FISH do preimplantacyjnej diagnostyki genetycznej

Ten artykuł opisuje wybór odpowiednich sond dla jednokomórkowych FISH, techniki rozprzestrzeniania jąder blastomerów oraz hybrydyzację in situ i punktację sygnału, stosowane w preimplantacyjnej diagnostyce genetycznej (PGD) w warunkach klinicznych.

Celem tej procedury jest zastosowanie techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do określenia statusu chromosomu płciowego lub translokacji zarodków ludzkich in vitro zagrożonych nieprawidłowościami genetycznymi. Osiąga się to poprzez lizę, biopsję pojedynczej komórki pobraną z zarodka w trzecim dniu na szklane szkiełko i suszenie jądra powietrzem. Drugim krokiem jest zakodowanie natury D i hybrydyzacja DNA jądra docelowego za pomocą sond DNA znakowanych fluorochromami o różnych kolorach.

Następnie nadmiar sondy jest usuwany za pomocą rygorystycznego mycia, a jądro jest barwione barwnikiem fluorescencyjnym specyficznym dla DNA. Ostatnim krokiem jest obejrzenie jądra za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i wykonanie obrazów cyfrowych. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują liczbę kopii docelowych regionów chromosomów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej technice będą miały trudności, ponieważ znajduje się ona na granicy techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Z 24-godzinnym wyprzedzeniem przygotuj bufor do lizy komórek do rozprzestrzeniania komórek. Przefiltruj roztwór i dozuj jedną mililitrową porcję do 10 do 15, 1,7 mililitra sterylnych mikroprobówek wirówek, zamknij i oznacz probówki przed zamrożeniem w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza tuż przed zabiegiem biopsji.

Rozmrozić bufor do lizy w temperaturze pokojowej. Naciąć mały okrąg o średnicy około pięciu milimetrów na spodniej stronie szkiełka pokrytego aminami za pomocą pisaka diamentowego, a następnie za pomocą twardego ołówka w kształcie czterech liter H wstępnie oznacz szkiełko BLO za pomocą rękawicy lateksowej. Aby usunąć pył grafitowy, użyj osobnego suwaka dla każdego lustra blastera w kolejności numerycznej.

Teraz umieść niewielką objętość buforu do lizy w okręgu. Przenieść blaster do biopsji do buforu do lizy. W razie potrzeby dodaj bufor do lizy, aby zlizować komórkę.

Obserwuj jądro, aby upewnić się, że pozostaje w okręgu i nie zostało utracone. Jeśli komórka nie ma jądra lub ma wiele jąder, należy wykonać biopsję innej komórki. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej.

Najpierw umyj próbki w słoikach coplan za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie spłucz dwukrotnie w sterylnej wodzie destylowanej, odwodnij serią etanolu przez dwie minuty w temperaturze pokojowej i wysusz na powietrzu. Upewnij się, że szkiełka są całkowicie zanurzone, a jeśli pył grafitowy wydostanie się na powierzchnię, zanurz się w czystej chusteczce.

Zapisz położenie jądra w okręgu, wizualizując je za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym. Następnie odwodnić próbki 100% etanolem przez dwie minuty w temperaturze pokojowej i wysuszyć na powietrzu. Teraz nałóż dwa mikrolitry mieszanki sondy i przykryj szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach dziewięć na dziewięć milimetrów.

Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego cementem gumowym. Wykonaj kodowaną naturację. Nadepnij na blok grzewczy w temperaturze 75 stopni Celsjusza na pięć minut, a następnie hybrydyzuj przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza dla każdego słoika sprzęgającego.

Zrównoważyć 50 mililitrów 0,4-krotności rygorystycznego roztworu myjącego SSC w łaźni wodnej o temperaturze 71 stopni Celsjusza. Umieść rygorystyczną butelkę do mycia i pusty słoik sprzęgający w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej, podgrzej do 71 stopni Celsjusza pH, rygorystyczne mycie i zdekantuj do słoików Cochin. Kontynuuj ostrożne usuwanie cementu gumowego z każdego szkiełka i spłucz szkiełko nakrywkowe za pomocą czterokrotnego SSC 0,05% tween 20 pH siedem w temperaturze pokojowej.

Umyj próbki w rygorystycznym myciu 0,4 razy SSC w temperaturze 71 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie czterokrotnie SSC 0,05% Tween 20 w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. W przypadku sond, które są znakowane pośrednio, opróżnij szkiełka z nadmiaru płynu i nałóż 20 mikrolitrów fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała pod kwadratem paraformy o wymiarach 20 na 20 milimetrów. Inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Usuń folię para, a następnie wykonaj następujące prania w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Raz na cztery razy SSC 0,05%tween 20 i dwa razy przez dwie minuty w PBS. Po opróżnieniu szkiełek nałóż sześć mikrolitrów nośnika montażowego z osłoną wektorową zawierającego DPI o wymiarach 22 na 22 milimetry.

Umieść szkiełko nakrywkowe na zero i odwróć suwak nad okładką. Osuszyć i uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego bezbarwnym lakierem do paznokci. Na koniec przeanalizuj próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Oceń każde jądro przez dwóch niezależnych analityków. Oprogramowanie do obrazowania umożliwia również wykonanie obrazu jądra w celu potwierdzenia diagnozy wizualnej oraz archiwizacji obrazu w ramach zapewnienia jakości w laboratorium. W tym przypadku rozprzestrzenianie się metafazy i jądro interfazowe przygotowane z limfocytów krwi obwodowej wskazują na nosicielstwo wzajemnej translokacji między krótkimi ramionami chromosomów piątego i dziewiątego z punktami przerwania na pięciu P: 14,3 i dziewiątym, P, dwa, 4,1.

Sondy rybne oświetlają zarówno segmenty zlokalizowane trans, jak i centralny segment sygnałów chromosomu dziewiątego. W jądrach wybuchowych od trzeciego dnia zarodki mogą być chwytane, a następnie łączone w celu utworzenia złożonego obrazu. Dwa sygnały dla każdej sondy wskazują dwie kopie każdego locus, co jest zgodne z normalnym lub zrównoważonym dopełnieniem.

W przypadku chromosomów translokacyjnych kolorowe sygnały wskazują jedną kopię segmentu chromosomu zlokalizowanego trans, pięć trzech kopii segmentu chromosomu dziewiątego zlokalizowanego trans i dwie kopie centralnego segmentu chromosomu dziewiątego CH. Dane te są zgodne z niezrównoważonym iloczynem man somi dla pięciu P 14,3 do pięciu PT i trisomii dla dziewięciu P dwóch, 4,1 do dziewięciu punktów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować biopsję pojedynczej komórki z ludzkiego zarodka i przygotować pojedyncze jądro przy użyciu techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Jest to ważne dla uzyskania powtarzalnych i optymalnych wyników badań w celu określenia dopełniacza chromosomu płciowego lub statusu translokacji zarodka.