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node</a>. The Authors&#160;and Discussion&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

<table><tbody><tr><td>Węglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodnian chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitroprusyd sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenylefryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetylocholina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siedmiowodnian chlorku magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia wewnątrzżyciowa węzła chłonnego pachwinowego

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Węzły chłonne (LN), rozmieszczone w całym organizmie, stanowią integralny element układu odpornościowego. Służą one jako miejsce indukcji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, a tym samym rozwoju komórek efektorowych. W związku z tym węzły chłonne są kluczowe w walce z naciekającymi patogenami i utrzymaniu stanu zdrowia. Wybór węzła chłonnego do badania zależy od dostępności oraz pożądanego modelu; węzeł chłonny pachwinowy jest dobrze położony i ułatwia prowadzenie badań nad biologicznie istotnymi modelami infekcji skóry oraz błon śluzowych narządów płciowych1.
Węzeł chłonny (LN) pachwinowy, podobnie jak wszystkie LN, posiada rozbudowaną sieć mikronaczyniową dostarczającą krew. Generalnie sieć mikronaczyniowa ta obejmuje główną tętniczkę doprowadzającą do LN, która następnie rozgałęzia się i zasila wysokomiąższowe żyłki (HEV). HEV są wyspecjalizowane w ułatwianiu migracji komórek odpornościowych do LN zarówno podczas homeostazy, jak i infekcji. Mechanizmy, za pomocą których HEV regulują migrację do LN w obu tych sytuacjach, są przedmiotem intensywnych badań. Tętniczka doprowadzająca do LN wywiera bezpośredni wpływ powyżej HEV i stanowi główne źródło składników odżywczych oraz krwi bogatej w komórki dostarczanych do LN. Co więcej, zmiany w tętniczce doprowadzającej są zaangażowane w ułatwianie indukcji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej1. Mikronaczyniowe układy LN mają oczywiste znaczenie w utrzymywaniu optymalnego ukrwienia LN i regulowaniu napływu komórek odpornościowych do LN, co stanowi kluczowe elementy prawidłowego funkcjonowania LN i w konsekwencji odpowiedzi immunologicznej1.
Zdolność do badania mikrokrążenia węzłów chłonnych in vivo jest kluczowa dla wyjaśnienia, w jaki sposób układ odpornościowy i mikrokrążenie oddziałują na siebie i wpływają na siebie wzajemnie w obrębie węzła chłonnego. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę obrazowania in vivo pachwinowego węzła chłonnego. Koncentrujemy się na obrazowaniu mikrokrążenia węzła chłonnego, zwracając szczególną uwagę na metody zapewniające badanie zdrowych naczyń, możliwość utrzymania obrazowania żywotnych naczyń przez kilka godzin oraz ilościową ocenę wielkości naczyń. Przedstawiono również metody perfuzji mikrokrążenia lekami wazoaktywnymi, a także możliwość śledzenia i ilościowego określania ruchu komórek.
Mikroskopia intravitalna węzła chłonnego pachwinowego umożliwia bezpośrednią ocenę funkcjonalności mikrokrążenia oraz analizę w czasie rzeczywistym bezpośredniego oddziaływania między komórkami odpornościowymi, węzłem chłonnym a mikrokrążeniem. Technika ta ma potencjał do łączenia z wieloma metodami immunologicznymi i fluorescencyjnym znakowaniem komórek, a także może być modyfikowana w celu badania unaczynienia innych węzłów chłonnych.

Przedstawiono technikę wykonywania mikroskopii intravitalnej węzła chłonnego (LN) pachwinowego. Technika ta umożliwia badanie mikrokrążenia i struktury węzła chłonnego w czasie rzeczywistym, in vivo, zarówno w stanie homeostazy, jak i podczas infekcji. Metoda ta może zostać dostosowana do badań nad migracją komórek oraz do analizy innych lokalizacji węzłów chłonnych.

