Name: Ortotopowy ksenoprzeszczep ludzkich złośliwych komórek nowotworowych osłonki nerwów obwodowych oznaczonych lucyferazą do testowania in vivo potencjalnych środków terapeutycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj metodę ortotopowego ksenoprzeszczepu komórek MPNST oznaczonych lucyferazą do nerwu kulszowego myszy immunodeficyjnych. Technika umożliwia testowanie in vivo potencjalnych środków terapeutycznych przy użyciu bioluminescencyjnego obrazowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez National Institute of Neurological Diseases and Stroke (grant R01 NS048353 dla S.L.C.), National Cancer Institute (granty R01 CA122804 dla S.L.C., R01 CA134773 dla Kevina A. Rotha i S.L.C. oraz CA13148-35 dla K.R.Z.) oraz Department of Defense (grant X81XWH-09-1-0086 dla S.L.C.). Środki wspierające funkcjonowanie zaplecza obrazowania małych zwierząt UAB Comprehensive Cancer Center zostały zapewnione z grantu NCI Core Support (P30 CA13148-35; E. Partridge, P.I.). Dziękujemy Alabama Neuroscience Blueprint Core Center (P30 NS57098) oraz UAB Neuroscience Core Center (P30 NS47466) za okazaną pomoc. Treść opracowania jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i nie musi odzwierciedlać oficjalnych opinii National Institutes of Health lub Department of Defense.

