Name: NanoDrop Mikroobjętość ilościowa kwasów nukleinowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Poznaj metody ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych przy użyciu spektrofotometrów NanoDrop 2000 C i NanoDrop 3300. Technologia mikroobjętościowa umożliwia pomiar zaledwie jednego mikrolitra próbki bez konieczności rozcieńczania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Richard W. Beringer i David L. Ash, naukowcy aplikacyjni z działu produktów Thermo Scientific NanoDrop, za pomoc techniczną i udział w filmowaniu.

1. Ilościowe oznaczanie kwasów nukleinowych w mikroobjętościach przy użyciu spektrofotometru NanoDrop 2000c
<ol>
<li>W celu rozpoczęcia należy oczyścić górną i dolną powierzchnię optyczną systemu utrzymującego próbkę w spektrofotometrze mikroobjętościowym, pipetując od 2 do 3 μL czystej wody dejonizowanej na dolną powierzchnię optyczną.</li>
<li>Zamknij ramię dźwigni, upewniając się, że górny piedestał styka się z wodą dejonizowaną. Podnieś ramię dźwigni i przetrzyj obie powierzchnie optyczne czystą, suchą, niepozostawiającą włókien chusteczką laboratoryjną.</li>
<li>Uruchom oprogramowanie NanoDrop i wybierz aplikację Nucleic Acid. Używając skalibrowanego pipetora do małych objętości, wykonaj pomiar tła (blank), nanosząc 1 μL buforu na dolną powierzchnię optyczną. Obniż ramię dźwigni i wybierz opcję „Blank” (Karta pustego pomiaru) w aplikacji Nucleic Acid (Kwasów nukleinowych).</li>
<li>Po zakończeniu pomiaru tła należy oczyścić obie powierzchnie optyczne za pomocą czystej, suchej i beztroskiej chusteczki laboratoryjnej.</li>
<li>Wybierz odpowiednią stałą dla próbki, która ma zostać zmierzona. 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Typ próbki</td>
 <td>Wybierz opcję</td>
 <td>Stała używana do obliczania stężenia </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dwuniciowe DNA</td>
 <td>DNA-50</td>
 <td>50</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ssDNA</td>
 <td>DNA-33</td>
 <td>33</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA</td>
 <td>RNA-40</td>
 <td>40</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oligonukleotyd</td>
 <td>Niestandardowy</td>
 <td>15-150</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 Tabela 1. Typowe zakresy stężeń kwasów nukleinowych dla bezpośrednich pomiarów absorbancji przy 280 nm z użyciem mikrowolumenowego spektrofotometru NanoDrop, tradycyjnego spektrofotometru z kuwetą przy zastosowaniu mikrokuwety TrayCell oraz mikrowolumenowego fluorospektrometru NanoDrop w połączeniu z testem PicoGreen.
</li>
<li>Odmiěř 1 μL próbki kwasu nukwinowego na dolny postument optyczny i zamknąć ramię dźwigni. Ponieważ pomiar jest niezależny od objętości, próbka musi jedynie wypełnić przerwę między dwiema powierzchniami optycznymi, aby pomiar mógł zostać wykonany.</li>
<li>Wybierz opcję „Measure” (Pomiar) w oprogramowaniu aplikacji. Program automatycznie obliczy stężenie kwasów nukleinowych oraz współczynniki czystości. Po pomiarze próbki sprawdź uzyskane widmo.</li>
