Name: Wydajna transformacja mchu Physcomitrella patens za pośrednictwem glikolu polietylenowego (PEG) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Poznaj efektywną transformację protoplastów mchu Physcomitrella patens za pomocą PEG. Ta metoda umożliwia niezawodne badanie funkcji genów w organizmach roślinnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L.V. jest wspierany przez NSF (IOS 1002837)

1. Przygotowanie protoplastów
<ol>
<li>Dodaj 9 mL 8% mannitolu do szalki Petriego.</li>
<li>Używając szpatułki, przenieś 7-dniowy mech z 2-3 płytek PPNH4 o średnicy 5 cm do szalki Petriego zawierającej mannitol.</li>
<li>Dodaj 3 mL 2% Driselase (Sigma D9515-25G) do szalki Petriego.</li>
<li>Inkubuj szalkę Petriego w temperaturze pokojowej przy łagodnym wstrząsaniu przez 1 godzinę.</li>
<li>Przefiltruj zawiesinę protoplastów przez sito o oczkach 10 μm (BD Falcon 352350).</li>
<li>Wiruj przefiltrowaną zawiesinę przy 250 g przez 5 minut. Usuń supernatant.</li>
<li>Resuspenduj protoplasty bardzo delikatnie w 500 μL 8% mannitolu.</li>
<li>Dodaj 9,5 mL 8% mannitolu do probówki kultury. Upewnij się, że protoplasty są w pełni zawieszone.</li>
<li>Powtórz etapy filtracji i resuspensji (1.6, 1.7 i 1.8) jeszcze dwa razy.</li>
<li>Pobierz 10 μL roztworu protoplastów i policz protoplasty w komorze countingowej (hemocytometrze).</li>
<li>Pomnóż liczbę protoplastów w obszarze 16 kwadratów przez 10 0, aby uzyskać liczbę protoplastów na mL (patrz Rysunek 1).</li>
</ol>
2. Transformacja
<ol>
<li>Centryfuguj zawiesinę protoplastów przy 250 g przez 5 minut. Usuń nadsącz.</li>
<li>Resuspenduj protoplasty w roztworze MMg do stężenia 1,6 miliona protoplastów / mL.</li>
<li>Inkubuj zawiesinę protoplastów w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
<li>Dodaj 60 μL zawiesiny protoplastów do probówki hodowlanej zawierającej 60 μg DNA. Delikatnie zamieszaj probówkę ruchem wirowym.</li>
<li>Dodaj 70 μL roztworu PEG/Ca do mieszaniny protoplastów i DNA. Delikatnie zamieszaj probówkę ruchem wirowym, aż cała mieszanina stanie się jednorodna.</li>
<li>Inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
<li>W czasie oczekiwania pokryj płytki PRM-B celofanem (krążki o średnicy 80 mm, A.A. Packaging Limited, UK); pozwól celofanowi nawodnić się na powierzchni płytki przez co najmniej 5 min.</li>
<li>Za pomocą szpatułki usuń pęcherzyki powietrza uwięzione między celofanem a płytką.</li>
<li>Rozcieńcz mieszaninę 3 mL roztworu W5.</li>
<li>Centryfuguj mieszaninę przy 250 g przez 5 minut. Usuń nadsącz.</li>
<li>Resuspenduj protoplasty w 2 mL roztopionego PRM-T (przed dodaniem do protoplastów roztwór ten można utrzymać w stanie ciekłym w temperaturze 42°C). Wysiej 1 mL resuspendowanych protoplastów na każdą płytkę PRM-B pokrytą celofanem. Owiń płytki taśmą Micropore (3M, Health Care). Przechowuj płytki w temperaturze 25°C w komorze wzrostowej.</li>
<li>Alternatywnie protoplasty można resuspendować w 1 mL ciekłej pożywki do wysiewu i wysiać 0,5 mL na płytkę PRM-B pokrytą celofanem. Pozwala to na szybszą regenerację, jednak liczba regenerujących się roślin jest mniejsza.</li>
<li>Komora wzrostowa jest ustawiona na cykl 16 godz. światła i 8 godz. ciemności.</li>