<ol><li>Rosenberg, M. P., Bortner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+transgenic+and+knockout+animal+models+should+be+used+%28for+drug+efficacy+studies+in+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Met.+Rev%22%5BJournal%5D)">Why transgenic and knockout animal models should be used (for drug efficacy studies in cancer).</a> Cancer Met. Rev. 17, 295-299 (1999).</li>
<li>Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+models+are+necessary+to+predict+therapy+of+transplantable+tumors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Met.+Rev%22%5BJournal%5D)">Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice.</a> Cancer Met. Rev. 17, 279-284 (1999).</li>
<li>Carroll, S. L., Ratner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+does+the+Schwann+cell+lineage+form+tumors+in+NF1%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">How does the Schwann cell lineage form tumors in NF1?</a> Glia. 56, 1590-1605 (2008).</li>
<li>Woodruff, J. M., Kourea, H. P., Louis, D. N., Scheithauer, B. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoodruff%2C+JM+%22Pathology+and+Genetics+of+Tumours+of+the+Nervous+System%22">Pathology and Genetics of Tumours of the Nervous System</a>. Kleihues, P., Cavenee, W. K. , IARC Press. Lyon. 172-174 (2000).</li>
<li>DeClue, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+expression+in+neurofibromatosis+type+1-related+tumors+and+NF1+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor expression in neurofibromatosis type 1-related tumors and NF1 animal models.</a> J. Clin. Invest. 105, 1233-1241 (2000).</li>
<li>Byer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tamoxifen+inhibits+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+growth+via+an+estrogen+receptor-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth via an estrogen receptor-independent mechanism.</a> Neuro-Oncology. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Zinn, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49, 103-115 (2008).</li>
<li>Wu, J. C., Sundaresan, G., Iyer, M., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+optical+imaging+of+firefly+luciferase+reporter+gene+expression+in+skeletal+muscles+of+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Therapy%22%5BJournal%5D)">Noninvasive optical imaging of firefly luciferase reporter gene expression in skeletal muscles of living mice.</a> Mol. Therapy. 4, 297-306 (2001).</li>
<li>Luker, G. D., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luciferase+real-time+bioluminescence+imaging+for+the+study+of+viral+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Luciferase real-time bioluminescence imaging for the study of viral pathogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 292, 285-296 (2005).</li>
<li>Dahlberg, W. K., Little, J. B., Fletcher, J. A., Suit, H. D., Okunieff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitivity+in+vitro+of+human+soft+tissue+sarcoma+cell+lines+and+skin+fibroblasts+derived+from+the+same+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Biol%22%5BJournal%5D)">Radiosensitivity in vitro of human soft tissue sarcoma cell lines and skin fibroblasts derived from the same patients.</a> Int. J. Radiat. Biol. 63, 191-198 (1993).</li>
<li>Badache, A., DeVries, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibrosarcoma-derived+Schwann+cells+overexpress+platelet-derived+growth+factor+%28PDGF%29+receptors+and+are+induced+to+proliferate+by+PDGF%5BTitle%5D)+AND+%22BB.+J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neurofibrosarcoma-derived Schwann cells overexpress platelet-derived growth factor (PDGF) receptors and are induced to proliferate by PDGF.</a> BB. J. Cell. Physiol. 177, 334-342 (1998).</li>
<li>Muir, D., Neubauer, D., Lim, I. T., Yachnis, A. T., Wallace, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenic+properties+of+neurofibromin-deficient+neurofibroma+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient neurofibroma Schwann cells.</a> Am. J. Pathol. 158, 501-513 (2001).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Szczegółowa metoda ortotopowego ksenoprzeszczepu przedstawiona w niniejszym opracowaniu została opracowana przez nas z wykorzystaniem komórek MPNST linii ST88-14, która jest szeroko stosowana w badaniach nad tymi guzami pochewek nerwów obwodowych związanych z NF1. Metodologia ta jest jednak łatwo dostosowywalna do badań przedklinicznych z wykorzystaniem innych linii komórkowych MPNST. Na przykład, z sukcesem podobnym do tego, który zaobserwowaliśmy w przypadku komórek ST88-14, przeprowadziliśmy ortotopowe ksenoprzeszczepy z wykorzystaniem komórek STS-26T10, linii pochodzącej ze sporadycznie występującego MPNST, oraz komórek T265-2c11, pochodzących z MPNST związanego z NF1.
Należy jednak zaznaczyć, że dokładne warunki opisane tutaj dla ortotopowego ksenoprzeszczepu komórek ST88-14 nie mogą zostać bezpośrednio zastosowane do przeszczepiania innych linii MPNST. Zamiast tego, kluczowe parametry metodologii muszą zostać określone empirycznie dla każdej linii komórkowej. Parametry te obejmują liczbę początkowo przeszczepianych komórek MPNST, czas przewidziany na rozwój przeszczepu oraz, w mniejszym stopniu, objętość, w której wstrzykiwane są komórki nowotworowe. Aby ustalić te parametry dla nowej linii, przeszczepiamy grupy myszy (5 myszy na grupę), stosując od 103 do 5 x 106 komórek nowotworowych, sprawdzając dwa stężenia komórek dla każdego rzędu wielkości (tj. 103 komórek, 5 x 103 komórek, 104 komórek, 5 x 104 komórek itd.). Większe liczby komórek nowotworowych (&gt;106) muszą być wstrzykiwane w większej objętości; ustaliliśmy, że można wstrzyknąć do 5 mL bez utraty komórek z przeszczepionego nerwu. Stwierdziliśmy również, że nie można wstrzyknąć więcej niż 5 x 106 komórek nowotworowych w objętości 5 mL, ponieważ gęstsze zawiesiny stają się coraz bardziej podatne na siły ścinania, które zabijają komórki nowotworowe. Obserwujemy te myszy do momentu, gdy co najmniej trzy zwierzęta w każdej grupie będą miały wyczuwalne guzy, po czym uśmiercamy tę grupę i badamy nerw histologicznie w celu potwierdzenia wzrostu przeszczepu. Oczywiście czas wymagany do osiągnięcia tego etapu będzie się różnić w zależności od liczby wstrzykniętych komórek; generalnie dążymy do uzyskania takiego stężenia komórek, które osiągnie maksymalny dopuszczalny wzrost guza w ciągu 30-60 dni. Szybszy wzrost może utrudnić osiągnięcie skutecznych stężeń terapeutycznych przed zakończeniem eksperymentu i/lub uniemożliwić zebranie wystarczającej liczby punktów danych z obrazowania bioluminescencyjnego w trakcie trwania doświadczeń. Przebieg czasowy dłuższy niż 60 dni sprawia, że dostosowywanie parametrów eksperymentalnych staje się uciążliwe i niepotrzebnie przedłuża czas trwania planowanych eksperymentów.
Na koniec odnotujemy, że zastosowaliśmy tę metodologię ortotopowego ksenoprzeszczepu z wykorzystaniem komórek ST88-14 przeszczepionych myszom NIH III w celu wykazania skuteczności terapeutycznej tamoksifenu6. Szczegółowy opis metod rutynowo stosowanych do oceny wpływu potencjalnych substancji terapeutycznych na ksenoprzeszczepy ortotopowe znajduje się w tej publikacji. Wykazano również, że komórki neurofibromatu mogą zostać z powodzeniem przeszczepione do nerwu obwodowego12, co sugeruje, że po wprowadzeniu modyfikacji procedury opisane w niniejszym protokole mogą być wykorzystane do przeprowadzenia badań przedklinicznych z potencjalnymi substancjami terapeutycznymi skierowanymi przeciwko neurofibromatom.

