Wydajna transformacja mchu Physcomitrella patens za pośrednictwem glikolu polietylenowego (PEG)
19 kwietnia 2011
Opisana jest prosta i skuteczna metoda przekształcania protoplastów Physcomitrella pantens. Metoda ta została zaadaptowana z protoplastów Physocmitrella protonemal i transformacji protoplastów mezofilu Arabidopsis 1.
Ogólnym celem tej procedury jest przekształcenie protoplastów SCO Metre. Osiąga się to poprzez uprzednie trawienie roślin za pomocą Drizly. Następnie protoplasty przemywa się mannitolem w celu usunięcia kropli, a następnie inkubuje się je z DNA i kołkiem.
Na koniec przekształcone protoplasty rozprowadza się na płytkach i inkubuje. Ostatecznie można uzyskać wyniki. To pokazuje przekształcone protoplasty wyrażające fluorescencyjnie znakowane białka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej Demonstrując procedurę, będzie Y lu, doktor habilitowany z mojego laboratorium.
Główną zaletą tej techniki jest to, że jest skuteczna i konsekwentnie generuje protoplasty, które wyrażają interesujące białko Aby wyizolować mech Protoplasty zaczynają od dodania dziewięciu mililitrów 8% mannitolu do szalki Petriego za pomocą szpatułki Umieść pięcio- do siedmiodniowego mchu z dwóch do trzech PP NH cztery płytki w mannitolu. Prosimy o zapoznanie się z dołączonym pisemnym protokołem, aby uzyskać informacje na ten temat i dodatkowe receptury odczynników. Następnie dodaj trzy mililitry 2% drizly i inkubuj w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając przez godzinę.
Przefiltrować mieszaninę przez siatkę o wielkości 100 mikronów, aby uzyskać zieloną, jednorodną zawiesinę. Następnie wirować filtrat o stężeniu 250 G przez pięć minut. Usunąć supernatant bardzo delikatnie.
Zawiesić protoplasty w 500 mikrolitrach 8% mannitolu. Następnie dodaj dodatkowe 9,5 mililitra 8% mannitolu. Upewnij się, że protoplasty są całkowicie zawieszone.
Wykonaj kroki mycia jeszcze dwa razy, ponownie obracając roztwór o stężeniu 250 G przez pięć minut. Odrzucenie supernatantu i resus zawieszający protoplasty. Pierwszy w 500 mikrolitrach.
Następnie 9,5 mililitra 8% mannitolu za pomocą hemocytometru. Policz liczbę protoplastów w 10 mikrolitrach zawiesiny, aby przekształcić DNA w wyizolowane protoplasty. Najpierw wirować mieszaninę protoplastów w temperaturze 250 G przez pięć minut.
Usunąć supernatant zawiesić protoplasty w stężeniu 1,6 miliona na mililitr w roztworze MMG. Inkubować zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie dodaj 600 mikrolitrów roztworu protoplastów do probówki hodowlanej zawierającej 60 mikrogramów DNA. Trząść.
Delikatnie dodaj 700 mikrolitrów roztworu wapnia PEG i wstrząśnij. W tym okresie oczekiwania dobrze inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przykryj talerze PRMB celofanem.
Następnie rozcieńczyć zawiesinę trzema mililitrami roztworu W Five, wirować pod ciśnieniem 250 G przez pięć minut. Aby usunąć ponowne zawieszenie PEG, protoplasty w dwóch mililitrach PRMT płytki po jednym mililitrze na płytkę PRMB pokrytą celofanem. Trzymaj płytki w temperaturze 25 stopni Celsjusza w komorze wzrostowej.
Na koniec, cztery dni po przemianie, przenieś celofan na świeże płytki selekcyjne. Rysunek ten przedstawia przykład 18-dniowych roślin zregenerowanych z protoplastów, przekształconych za pomocą 15 mikrogramów super zwiniętego osocza, DNA, przenoszącego kasetę oporności na higromycynę. W tym przypadku 30 mikrogramów tego samego super zwijanego plazmidu, DNA, zostało przekształconych w protoplasty.
W tej próbce przekształcono 60 mikrogramów DNA w kratę. I wreszcie, rośliny te zostały zregenerowane z protoplastów, które zostały przekształcone za pomocą 120 mikrogramów tego samego super zwiniętego plazmowego DNA przenoszącego kasetę odporności na higromycynę. Na wydajność przemiany nie mają wpływu stężenia DNA do 60 mikrogramów.
Jednak wyższe stężenia DNA są szkodliwe dla tej procedury. Dane wskazują, że metoda ta zapewnia spójne wyniki w szerokim zakresie ilości DNA raz w semestrze. Tę technikę można wykonać w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po tej procedurze można wykonać dodatkowe metody, takie jak przejściowe RNAi i nokauty genów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące funkcji genów.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje prostą i wydajną metodę transformacji protoplastów Physcomitrella patens. Technika ta została opracowana na podstawie istniejących protokołów transformacji protoplastów i ma na celu uzyskanie powtarzalnych, pomyślnych wyników.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia roślin
- Inżynieria genetyczna
- Biologia komórki
Wstęp
- Protoplasty to komórki roślinne pozbawione ścian komórkowych.
