Mikroobjętościowe oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych za pomocą NanoDrop

System retencji próbek NanoDrop to innowacyjna technologia wykorzystująca naturalne napięcie powierzchniowe cieczy do utrzymywania i pomiaru próbek o objętości mikrolitrowej pomiędzy dwoma postumentami optycznymi, bez konieczności stosowania kuwet QTS lub kapilar. Bezpośrednio na dolną powierzchnię optyczną pipetuje się tak małą ilość próbki, jak 1 µL. Po zamknięciu ramienia spektrometru pomiędzy górnym a dolnym postumentem optycznym tworzy się kolumna cieczy.

Dzięki napięciu powierzchniowemu tworzącemu pionową ścieżkę optyczną, długość tej ścieżki może automatycznie zmieniać się w czasie rzeczywistym podczas pomiaru. Skrócenie długości ścieżki umożliwia pomiar wyższych stężeń, co w praktyce eliminuje konieczność przeprowadzania rozcieńczeń w przypadku większości próbek kwasów nukleinowych. Ponadto system zatrzymywania próbek przyspiesza proces eksperymentalny dzięki szybkiemu oczyszczaniu, które polega na prostym przetarciu powierzchni optycznych chusteczką laboratoryjną.

W dzisiejszym materiale zaprezentujemy dwie procedury oznaczania stężenia kwasów nukleinowych z wykorzystaniem mikroobjętościowej aparatury firmy Thermo Scientific. Pierwszy protokół dotyczy bezpośredniego pomiaru kwasów nukleinowych za pomocą spektrofotometru NanoDrop 2000 C. Drugi protokół obejmuje pośredni fluorescencyjny pomiar kwasów nukleinowych z wykorzystaniem spektrometru NanoDrop 3000 fluoro.

Aby rozpocząć, należy oczyścić górną i dolną powierzchnię optyczną systemu utrzymania próbki spektrofotometru mikropojemnościowego, naniosząc pipetą od 2 do 3 µL czystej wody dejonizowanej na dolną powierzchnię optyczną. Zamknij ramię dźwigni, upewniając się, że górny piedestał styka się z wodą dejonizowaną. Podnieś ramię dźwigni i wytrzyj obie powierzchnie optyczne czystą, suchą i beztussową chusteczką laboratoryjną.

Następnie otwórz oprogramowanie NanoDrop i wybierz aplikację do kwasów nukleinowych. Za pomocą skalibrowanej pipety do małych objętości wykonaj pomiar tła, nanieosząc 1 µL buforu na dolną powierzchnię optyczną. Opuść ramię dźwigni i wybierz opcję blank w aplikacji do kwasów nukleinowych.

Po zakończeniu pomiaru próbki ślepej należy oczyścić obie powierzchnie optyczne za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Podobnie jak wcześniej, należy wybrać odpowiednią stałą dla próbki przeznaczonej do pomiaru. Następnie należy nanieść 1 µL próbki kwasów nukleinowych na dolny piedestał optyczny i zamknąć ramię dźwigni.

Ponieważ pomiar jest niezależny od objętości, próbka musi jedynie wypełnić szczelinę między dwiema powierzchniami optycznymi. Aby wykonać pomiar, należy wybrać opcję pomiaru w oprogramowaniu aplikacyjnym; program automatycznie obliczy stężenie kwasów nukleinowych oraz współczynniki czystości. Po pomiaru próbki należy przeanalizować wynik spektralny. Typowa próbka kwasów nukleinowych będzie miała bardzo charakterystyczny profil.

Spektralne wskaźniki niskiej jakości próbki obejmują zakłócenia długości fali w dolinie oraz w piku 260 nanometrów. Typowe źródła zanieczyszczeń związanych z konkretnymi technikami izolacji kwasów nukleinowych to fenol, triol oraz ekstrakcja kolumnowa. W przypadku ekstrakcji fenolowo-triolowej zanieczyszczenie pozostałościami odczynnika może być sygnalizowane przez nieprawidłowe widma w zakresie od 220 do 240 nanometrów, a także przez przesunięcia w regionie od 260 do 280 nanometrów.

I odwrotnie, pozostałości guanidyny z ekstrakcji kolumnowej mogą przyczyniać się do powstania piku w pobliżu 230 nanometrów oraz przesunięcia minimum z 230 nanometrów do około 240 nanometrów. Aby dokładnie ocenić czystość próbki, stosunek 2 62 80 oraz 2 62 30 należy analizować w połączeniu z ogólną jakością widma. Czyste kwasy nukleinowe zazwyczaj dają stosunek 2 62 80 wynoszący około 1,8 dla DNA i około 2,0 dla RNA.

Stosunek ten zależy od pH oraz siły jonowej buforu użytego do pomiarów próbki i próbki ślepej. Fluorymetr Banana drop 3, 300 wykorzystuje ten sam opatentowany system retencji próbek o mikroobjętości, co spektrofotometr NanoDrop 2000 C. Ponieważ pomiary fluorescencji są wykonywane przy użyciu zaledwie 1 µL próbki, użytkownik wybiera jedno z trzech źródeł światła LED do wzbudzenia, które naświetla próbkę poziomo.