<li>Przenieś celofan na świeżą płytkę selekcyjną 4 dni po transformacji.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:
Przykład transformacji przedstawiono na Rysunku 2. DNA wykorzystane w tym przykładzie stanowił superzwinięty plazmid o rozmiarze 7,8 kb zawierający kasetę oporności na hygromycynę. Ilość wysianych protoplastów została zredukowana do 50% na potrzeby dokumentacji fotograficznej. Zdjęcia wykonano dwa tygodnie po przeniesieniu roślin na podłoża selekcyjne. Wydajność transformacji nie zmienia się przy stężeniach DNA do 60 μg. Wyższe stężenia DNA pogarszają wydajność transformacji. Dane wykazały, że metoda ta zapewnia powtarzalne wyniki w szerokim zakresie ilości DNA. Metoda ta pozwala również na skuteczne generowanie stabilnych transformantów, co przedstawiono w Tabeli 1; uzyskano około 4 stabilnych transformantów na mikrogram linearyzowanego DNA, co jest wynikiem znacznie wyższym niż raportowano wcześniej14.
Przetestowaliśmy również wpływ szoku termicznego na wydajność transformacji, przeprowadzając transformację superzwiniętym plazmidem zawierającym gen białka fluorescencyjnego jako marker. Szok termiczny wykonano 10 minut po inkubacji w temperaturze pokojowej (w ramach kroku 2.6), inkubując mieszaninę w kąpieli wodnej o temperaturze 45°C przez 3 minuty. Bezpośrednio po szoku termicznym mieszaninę inkubowano w kąpieli wodnej w temperaturze pokojowej przez 17 min. Wyniki zapisano 2 godziny po transformacji. Stosunki liczby transformantów uzyskanych z zastosowaniem i bez zastosowania szoku termicznego były bardzo podobne (~25%), jednak zaobserwowaliśmy niekorzystny wpływ szoku termicznego na żywotność protoplastów (dane nie przedstawiono).
<img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy siatki cząsteczkowej do analizy wielkości cząstek, skala 10 μm, metoda kalibracji siatki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Widok protoplastów w komorze countingowej. Sekcja niezbędna do liczenia protoplastów jest zaznaczona czerwonym kwadratem. Należy zwrócić uwagę na 16 kwadratów wymaganych do liczenia protoplastów (patrz pkt 1.1); na obrazie widoczna jest liczba 24 protoplastów (240 00 komórek/ml).
<img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig2.jpg" alt="Wzrost kolonii bakteryjnych na płytkach agarowych; badanie porównawcze; wyniki eksperymentu; analiza mikrobiologiczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Zdjęcia 18-dniowych transformantów przejściowych. Protoplasty poddano transformacji wskazaną ilością superzwiniętego plazmidu. A: 15μg; B: 30μg; C: 60μg; D: 120μg.
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Ilość DNA (μg)</td>
 <td>Wydajność (transformanty/μg DNA)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15, superzwinięty plazmid</td>
 <td>120±24</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30, superzwinięty plazmid</td>
 <td>145±54</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60, superzwinięty plazmid</td>
 <td>121±60</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>120, superzwinięty plazmid</td>
 <td>71±38</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60, zlinearyzowany plazmid</td>
 <td>4±1</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Wydajność transformacji przy różnych ilościach DNA.

