Name: FISH do preimplantacyjnej diagnostyki genetycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Poznaj technikę FISH do preimplantacyjnej diagnostyki genetycznej w ludzkich zarodkach in vitro. Ta metoda umożliwia analizę chromosomów płci i translokacji z pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Lizowanie i rozprzestrzenianie jądra z pobranego blastomeru
<ol>
<li>Bufor do lizy komórek do rozcierania komórek (0,2% Tween20 w 0,01 M HCl, pH 2,0) należy przygotować z 24-godzinnym wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -20°C. Przygotować 100 mL i przefiltrować 20 mL do sterylnego pojemnika uniwersalnego o pojemności 30 mL, używając sterylnej strzykawki 20 mL i filtra strzykawkowego. Rozdzielić w aliquoty po 1 mL do 10-15 sterylnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL, zamknąć i opisać probówki przed zamrożeniem. Zaleca się stosowanie dwóch różnych serii: nowej oraz poprzedniej, która została przetestowana i może być użyta, jeśli nowa seria okaże się niesatysfakcjonująca.</li>
<li>Rozmrozić bufor do lizy w temperaturze pokojowej na 30 minut przed procedurą biopsji. W praktyce temperatura robocza będzie mieścić się w zakresie między temperaturą pokojową a temperaturą dłoni.</li>
<li>Narysować mały okrąg (średnica około 5 mm) na spodniej stronie szkiełka pokrytego aminą (np. Genetix) za pomocą rysika diamentowego i opisać szkiełko numerem przypadku, unikalnym numerem szkiełka oraz datą biopsji. Użyć osobnego szkiełka dla każdego blastomeru w kolejności numerycznej i opisać go numerem zarodka. Szkiełka należy opisywać twardym ołówkiem (np. 4H) i „przetrzeć” rękawiczką lateksową, aby usunąć pył grafitowy.</li>
<li>Nanieść niewielką objętość buforu do lizy wewnątrz okręgu.</li>
<li>Przenieść pobrany blastomer do buforu do lizy. W razie potrzeby dodawać bufor do lizy wewnątrz okręgu, aż komórka zacznie ulegać lizie; komórka powinna ulec całkowitej lizie, a cytoplazma powinna się rozprzestrzenić przed wyschnięciem buforu.</li>
<li>Obserwować jądro komórkowe, aby upewnić się, że pozostaje ono wewnątrz okręgu i nie uległo zgubieniu; jeśli komórka nie posiada jądra lub posiada wiele jąder, należy pobrać inną komórkę.</li>
<li>Pozostawić szkiełko do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. 	Hybrydyzacja in situ jądra pojedynczego blastomeru
<ol>
<li>Przygotować serię etanolową (70, 90 i 100%) sporządzoną w sterylniej wodzie destylowanej.</li>
<li>Włączyć blok grzejny (np. Hybaid Omnislide lub Vysis Hybrite) i ustawić temperaturę na 75°C.</li>
<li>Rozmrozić sondy, wymieszać na wortexie i odwir fracciones w wirówce. Odczynniki należy sprawdzić i zweryfikować przed przygotowaniem mieszaniny sond. Odmierzyć pipetą objętości określone przez producenta, aby przygotować mieszaninę sond w sterylnym probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,65 mL, a następnie wymieszać na wortexie i odwirować przed użyciem. Całkowita objętość mieszaniny sond powinna być wystarczająca, aby zapewnić 2 μL na każde badane jądro komórkowe, z zaokrągleniem w górę do najbliższych 10 μL w celu zachowania marginesu bezpieczeństwa.</li>