<table><tbody><tr><td>Myszy SCID linii Foxchase (outbred)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>#236</td><td></td></tr><tr><td>Myszy NIH III</td><td>Taconic</td><td>#NIHBNX</td><td></td></tr><tr><td>Myszy NOD-SCID&amp;#947;</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#005557</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do odrywania komórek (Cell Stripper)</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-056-cl</td><td></td></tr><tr><td>Klej chirurgiczny Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamiltona</td><td>Hamilton Co</td><td>#80030</td><td>objętość 10 &amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Igły do strzykawki Hamiltona</td><td>Hamilton Co</td><td>#7803-05</td><td>33 Ga., 0,5 cala, PT4 (wykonane na zamówienie)</td></tr><tr><td>Kolczyki do uszu</td><td>National Band and Ear Tag Co.</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>Maść oftalmiczna</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

ortotopowe ksenoprzeszczepy ludzkich komórek złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych znakowanych lucyferazą do testowania potencjalnych środków terapeutycznych in vivo

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Chociaż badania przesiewowe in vitro są niezbędne do wstępnej identyfikacji potencjalnych czynników terapeutycznych, rygorystyczna ocena zdolności leku do hamowania wzrostu guza musi zostać przeprowadzona na odpowiednim modelu zwierzęcym. Rodzaj modelu zwierzęcego, który najlepiej nadaje się do tego celu, jest przedmiotem intensywnych dyskusji. Niektóre dowody wskazują, że badania przedkliniczne sprawdzające działanie leków na guzy powstające u myszy transgenicznych lepiej przewidują wyniki kliniczne1, dlatego potencjalne czynniki terapeutyczne są często testowane w tych modelach. Niestety, modele transgeniczne nie są dostępne dla wielu typów nowotworów. Ponadto modele transgeniczne często wykazują inne ograniczenia, takie jak wątpliwości co do tego, jak dobrze mysi guz odzwierciedla jego ludzki odpowiednik, niepełna penetracja fenotypu nowotworowego oraz brak możliwości przewidzenia, kiedy rozwinie się guz.
W konsekwencji wielu badaczy w badaniach przedklinicznych wykorzystuje modele ksenoprzeszczepów (ludzkie komórki nowotworowe przeszczepione niedoborowym immunologicznie myszom), jeśli nie są dostępne odpowiednie transgeniczne modele nowotworów. Nawet w przypadku dostępności modeli transgenicznych, często łączy się je z modelami ksenoprzeszczepów, ponieważ te drugie umożliwiają szybkie określenie zakresów terapeutycznych. Ponadto takie podejście pozwala na porównanie skuteczności preparatu w nowotworach transgenicznych i w rzeczywistych ludzkich komórkach nowotworowych. Historycznie ksenoprzeszczepy często wykonywano poprzez podskórne wstrzykiwanie komórek nowotworowych (ksenoprzeszczepy ektopowe). Technika ta jest szybka, powtarzalna, stosunkowo tania i pozwala na ciągłe ilościowe określanie wzrostu guza w okresie terapeutycznym2. Jednak przestrzeń podskórna nie jest naturalnym mikrośrodowiskiem dla większości nowotworów, dlatego wyniki uzyskane za pomocą ksenoprzeszczepów ektopowych mogą być mylące ze względu na czynniki takie jak brak organowo specyficznej ekspresji genów tkanki gospodarza i nowotworu. Zdecydowanie zalecano zatem, aby badania nad przeszczepami ektopowymi zastąpić lub uzupełnić badaniami, w których ludzkie komórki nowotworowe są przeszczepiane do tkanki pochodzenia (ksenoprzeszczepy ortotopowe)2. Niestety wdrożenie tej rekomendacji jest często utrudnione przez fakt, że metodologie ksenoprzeszczepów ortotopowych nie zostały jeszcze opracowane dla wielu typów nowotworów.
Złośliwe guzy pochewek nerwów obwodowych (MPNST) to wysoce agresywne mięsaki, które występują sporadycznie lub w związku z neurofibromatozą typu 13, a najczęściej rozwijają się w nerwie kulszowym4. W niniejszej pracy opisujemy technicznie prostą metodę, w której ludzkie komórki MPNST znakowane lucyferazą świetlikową są ortotopowo przeszczepiane do nerwu kulszowego myszy z niedoborem odporności. Omówiono również nasze podejście do oceny sukcesu procedury przeszczepiania u poszczególnych zwierząt oraz późniejszej bezstronnej randomizacji do grup badawczych.

