Ocena właściwości sygnalizacyjnych nabłonków ektodermalnych podczas rozwoju kraniofacjalnego
24 marca 2011
W niniejszym artykule opisano technikę transplantacji tkanek, która została opracowana w celu zbadania właściwości sygnalizacyjnych i wzorowania powierzchniowego ektodermy głownej podczas rozwoju kraniofacjalnego.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie embrionów chimerycznych poprzez przeszczepienie ektodermy z embrionów dawców do rozwijającej się górnej szczęki embrionów kurzych. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie skóry dawcy do transplantacji, a następnie przygotowanie miejsca u biorcy do wszczepienia.
Ostatnim krokiem procedury jest umieszczenie tkanki dawcy w miejscu biorcy i przymocowanie przeszczepu w odpowiedniej pozycji. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące wyłączne przyjęcie się ektodermy dawcy, a dzięki analizie molekularnej i morfologicznej można określić funkcję rekodowanej skóry dawcy. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak określenie roli różnych tkanek podczas morfogenezy.
Procedurę zaprezentuje dr Diane, starsza badaczka z naszego laboratorium. Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować pożywki oraz upewnić się, że wszystkie wymagane roztwory są dostępne i mają odpowiednią temperaturę. Następnie, stosując odpowiednią ochronę oczu, należy wypalić kapilary do uzyskania cienkiego końca nad płomieniem palnika spirytusowego.
Aby zaostrzyć igły wolframowe za pomocą szklanych rurek, należy trzymać je w płomieniu palnika propanowego. Rozpocznij wyjmowanie zarodka donora z otoczki, naklejając kawałek taśmy na koniec jaja. Następnie użyj czubka igły sekcyjnej, aby wykonać niewielki otwór w środku taśmy.
Wprowadź strzykawkę o pojemności 10 ml oraz igłę hipodermiczną o rozmiarze 18G do otworu i pobierz 1 ml albuminy z jaja. Następnie, używając igły sekcyjnej, wykonaj mały otwór w górnej części skorupki. Naklej drugi kawałek taśmy, aby zakryć ten otwór.
Za pomocą dwóch par pęset wykonaj okrągłe otwór w jajku. Chwyć embrion i umieść go w naczyniu z lodowatym PBS w celu przemycia. Po usunięciu głowy embrionu, umieść go w naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym bezsurowicze DMEM w temperaturze pokojowej.
Umieść szalkę pod mikroskopem stereoskopowym, trzymając głowę pęsetą. Za pomocą nożyczek sprężynowych oddziel od reszty głowy górną szczękę i lagon. Następnie, używając uchwytu do ostrzy z ostrym żytkiem, odetnij wyrostek czołowo-nosowy od górnej szczęki.
Za pomocą pipety przenieść wyrostek nosowy czołowy do 30 milimetrowej szalki Petriego zawierającej odpowiednią objętość roztworu diss w PBS i inkubować na lodzie przez 20 minut. Po upływie czasu inkubacji odessać roztwór dispa, uważając, aby nie naruszyć tkanki. Następnie całkowicie przykryć tkanki pożywką DMEM zawierającą 1% BSA.
Aby zatrzymać proces trawienia, przenieść tkankę do nowej szalki hodowlanej. Następnie, pracując pod mikroskopem stereoskopowym, unieruchomić tkankę za pomocą nieostrzonej igły wolframowej, używając do manipulacji ostrej igły wolframowej.
Oddziel ektodermę, odrywając ją od pozostałych tkanek. Po przygotowaniu przechowywać tkankę przeszczepioną w DMEM z BSA na lodzie do momentu, aż gospodarz będzie gotowy do transplantacji. Korzystając z wcześniej zaprezentowanej metody, wykonać okno w jajku kurzym.
Umieść jajo z zarodkiem pod mikroskopem stereoskopowym, używając dwóch par pęset. Chwyć błonę IGN oraz owodni i ostrożnie je przerwij, aby wykonać otwór i odsłonić zarodek gospodarza. Obróć głowę, przykładając pęsetę do prawego oka i wywierając nacisk, jednocześnie stabilnie trzymając głowę.