Następnie fluorescencja próbki jest zbierana pod kątem 90 stopni w pionie do wewnętrznego spektrometru. Aby zademonstrować wysoką czułość mikroobjętościowego oznaczania ilości kwasów nukleinowych przy użyciu NanoDrop 3, 300, stosuje się zestaw do fluorescencji PicoGreen; w pierwszej kolejności należy doprowadzić standardy z zestawu oraz wszystkie próbki kwasów nukleinowych do temperatury pokojowej. Próbki fluorescencyjne są światłoczułe i powinny być przechowywane w probówkach z bursztynowego szkła lub owinięte folią aluminiową.

Przygotować wystarczającą ilość buforu 1X TE dla wszystkich standardów i próbek przeznaczonych do pomiaru, a także dla niezbędnego roboczego roztworu pico green. Bufor 1X TE przygotować poprzez rozcieńczenie dostarczonego buforu 20X TE wodą wolną od nukleaz zgodnie z protokołem producenta. Objętości reakcji mogą wynosić od 200 µL do nawet 10 µL.

W tym przykładzie przygotujemy objętości reakcyjne wynoszące 10 µL. Następnie należy przygotować seryjnie rozcieńczone wzorce dwuniciowego DNA oraz fiolki lub probówki wolne od nukleaz. Pozwoli to na objęcie oczekiwanego zakresu stężeń w nieznanych próbkach DNA.

Przenieś pięć µL każdego z rozcieńczonych standardów dwuniciowego DNA do oddzielnie oznakowanych, wolnych od nukleaz probówek z ciemnego szkła lub owiniętych folią aluminiową. Następnie odmień pięć µL każdej badanej próbki dwuniciowego DNA do odpowiednio zabezpieczonej przed światłem probówki. Po przygotowaniu roztworu roboczego Pico Green zgodnie z protokołem producenta, przenieś równą objętość tego roztworu do każdej probówki zawierającej standard dwuniciowego DNA lub próbkę dwuniciowego DNA – w tym przypadku pięć µL.

Połączyć równe objętości buforu XTE oraz gotowego roztworu Pico Green. W celu przygotowania kontroli negatywnej, która służy jako roztwór referencyjny, dokładnie wymieszać zawartość każdej probówki poprzez delikatne pipetowanie, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Wszystkie wzorce i próbki należy doprowadzić do tej samej temperatury przed pomiarem, ponieważ sygnał fluorescencyjny zależy od temperatury. Aby przygotować instrument i przeprowadzić pomiary, najpierw należy oczyścić dolną i górną powierzchnię systemu mocowania próbek, a następnie nanieść pipetą od 2 do 3 µL wody dejonizowanej na dolną powierzchnię optyczną. Następnie należy podnieść ramię dźwigni i osuszyć górny oraz dolny piedestał czystą, niepozostawiającą włókien chusteczką laboratoryjną.

Przed rozpoczęciem upewnij się, że powierzchnie są wolne od kłaczków. Kłaczki mogą wykazywać fluorescencję w obecności źródła wzbudzenia i mogą zakłócać pomiar. Uruchom oprogramowanie instrumentu.

Wybierz aplikację dla kwasów nukleinowych, a następnie opcję pico green dla dwuniciowego DNA i pipetuj 2 µL 1X TE na dolny piedestał. Zamknij ramię dźwigni i wybierz opcję blank w polu oprogramowania instrumentu. Po zakończeniu pomiaru blanku osusz obie powierzchnie systemu zatrzymującego próbkę z roztworu blanku.

Następnie wymieszaj roztwór wzorcowy poprzez delikatne pipetowanie za pomocą końcówek o niskiej retencji. Nanieś dwie microliters roztworu wzorcowego na dolny piedestał i zamknij ramię dźwigni. W zakładce standardy wybierz opcję reference i wybierz pożądane jednostki.

Kliknij przycisk pomiaru, aby rozpocząć cykl pomiarowy. Po zakończeniu cyklu pomiarowego otwórz ramię dźwigni i dokładnie osusz powierzchnie systemu zatrzymującego próbkę. Wykonaj pomiary do pięciu powtórzeń wzorca, używając nowej końcówki Eloqua dla każdego powtórzenia.

Powtórz proces dla pozostałych wzorców, aby utworzyć krzywą wzorcową. Można użyć do siedmiu wzorców. Oprogramowanie jest zaprojektowane tak, aby przechowywać do pięciu powtórzeń dla każdego wzorca.

Wartości powtórzeń standardów są uśredniane w celu wygenerowania krzywej wzorcowej, na podstawie której automatycznie wyznacza się stężenia próbek. Po utworzeniu krzywej wzorcowej należy wybrać kartę próbek, wprowadzić odpowiednie identyfikatory próbek i zmierzyć każdą nieznaną próbkę. Poprawna krzywa wskazuje na spełnienie wymogu minimalnej liczby standardów.

Stężenie DNA jest obliczane automatycznie na podstawie krzywej wzorcowej. Aparatura NanoDrop do mikroobjętości może określać stężenie kwasów nukleinowych za pomocą bezpośrednich pomiarów A260 lub pośrednich metod fluorometrycznych. Spektrofotometry NanoDrop mogą być również wykorzystywane do ilościowego oznaczania białek przy użyciu bezpośredniej absorbancji A280 lub kolorymetrycznych testów białkowych.