Opisano metodę niezawodnego przeszczepiania ludzkich komórek złośliwego guza pochewki nerwów obwodowych znakowanych lucyferazą do nerwu kulszowego myszy z niedoborem odporności. Omówiono również wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego do wykazania prawidłowego przyjęcia przeszczepów nowotworowych oraz kryteria losowego przydziału zwierząt do grup badawczych.

Ortotopowe ksenoprzeszczepy ludzkich komórek złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych znakowanych lucyferazą do testowania potencjalnych środków terapeutycznych in vivo

Chociaż badania przesiewowe in vitro są niezbędne do wstępnej identyfikacji potencjalnych substancji terapeutycznych, rygorystyczna ocena zdolności leku do ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie, czy kandydujący środek terapeutyczny skutecznie hamuje wzrost komórek M-P-N-S-T przeszczepionych do nerwu kulszowego myszy z niedoborem odporności. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie usunięcie komórek nowotworowych z kolby tkankowej, ich przemycie i ponowne zawieszenie w odpowiednim stężeniu. Drugim krokiem procedury jest chirurgiczne odsłonięcie nerwu kulszowego, a następnie wstrzyknięcie do nerwu 5 000 komórek.Kolejnym krokiem jest ocena powodzenia przeszczepu za pomocą obrazowania optycznego in vivo, randomizacja CIN na grupy badawcze oraz rozpoczęcie terapii z zastosowaniem kandydackiego związku terapeutycznego. Ostatnim etapem procedury jest pobranie guzów 30 dni po przeszczepieniu i analiza wpływu kandydackiego związku terapeutycznego na guz. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące, czy środek terapeutyczny zahamował wzrost guza, stosując metody takie jak porównanie masy guzów, analiza względnych szybkości proliferacji poprzez barwienie immunocytochemiczne na KI 67 oraz ocena poziomu śmierci komórek nowotworowych u myszy kontrolnych i leczonych za pomocą testów TUNEL.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przeszczepy podskórne, jest to, że modeluje ona naturalne mikrośrodowisko, co lepiej odzwierciedla wzrost M-P-N-S-T; technikę tę zademonstruje Amy Turk, technik z mojego laboratorium. Myszy immunodeficyjne (nie-nude) przygotowuje się w dniu poprzedzającym przeszczep. Za pomocą strzygarki należy ogolić sierść zznieczyszonej myszy, pracując na podkładce grzewczej w celu utrzymania temperatury ciała.Użyj chemicznego środka do depilacji, aby usunąć pozostałe włosy. Po usunięciu wszystkich włosów umieść mysz na podkładce grzewczej w klatce izolacyjnej bez ściółki, aż do pełnego powrotu do sprawności. W dniu przeszczepu odwiruj komórki z prędkością 3000 RPM przez pięć minut.Ostrożnie usuń supernatant i resuspenduj osad komórkowy w DMEM 10 bez puromycyny do końcowego stężenia 5 × 10³ komórek na 3 µL. Przechowuj komórki w lodzie do momentu użycia. Na początek umieść znieczulone zwierzę na podgrzewaczu i nałóż maść okulistyczną do każdego oka.Przymocuj do prawego ucha każdej myszy kolczyk z unikalnym numerem identyfikacyjnym. Aby ułatwić identyfikację w trakcie trwania badania, ułóż zwierzę na brzuchu i rozstaw tylne kończyny. Przykryj mysz sterylnym polem operacyjnym, pozostawiając odsłonięte okno chirurgiczne w miejscu, gdzie zostanie wykonany przeszczep.Nanieś Betadine na pole operacyjne za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem, zaczynając od środka boku i stopniowo przesuwając się spiralnie na zewnątrz, aż do krawędzi pola operacyjnego. Następnie w ten sam sposób nanieś 70% ethanol na pole operacyjne. Kolejne aplikacje Betadine, po których następuje ethanol, powtórz jeszcze dwukrotnie.Wyjąć komórki z lodu, a następnie delikatnie wymieszać je za pomocą wortexa lub uderzając w probówkę, aby resuspender osiadłe komórki. Za pomocą pipety pobrać 3,2 µL zawiesiny komórkowej i nanieść ją na kawałek parafiny. Nabrać 3 µL zawiesiny komórkowej do strzykawki Hamiltona o