Mikroskopia wewnątrzżyciowa węzła chłonnego pachwinowego

Węzły chłonne (LN), rozmieszczone w całym organizmie, stanowią integralny element układu odpornościowego. Służą one jako miejsce indukcji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i ocena tętnicy doprowadzającej do węzła chłonnego pachwinowego in vivo. Osiąga się to poprzez stworzenie płata skórnego poprzez ostrożne rozcięcie skóry w okolicy pachwinowej myszy, obejmujące węzeł chłonny pachwinowy. Następnie oddziela się tkankę łączną pokrywającą obszar węzła chłonnego.Następnie należy usunąć otaczającą tkankę tłuszczową, aby odsłonić naczynia tętnicze doprowadzające krew do węzła chłonnego. Na koniec zmiany w unaczynieniu węzła chłonnego są wizualizowane i oceniane za pomocą mikroskopii witalnej P. Chociaż preparatem, który zostanie dziś zaprezentowany, jest mikrokrążenie w węźle chłonnym pachwinowym, opisane techniki chirurgiczne można zastosować również w przypadku innych preparatów, takich jak mięśnie szkieletowe czy mózg.Zazwyczaj osoby początkujące stosujące tę technikę napotykają trudności z dwóch głównych powodów. Po pierwsze, praca odbywa się na żywym zwierzęciu, a po drugie, ze względu na przeprowadzanie zabiegu na bardzo małym obszarze, jakiekolwiek zakłócenia w obrębie samego naczynia lub w jego otoczeniu mogą wywrzeć negatywny wpływ, co byłoby szkodliwe dla planowanego eksperymentu. Demonstracja wizualna tej techniki jest kluczowa dla osiągnięcia sukcesu.Procedura ta obejmuje szereg skomplikowanych etapów, których opis tekstowy nie oddaje w pełni praktycznego wykonania techniki. Aby przeprowadzić ją prawidłowo, niezbędne jest obejrzenie prezentacji. Życzymy wielu sukcesów.Mysz zostaje najpierw znieczulona, a obszar operacyjny ogolony. Szczegóły znajdują się w tekście manuskryptu. Następnie mysz można umieścić na przezroczystej desce operacyjnej w pozycji grzbietnej.Przymocuj mysz do płytki, przyklejając taśmą każdą z poduszek stóp. Dzień przed eksperymentem przygotuj mieszaninę Thes Guard 180 4 zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, używając standardowej jednorazowej szalki Petriego jako formy, wlej mieszaninę do głębokości około one quarter inch i pozostaw do utwardzenia na noc. Wyjmij Thes Guard z szalki Petriego i umieść go na płytce chirurgicznej.Umieść ogoloną, znieczuloną mysz pod stereomikroskopem. Wykonaj cięcie w linii pośrodkowej wzdłuż brzusznej powierzchni jamy brzusznej, używając stalowych pęsety numer pięć oraz prostych nożyczek sprężynowych. Następnie kontynuuj cięcie w linii pośrodkowej ukośnie w kierunku kończyn i odsunie skórę w stronę kręgosłupa.Gdy ln stanie się wyraźnie widoczny, przypnij odsuniętą skórę do podstawki typu 180 4, używając stalowych szpilek entomologicznych i szczypiec z powłoką epoksydową inox. Na dany obszar nanieś sól fizjologiczną lub roztwór PSS.Następnie należy usunąć cienką warstwę tkanki łącznej pokrywającą obszar wokół węzła chłonnego (ln). Za pomocą pęsety ostrożnie chwytamy małe fragmenty tkanki łącznej i odcinamy je od ln. Następnie, używając nożyczek sprężynowych, usuwamy tkankę tłuszczową pokrywającą i otaczającą węzeł chłonny (LN), aż do odsłonięcia łożyska mikronaczyniowego.W tym kroku ważne jest, aby zachować ostrożność i nie dotykać instrumentami chirurgicznymi naczyń krwionośnych będących przedmiotem badania oraz nie uszkodzić ich, przykładając zbyt dużą siłę podczas manipulowania otaczającą je tkanką. Tłuszcz najlepiej usuwać z okolic ln, rozluźniając tkankę łączną i trzymając tkankę tłuszczową pęsetą, a