<li>Oprogramowanie automatycznie obliczy stężenie kwasów nukleinowych oraz współczynniki czystości. Po pomiarze próbki należy przeanalizować obraz widma w celu oceny jakości próbki.</li>
<li>Typowa próbka kwasów nukleinowych będzie miała bardzo charakterystyczny profil. 
<img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Wykres widma absorpcyjnego kwasów nukleinowych, 230-340 nm, piki przy 260 nm; wynik spektroskopii UV-Vis." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Typowa próbka kwasów nukleinowych będzie charakteryzować się bardzo charakterystycznym profilem.</li>
<li>Typowe źródła zanieczyszczeń związanych z konkretnymi technikami izolacji kwasów nukleinowych obejmują ekstrakcję fenolem/Trizolem oraz ekstrakcję kolumnową. W przypadku ekstrakcji fenolem/Trizolem zanieczyszczenie pozostałościami odczynników może być wskazane przez nieprawidłowe widma w zakresie od 220 do 240 nm, a także przez przesunięcia w obszarze od 260 do 280 nm. Z kolei pozostałości guanidyny z ekstrakcji kolumnowej mogą przyczyniać się do powstania piku w pobliżu 230 nm oraz przesunięcia minimum z 230 nm do około 240 nm. 
<img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Wykres widm absorpcyjnych kwasów nukleinowych; porównanie z efektami zanieczyszczenia guanidyną i fenolem." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Przesunięcia maksimów i minimów w próbkach B i C w porównaniu z próbką A obrazują, w jaki sposób zanieczyszczenia mogą wpływać na widma próbek kwasów nukleinowych.</li>
<li>Aby dokładnie ocenić jakość próbki, stosunki 260/280 lub 260/230 należy analizować w połączeniu z ogólną jakością widma. Czyste kwasy nukleinowe dają zazwyczaj stosunek 260/280 wynoszący odpowiednio ok. 1,8 dla DNA i ok. 2,0 dla RNA. Stosunek ten jest zależny od pH oraz siły jonowej buforu wykorzystanego do pomiarów próbki i próby blank. Roztwory kwasowe zaniżają stosunek o 0,2–0,3, natomiast roztwory zasadowe zawyżają go o 0,2–0,3. Istotne odchylenia w stosunkach czystości mogą wskazywać na obecność białek, fenolu lub innych zanieczyszczeń, które silnie absorbują światło przy 280 nm lub w pobliżu tej długości fali. Stosunek czystości 260/230 jest drugim miernikiem czystości DNA, a wartości dla „czystych” kwasów nukleinowych mieszczą się zazwyczaj w zakresie 1,8–2,2. Stosunki czystości znacznie niższe od wartości oczekiwanych mogą wskazywać na konieczność dalszej optymalizacji zastosowanej techniki izolacji.</li>
<li>Spektrofotometry NanoDrop mogą być również wykorzystywane do oznaczania ilości białek przy użyciu bezpośredniego pomiaru absorbancji lub kolorymetrycznych testów białkowych. Aby zapewnić prawidłowe formowanie się kolumny oraz powtarzalność, 2-μl zalecane jest stosowanie próbek białek. Należy zapoznać się z następującym filmem JoVE: Microvolume Protein Concentration Determination Using the NanoDrop Spectrophotometer <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">**Analiza obrazów z mikroskopii konfokalnej**