pojemności 10 µL.Wyposażyć strzykawkę w igłę o rozmiarze 33 G. Przechowywać komórki oraz strzykawkę zawierającą komórki w lodzie do momentu użycia. Używając uchwytu do skalpela nr 4 z ostrzem nr 22, wykonać nacięcie skóry w okolicy boku, tuż poniżej kości udowej i równolegle do niej.Rozszerzyć nacięcie skóry za pomocą kleszczyków chirurgicznych, aby odsłonić leżący pod nią mięsień. Używając nożyczek o ostrych końcach, przeprowadzić rozwarstwienie tępe nożyczkami przez powięź biegnącą wzdłuż nogi, a następnie, pracując pod mikroskopem, odsłonić nerw kulszowy, który znajduje się pod białą, liniową strukturą o grubości zbliżonej do grubej nici. Używając zakrzywionej pęsety o ostrych końcach, ostrożnie przeprowadzić preparację pod nerwem, uwalniając go od leżącego poniżej mięśnia.Pozostaw pęsetę w miejscu, aby utrzymać nerw w uniesieniu i zapewnić jego izolację. Ostrożnie wprowadź igłę strzykawki Hamiltona do nerwu, starając się zachować kąt wstrzyknięcia jak najbardziej równoległy do nerwu, aby uniknąć przebicia go na wylot. Po prawidłowym umieszczeniu igły w nerwie, zredukuj napięcie wywołane przez pęsetę i powoli wstrzyknij komórki w czasie od 45 do 60 sekund. Powolne wstrzykiwanie jest niezbędne, aby zapobiec cofnięciu się komórek nowotworowych i ich utracie.Po pomyślnym wstrzyknięciu do wszystkich komórek, powoli wycofaj igłę, aby zminimalizować utratę wstrzykniętego materiału. Po zakończeniu iniekcji usuń zacisk chirurgiczny i pęsetę. Następnie ostrożnie umieść nerw z powrotem w jego pierwotnym położeniu.Zamknąć nacięcie za pomocą chirurgicznego kleju wet bond, utrzymując brzegi rany pęsetą przez około 20 sekund do czasu wyschnięcia kleju. Umieścić zwierzę w ogrzewanej klatce bez ściółki do czasu pełnego powrotu do sprawności. Monitorować stan zdrowia myszy.Myszami są codziennie wykluczane z badania, jeśli obciążenie nowotworem przekroczy 10% normalnej masy ciała zwierzęcia lub utrata masy ciała przekroczy 20%. Aby ocenić powodzenie procedury, należy wykonać obrazowanie bioluminescencyjne jeden i trzy dni po przeszczepieniu. Wstrzyknij myszy 2,5 milligrams Lucifera i umieść znieczulone zwierzę na podgrzewanej platformie obrazującej.Emisję światła z lucyferazy świetlika wykazanej w guzie wykrywa się 10 minut po wstrzyknięciu substratu. Używając oprogramowania firmy Xeno Gen, ustaw czasy akwizycji obrazu w zakresie od jednej sekundy do 10 minut. Następnie wykonaj czarno-białe zdjęcia myszy oraz obrazy w pseudokolorach.Skala bioluminescencji została nałożona na te obrazy, aby zapewnić pomiar intensywności emisji światła. Aby myszy mogły zostać zakwalifikowane do kohorty badania przedklinicznego, muszą wykazywać wykrywalny sygnał bioluminescencji zarówno w pierwszym, jak i trzecim dniu po przeszczepieniu, a intensywność sygnału musi wzrosnąć między pierwszym a trzecim dniem. Przedstawiony tutaj jest typowy progresywny wzrost bioluminescencji obserwowany od 1 do 18 dnia po przeszczepieniu w prawidłowo ustanowionym ksenoprzeszczepie ortotopicznym u myszy nude.Zwróć uwagę na podobieństwo sygnałów wykrytych w obszarze zainteresowania u różnych myszy. Ponowne obrazowanie 10 i 18 dni po przeszczepieniu wykazuje, że sygnały bioluminescencyjne w miejscu przeszczepu sukcesywnie zwiększają się u poszczególnych myszy. Ilościowe oznaczenie sygnałów bioluminescencyjnych obserwowanych od 1 do 24 dni po przeszczepieniu pokazuje, że mimo stopniowego wzrostu tych sygnałów, wzrost guza wyraźnie przyspiesza w późniejszych etapach okresu badania.Biorąc pod uwagę agresywny wzrost M pns ts, przeszczepione komórki nowotworowe często przełamują naturalne bariery nerwu i naciekają sąsiednie tkanki. Ta mikrofotografia miejsca przeszczepu demonstruje wzrost guza oraz ogniskową inwazję do sąsiedniego mięśnia szkieletowego. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać przeprowadzona u jednej myszy w ciągu 10 minut.