<ol><li>Abel, S., Theologis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+Arabidopsis+leaf+protoplasts%3A+a+versatile+experimental+system+to+study+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression.</a> Plant J. 5, 421-427 (1994).</li>
<li>Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryophytes+as+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bryologist%22%5BJournal%5D)">Bryophytes as model systems.</a> Bryologist. 103, 128-133 (2000).</li>
<li>Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant J. 11, 1195-1206 (1997).</li>
<li>Schaefer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in Physcomitrella patens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).</li>
<li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).</li>
<li>Cove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The moss Physcomitrella patens.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).</li>
<li>Kamisugi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%3A+homologous+recombination%2C+concatenation+and+multiple+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration.</a> Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formin-mediated+actin-filament+elongation+is+essential+for+polarized+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).</li>
<li>Sawahel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+DNA+into+Physcomitrella+protonemal+tissue+by+using+the+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun.</a> Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).</li>
<li>Schaefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).</li>
<li>Cho, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+bombardment+mediated+transformation+and+GFP+expression+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).</li>
<li>Ashton, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bryophyte+Physcomitrella+patens+replicates+extrachromosomal+transgenic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements.</a> New Phytol. 146, 391-402 (2000).</li>
<li>Hohe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+and+highly+standardized+transformation+procedure+allows+efficient+production+of+single+and+multiple+targeted+gene-knockouts+in+a+moss%2C+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens.</a> Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+is+essential+for+tip+growth+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Metoda przedstawiona w niniejszej pracy umożliwia prostą i powtarzalną transformację DNA do protoplastów Physcomitrella patens. Metoda ta została pierwotnie opracowana dla Arabidopsis1, jednak tutaj wykazaliśmy, że sprawdza się ona w przypadku protoplastów Physcomitrella patens, czyli rośliny prostszej i odmiennej. W związku z tym metodę tę można zastosować do innych gatunków roślin po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji. Możliwe modyfikacje w celu optymalizacji obejmują stężenie protoplastów w MMg, czas inkubacji w MMg oraz w roztworze PEG/Ca. W rutynowych eksperymentach zdecydowaliśmy się na użycie 60 μg DNA, ponieważ liczba transformantów rośnie liniowo wraz ze stężeniem DNA aż do tego poziomu (Tabela 1). Dzięki jednej transformacji z użyciem 60 μg DNA uzyskaliśmy około 7000 transformantów przejściowych lub 200 transformantów stabilnych, co pozwala na dalszy screening i analizę dużej populacji roślin.
Przekształcone protoplasty można rozsiać w płynnej pożywce do platerowania lub PRM-T. Choć wydajność regeneracji jest niższa przy zastosowaniu płynnej pożywki do platerowania, wybieramy tę metodę w przypadku przekształcania protoplastów za pomocą superzwiniętych plazmidów. Jak pokazano w Tabeli 1, transformacje przeprowadzone z użyciem superzwiniętego DNA plazmidowego generują znacznie więcej transformantów, dzięki czemu nadal możemy uzyskać dużą liczbę roślin przy zastosowaniu płynnej pożywki. Ponadto rozsiewanie protoplastów w płynnej pożywce umożliwia szybszą regenerację, co jest istotne w eksperymentach obejmujących fenotypy przejściowe, takich jak doświadczenia z wyciszaniem genów RNAi9,15. Dodatkowo brak agaru powierzchniowego ułatwia izolację roślin do immunobarwienia i RT-PCR9,15.