**Streszczenie**
Mikroskopia konfokalna jest potężnym narzędziem do obrazowania próbek biologicznych, ponieważ pozwala na uzyskanie wysokiej rozdzielczości obrazów w trzech wymiarach poprzez eliminację światła spoza płaszczyzny ogniskowania. Jednakże samo wykonanie obrazowania to tylko pierwszy etap; kluczowym elementem jest późniejsza analiza danych w celu wyciągnięcia naukowych wniosków. W tym filmie przedstawiono podstawowe zasady i techniki analizy obrazów z mikroskopii konfokalnej przy użyciu oprogramowania ImageJ. Omówiono procesy takie jak kalibracja, ustawianie progu (thresholding), analiza obszarów i intensywności fluorescencji oraz techniki kolokalizacji, które pozwalają na precyzyjną kwantyfikację danych biologicznych z obrazów mikroskopowych.

**Słowa kluczowe**
mikroskopia konfokalna, obrazowanie, ImageJ, analiza obrazu, kolokalizacja, fluorescencja, kwantyfikacja, przetwarzanie obrazów, mikroskopia laserowa, biologia komórki</a></li>
</ol>
2. Wysokoczułe oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych w mikroobjętościach przy użyciu fluorospektrometru NanoDrop 3300
<ol>
<li>W celu zademonstrowania wysokoczułego ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych w mikroobjętościach przy użyciu NanoDrop 3300 stosuje się zestaw do fluorescencji PicoGreen. Na początek należy doprowadzić standardy z zestawu oraz wszystkie próbki kwasów nukleinowych do temperatury pokojowej. Próbki fluorescencyjne są światłoczułe i powinny być przechowywane w probówkach bursztynowych lub owiniętych folią aluminiową.</li>
<li>Należy przygotować odpowiednią ilość buforu 1x TE dla wszystkich mierzonych standardów i próbek, a także dla niezbędnego roztworu roboczego PicoGreen. Bufor 1x TE przygotowuje się poprzez rozcieńczenie dostarczonego buforu 20x TE wodą wolną od nukleaz zgodnie z protokołem producenta. Objętości reakcji mogą wynosić od 200 μL do nawet 10 μL. W niniejszym przykładzie przygotowane zostaną reakcje o objętości 10 μL.</li>
<li>W probówkach lub fiolkach wolnych od nukleaz należy przygotować seryjne rozcieńczenia standardów dsDNA o stężeniu dwukrotnie wyższym niż końcowe pożądane stężenie. Przenieść 5 μL każdego z rozcieńczonych standardów dsDNA do oddzielnej, oznakowanej probówki bursztynowej lub pokrytej folią, wolnej od nukleaz.</li>
<li>Do odpowiednio oznakowanych probówek bursztynowych lub pokrytych folią, wolnych od nukleaz, należy odmierzyć po 5 μL każdej badanej próbki dsDNA.</li>
<li>Przygotować roztwór roboczy PicoGreen zgodnie z protokołem producenta. Do każdej probówki zawierającej standard lub badaną próbkę przenieść taką samą objętość roztworu roboczego PicoGreen (w tym przykładzie 5 μL).</li>
<li>W celu przygotowania kontroli negatywnej, która służy jako roztwór referencyjny, należy połączyć równe objętości buforu 1x TE i roztworu roboczego PicoGreen.</li>
<li>Zawartość każdej probówki z reakcją należy dokładnie wymieszać poprzez delikatne pipetowanie i inkubować reakcje w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wszystkie standardy i próbki powinny zostać doprowadzone do tej samej temperatury przed pomiarem, ponieważ sygnał fluorescencji zależy od temperatury.</li>
<li>Aby przygotować instrument i przeprowadzić pomiary, należy najpierw oczyścić dolną i górną powierzchnię systemu utrzymywania próbki. Nanieść 2 do 3 μL wody dejonizowanej na dolną powierzchnię optyczną, zamknąć, a następnie otworzyć ramię dźwigni i osuszyć górny oraz dolny postument czystą, niepozostawiającą włókien chusteczką laboratoryjną. Przed kontynuacją należy upewnić się, że powierzchnie są wolne od włókien, ponieważ mogą one wykazywać fluorescencję w obecności źródła wzbudzenia i zakłócać pomiar.</li>
<li>Otworzyć oprogramowanie urządzenia, wybrać aplikację „Nucleic Acids” i zaznaczyć opcję „PicoGreen-dsDNA”.</li>
<li>Aby wyzerować instrument, nanieść 2 μL buforu 1x TE na dolny postument, zamknąć ramię i wybrać pole „Blank” w oprogramowaniu urządzenia. Po zakończeniu zerowania należy osuszyć roztwór zerujący z obu powierzchni systemu utrzymywania próbki.</li>
<li>Wymieszać roztwór referencyjny poprzez delikatne pipetowanie. Używając końcówek o niskiej retencji, nanieść 2 μL na dolny postument i zamknąć ramię.</li>
<li>W typie pomiaru wybrać „Reference” i zaznaczyć pożądane jednostki. Kliknąć „Measure”, aby rozpocząć cykl pomiarowy.</li>
<li>Po zakończeniu cyklu pomiarowego otworzyć ramię i dokładnie osuszyć powierzchnie systemu utrzymywania próbki. Zmierzyć do pięciu powtórzeń roztworu referencyjnego, używając nowej porcji dla każdego powtórzenia.</li>
<li>Powtórzyć proces dla pozostałych standardów w celu zbudowania krzywej wzorcowej. Można zastosować do siedmiu standardów. Oprogramowanie jest zaprojektowane tak, aby przechowywać do pięciu powtórzeń dla każdego standardu. Wyniki powtórzeń standardów są uśredniane w celu wygenerowania krzywej wzorcowej, na podstawie której automatycznie wyznacza się stężenia próbek.</li>
<li>Po utworzeniu krzywej wzorcowej wybrać zakładkę „Samples”, wprowadzić odpowiednie informacje o identyfikatorach próbek i zmierzyć każdą nieznaną próbkę.</li>
</ol>

<ol><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li>
<li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoolstra%2C+C+%22Implen+Applications+Note%22">Implen Applications Note</a>. , Munich, Germany. (2006).</li>
<li>Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJr%2C+Ingle+%22Spectrochemical+analysis%22">Spectrochemical analysis</a>. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).</li>
<li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Lett%22%5BJournal%5D)">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li>
</ol>

Philippe Desjardins oraz Debra Conklin są zatrudnieni w firmie Thermo Scientific NanoDrop Products, Inc, która produkuje instrumenty wykorzystane w niniejszym artykule.