Za pomocą pęsety i igły należy usunąć skórę właściwą gospodarza, aby przygotować miejsce na przeszczep. Do szalki Petriego zawierającej przygotowane przeszczepy należy dodać 2 µL czerwieni neutralnej. Przeszczep należy przenieść do gospodarza za pomocą pipety szklanej.
Umieść przeszczep w miejscu usuniętego ektodermy. W każdym rogu przeszczepionej tkanki umieść szklany pin, aby przymocować przeszczep po zabiegu. Szczelnie zamknij okno za pomocą taśmy.
Przenieś embrion z powrotem do inkubatora aż do osiągnięcia wymaganego etapu rozwoju do analizy; na tym obrazie widoczna jest tkanka z URA zarodka przepiórki, która została zabarwiona specyficznym dla przepiórki przeciwciałem anty Q-C-P-N-A. Przeszczepiona tkanka znajduje się pomiędzy dwiema strzałkami. Brak dowodów na zabarwienie QCPN w tkance gospodarza z chimery mysz-zarodek; tutaj ponownie przeszczepiona tkanka znajduje się pomiędzy dwiema strzałkami w C dwóch hybrydyzacjach z sondą specyficzną dla sekwencji powtórzonej B dwóch.
W badaniu genów klasy pierwszej wykazano, że ekspresja sign B two jest ograniczona do obszaru obejmującego przeszczep pokazany tutaj jako obraz chimery lustrzanej pisklęcia przepiórki barwionej trichromem. Barwienie trichromowe nadaje kolagenowi i kościom kolor niebieski. Powielenie szkieletu górnej szczęki jest widoczne w miejscu wskazanym strzałką. Ten obraz przedstawia chimerę lustrzaną pisklęcia myszy, która została ponownie zabarwiona trichromem.
Widoczna jest duplikacja szkieletu górnej szczęki. Obraz ten przedstawia radioznaczoną hybrydyzację in situ normalnej ekspresji BMP 7 w mezenchymie zarodka kurczaka; pokazana tutaj tkanka pochodzi z chimery mysz-kurczak. Widać, że ekspresja BMP 7 została indukowana w mezenchymie sąsiadującym z przeszczepem, co wskazano strzałką.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat manipulowania zarodkami kurczęt w celu oceny mechanizmów regulujących rozwój wyrostka czołowego i nosowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje technikę transplantacji tkanek mającą na celu stworzenie embrionów chimerycznych w celu zbadania właściwości sygnałowych i wzorcujących powierzchniowej ektodermy głownej podczas rozwoju kraniofacjalnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwoju
- Rozwój kraniofacjalny
- Inżynieria tkankowa
Wstęp
- Badanie koncentruje się na roli ektodermy w morfogenezie kraniofacialnej.
- Zrozumienie interakcji tkankowych jest kluczowe dla biologii rozwoju.
- Zarodki chimeryczne pozwalają na wgląd w funkcję i rozwój tkanek.
- Technika ta może pomóc w zidentyfikowaniu wkładu poszczególnych tkanek w procesy rozwojowe.
Cel badania
- Aby przetestować właściwości sygnałowe powierzchniowej ektodermy głownej.
- Aby przeanalizować wpływ ektodermy na wzorce rozwoju w trakcie rozwoju kraniofacjalnego.
- Aby zbadać rolę ektodermy dawcy w rozwoju tkanek gospodarza.
Zastosowane metody
- Przeszczepienie ektodermy z embrionów dawców do embrionów kurczaka.
- Przygotowanie miejsca biorcy do przeszczepienia.
- Umieszczenie i mocowanie tkanki dawcy w miejscu biorcy.
- Analiza molekularna i morfologiczna przeszczepionej tkanki.
Główne wyniki
- Zaobserwowano pomyślny przeszczep ektodermy dawcy.
- Analiza molekularna ujawniła funkcjonalną rolę ektodermy dawcy.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia oddziaływań tkankowych podczas rozwoju.
- Otrzymane dane dostarczają informacji na temat mechanizmów morfogenezy kraniofacjalnej.
Wnioski
- Technika transplantacji jest skuteczna w badaniu funkcji ektodermy.
- Wyniki pogłębiają wiedzę na temat procesów rozwoju kraniofacialnego.