orthotopic-xenografting-human-luciferase-tagged-malignant-peripheral

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ortotopowe przeszczepienie ludzkich komórek guzów osłonek nerwów obwodowych oznaczonych luciferase dla in vivo testowania kandydujących środków terapeutycznych

Ksenoprzeszczepy ludzkich guzów mózgu zmodyfikowane lucyferazą mogą być tworzone wewnątrzczaszkowo u myszy atymicznych, z późniejszym monitorowaniem wzrostu guza i odpowiedzi na terapię za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. W połączeniu z analizą przeżywalności, monitorowanie bioluminescencyjne stanowi niezbędne narzędzie badawcze w badaniach przedklinicznych terapii rozważanych w leczeniu guzów mózgu.

Tworzenie wewnątrzczaszkowych ksenograftów guzów mózgu z późniejszą analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego

W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.

In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Opisujemy zintegrowaną metodę precyzyjnej implantacji stereotaktycznej ludzkich komórek wielopostaciowego glejaka do mózgów myszy nago oraz następującego po niej seryjnego obrazowania in vivo w celu monitorowania wzrostu i odpowiedzi na leczenie powstałych ksenograftów.

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

Lepsze zrozumienie biologii raka trzustki jest niezwykle potrzebne, aby umożliwić opracowanie lepszych opcji terapeutycznych w leczeniu raka trzustki. Aby odpowiedzieć na tę potrzebę, demonstrujemy ortotopowy model raka trzustki, który umożliwia nieinwazyjne monitorowanie progresji raka za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo.