Przedstawione tutaj protokoły ilościowe opierają się na najpowszechniej akceptowanych systemach mikroobjętościowych. Systemy te stanowią praktyczną alternatywę dla tradycyjnych metod oznaczania ilości kwasów nukleinowych, które wymagają większych objętości próbek i zastosowania aparatury zawierającej próbkę.
Technologia mikrowolumenowa NanoDrop wykorzystuje system zatrzymywania próbki, który opiera się na właściwościach napięcia powierzchniowego mierzonej próbki w celu utworzenia kolumny cieczy. Niezbędne jest, aby próbka miała kontakt z górną i dolną optyczną powierzchnią pomiarową w celu prawidłowego uformowania kolumny. Jeśli w dowolnym momencie wyniki pomiarów wydają się niedokładne lub niepowtarzalne, najprawdopodobniej jest to wynik niejednorodności próbki lub przerwania kolumny cieczy.
Detergenty i alkohol izopropylowy nie są zalecanymi środkami czyszczącymi, ponieważ mogą one doprowadzić do utraty kondycjonowania powierzchni pomiarowych piedestału. Brak kondycjonowania piedestału występuje, gdy właściwości hydrofobowe jego powierzchni zostaną naruszone, co skutkuje spłaszczeniem kropli próbki. Niekondycjonowane piedestały mogą prowadzić do przerwania kolumny cieczy podczas pomiaru.
<img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Równowaga statyczna; bilans momentów sił; schemat; ilustrujący punkt równowagi obrotowej; fizyka." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Powierzchnia niepoddana kondycjonowaniu charakteryzuje się spłaszczeniem kropli wody.
Nieodtłuszczone powierzchnie podstawki można odnowić, używając preparatu NanoDrop Pedestal Reconditioning Compound (PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Products). Cienką warstwę preparatu do odnawiania nanosi się na górną i dolną powierzchnię podstawki, pozostawia do wyschnięcia przez ok. 30 seconds, a następnie ściera za pomocą czystej, suchej i niepozostawiającej włókien chusteczki laboratoryjnej. Prawidłowo odnowiony stan charakteryzuje się tym, że kropla wody przyjmuje formę kuli po naniesieniu na dolną powierzchnię podstawki.
<img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Równowaga statyczna; napięcie powierzchniowe; schemat; układ doświadczalny; analiza stabilności kropli." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Powierzchnia poddana regeneracji charakteryzuje się skupianiem się kropli wody. 
Systemy do ilościowego oznaczania mikrometrie znacząco ograniczają zużycie próbek i drastycznie zwiększają zakres stężeń w porównaniu z bardziej tradycyjnymi systemami kwantyfikacji. Chociaż pomiary mikrometryczne często stawały się technologią umożliwiającą analizę w sytuacjach z ograniczoną masą komórkową, takich jak biopsje igłowe i mikrodysekcja sterowana laserem, wydajność i łatwość obsługi tej metodologii sprawiły, że stała się ona powszechnie akceptowaną alternatywą dla tradycyjnych metod ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych, nawet w przypadku dostępności dużej ilości materiału.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Zobacz materiał ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroobjętościowe oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych za pomocą nanodrop