następnie delikatnie ją usuwając, aż do momentu uzyskania przejrzystego pola widzenia. Po usunięciu tkanki łącznej i tłuszczowej można zwizualizować główny odcinek tętniczy sąsiadujący z LN oraz nadkładającą go towarzyszącą ven.Po odsłonięciu interesującego fragmentu naczynia pod mikroskopem operacyjnym, należy unieruchomić preparat w mikroskopie intravitalnym. Przygotuj linie superfuzji i ssania. Na tym etapie procedury kluczowe jest, aby odsłonięta tkanka była stale poddawana superfuzji roztworem Equilibrated PSS.Superfuzja PSS odbywa się grawitacyjnie. Płyn przepływa z rezerwuaru początkowego do rezerwuaru w koszulce wodnej, który jest napowietrzany mieszaniną 5% Carbon dioxide balance nitrogen, a następnie spływa linią kroplową z prędkością 10 milliliters per minute. Należy zastosować linię ssącą, aby stale odprowadzać superfuzowany PSS z preparatu, umieszczając ją u dołu płata skóry; następnie należy sprawdzić i dostosować temperaturę cyrkulującej kąpieli wodnej oraz tempo superfuzji PSS, aby uzyskać optymalną temperaturę wynoszącą około 36 degrees Celsius.W trakcie przygotowania należy pozwolić na równowagę naczyń krwionośnych z PSS przez co najmniej 60 minut. Należy zapobiegać hipotermii zwierzęcia, monitorując temperaturę termometrem rektalnym i stosując zewnętrzną lampę grzewczą. Podczas wyrównywania PSS należy zmierzyć średnicę naczynia.Należy użyć suwaków wideo w kilku punktach czasowych, aby upewnić się, że naczynie uległo stabilizacji; stabilizację definiuje się jako utrzymanie stałej średnicy z dokładnością do 5 µm przez okres 20 minut. Pomiary średnicy są rejestrowane na komputerze przy użyciu oprogramowania ChartLab. Po okresie równoważenia należy ocenić stan naczynia, stosując specyficzny agonista mięśni gładkich, taki jak fenylefryna, co pokazano tutaj na przykładzie fenylefryny.Dodaj agonistę do roztworu. Należy ocenić osiem agonistów przy każdym logarytmicznym wzroście kumulatywnego stężenia agonisty dodawanego do naczynia pomiędzy aplikacjami każdego agonisty. Należy przeprowadzić fazę płukania przy użyciu PSS przez 30 minut lub do momentu, aż naczynie powróci do średnicy spoczynkowej.Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki obrazowania węzła chłonnego pachwinowego po okresie ekwilibracji. Podanie soli fizjologicznej do tętnicy pozwala na uzyskanie wyraźnego obrazu, który umożliwia identyfikację zarówno tętnicy doprowadzającej (wskazanej tutaj czerwoną strzałką), jak i żyły odprowadzającej (wskazanej zieloną strzałką), które zaopatrują węzeł chłonny pachwinowy. Wykres przedstawia typową odpowiedź naczynioruchową tętnicy doprowadzającej węzła chłonnego pachwinowego na kumulatywne dodawanie fenylefryny do soli fizjologicznej.W zakresie stężeń od 10⁻⁹ M do 10⁻⁵ M występowanie silnego skurczu naczyń sugeruje prawidłową funkcję mięśni gładkich w tętnicy. Na tym wykresie przedstawiono typową odpowiedź naczyniową na kumulatywne dodawanie acetylocholiny do soli fizjologicznej w zakresie stężeń od 10⁻⁹ M do 10⁻⁵ M.Wystąpienie silnej wazodylatacji sugeruje prawidłową funkcję śródbłonka w tętnicy. Przygotowując ten preparat, należy pamiętać przede wszystkim o zminimalizowaniu zaburzeń naczynia i obszaru go otaczającego, aby zmaksymalizować szansę na sukces. Po wykonaniu tej procedury można wprowadzić inne metody, takie jak fluorescencja, w celu zbadania innych funkcji komórkowych, na przykład ruchu komórek.Opracowanie tej techniki utorowało drogę do połączenia immunologii i biologii naczyniowej w nową dziedzinę – immunologię naczyniową.