<li>Przeprowadzić wstępne mycie szkiełek w naczyniach Coplina, używając soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (pH 7,0: 0,14 M NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4) przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Płukać szkiełka dwukrotnie w sterylniej wodzie destylowanej.</li>
<li>Odwodnić szkiełka w serii etanolowej (70, 90 i 100%) po 2 min w każdym etapie w temperaturze pokojowej, a następnie wysuszyć na powietrzu. Upewnić się, że szkiełka są całkowicie zanurzone; jeśli na powierzchni pojawi się pył grafitowy, zebrać go czystą chusteczką.</li>
<li>Zapisać położenie jądra komórkowego w obrębie okręgu, wizualizując je za pomocą mikroskopu fazowego.</li>
<li>Odwodnić w 100% etanolu przez 2 min w temperaturze pokojowej i wysuszyć na powietrzu.</li>
<li>Nanieść 2 μL mieszaniny sond i przykryć szkiełkiem cover-slip o wymiarach 9 x 9 mm (jedna czwarta szkiełka nr 1 o wymiarach 18 x 18 mm).</li>
<li>Uszczelnić krawędzie szkiełka przykrywkowego cementem gumowym (np. Cow Gum; Cow Proofing).</li>
<li>Przeprowadzić denaturację szkiełek na bloku grzejnym w temperaturze 75°C przez 5 min, a następnie hybrydyzować szkiełka przez noc (16-20 h) w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37°C. Mieszaniny sond składające się wyłącznie z sond centromerycznych (np. w przypadkach sprzężonych z płcią) dadzą satysfakcjonujący wynik po 60 min hybrydyzacji.</li>
<li>Przygotować kąpiel wodną z odpowiednią liczbą naczyń Coplina i podgrzać do 71°C.</li>
<li>Przygotować roztwór do rygorystycznego płukania 0,4x standardowego cytrynianu saline (SSC) (pH 7,0 przy 71°C, 0,06 M NaCl, 6 mM C6H5Na3O7.2H2O) i podgrzać w kąpieli wodnej.</li>
<li>Nalać 50 mL roztworu do rygorystycznego płukania do każdego wymaganego naczynia Coplina i sprawdzić czystym termometrem, czy temperatura bezpośrednio przed użyciem wynosi 71°C.</li>
<li>Ostrożnie usunąć cement gumowy z każdego szkiełka i spłukać szkiełko przykrywkowe, używając 4x SSC/0,05% Tween20 (pH 7,0) w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Myć szkiełka w rygorystycznym roztworze 0,4x SSC w temperaturze 71°C przez 5 min. Myć nie więcej niż 6 szkiełek w jednym naczyniu Coplina.</li>
<li>Myć szkiełka w 4x SSC/0,05% Tween20 w temperaturze pokojowej przez 2 min.</li>
<li>Jeśli mieszanina sond zawiera sondy znakowane pośrednio, odprowadzić nadmiar cieczy ze szkiełek i nanieść 20 μL przeciwciała sprzężonego z fluoroforem pod kwadratem Parafilmu o wymiarach 20 x 20 mm.</li>
<li>Inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37°C przez 15 min.</li>
<li>Usunąć Parafilm i raz wypłukać w 4x SSC/0,05% Tween20 w temperaturze pokojowej przez 2 min.</li>
<li>Myć dwukrotnie przez 2 min w PBS w temperaturze pokojowej i odprowadzić ciecz ze szkiełek.</li>
<li>Nanieść 6 μL DAPI/Vectashield (160 ng 4',6-diamidino-2-fenyloindolu dihydrochlorku w 1 mL medium montażowego Vectashield, Vector Laboratories) na szkiełko przykrywkowe nr 0 o wymiarach 22 x 22 mm i odwrócić szkiełko nad szkiełkiem przykrywkowym.</li>
<li>Osuszyć i uszczelnić krawędzie szkiełka przykrywkowego bezbarwnym lakierem do paznokci.</li>
</ol>
3. Analiza przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego odpowiednio wyposażonego w filtry dopasowane do stosowanych sond.