<table><tbody><tr><td>PPNH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>1,84 mM KH2PO4&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 3,4 mM Ca(NO₃)₂&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 1 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 2,72 mM tartrynianu diamonu&lt;br/&gt; 54 &amp;#x03BC;M FeSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 9.93 &amp;#x03BC;M H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 1.97 &amp;#x03BC;M MnCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;Opisano prostą i wydajną metodę transformacji protoplastów *Physcomitrella patens*. Metoda ta została zaadaptowana z protokołów transformacji protoplastów protonemialnych *Physcomitrella* oraz protoplastów mezofylu *Arabidopsis*1. Dzięki zdolności do wydajnej mitotycznej rekombinacji homologicznej, *Physcomitrella patens* stała się w ostatnich latach ważnym systemem modelowym2. Zdolność ta pozwala na osiągnięcie wysokiej częstotliwości celowania w geny3-9, czego nie obserwuje się u innych roślin modelowych, takich jak *Arabidopsis*. Aby w pełni wykorzystać ten system, niezbędna jest skuteczna i łatwa metoda wprowadzania DNA do komórek mchu. Najczęstszymi sposobami transformacji tego mchu są bombardowanie cząsteczkami10 oraz pobieranie DNA za pośrednictwem PEG11. Chociaż bombardowanie cząsteczkami może zapewnić wysoką wydajność transformacji12, pistolety genowe nie są łatwo dostępne dla wielu laboratoriów, a protokół jest trudny do standaryzacji. Z drugiej strony transformacja za pośrednictwem PEG nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być przeprowadzona w każdym laboratorium posiadającym komorę z laminarnym przepływem powietrza. W niniejszej pracy przedstawiamy prostą i wysoce wydajną metodę transformacji protoplastów mchu. Metoda ta pozwala na uzyskanie ponad 120 przejściowych transformantów na mikrogram DNA, co stanowi poprawę względem najwydajniejszego protokołu opisanego wcześniej13. Ze względu na prostotę, wydajność i powtarzalność, metoda ta może być stosowana zarówno w projektach wymagających dużej liczby transformantów, jak i w rutynowej transformacji.&gt; 0.23 &amp;#x03BC;M CoCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 0.19 &amp;#x03BC;M ZnSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;7 h&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 0.22 &amp;#x03BC;M CuSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;5h&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;Opisano prostą i wydajną metodę transformacji protoplastów *Physcomitrella patens*. Metoda ta została opracowana na podstawie protokołów transformacji protoplastów protonemialnych *Physcomitrella* oraz protoplastów mezofylu *Arabidopsis*1. Ze względu na zdolność do wydajnej mitotycznej rekombinacji homologicznej, *Physcomitrella patens* stała się w ostatnich latach ważnym systemem modelowym2. Zdolność ta umożliwia osiągnięcie wysokiej częstotliwości celowania genowego3-9, czego nie obserwuje się u innych roślin modelowych, takich jak *Arabidopsis*. Aby w pełni wykorzystać ten system, niezbędna jest skuteczna i łatwa metoda wprowadzania DNA do komórek mchu. Najczęstszymi sposobami transformacji tego mchu są bombardowanie cząsteczkami10 oraz pobór DNA zapśredniczony przez PEG11. Chociaż bombardowanie cząsteczkami może zapewnić wysoką wydajność transformacji12, pistolety genowe nie są łatwo dostępne dla wielu laboratoriów, a sam protokół jest trudny do standaryzacji. Z drugiej strony transformacja zapśredniczona przez PEG nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być przeprowadzona w każdym laboratorium wyposażonym w komorę z laminarnym przepływem powietrza. Przedstawiamy prostą i wysoce wydajną metodę transformacji protoplastów mchu. Metoda ta pozwala na uzyskanie ponad 120 przejściowych transformantów na mikrogram DNA, co stanowi udoskonalenie w stosunku do najwydajniejszego protokołu opisanego do tej pory13. Dzięki swojej prostocie, wydajności i powtarzalności metoda ta może być stosowana zarówno w projektach wymagających dużej liczby transformantów, jak i w rutynowej transformacji.&gt; 0.10 &amp;#x03BC;M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 0.168 &amp;#x03BC;M KI&lt;Opisano prostą i wydajną metodę transformacji protoplastów *Physcomitrella patens*. Metoda ta została zaadaptowana z protokołów transformacji protoplastów protonemów *Physcomitrella* oraz protoplastów mezofylu *Arabidopsis*1. Ze względu na zdolność do wydajnej mitotycznej rekombinacji homologicznej, *Physcomitrella patens* stała się w ostatnich latach ważnym systemem modelowym2. Zdolność ta umożliwia wysoką częstotliwość celowania genowego3-9, co nie występuje w innych roślinach modelowych, takich jak *Arabidopsis*. Aby w pełni wykorzystać ten system, niezbędna jest skuteczna i łatwa metoda wprowadzania DNA do komórek mchu. Najpowszechniejszymi sposobami transformacji tego mchu są bombardowanie mikropociskami10 oraz pobieranie DNA za pośrednictwem PEG11. Chociaż bombardowanie mikropociskami może zapewnić wysoką wydajność transformacji12, pistolety genowe nie są powszechnie dostępne w wielu laboratoriach, a protokół jest trudny do standaryzacji. Z drugiej strony, transformacja za pośrednictwem PEG nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być przeprowadzona w każdym laboratorium wyposażonym w komorę z laminarnym przepływem powietrza. W niniejszej pracy przedstawiamy prostą i wysoce wydajną metodę transformacji protoplastów mchu. Metoda ta pozwala na uzyskanie ponad 120 przejściowych transformantów na mikrogram DNA, co stanowi poprawę w stosunku do najwydajniejszego protokołu opisanego wcześniej13. Ze względu na prostotę, wydajność i powtarzalność metoda ta może być stosowana zarówno w projektach wymagających dużej liczby transformantów, jak i w rutynowej transformacji.