Ocena właściwości sygnalizacyjnych nabłonka ektodermalnego podczas rozwoju twarzoczaszki
March 24th, 2011
Ten artykuł opisuje technikę przeszczepu tkanek, która została zaprojektowana w celu przetestowania właściwości sygnalizacyjnych i wzorcowych powierzchniowej ektodermy głowowej podczas rozwoju twarzoczaszki.
Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie chimerycznych zarodków poprzez przeszczepienie ektodermy z zarodków dawcy do rozwijającej się górnej szczęki zarodków piskląt. Osiąga się to poprzez uprzednie usunięcie skóry właściwej dawcy do przeszczepu. Następnie miejsce żywiciela jest przygotowywane do wszczepienia.
Ostatnim etapem zabiegu jest umieszczenie tkanki dawcy w miejscu żywiciela i umieszczenie przeszczepu na miejscu. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na wyłączne wszczepienie ektodermy dawcy, a dzięki analizie molekularnej i morfologicznej można określić funkcję skóry właściwej dawcy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii rozwoju, takie jak identyfikacja roli różnych tkanek podczas morfogenezy.
Procedurę zademonstruje dr Diane, która jest starszym badaczem z naszego laboratorium. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować podłoże i upewnić się, że wszystkie wymagane roztwory są dostępne i mają odpowiednią temperaturę. Następnie, nosząc odpowiednią ochronę oczu, przeciągnij mikrorurki kapilarne do cienkiego punktu nad płomieniem alkoholowym.
Aby zrobić szklane szpilki, naostrz igły wolframowe, trzymając je w płomieniu palnika propanowego. Rozpocznij ekstrakcję zarodka dawcy ze skorupy, umieszczając kawałek taśmy na końcu komórki jajowej. Następnie użyj czubka igły do preparowania, aby utworzyć mały otwór w środku taśmy.
Włóż 10-mililitrową strzykawkę i igłę podskórną o rozmiarze 18 do otworu i usuń jeden mililitr albuminy z jajka. Następnie za pomocą igły do preparowania wykonaj mały otwór na górze skorupy. Umieść drugi kawałek taśmy, aby zakryć ten otwór.
Wytnij okrągły otwór w jajku za pomocą dwóch par kleszczy. Chwyć zarodek i umieść go w naczyniu z lodowatym PBS do umycia. Po usunięciu głowy zarodka umieść ją w naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym DMEM o temperaturze pokojowej, wolnym od surowicy.
Umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym, trzymając głowę kleszczami. Użyj nożyczek sprężynowych, aby grubo wyciąć górną szczękę i lagon od reszty głowy. Następnie za pomocą uchwytu na ostrze z ostrą żyletką przyciąć przedni wyrostek nosowy od górnej szczęki.
Za pomocą pipety przenieś wyrostek nosowy fronton na 30-milimetrową szalkę Petriego zawierającą wystarczającą objętość dissu w PBS i inkubuj na lodzie przez 20 minut. Po upływie czasu inkubacji należy odessać roztwór dispa bez naruszania tkanki. Następnie całkowicie pokryj tkanki DMEM zawierającym 1% BSA.
Aby zatrzymać trawienie, przenieś tkankę do nowego naczynia hodowlanego. Następnie praca pod mikroskopem preparacyjnym. Przytrzymaj tkankę nienaostrzoną igłą wolframową za pomocą zaostrzonej igły wolframowej.
Oddziel ektodermę, odrywając ją od innych tkanek. Po przygotowaniu należy przechowywać przeszczepioną tkankę w DMEM z BSA na lodzie, aż gospodarz będzie gotowy do przeszczepu. Korzystając z wcześniej zademonstrowanej metody, utwórz okno w jaju kurzym.
Umieść komórkę jajową zawierającą zarodek pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą dwóch par kleszczy. Chwyć błonę IGN i owodnię i delikatnie rozerwij, aby zrobić dziurę i odsłonić zarodek gospodarza. Obróć głowę, kładąc kleszcze na prawym oku i wywierając nacisk, trzymając głowę stabilnie.
Użyj języka i igły, aby usunąć skórę ciała gospodarza, aby pomieścić przeszczep. Dodaj dwa mikrolitry neutralnej czerwieni do szalki Petriego zawierającej przygotowane przeszczepy. Użyj szklanej pipety, aby przenieść przeszczep do gospodarza.
Umieść przeszczep w miejscu, w którym zastąpi usuniętą ektodermę. Włóż szklaną szpilkę w każdym rogu przeszczepionej tkanki, aby przypiąć przeszczep na miejscu Po wszczepieniu. Zamknij szczelnie okno taśmą.
Zwróć zarodek do inkubatora aż do wymaganego etapu rozwoju do analizy, ten obraz pokazuje tkankę z URA pisklęcia przepiórki, która została wybarwiona przeciwciałem specyficznym dla przepiórki anty Q-C-P-N-A. Przeszczepiona tkanka znajduje się między dwiema strzałkami. Nie ma dowodów na barwienie QCPN w tkance rodzaju meen z mysiego dzwonka pisklęcia, które jest tutaj widoczne Ponownie, przeszczepiona tkanka znajduje się między dwiema strzałkami w hybrydyzacji C dwie z zatwierdzoną specyficzną dla znaku B dwie powtarzające się sekwencje.