- Metodę tę można zastosować do dalszych badań nad zagadnieniami z zakresu biologii rozwoju.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia mechaniczną analizę sygnalizacji tkankowej w morfogenezie kraniofacialnej, wspierając walidację celów w szlakach rozwojowych. Poprzez tworzenie modeli chimerycznych badacze mogą oceniać właściwości sygnalizacyjne pochodzenia ektodermalnego, istotne dla mechanizmów wad wrodzonych. Podejście to dostarcza systemu istotnego dla badanych schorzeń, pozwalającego na weryfikację hipotez dotyczących oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych we wczesnym rozwoju.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceuticals
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Badanie właściwości sygnalizacyjnych ektodermy dawcy w celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych rozwoju twarzy.
- Wartość operacyjna: Wykorzystanie markerów jąderka lub elementów powtarzalnych do rozróżnienia tkanek gospodarza i dawcy w celu jednoznacznego śledzenia linii komórkowych.
- Wartość naukowa: Umożliwienie oceny funkcjonalnej ektodermy z embrionów mutantów w celu powiązania genotypu z efektami wzorcowania fenotypowego.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszych analiz molekularnych i morfologicznych w zakresie indukcji sygnalizacji.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje rozmieszczenie i mocowanie przeszczepów, aby zapewnić powtarzalne przyjęcie przeszczepu w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Wartość naukowa: Wspiera ilościowe odczyty, takie jak ekspresja BMP7 w sąsiadującej mezenchymie, w celu pomiaru aktywacji szlaku.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ustanawia istotny dla choroby system z wykorzystaniem ektodermy mysiej do modelowania ludzkich fenotypów mutantów kraniofacialnych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez badanie interakcji tkankowych w modelu embrionu kręgowca.
- Wartość naukowa: Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez izolację funkcji ektodermy w kształtowaniu duplikacji szkieletu górnej szczęki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów odkrywania leków, w których testy z przeszczepem tkanek pozwalają na wyjaśnienie hierarchii sygnalizacyjnych przed priorytetyzacją celów w szlakach kraniofacjalnych.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez dotyczących sygnalizacji ektodermy w rozwoju procesu czołowo-nosowego poprzez generowanie embrionów chimerycznych.
- Przesiewanie: Opisuje przygotowanie do analizy poprzez standaryzację przygotowania miejsca gospodarza i pozycjonowania przeszczepu w celu uzyskania spójnych wyników molekularnych.
- Analityka: Podkreśla analizę molekularną (np. hybrydyzację in situ, immunobarwienie) oraz ocenę morfologiczną (np. barwienie trichromowe) w celu ewaluacji wyników sygnalizacji.
- Badania translacyjne: Łączy z ciągłością przedkliniczną, umożliwiając testowanie ektodermy mutantów mysich u gospodarzy kurzych w celu modelowania ludzkich wariantów rozwojowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia platformę chimeryczną jako możliwość wielokrotnego wykorzystania do testowania wielu tkanek dawcy lub wariantów genetycznych w różnych badaniach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Możliwość przewidywania wiarygodności walidacji celu poprzez bezpośrednią ocenę sygnalizacji indukowanej przez ektodermę w tkankach gospodarza.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki zdefiniowanym etapom transplantacji oraz markerom specyficznym dla tkanek umożliwiającym rozróżnienie dawcy od gospodarza.
- Wartość strategiczna: Lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach sygnalizacji nabłonkowo-mezenchymalnej.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowaną sygnalizację ektodermy w modelach morfogenezy kraniofacjalnej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie sekcji embrionów, obchodzenia się z tkankami oraz hodowli embrionów chimerycznych.
- Potrzebne instrumentarium obejmuje mikroskop sekcyjny, narzędzia mikrokapilarne oraz zestaw do hodowli tkankowej niezbędny do manipulacji embrionami.
- Standaryzacja międzyzespołowa wymaga spójnego określania stadium rozwoju gospodarza, oceny żywotności przeszczepu oraz protokołów analizy molekularnej.
- Kwestie adaptacyjne w różnych systemach modelowych obejmują optymalizację czasów trawienia i pośrodków hodowlanych dla różnych gatunków dawców (przepiórka, mysz).
- Ograniczenia praktyczne obejmują okna żywotności przeszczepu oraz wskaźniki przeżywalności embrionów gospodarzy po transplantacji, co odnotowano w ograniczeniach czasowych procedury.