&gt; Do pożywki stałej dodać 0,7% agaru.</td></tr><tr><td>PRM-B</td><td></td><td></td><td>PPNH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; z 6% mannitolem i 0,8% agarem. Dodać 10 ml 1M CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; do 1 l przed wylaniem płyt. </td></tr><tr><td>PRM-T</td><td></td><td></td><td>PPNH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; z 6% mannitolem i 0,6% agarem. Dodać 0,5 ml 1M CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; do 50 ml przed użyciem.</td></tr><tr><td>Krajowe podłoże płynne</td><td></td><td></td><td>PPNH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; z 8,5% mannitolem bez agaru. Dodać 0,5 ml 1M CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; do 50 ml przed użyciem.</td></tr><tr><td>2% Driselase</td><td></td><td></td><td>Do 200 ml 8% mannitolu dodać 4 g Driselase (Sigma D9515-25G). Mieszać delikatnie przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować przez 30 min w temperaturze 4°C.&amp;deg;C i delikatnie mieszaj przez 5 min w temperaturze pokojowej. Wirować przy 2 500 g przez 10 min, a następnie odrzucić osad. Przefiltrować przez filtr 0,22 &amp;#x03BC;m, a następnie przechowywać w zamrożonych aliquotach po 10 ml. Przed użyciem rozmrozić w kąpieli wodnej o temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>MMg</td><td></td><td></td><td>0,4 M mannitolu&lt;br/&gt; 15 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 4 mM MES (pH 5,7)</td></tr><tr><td>PEG/Ca2+</td><td></td><td></td><td>4 g PEG4000&lt;Opisano prostą i wydajną metodę transformacji protoplastów *Physcomitrella patens*. Metoda ta została zaadaptowana z protokołów transformacji protoplastów protonemów *Physcomitrella* oraz protoplastów mezofylu *Arabidopsis*1. Dzięki zdolności do efektywnej mitotycznej rekombinacji homologicznej, *Physcomitrella patens* stała się w ostatnich latach istotnym systemem modelowym2. Zdolność ta pozwala na osiągnięcie wysokiej częstotliwości celowania genów3-9, czego nie obserwuje się u innych roślin modelowych, takich jak *Arabidopsis*. Aby w pełni wykorzystać ten system, niezbędna jest skuteczna i łatwa metoda dostarczania DNA do komórek mchu. Najczęstszymi sposobami transformacji tego mchu są bombardowanie cząsteczkami10 oraz pobieranie DNA wspomagane przez PEG11. Chociaż bombardowanie cząsteczkami może zapewnić wysoką wydajność transformacji12, pistolety genowe nie są powszechnie dostępne w wielu laboratoriach, a sam protokół jest trudny do standaryzacji. Z drugiej strony, transformacja wspomagana przez PEG nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być przeprowadzona w każdym laboratorium wyposażonym w komorę z laminarnym przepływem powietrza. Przedstawiamy tutaj prostą i wysoce wydajną metodę transformacji protoplastów mchu. Metoda ta pozwala uzyskać ponad 120 przejściowych transformantów na mikrogram DNA, co stanowi poprawę w stosunku do najwydajniejszego protokołu opisanego wcześniej13. Ze względu na prostotę, wydajność i powtarzalność, metoda ta może być stosowana zarówno w projektach wymagających dużej liczby transformantów, jak i w rutynowej transformacji.&gt; 3 ml H2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;Opisano prostą i wydajną metodę transformacji protoplastów *Physcomitrella patens*. Metoda ta została opracowana na podstawie protokołów transformacji protoplastów protonemialnych *Physcomitrella* oraz protoplastów mezoﬁlu *Arabidopsis*1. Ze względu na zdolność do wydajnej mitycznej rekombinacji homologicznej, *Physcomitrella patens* stała się w ostatnich latach istotnym systemem modelowym2. Zdolność ta umożliwia uzyskanie wysokiej częstotliwości celowania w geny3-9, czego nie obserwuje się u innych roślin modelowych, takich jak *Arabidopsis*. Aby w pełni wykorzystać ten system, niezbędna jest skuteczna i łatwa metoda wprowadzania DNA do komórek mchu. Najczęstszymi sposobami transformacji tego mchu są bombardowanie cząstkami10 oraz pobieranie DNA za pośrednictwem PEG11. Chociaż bombardowanie cząstkami może zapewnić wysoką wydajność transformacji12, pistolety genowe nie są łatwo dostępne dla wielu laboratoriów, a protokół ten jest trudny do standaryzacji. Z drugiej strony, transformacja za pośrednictwem PEG nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być przeprowadzona w każdym laboratorium wyposażonym w komorę z laminarnym przepływem powietrza. Przedstawiamy tutaj prostą i wysoce wydajną metodę transformacji protoplastów mchu. Metoda ta pozwala na uzyskanie ponad 120 przejściowych transformantów na mikrogram DNA, co stanowi poprawę w stosunku do najwydajniejszego protokołu zgłoszonego wcześniej13. Ze względu na prostotę, wydajność i powtarzalność, metoda ta może być stosowana zarówno w projektach wymagających dużej liczby transformantów, jak i w rutynowej transformacji.&gt; 2,5 ml 0,8 M mannitolu&lt;br/&gt; 1 ml 1M CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>W5</td><td></td><td></td><td>154 mM NaCl&lt;br/&gt; 125 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 5 mM KCl&lt;br/&gt; 2 mM MES (pH 5,7) </td></tr></tbody></table>