W klasie pierwszej geny ujawniają, że ekspresja znaku B dwa jest ograniczona do omu obejmującego przeszczep pokazany tutaj jako obraz lustra dzwonka przepiórki, które zostało zabarwione trójchromem, barwienie trichromem sprawia, że kolagen i kość mają niebieski kolor. Duplikacja szkieletu górnej szczęki jest widoczna, jak wskazuje strzałka. Ten obraz przedstawia lustro dzwonka dla piskląt myszy, które zostało ponownie poplamione na trójkolorowo.
Widoczna jest duplikacja szkieletu górnej szczęki. Ten obraz pokazuje radioaktywną w C 2 hybrydyzację normalnej ekspresji BMP 7 w mechy zarodka pisklęcia tratwy, pokazana tutaj jest tkanka z lustra dzwonka piskląt myszy. Można zauważyć, że ekspresja BMP siedem jest indukowana w mechy przylegającej do przeszczepu, jak wskazuje strzałka.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak manipulować zarodkami piskląt, aby ocenić mechanizmy regulujące rozwój wyrostka przedniego i nosowego.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje technikę transplantacji tkanki mającą na celu stworzenie chimerycznych zarodków w celu badania właściwości sygnalizacyjnych i wzorców powstawania powierzchniowego ektoderma głowowego podczas rozwoju twarzoczaszki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwojowa
- Rozwijanie twarzoczaszki
- Inżynieria tkankowa
Tło
- Badanie koncentruje się na roli ektoderma w morfogenezie twarzoczaszki.
- Zrozumienie interakcji tkanek jest kluczowe dla biologii rozwojowej.
- Chimeryczne zarodki zapewniają wgląd w funkcjonowanie i rozwój tkanek.
- Ta technika może pomóc w identyfikacji wkładu różnych tkanek w trakcie rozwoju.
Cel badania
- Aby przetestować właściwości sygnalizacyjne powierzchniowego ektoderma głowowego.
- Aby przeanalizować efekty wzorcowania ektoderma podczas rozwoju twarzoczaszki.
- Aby zbadać rolę ektoderma dawcy w rozwoju tkanki gospodarza.
Stosowane metody
- Transplantacja ektoderma z zarodków dawcy do zarodków kurczaka.
- Przygotowanie miejsca gospodarza do wszczepienia.
- Umieszczenie i przymocowanie tkanki dawcy na miejscu gospodarza.
- Analiza molekularna i morfologiczna wszczepowanej tkanki.
Główne wyniki
- Zobserwowano pomyślne wszczepienie ektoderma dawcy.
- Analiza molekularna ujawnił funkcjonalną rolę ektoderma dawcy.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia interakcji tkanek podczas rozwoju.
- Wyniki zapewniają wgląd w mechanizmy morfogenezy twarzoczaszki.
Wnioski
- Technika transplantacji jest skuteczna w badaniu funkcji ektoderma.
- Wyniki zwiększają wiedzę o procesach rozwoju twarzoczaszki.
- Ta metoda może być zastosowana do dalszego badania pytań dotyczących biologii rozwoju.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables mechanistic interrogation of tissue signaling in craniofacial morphogenesis, supporting target validation in developmental pathways. By establishing chimeric models, researchers can assess ectoderm-derived signaling properties relevant to congenital disorder mechanisms. The approach provides a disease-relevant system for de-risking hypotheses about epithelial-mesenchymal interactions in early development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Tests signaling properties of donor ectoderm to clarify molecular mechanisms in facial development.
- Operational Value: Uses nucleolar or repetitive element markers to distinguish host and donor tissues for unambiguous lineage tracing.
- Scientific Value: Enables functional assessment of ectoderm from mutant embryos to link genotype to phenotypic patterning outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream molecular and morphological analysis of signaling induction.
- Operational Value: Standardizes graft placement and affixation to ensure reproducible engraftment across experimental conditions.
- Scientific Value: Supports quantitative readouts such as BMP7 expression in adjacent mesenchyme to measure pathway activation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes disease-relevant system using mouse ectoderm to model human craniofacial mutant phenotypes.
- Operational Value: Enables continuity from discovery through preclinical validation by testing tissue interactions in a vertebrate embryo model.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by isolating ectoderm function in patterning upper jaw skeleton duplication.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where tissue transplantation assays clarify signaling hierarchies before target prioritization in craniofacial pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ectoderm signaling in frontonasal process development through chimeric embryo generation.
- Screening: Describes assay readiness via standardized host site preparation and graft positioning for consistent molecular readouts.
- Analytics: Highlights molecular analysis (e.g., in situ hybridization, immunostaining) and morphological scoring (e.g., trichrome staining) to evaluate signaling outcomes.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling testing of mutant mouse ectoderm in chick hosts to model human developmental variants.
- Enterprise Reuse: frames the chimera platform as a reusable capability for testing multiple donor tissues or genetic variants across studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct assessment of ectoderm-induced signaling in host tissues.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined transplantation steps and tissue-specific markers for donor-host discrimination.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in epithelial-mesenchymal signaling pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on validated ectoderm signaling in craniofacial morphogenesis models.
Implementation Considerations
- Required expertise in embryonic dissection, tissue handling, and chimeric embryo culture.
- Instrumentation needs include dissecting microscope, microcapillary tools, and tissue culture setup for embryo manipulation.
- Cross-team standardization requires consistent host staging, graft viability assessment, and molecular analysis protocols.
- Adaptation considerations across model systems involve optimizing digestion times and culture media for different donor species (quail, mouse).
- Practical limitations include graft viability windows and host embryo survival rates post-transplantation, as noted in procedural timing constraints.
