Ortotopowy ksenoprzeszczep ludzkich złośliwych komórek nowotworowych osłonki nerwów obwodowych oznaczonych lucyferazą do testowania in vivo potencjalnych środków terapeutycznych

Opisano metodę niezawodnego szczepienia ludzkich złośliwych komórek guza osłonki nerwu obwodowego oznaczonych lucyferazą do nerwu kulszowego myszy z niedoborem odporności. Omówiono również zastosowanie obrazowania bioluminescencyjnego w celu wykazania prawidłowego ustalania przeszczepów nowotworowych oraz kryteriów losowej segregacji zwierząt do grup badanych.

Ogólnym celem tej procedury jest ustalenie, czy potencjalny środek terapeutyczny skutecznie hamuje wzrost komórek M-P-N-S-T wszczepionych do nerwu kulszowego myszy z niedoborem odporności. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie komórek nowotworowych z kolby tkankowej, umycie ich i ponowne zawieszenie ich w odpowiednim stężeniu. Drugim etapem zabiegu jest chirurgiczne odsłonięcie nerwu kulszowego, a następnie wstrzyknięcie do nerwu 5 000 komórek.

Następnym krokiem jest określenie powodzenia przeszczepu za pomocą obrazowania in vivo, opartego na świetle, randomizującego CIN do grup badawczych i rozpoczęcia terapii potencjalnym środkiem terapeutycznym. Ostatnim etapem procedury jest pobranie guzów 30 dni po przeszczepie i przeanalizowanie wpływu potencjalnego środka terapeutycznego na guz. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokażą, czy środek terapeutyczny zmniejszył wzrost guza za pomocą metod takich jak porównanie mas guza, przyjrzenie się względnym wskaźnikom proliferacji poprzez barwienie immunologiczne dla KI 67 i ocena poziomów śmierci komórek nowotworowych u myszy kontrolnych i leczonych testami tunelowymi.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak przeszczep podskórny, jest to, że modeluje normalne mikrośrodowisko, które lepiej modeluje wzrost M-P-N-S-T, demonstrując tę technikę, będzie Amy Turk, technik z mojego laboratorium. Nienagie myszy z niedoborem odporności przygotowuje się dzień przed szczepieniem. Użyj maszynki do strzyżenia, aby zgolić włosy znieczulonej myszy pracującej na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała.

Użyj chemicznego środka do depilacji, aby usunąć pozostałe włosy. Po usunięciu wszystkich włosów umieść mysz na poduszce grzewczej w klatce izolacyjnej bez ściółki, aż w pełni wyzdrowieje. W dniu szczepienia odwirować komórki z prędkością 3000 obr./min przez pięć minut.

Ostrożnie usunąć snat i ponownie zawiesić osad komórkowy w DMEM 10 bez pur mycyny do końcowego stężenia pięć razy 10 do trzecich komórek na trzy mikrolitry. Trzymaj komórki na lodzie, aż będą gotowe do użycia. Na początek umieść znieczulone zwierzę na poduszce grzewczej i nałóż maść okulistyczną na każde oko.

Przypnij kolczyk z unikalnym numerem identyfikacyjnym do prawego ucha każdej myszy. Aby ułatwić identyfikację podczas badania, należy ułożyć zwierzę na brzuchu i rozłożyć tylne nogi. Przykryj mysz sterylną serwetą i odsłoń okno chirurgiczne, w którym nastąpi przeszczep.

Nałóż Betadine na pole operacyjne za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką, zaczynając od środka boku i stopniowo spiralnie kierując się na zewnątrz do krawędzi okna operacyjnego. 70% etanol jest następnie nakładany na pole operacyjne w ten sam sposób. Kolejne aplikacje Betadine, a następnie etanolu powtarza się jeszcze dwukrotnie.

Usuń komórki z lodu i delikatnie odwiruj lub przesuń rurkę, aby ponownie zawiesić osadzone komórki. Za pomocą pipety usuń 3,2 mikrolitra zawiesiny komórek i wyrzuć ją na kawałek paraformu. Pobrać trzy mikrolitry zawiesiny komórek do 10-mikrolitrowej strzykawki Hamiltona.

Wyposażony w igłę o rozmiarze 33. Trzymać komórki i strzykawkę na lodzie do momentu, gdy będą gotowe do użycia. Użyj rękojeści skalpela numer cztery, wyposażonej w ostrze skalpela numer 22, aby wykonać nacięcie przez skórę boku tuż poniżej i równolegle do kości udowej.