efektywna transformacja mchu physcomitrella patens za pomocą glikolu polietylenowego (peg)

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

Opisano prostą i wydajną metodę transformacji protoplastów Physcomitrella patens. Metoda ta została zaadaptowana z protokołów transformacji protoplastów protonemialnych Physcomitrella oraz protoplastów mezofylu Arabidopsis1. Dzięki zdolności do efektywnej mitotycznej rekombinacji homologicznej, Physcomitrella patens stała się w ostatnich latach ważnym systemem modelowym2. Zdolność ta umożliwia wysoką częstotliwość celowania w geny3-9, co nie występuje w innych roślinach modelowych, takich jak Arabidopsis. Aby w pełni wykorzystać ten system, potrzebna jest skuteczna i łatwa metoda dostarczania DNA do komórek mchu. Najczęstszymi sposobami transformacji tego mchu są bombardowanie cząsteczkami10 oraz pobieranie DNA za pośrednictwem PEG11. Chociaż bombardowanie cząsteczkami może zapewnić wysoką wydajność transformacji12, pistolety genowe nie są łatwo dostępne dla wielu laboratoriów, a protokół ten jest trudny do standaryzacji. Z drugiej strony transformacja za pośrednictwem PEG nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być przeprowadzona w każdym laboratorium wyposażonym w sterylną komorę z laminarnym przepływem powietrza. W niniejszej pracy przedstawiamy prostą i wysoce wydajną metodę transformacji protoplastów mchu. Metoda ta pozwala na uzyskanie ponad 120 transformantów przejściowych na mikrogram DNA, co stanowi poprawę względem najwydajniejszego protokołu opisanego wcześniej13. Ze względu na prostotę, wydajność i powtarzalność, metoda ta może być stosowana zarówno w projektach wymagających dużej liczby transformantów, jak i w rutynowej transformacji.

Opisano prostą i wydajną metodę transformacji protoplastów Physcomitrella pantens. Metoda ta została zaadaptowana z protokołów transformacji protoplastów protonemialnych Physocmitrella oraz protoplastów mezofilu Arabidopsis1.