- Techniki transformacji są niezbędne do badania funkcji genów u roślin.
- Physcomitrella patens służy jako organizm modelowy w badaniach nad roślinami.
- Istniejące metody transformacji protoplastów mogą być skomplikowane i czasochłonne.
Cel badania
- Aby dostarczyć usprawniony protokół transformacji protoplastów Physcomitrella patens.
- Aby zwiększyć wydajność i niezawodność transformacji protoplastów.
- Aby ułatwić dalsze badania genetyczne nad mchem.
Zastosowane metody
- Trawienie tkanki mchu za pomocą Drizly w celu izolacji protoplastów.
- Przemywanie protoplastów mannitolem w celu usunięcia zanieczyszczeń.
- Transformacja wyizolowanych protoplastów DNA przy użyciu PEG.
- Inkubacja transformowanych protoplastów na pożywkach selekcyjnych.
Główne wyniki
- Przetransformowane protoplasty skutecznie wyekspresowały białka fluorescencyjne.
- Metoda wykazała spójną wydajność transformacji przy różnych stężeniach DNA.
- Stwierdzono, że wyższe stężenia DNA działają niekorzystnie na powodzenie transformacji.
- Cała procedura może zostać ukończona w ciągu około trzech godzin.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia niezawodne podejście do transformacji protoplastów Physcomitrella patens.
- Umożliwia ona przeprowadzanie kolejnych eksperymentów, takich jak przejściowe RNAi oraz nokauty genów.
- Protokół ten może znacząco pomóc w zrozumieniu funkcji genów u mchów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Transformacja protoplastów Physcomitrella patens za pomocą PEG umożliwia wydajną i powtarzalną dostawę genów, wspierając wysokoprzepustową genomikę funkcjonalną w systemach roślinnych. Możliwość ta jest kluczowa dla zespołów zajmujących się wczesną fazą odkrywania, dążących do zbadania funkcji genów, walidacji celów oraz przyspieszenia wyjaśniania szlaków sygnałowych w modelu podatnym na modyfikacje genetyczne. Skalowalność i potencjał standaryzacji tej metody sprawiają, że jest ona cenna w kontekście screeningu genetycznego w całym portfolio oraz redukcji ryzyka mechanistycznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia szybką analizę funkcji genów poprzez efektywne dostarczanie DNA do komórek mchu.
- Wspiera wysokoczęstotliwościowe celowanie genowe w celu funkcjonalnej walidacji celów oraz analizy szlaków.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie precyzyjnych modyfikacji genetycznych w systemie modelowym.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do późniejszych hipotez biologicznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowany protokół generowania dużej liczby transformantów do testów przesiewowych.
- Gwarantuje powtarzalną wydajność transformacji, wspierając niezawodność i skalowalność testów.
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do oceny związków i przesiewu fenotypowego.
- Zmniejsza zależność od specjalistycznego sprzętu, zwiększając dostępność dla zespołów opracowujących testy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia prowadzenie dalszych analiz, takich jak przejściowe RNAi oraz badania nad knockoutem genów w kontekście modelowania chorób.
- Zapewnia ciągłość procesu od odkrywania genów po walidację przedkliniczną w systemach roślinnych.
- Stanowi platformę do poszukiwania biomarkerów translacyjnych w przypadku powiązania z szlakami istotnymi dla danej choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół transformacji wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do identyfikacji wiodących związków, umożliwiając manipulacje genetyczne, walidację celów oraz opracowywanie testów w modelach roślinnych.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez efektywne dostarczanie genów oraz analizę ich ekspresji.
- Przesiewy: Wspiera gotowość i powtarzalność testów poprzez generowanie jednolitych populacji transformantów.
- Analityka: Dostarcza wyników ilościowych, takich jak wydajność transformacji i poziom ekspresji białek, do celów analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Umożliwia prowadzenie badań genetycznych, które stanowią podstawę do opracowywania modeli przedklinicznych i identyfikacji biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje szeroko stosowalną, znormalizowaną możliwość transformacji dla różnorodnych badań genetycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad funkcją genów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność w procesach transformacji genetycznej.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową dzięki umożliwieniu generowania wiarygodnych danych na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów genetycznych i szlaków sygnałowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli komórkowych roślin oraz technik sterylnych w celu izolacji i transformacji protoplastów.
- Niezbędny jest dostęp do podstawowej infrastruktury laboratoryjnej, w tym do wirówki i mikroskopii fluorescencyjnej w celu walidacji wyników.
- Wymagana jest standaryzacja parametrów transformacji pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności w różnych projektach.
- Może być wymagana adaptacja metody do zastosowania u innych gatunków roślin lub w innych systemach modelowych poza Physcomitrella patens.
- Wydajność transformacji jest zależna od stężenia DNA, przy czym większe ilości mogą być szkodliwe.