<ol>
<li>Oceń sygnały poprzez bezpośrednią wizualizację przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego i pojedynczych filtrów pasmowych dla każdego fluorochromu zastosowanego w teście. Każde jądro komórkowe powinno zostać ocenione przez dwóch analityków. Ogólna wytyczna powinna prowadzić do uznania sygnału za pojedynczy w przypadku, gdy dwa blisko położone sygnały są oddalone od siebie o mniej niż jedną domenę (szerokość sygnału); należy jednak kierować się doświadczeniem przy interpretacji sygnałów o różnej wielkości, intensywności i stopniu rozdzielenia.</li>
<li>Użyj oprogramowania do obrazowania (np. Isis, MetaSystems, Altlussheim, Niemcy; CytoVision, Genetix), aby zarejestrować obraz jądra komórkowego w celu potwierdzenia diagnozy wizualnej oraz do archiwizacji obrazów w ramach planu zapewnienia jakości laboratorium.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Należy zbadać jądra w metafazie i interfazie z hodowli limfocytów krwi obwodowej, aby potwierdzić, że wybrane sondy są specyficzne dla chromosomów z translokacją, informatywne dla punktów pęknięcia (sondy subtelomerowe powinny hybrydyzować tylko z segmentami translokowanymi, a sonda(y) centromerowa(e) z segmentami centrycznymi), a sygnały w jądrach w interfazie powinny być jasne i wyraźne. W celu oceny wydajności testu zaleca się zliczenie liczby sygnałów dla każdej sondy w 100 jądrach w interfazie dla każdego partnera. W tym przypadku w 95%–99% jąder odnotowano 2 sygnały dla każdej sondy. Rycina 1 przedstawia jądro w metafazie i interfazie z preparatu dla translokacji wzajemnej między krótkimi ramionami chromosomów 5 i 9.
Sygnały w jądrach w fazie interfazy blastomerów zarodka powinny być jasne i wyraźne, a ich ocena powinna być przeprowadzona przy użyciu oddzielnych filtrów pasmowych dla zastosowanych kolorów. Rycina 2 przedstawia jądro blastomeru z prawidłowym wzorem sygnałów (2 kopie dla wszystkich badanych loci), co jest zgodne z prawidłowym lub zbalansowanym zestawem chromosomów dla chromosomów 5 i 9, oraz jądro z nieprawidłowym wzorem sygnałów, odpowiadającym niezbalansowanemu produktowi translokacji, w którym występuje monosomia (jedna kopia) dla translokowanego segmentu chromosomu 5 oraz trisomia (3 kopie) dla translokowanego segmentu chromosomu 9.
<img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig1.jpg" alt="Analiza aberracji chromosomowych; technika FISH; schemat z chromosomami oznaczonymi jako der(9) i der(5)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Preparat metafazy oraz jądra w interfazie przygotowany z hodowli limfocytów krwi obwodowej od nosiciela translokacji wzajemnej ramion krótkich chromosomów 5 i 9 z punktami pęknięcia w 5p14.3 i 9p24.1: 46,XY,t(5;9)(p14.3;p24.1).ish t(5;9)(5ptel48-,9ptel30+;9ptel30-,5ptel48+,9cen+). Sondy FISH dobrano dla obu segmentów translokowanych (5p14.3→5pter, czerwona Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1→9pter, zielona Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) oraz dla segmentu centrycznego chromosomu 9 (9p24.1→9qter, niebieska Abbott CEP 9 alpha satellite SpectrumAqua).
<img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig2.jpg" alt="Schematy analizy fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wykrywania translokacji chromosomowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Sygnały w jądrach blastomerów w fazie interfazy z embrionów 3-dniowych, zarejestrowane przy użyciu różnych filtrów dla każdego fluorochromu i połączone w celu utworzenia obrazu kompozytowego. (A) Dwa sygnały dla każdej sondy wskazujące na dwie kopie każdego locus, co jest zgodne z prawidłowym lub zrównoważonym zestawem dla chromosomów z translokacją. (B) Jeden sygnał czerwony, trzy sygnały zielone i dwa sygnały niebieskie wskazujące na jedną kopię translokowanego segmentu chromosomu 5, trzy kopie translokowanego segmentu chromosomu 9 i dwie kopie segmentu centrycznego chromosomu 9, co jest zgodne z segregacją sąsiednią-1 (adjacent-1) translokacji, prowadzącą do powstania niezrównoważonego produktu z monosomią dla 5p14.3→5pter i trisomią dla 9p24.1→9pter.