Efektywna transformacja mchu Physcomitrella patens za pomocą glikolu polietylenowego (PEG)

Opisano prostą i wydajną metodę transformacji protoplastów *Physcomitrella patens*. Metoda ta została dostosowana z protokołów dla *Physcomitrella* ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest transformacja protoplastów SCO Metre. Jest to realizowane poprzez wstępne trawienie roślin za pomocą Drizly. Następnie protoplasty są płukane mannitolem w celu usunięcia Drizly, a następnie inkubowane z DNA i peg.Na koniec przekształcone protoplasty roznosi się na płytki i inkubuje. W rezultacie można uzyskać obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, ukazujące przekształcone protoplasty wykazujące ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie. Procedurę tę zademonstruje Y lu, postdoc z mojego laboratorium.Główną zaletą tej techniki jest jej skuteczność oraz powtarzalność w generowaniu protoplastów wykazujących ekspresję białka zainteresowania. Aby wyizolować protoplasty mchu, należy rozpocząć od dodania szpatułką dziewięciu mililitrów 8% mannitolu do szalki Petriego. Następnie do mannitolu należy przenieść mch z dwóch do trzech płytek PP NH 4 w wieku od pięciu do siedmiu dni. Przepis przygotowania tego oraz dodatkowych odczynników znajduje się w załączonym protokole pisemnym. Następnie należy dodać trzy mililitry 2% drisly i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, delikatnie wstrząsając.Przefiltruj mieszaninę przez sito o oczkach 100 micron, aby uzyskać zieloną, jednorodną zawiesinę. Następnie wiruj filtrat z prędkością 250 G przez pięć minut. Bardzo ostrożnie odlej nadsącz.Resuspendować protoplasty w 500 µL 8% mannitolu. Następnie dodać kolejne 9,5 ml 8% mannitolu. Upewnić się, że protoplasty są w pełni zawieszone.Powtórz etapy płukania jeszcze dwa razy, ponownie wirując roztwór przy 250 G przez pięć minut. Odlej supernatant i ponownie zresuspenduj protoplasty, najpierw w 500 µL.Następnie należy dodać 9,5 mililitrów 8% mannitolu, korzystając z cytometru hematologicznego. Należy policzyć liczbę protoplastów w 10 mikrolitrach zawiesiny, aby wprowadzić DNA do wyizolowanych protoplastów. W pierwszej kolejności należy odwirować mieszaninę protoplastów przy 250 G przez pięć minut.Usunąć supernatant i resuspendować protoplasty w roztworze MMG do stężenia 1,6 miliona na mililitr. Inkubować zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie dodać 600 µL roztworu protoplastów do probówki z hodowlą zawierającej 60 µg DNA. Wstrząsnąć.Ostrożnie dodaj 700 µL roztworu PEG z wapniem i wymieszaj. Przez ten czas inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przykryj płytki PRMB folią celofanową.Następnie rozcieńczyć zawiesinę trzema mililitrami roztworu W5 i wirować przy 250 G przez pięć minut. Aby usunąć PEG, resuspender protoplasty w dwóch mililitrach PRMT i wysiać jeden mililitr na płytkę PRMB przykrytą celofanem. Przechowywać płytki w temperaturze 25 °C w komorze wzrostowej.Wreszcie, cztery dni po transformacji, przenieś celofan na świeże płytki selekcyjne. Rysunek ten przedstawia przykład 18-dniowych roślin zregenerowanych z protoplastów, które poddano transformacji 15 µg superzwiniętego plazmidowego DNA zawierającego kasetę oporności na hygromycynę. W tym przypadku do protoplastów wprowadzono 30 µg tego samego superzwiniętego plazmidowego DNA.W tej próbce przeprowadzono transformację za pomocą 60 µg kolistego DNA. Ostatecznie rośliny te zregenerowano z protoplastów, które poddano transformacji 120 µg tego samego superzwiniętego plazmidowego DNA zawierającego kasetę oporności na hygromycynę. Wydajność transformacji nie zmienia się przy stężeniach DNA do 60 µg.Jednakże wyższe stężenia DNA są niekorzystne dla tej procedury. Dane wskazują, że metoda ta dostarcza spójnych wyników w szerokim zakresie ilości DNA w ciągu jednego semestru. Technika ta może zostać przeprowadzona w trzy godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować dodatkowe metody, takie jak przejściowe RNAi oraz nokaut genów, aby odpowiedzieć na kolejne pytania dotyczące funkcji genów.