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Nieustannie opracowywane są testy biomolekularne wykorzystujące coraz mniejsze ilości materiału, co często wyklucza stosowanie konwencjonalnych instrumentów opartych na kuwetach do oznaczania ilości kwasów nukleinowych na rzecz tych, które umożliwiają pomiary mikroobjętościowe.
System zatrzymywania próbek mikroobjętościowych NanoDrop (Thermo Scientific NanoDrop Products) działa dzięki połączeniu technologii światłowodowej i naturalnych właściwości napięcia powierzchniowego, co pozwala na przechwytywanie i zatrzymywanie niewielkich ilości próbki niezależnie od tradycyjnych urządzeń zawierających, takich jak kuwety czy kapilary. Co więcej, system wykorzystuje krótsze drogi optyczne, co umożliwia pomiar szerokiego zakresu stężeń kwasów nukleinowych, w zasadzie eliminując konieczność przeprowadzania rozcieńczeń. Zmniejszenie objętości próbki wymaganej do analizy spektroskopowej ułatwia również wprowadzenie dodatkowych etapów kontroli jakości w wielu procesach biologii molekularnej, zwiększając wydajność i ostatecznie prowadząc do większej pewności co do wyników analiz końcowych.
Wraz z ostatnimi postępami eksperymentalnymi pojawiła się również potrzeba prowadzenia wysokoczułej analizy fluorescencyjnej dla ograniczonej masy próbki. Dzięki zastosowaniu tej samej technologii zatrzymywania próbek w mikrobioobjętościach, pomiary fluorescencji można przeprowadzać przy użyciu 2 μL materiału, co pozwala na znaczne zmniejszenie wymagań objętościowych dla testów fluorescencyjnych. Takie mikroreakcje o objętości 10 μL lub mniejszej są obecnie możliwe dzięki zastosowaniu specjalistycznego fluorospektrometru do mikroobjętości.
Zaprezentowane zostaną dwa protokoły mikroobjętościowego oznaczania ilości kwasów nukleinowych, wykorzystujące zintegrowane systemy zatrzymywania próbek jako praktyczne alternatywy dla tradycyjnych protokołów opartych na kuwetach. Po pierwsze, opisano bezpośrednią metodę pomiaru absorbancji A260 z użyciem spektrofotometru mikroobjętościowego. Następnie przedstawiono metodę fluorescencyjną, która umożliwia prowadzenie reakcji fluorescencyjnych w zredukowanej objętości przy użyciu fluorospektrometru mikroobjętościowego. Te nowoczesne techniki pozwalają na ocenę stężeń kwasów nukleinowych w zakresie od 1 pg/ μL do 15 000 ng/ μL przy minimalnym zużyciu próbki.

Zastosowanie systemów mikroobjętościowych NanoDrop jako praktycznych i wydajnych alternatyw dla tradycyjnej metodologii oznaczania ilości kwasów nukleinowych opisano poprzez prezentację dwóch protokołów mikroobjętościowego oznaczania ilości kwasów nukleinowych.

Mikroobjętościowe oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych za pomocą NanoDrop

Nieustannie opracowywane są analizy biomolekularne wykorzystujące coraz mniejsze ilości materiału, co często wyklucza stosowanie konwencjonalnych...