Bioluminescencyjny ortotopowy model progresji raka trzustki

Komórki glejaka GL261 dostarczają użytecznego immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie właściwych technik monitorowania wzrostu guza wewnątrzczaszkowego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo oraz zweryfikowanie użyteczności komórek GL261 zmodyfikowanych lucyferazą do badania immunologii guza i podejść immunoterapeutycznych w leczeniu glejaka.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka

Obrazowanie bioluminescencyjne jest dobrze znanym narzędziem do lokalizacji guzów i przerzutów, ale kwantyfikacja tych obrazów często wymaga skomplikowanych obliczeń i specjalnych instrumentów. Opisujemy łatwą w użyciu metodę luminoscore, opartą na precyzyjnych warunkach akwizycji, niewymagającą obliczeń i umożliwiającą monitorowanie obciążenia guzem i odpowiedzi na leczenie w modelach mysich.

Metoda kwantyfikacji guza oparta na bioluminescencji do monitorowania progresji guza i efektów leczenia w modelach chłoniaka myszy

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Tutaj używamy obrazowania bioluminescencyjnego, rentgenowskiego i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej, aby zbadać, jak hamowanie aktywności mTOR wpływa na guzy szpiczaka kostnego przeszczepionego szpiczakiem kostnym w modelu ksenoprzeszczepu. Pozwala to na fizjologicznie istotne, nieinwazyjne i multimodalne analizy działania przeciwszpiczaka mózgu terapii ukierunkowanych na guzy szpiczaka kostnego przeszczepione szpiczakiem kostnym in vivo.

Multimodalna bioluminescencyjna i pozytroniczna tomografia emisyjna/tomografia obliczeniowa ksenoprzeszczepów szpiczaka mnogiego szpiku kostnego u myszy NOG

Opisujemy intraparenchymalne przeszczepienie ludzkich nerwowych komórek progenitorowych transdukowanych podwójnym wektorem reporterowym wyrażającym lucyferazy-zielone białko fluorescencyjne (GFP) w mózgu myszy. Po przeszczepie sygnał lucyferazy jest wielokrotnie mierzony za pomocą bioluminescencji in vivo i przeszczepionych komórek wykazujących ekspresję GFP, identyfikowanych w sekcjach mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Głównym wyzwaniem przy opracowywaniu nowych terapii raka płuc jest modelowanie mikrośrodowiska guza w miarę postępu choroby regionalnej w kierunku choroby przerzutowej. Tutaj opisujemy prostą metodę ustanowienia ortotopowego modelu syngeneicznego raka płuc, który pozwala na śledzenie chorób in vivo w czasie.

Minimalnie inwazyjna metoda tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu myszy raka płuc

Neurofibromoza typu 1 (NF1) prowadzi do łagodnych guzów osłonki nerwowej obwodowej (neurofibromów), które wymagają specyficznego mikrośrodowiska nerwowego do wzrostu. Opracowano zoptymalizowany model ksenotransplanttu ortotopowego, wykorzystujący intraneuralne wstrzykiwanie ludzkich komórek Schwanna do myszy NSG. Model ten przypomina ludzkie neurofibromy i stanowi cenną platformę do oceny strategii terapeutycznych.

Ortotopowy ksenoprzeszczep nerwu kulszowego dla neurofibromozy typu 1

Poznaj metodę ortotopowego ksenoprzeszczepu komórek MPNST oznaczonych lucyferazą do nerwu kulszowego myszy immunodeficyjnych. Technika umożliwia testowanie in vivo potencjalnych środków terapeutycznych przy użyciu bioluminescencyjnego obrazowania.

Ortotopowy ksenoprzeszczep ludzkich złośliwych komórek nowotworowych osłonki nerwów obwodowych oznaczonych lucyferazą do testowania in vivo potencjalnych środków terapeutycznych (Wideo) | JoVE Journal

Ortotopowe ksenoprzeszczepy ludzkich komórek złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych znakowanych lucyferazą do testowania potencjalnych środków terapeutycznych in vivo

Przeglądaj więcej filmów