efficient-polyethylene-glycol-peg-mediated-transformation-moss

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Skuteczną transformację mechów Physcomitrella patens z wykorzystaniem glikolu polietylenowego (PEG)

Protokół opisuje ekspresję białek z wykorzystaniem drożdży metylotroficznych Pichia pastoris. Przeprowadzono również przygotowanie elektrokompetentnych komórek drożdży, transformację wektora z genem zainteresowania do P. pastoris oraz oczyszczanie DNA drożdży. Ostatnie etapy tego protokołu ekspresji białek stanowią analiza Western blot oraz oczyszczanie białek.

Ekspresja białek rekombinowanych w metylotropowych drożdżach Pichia pastoris

Niniejszy artykuł opisuje transformację genetyczną jednokomórkowej morskiej algi Ostreococcus tauri za pomocą elektroporacji. Ten organizm eukariotyczny stanowi efektywną platformę modelową dla roślin wyższych, posiadając znacznie zredukowaną złożoność genomową i komórkową oraz będąc łatwo podatnym na hodowlę komórkową i biologię chemiczną.

Transformacja genomiczna piko-eukarionta Ostreococcus tauri

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Opisujemy solidną strategię wymiany genów w celu genetycznego manipulowania grzybem Ustilago maydis. Ten protokół wyjaśnia, jak generować mutanty delecji w celu zbadania fenotypów infekcji. Można go rozszerzyć o modyfikację genów w dowolny sposób, np. poprzez dodanie sekwencji kodującej znacznik białka fluorescencyjnego.

Manipulacja genetyczna patogenu roślinnego Ustilago maydis w celu zbadania biologii grzybów i interakcji mikroorganizmów roślinnych

Opracowaliśmy prosty i efektywny protokół do przygotowania dużych ilości protoplastów soi do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach.

Prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium za pomocą metody zanurzania kwiatów może być z powodzeniem wykorzystana do stworzenia stabilnych linii transgenicznych modelu ekstremofitu Schrenkiella parvula. Przedstawiamy protokół zmodyfikowany w stosunku do tego dla Arabidopsis thaliana, biorąc pod uwagę różne nawyki wzrostu i cechy fizjologiczne ekstremofitu.

Wzrost roślin i przemiana kwiatowa za pośrednictwem Agrobacterium ekstremofitu Schrenkiella parvula

Tutaj prezentujemy protokół o wysokiej przepustowości do przejściowego transfekcji milionów protoplastów kukurydzy do testowania dużych bibliotek plazmidów w komórkach mezofilu kukurydzy.

Skalowalna transfekcja protoplastów mezofilu kukurydzy

Ten protokół opisuje wykorzystanie transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (AMT) do integracji interesujących genów z genomem jądrowym zielonej mikroalgi Chlorella vulgaris, co prowadzi do produkcji stabilnych transformantów.

Inżynieria genetyczna zielonych mikroalg za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, Chlorella vulgaris

Przedstawiamy prosty, skuteczny i powtarzalny protokół transformacji Phytophthora palmivora, pośredniczonego przez Agrobacterium, który jest również stosowany do P. capsici.

Uproszczona metoda transformacji Phytophthora palmivora za pośrednictwem bakterii agrobakterii

Uprawa niektórych odmian lnu w warunkach stresu nutrientowego prowadzi do zmienności genomicznej w obrębie określonej części genomu oraz do zmienności fenotypowej. Złożona insercja w konkretnym miejscu jest powiązana z wzrostem w różnych reżimach odżywczych oraz ze zmianami w ekspresji genów w obrębie tego miejsca.

Indukowane środowiskowo dziedziczne zmiany u lnu

Poznaj efektywną transformację protoplastów mchu Physcomitrella patens za pomocą PEG. Ta metoda umożliwia niezawodne badanie funkcji genów w organizmach roślinnych.

Efektywna transformacja mchu Physcomitrella patens za pomocą glikolu polietylenowego (PEG)

Przeglądaj więcej filmów