System retencji próbek NanoDrop to innowacyjna technologia wykorzystująca naturalne napięcie powierzchniowe cieczy do utrzymywania i pomiaru próbek o objętości mikrolitrowej pomiędzy dwoma postumentami optycznymi, bez konieczności stosowania kuwet QTS lub kapilar. Bezpośrednio na dolną powierzchnię optyczną pipetuje się tak małą ilość próbki, jak 1 µL. Po zamknięciu ramienia spektrometru pomiędzy górnym a dolnym postumentem optycznym tworzy się kolumna cieczy.Dzięki napięciu powierzchniowemu tworzącemu pionową ścieżkę optyczną, długość tej ścieżki może automatycznie zmieniać się w czasie rzeczywistym podczas pomiaru. Skrócenie długości ścieżki umożliwia pomiar wyższych stężeń, co w praktyce eliminuje konieczność przeprowadzania rozcieńczeń w przypadku większości próbek kwasów nukleinowych. Ponadto system zatrzymywania próbek przyspiesza proces eksperymentalny dzięki szybkiemu oczyszczaniu, które polega na prostym przetarciu powierzchni optycznych chusteczką laboratoryjną.W dzisiejszym materiale zaprezentujemy dwie procedury oznaczania stężenia kwasów nukleinowych z wykorzystaniem mikroobjętościowej aparatury firmy Thermo Scientific. Pierwszy protokół dotyczy bezpośredniego pomiaru kwasów nukleinowych za pomocą spektrofotometru NanoDrop 2000 C. Drugi protokół obejmuje pośredni fluorescencyjny pomiar kwasów nukleinowych z wykorzystaniem spektrometru NanoDrop 3000 fluoro.Aby rozpocząć, należy oczyścić górną i dolną powierzchnię optyczną systemu utrzymania próbki spektrofotometru mikropojemnościowego, naniosząc pipetą od 2 do 3 µL czystej wody dejonizowanej na dolną powierzchnię optyczną. Zamknij ramię dźwigni, upewniając się, że górny piedestał styka się z wodą dejonizowaną. Podnieś ramię dźwigni i wytrzyj obie powierzchnie optyczne czystą, suchą i beztussową chusteczką laboratoryjną.Następnie otwórz oprogramowanie NanoDrop i wybierz aplikację do kwasów nukleinowych. Za pomocą skalibrowanej pipety do małych objętości wykonaj pomiar tła, nanieosząc 1 µL buforu na dolną powierzchnię optyczną. Opuść ramię dźwigni i wybierz opcję blank w aplikacji do kwasów nukleinowych.Po zakończeniu pomiaru próbki ślepej należy oczyścić obie powierzchnie optyczne za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Podobnie jak wcześniej, należy wybrać odpowiednią stałą dla próbki przeznaczonej do pomiaru. Następnie należy nanieść 1 µL próbki kwasów nukleinowych na dolny piedestał optyczny i zamknąć ramię dźwigni.Ponieważ pomiar jest niezależny od objętości, próbka musi jedynie wypełnić szczelinę między dwiema powierzchniami optycznymi. Aby wykonać pomiar, należy wybrać opcję pomiaru w oprogramowaniu aplikacyjnym; program automatycznie obliczy stężenie kwasów nukleinowych oraz współczynniki czystości. Po pomiaru próbki należy przeanalizować wynik spektralny. Typowa próbka kwasów nukleinowych będzie miała bardzo charakterystyczny profil.Spektralne wskaźniki niskiej jakości próbki obejmują zakłócenia długości fali w dolinie oraz w piku 260 nanometrów. Typowe źródła zanieczyszczeń związanych z konkretnymi technikami izolacji kwasów nukleinowych to fenol, triol oraz ekstrakcja kolumnowa. W przypadku ekstrakcji fenolowo-triolowej zanieczyszczenie pozostałościami odczynnika może być sygnalizowane przez nieprawidłowe widma w zakresie od 220 do 240 nanometrów, a także przez przesunięcia w regionie od 260 do 280 nanometrów.I odwrotnie, pozostałości guanidyny z ekstrakcji kolumnowej mogą przyczyniać się do powstania piku w pobliżu 230 nanometrów oraz przesunięcia minimum z 230 nanometrów do około 240 nanometrów. Aby dokładnie ocenić czystość próbki, stosunek 2 62 80 oraz 2 62 30 należy analizować w połączeniu z ogólną jakością widma. Czyste kwasy nukleinowe zazwyczaj dają stosunek 2 62 80 wynoszący około 1,8 dla DNA i około 2,0 dla RNA.Stosunek ten zależy od pH oraz siły jonowej buforu użytego do pomiarów próbki i próbki ślepej. Fluorymetr Banana drop 3, 300 wykorzystuje ten sam opatentowany system retencji próbek o mikroobjętości, co spektrofotometr NanoDrop 2000 C. Ponieważ pomiary fluorescencji są wykonywane przy użyciu zaledwie 1 µL próbki, użytkownik wybiera jedno z trzech źródeł światła LED do wzbudzenia, które naświetla próbkę poziomo.Następnie fluorescencja próbki jest zbierana pod kątem 90 stopni w pionie do wewnętrznego spektrometru. Aby zademonstrować wysoką czułość