intravital-microscopy-of-the-inguinal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Mikroskopia przyżyciowa pachwinowego węzła chłonnego

Ostatnie postępy w mikroskopii dwufotonowej umożliwiły obrazowanie in situ żywych tkanek w modelach zwierzęcych w czasie rzeczywistym, co zwiększyło nasze możliwości badania zachowania komórek zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. W niniejszym materiale przedstawiamy przygotowania niezbędne do przeprowadzenia obrazowania przyżyciowego węzła chłonnego podkolanowego myszy.

Obrazowanie intravitalne węzła chłonnego podkolanowego myszy

Niedawno opracowane techniki obrazowania z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) mogą pomóc w wyjaśnieniu roli, jaką układ limfatyczny odgrywa w przerzutowaniu nowotworów, odpowiedzi immunologicznej, gojeniu ran oraz innych chorobach związanych z układem limfatycznym.

Nieinwazyjne obrazowanie optyczne naczyń limfatycznych myszy

W tym filmie demonstrujemy technikę obrazowania pachwinowego węzła chłonnego w modelu mysim za pomocą ultrawysokiej częstotliwości obrazowania ultradźwiękowego. Ta nieinwazyjna technika obrazowania pozwala na monitorowanie zmian objętości węzłów chłonnych u zwierzęcia w czasie.

Analiza objętości pachwinowych węzłów chłonnych myszy: technika obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości w celu określenia objętości pachwinowego węzła chłonnego w modelu mysim

Ten film demonstruje wizualizację śródnabłonkowych limfocytów γδ (IELs) u myszy transgenicznych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zabieg chirurgiczny polega na wytworzeniu linii perforacji i wykonaniu podłużnego nacięcia w celu odsłonięcia błony śluzowej i kosmków jelitowych. Transgeniczne myszy wyrażają białka reporterowe wyłącznie w γδ IELs, umożliwiając ich śledzenie. Obrazowanie przyżyciowe rejestruje dynamiczny ruch IEL γδ znakowanych zieloną fluorescencją wzdłuż błony podstawnej komórki...

Wizualizacja śródnabłonkowych limfocytów śródnabłonkowych gamma delta

Ten film demonstruje procedurę chirurgicznej izolacji węzła chłonnego drenującego pachwinę na modelu mysim. Nacięcie okolicy brzusznej zapewnia dostęp do pachwinowego węzła chłonnego, który jest pobierany chirurgicznie. Pobrany półprzezroczysty pachwinowy węzeł chłonny można wykorzystać do badań immunologicznych.

Pobieranie węzła chłonnego drenującego pachwiny z modelu mysiego

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Ten protokół opisuje technikę obrazowania różnych populacji komórek w drenujących węzłach chłonnych bez zmian w strukturze narządu.

Wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Tutaj pokazujemy, jak wykonać mikroskopię przyżyciową na żyłkach powłosilarnych mięśnia cremaster myszy. Powszechnie stosowany do różnych modeli zapalenia i sepsy, szczególnie tych indukowanych przez chemokiny i cytokiny, podkreślamy jego znaczenie w badaniu muskolopatii obejmujących przesadny naciek leukocytów mięśniowych.

Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Czerniak jest bardzo agresywną chorobą, która szybko rozprzestrzenia się na inne narządy. Protokół ten opisuje zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości, w połączeniu z renderowaniem 3D, do monitorowania objętości pachwinowych węzłów chłonnych w mysim modelu czerniaka z przerzutami Braf/Pten.

Analiza objętości węzłów chłonnych za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu czerniaka Braf/Pten

Poznaj technikę mikroskopii przyżyciowej pachwinowego węzła chłonnego u myszy. Ta metoda umożliwia wizualizację mikrokrążenia węzła chłonnego w czasie rzeczywistym i badanie odpowiedzi naczyniowych.

Mikroskopia wewnątrzżyciowa węzła chłonnego pachwinowego

Przeglądaj więcej filmów