Otwórz nacięcie skóry za pomocą zacisku chirurgicznego, aby odsłonić leżący pod spodem mięsień. Użyj nożyczek z ostrymi końcówkami, aby stępić powięź biegnącą wzdłuż nogi i odsłonić nerw kulszowy, który leży pod białą liniową strukturą o grubości grubej nici pracującej pod mikroskopem. Użyj pary zakrzywionych kleszczy z ostrymi końcówkami, aby ostrożnie wyciąć nerw, rozluźniając go od leżącego poniżej mięśnia.

Pozostaw kleszcze na miejscu, aby nerw był zarówno uniesiony, jak i starannie odizolowany Włóż igłę strzykawki Hamiltona do nerwu, starając się utrzymać kąt wstrzyknięcia jak najbardziej równoległy do nerwu, tak aby nie przebić się do spodu. Gdy igła zostanie prawidłowo umieszczona w nerwie, rozluźnij napięcie wytwarzane przez kleszcze i powoli wstrzykuj komórki w ciągu 45 do 60 sekund. Powolne wstrzykiwanie jest niezbędne, aby zapobiec cofaniu się komórek nowotworowych powodującemu ich utratę.

Po pomyślnym wstrzyknięciu wszystkich komórek należy powoli wycofać igłę, aby zminimalizować utratę wstrzykniętego materiału. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy zdjąć zacisk chirurgiczny i kleszcze. Następnie ostrożnie umieść nerw z powrotem w jego pierwotnym miejscu.

Zamknij nacięcie klejem chirurgicznym vet bond, przytrzymując je kleszczami przez około 20 sekund, aby klej wyschł. Umieść zwierzę w ogrzewanej klatce wolnej od ściółki, aż w pełni wyzdrowieje. Monitoruj stan zdrowia myszy.

Codzienne myszy są usuwane z badania. Jeśli obciążenie guzem przekracza 10% normalnej masy ciała zwierzęcia lub utrata masy ciała przekracza 20%Aby określić powodzenie zabiegu, wykonaj obrazowanie bioluminescencyjne jeden i trzy dni po szczepieniu. Wstrzyknij myszu 2,5 miligrama Lucyfera i umieść znieczulone zwierzę na podgrzewanej platformie obrazowania.

Emisja światła z lucyferazy świetlika wyrażonej w guzie jest wykrywana 10 minut po wstrzyknięciu substratu. Za pomocą oprogramowania Xeno Gen ustaw czas akwizycji obrazu w zakresie od jednej sekundy do 10 minut. Następnie zrób czarno-białe zdjęcia myszy Pseudocolor.

Skalowanie bioluminescencji jest nakładane na te obrazy, aby zapewnić miarę intensywności emisji światła. Aby kwalifikować się do włączenia do kohorty badań przedklinicznych, myszy muszą mieć wykrywalny sygnał bioluminescencyjny, zarówno jeden, jak i trzy dni po szczepieniu, a intensywność sygnału musi wzrosnąć między pierwszym a trzecim dniem. Pokazany tutaj jest typowy postępujący wzrost bioluminescencji obserwowany od jednego do 18 dni po przeszczepie w prawidłowo założonym ortotopowym ksenoprzeszczepie u nagiej myszy.

Zwróć uwagę na podobieństwo sygnałów wykrytych w obszarze zainteresowania różnych myszy. Ponowne obrazowanie 10 dni i 18 dni po szczepieniu pokazuje, że sygnały bioluminescencyjne stopniowo zwiększają się w miejscu przeszczepu u poszczególnych myszy. Kwantyfikacja sygnałów bioluminescencyjnych obserwowanych od jednego do 24 dni po przeszczepie pokazuje, że chociaż sygnały te stopniowo zwiększają, wzrost guza znacznie przyspiesza w późniejszych etapach okresu badania.

Biorąc pod uwagę agresywny wzrost M pns ts, przeszczepione komórki nowotworowe często naruszają normalne bariery nerwu i atakują sąsiednie tkanki. Ta mikrofotografia miejsca przeszczepu pokazuje wzrost guza i ogniskową inwazję na sąsiednie mięśnie szkieletowe Po opanowaniu tej techniki można wykonać na jednej myszy w ciągu 10 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.