mikroobjętościowego oznaczania ilości kwasów nukleinowych przy użyciu NanoDrop 3, 300, stosuje się zestaw do fluorescencji PicoGreen; w pierwszej kolejności należy doprowadzić standardy z zestawu oraz wszystkie próbki kwasów nukleinowych do temperatury pokojowej. Próbki fluorescencyjne są światłoczułe i powinny być przechowywane w probówkach z bursztynowego szkła lub owinięte folią aluminiową.Przygotować wystarczającą ilość buforu 1X TE dla wszystkich standardów i próbek przeznaczonych do pomiaru, a także dla niezbędnego roboczego roztworu pico green. Bufor 1X TE przygotować poprzez rozcieńczenie dostarczonego buforu 20X TE wodą wolną od nukleaz zgodnie z protokołem producenta. Objętości reakcji mogą wynosić od 200 µL do nawet 10 µL.W tym przykładzie przygotujemy objętości reakcyjne wynoszące 10 µL. Następnie należy przygotować seryjnie rozcieńczone wzorce dwuniciowego DNA oraz fiolki lub probówki wolne od nukleaz. Pozwoli to na objęcie oczekiwanego zakresu stężeń w nieznanych próbkach DNA.Przenieś pięć µL każdego z rozcieńczonych standardów dwuniciowego DNA do oddzielnie oznakowanych, wolnych od nukleaz probówek z ciemnego szkła lub owiniętych folią aluminiową. Następnie odmień pięć µL każdej badanej próbki dwuniciowego DNA do odpowiednio zabezpieczonej przed światłem probówki. Po przygotowaniu roztworu roboczego Pico Green zgodnie z protokołem producenta, przenieś równą objętość tego roztworu do każdej probówki zawierającej standard dwuniciowego DNA lub próbkę dwuniciowego DNA – w tym przypadku pięć µL.Połączyć równe objętości buforu XTE oraz gotowego roztworu Pico Green. W celu przygotowania kontroli negatywnej, która służy jako roztwór referencyjny, dokładnie wymieszać zawartość każdej probówki poprzez delikatne pipetowanie, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Wszystkie wzorce i próbki należy doprowadzić do tej samej temperatury przed pomiarem, ponieważ sygnał fluorescencyjny zależy od temperatury. Aby przygotować instrument i przeprowadzić pomiary, najpierw należy oczyścić dolną i górną powierzchnię systemu mocowania próbek, a następnie nanieść pipetą od 2 do 3 µL wody dejonizowanej na dolną powierzchnię optyczną. Następnie należy podnieść ramię dźwigni i osuszyć górny oraz dolny piedestał czystą, niepozostawiającą włókien chusteczką laboratoryjną.Przed rozpoczęciem upewnij się, że powierzchnie są wolne od kłaczków. Kłaczki mogą wykazywać fluorescencję w obecności źródła wzbudzenia i mogą zakłócać pomiar. Uruchom oprogramowanie instrumentu.Wybierz aplikację dla kwasów nukleinowych, a następnie opcję pico green dla dwuniciowego DNA i pipetuj 2 µL 1X TE na dolny piedestał. Zamknij ramię dźwigni i wybierz opcję blank w polu oprogramowania instrumentu. Po zakończeniu pomiaru blanku osusz obie powierzchnie systemu zatrzymującego próbkę z roztworu blanku.Następnie wymieszaj roztwór wzorcowy poprzez delikatne pipetowanie za pomocą końcówek o niskiej retencji. Nanieś dwie microliters roztworu wzorcowego na dolny piedestał i zamknij ramię dźwigni. W zakładce standardy wybierz opcję reference i wybierz pożądane jednostki.Kliknij przycisk pomiaru, aby rozpocząć cykl pomiarowy. Po zakończeniu cyklu pomiarowego otwórz ramię dźwigni i dokładnie osusz powierzchnie systemu zatrzymującego próbkę. Wykonaj pomiary do pięciu powtórzeń wzorca, używając nowej końcówki Eloqua dla każdego powtórzenia.Powtórz proces dla pozostałych wzorców, aby utworzyć krzywą wzorcową. Można użyć do siedmiu wzorców. Oprogramowanie jest zaprojektowane tak, aby przechowywać do pięciu powtórzeń dla każdego wzorca.Wartości powtórzeń standardów są uśredniane w celu wygenerowania krzywej wzorcowej, na podstawie której automatycznie wyznacza się stężenia próbek. Po utworzeniu krzywej wzorcowej należy wybrać kartę próbek, wprowadzić odpowiednie identyfikatory próbek i zmierzyć każdą nieznaną próbkę. Poprawna krzywa wskazuje na spełnienie wymogu minimalnej liczby standardów.Stężenie DNA jest obliczane automatycznie na podstawie krzywej wzorcowej. Aparatura NanoDrop do mikroobjętości może określać stężenie kwasów nukleinowych za pomocą bezpośrednich pomiarów A260 lub pośrednich metod fluorometrycznych. Spektrofotometry NanoDrop mogą być również wykorzystywane do ilościowego oznaczania białek przy użyciu bezpośredniej absorbancji A280 lub kolorymetrycznych testów białkowych.

nanodrop-microvolume-quantitation-of-nucleic-acids

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

NanoDrop Pomiar mikrowolumenów kwasów nukleinowych

Ten film przedstawia protokół immunoprecypitacji zmetylowanego DNA (MeDIP). MeDIP jest dwudniową procedurą, która pozwala na selektywne wyodrębnienie zmetylowanych fragmentów DNA z próbki genomowego DNA przy użyciu przeciwciał specyficznych dla 5-metylocytozyny (anti-5 mC).

Immunoprecypitacja zmetylowanego DNA

Próbki o mikroobjętości są kwantyfikowane za pomocą systemu spektrofotometrycznego, który wykorzystuje naturalne napięcie powierzchniowe do utrzymania próbek bez użycia kuwet lub kapilar. Zakres dynamiczny stężeń białek oraz szybkość ich pomiaru są znacznie zwiększone dzięki zastosowaniu tej metody.

Oznaczanie stężenia białek w mikroobjętościach z wykorzystaniem spektrofotometru NanoDrop 2000c

Niniejszy komunikat przedstawia dane dotyczące dokładności i powtarzalności spektrofotometru UV-VIS BioSpec-nano w oznaczaniu ilościowym dsDNA oraz białek. Nawet przy ultra małych objętościach (1 do 2 µL) powtarzalność jest doskonała, natomiast zautomatyzowana funkcja przecierania zwiększa wydajność i minimalizuje zjawisko przeniesienia próbki, co pozwala na uzyskanie bardziej precyzyjnych wyników.

Oznaczanie stężenia kwasów nukleinowych i białek przy użyciu mikroobjętościowego spektrofotometru Bio-spec Nano

Ten film pokazuje użyteczność cyfrowego PCR w formacie chip-in-a-tube do wykrywania zmian pojedynczych nukleotydów w próbkach DNA. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na komory, które działają jako niezależne reakcje PCR, a wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych ze amplifikowanych celów w komorach służy do obliczenia częstotliwości wariantu allelu w próbce.

Cyfrowy PCR oparty na chip-in-a-tube do ilościowego oznaczania wariantów pojedynczych nukleotydów

MikroRNA (miRNA) to szeroko konserwatywna klasa cząsteczek regulatorowych. Tutaj opisujemy metodę klonowania miRNA, która opiera się na dwóch silnych etapach ligacji, po których następuje sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Nasza metoda pozwala na dokładną ocenę ilościową miRNA w całym genomie.

Wysoce wydajna ligacja małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Opisujemy cyfrowy test końcowy do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych za pomocą uproszczonego (analogowego) odczytu. Mierzymy fluorescencję masową kropelkowych testów cyfrowych za pomocą standardowej maszyny qPCR, a nie specjalistycznego oprzyrządowania, i potwierdzamy nasze wyniki za pomocą mikroskopii.

Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

Opisana jest czuła i dokładna metoda kwantyfikacji mikroRNA bez komórek przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii kropelkowej cyfrowego PCR.

Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR

Półelastyczne polimery wykazują unikalne właściwości mechaniczne, które są szeroko stosowane przez żywe systemy. Jednak systematyczne badania nad biopolimerami są ograniczone, ponieważ właściwości takie jak sztywność polimeru są niedostępne. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób to ograniczenie jest obchodzone przez programowalne nanorurki DNA, umożliwiając eksperymentalne badania wpływu sztywności włókien.

Nanorurki DNA jako wszechstronne narzędzie do badania polimerów półelastycznych

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru bezwzględnej liczby kopii mitochondrialnego (mt)DNA i poziomów heteroplazmii delecji mtDNA w pojedynczych komórkach.

Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Protokół ten szczegółowo opisuje oddzielenie nabłonka soczewki oka myszy od masy masowej komórek włóknistych, a następnie izolację RNA i analizę qPCR. Metoda ta pozwala na oddzielenie przedziałów komórek soczewki w celu bardziej szczegółowej analizy transkryptomu i procesów biologicznych w komórkach nabłonkowych w porównaniu ze zróżnicowanymi komórkami włóknistymi.

Izolacja RNA z nabłonka soczewek ocznych myszy i mas masowych komórek włóknistych

Poznaj metody ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych przy użyciu spektrofotometrów NanoDrop 2000 C i NanoDrop 3300. Technologia mikroobjętościowa umożliwia pomiar zaledwie jednego mikrolitra próbki bez konieczności rozcieńczania.

Mikroobjętościowe oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych za pomocą NanoDrop

Przeglądaj więcej filmów