<ol><li>Scriven, P. N., Handyside, A. H., Ogilvie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+translocations%3A+segregation+modes+and+strategies+for+preimplantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prenat.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Chromosome translocations: segregation modes and strategies for preimplantation genetic diagnosis.</a> Prenat. Diagn. 18, 1437-1449 (1998).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for chromosome rearrangements. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 194-201 (2009).</li>
<li>Harper, J. C., Coonen, E., Ramaekers, F. C. S., Delhanty, J. D. A., Handyside, A. H., Winston, R. M. L., Hopman, A. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+sex+of+human+preimplantation+embryos+in+two+hours+using+an+improved+spreading+method+and+fluorescent+in+situ+hybridisation+using+directly+labelled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Identification of the sex of human preimplantation embryos in two hours using an improved spreading method and fluorescent in situ hybridisation using directly labelled probes.</a> Hum. Reprod. 9, 721-724 (1994).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for sex-linked diseases and sex-selection for non-medical reasons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 230-235 (2009).</li>
<li>Munné, S., Lee, A., Rosenwaks, Z., Grifo, J., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+major+chromosome+aneuploidies+in+human+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplantation embryos.</a> Hum. Reprod. 8, 2185-2192 (1993).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for infertility (preimplantation genetic screening). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 203-229 (2009).</li>
<li>Scriven, P. N., Bossuyt, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+accuracy%3A+theoretical+models+for+preimplantation+genetic+testing+of+a+single+nucleus+using+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique.+Hum+Reprod%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetics%22%5BJournal%5D)">Diagnostic accuracy: theoretical models for preimplantation genetic testing of a single nucleus using the fluorescence in situ hybridization technique. Hum Reprod.</a> Cytogenetics. 5, 394-400 (2010).</li>
<li>Coonen, E., Dumoulin, J. C., Ramaekers, F. C., Hopman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+preparation+of+preimplantation+embryo+interphase+nuclei+for+analysis+by+fluorescence+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Optimal preparation of preimplantation embryo interphase nuclei for analysis by fluorescence in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 9, 533-537 (1994).</li>
<li>Dozortsev, D. I., McGinnis, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fixation+technique+for+fluorescence+in+situ+hybridization+for+preimplantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">An improved fixation technique for fluorescence in situ hybridization for preimplantation genetic diagnosis.</a> Fertil. Steril. 76, 186-188 (2001).</li>
<li>Hsu, L. Y., Benn, P. A., Tannenbaum, H. L., Perlis, T., Carlson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+polymorphisms+of+1%2C+9%2C+16%2C+and+Y+in+4+major+ethnic+groups%3A+a+large+prenatal+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosomal polymorphisms of 1, 9, 16, and Y in 4 major ethnic groups: a large prenatal study.</a> Am. J. Med. Genet. 26, 95-101 (1987).</li>
<li>Shim, S. H., Pan, A., Huang, X. L., Tonk, V. S., Varma, S. K., Milunsky, J. M., Wyandt, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+variants+with+D15Z1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Genet.+Technol%22%5BJournal%5D)">FISH variants with D15Z1.</a> J. Assoc. Genet. Technol. 29, 146-151 (2003).</li>
<li>Knight, S. J., Flint, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfect+endings%3A+a+review+of+subtelomeric+probes+and+their+use+in+clinical+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Perfect endings: a review of subtelomeric probes and their use in clinical diagnosis.</a> J. Med. Genet. 37, 401-409 (2000).</li>
<li>Thornhill, A. R., de Die-Smulders, C. E., Geraedts, J. P., Harper, J. C., Harton, G. L., Lavery, S. A., Moutou, C., Robinson, M. D., Schmutzler, A. G., Scriven, P. N., Sermon, K. D., Wilton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESHRE+PGD+Consortium+%28PGS%29+ESHRE+PGD+Consortium+%27Best+practice+guidelines+for+clinical+preimplantation+genetic+diagnosis+%28PGD%29+and+preimplantation+genetic+screening+%28PGS%29%27%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">ESHRE PGD Consortium (PGS) ESHRE PGD Consortium 'Best practice guidelines for clinical preimplantation genetic diagnosis (PGD) and preimplantation genetic screening (PGS)'.</a> Hum. Reprod. 20, 35-48 (2005).</li>
<li>Munné, S., Wells, D., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+requirements+for+preimplantation+genetic+diagnosis+to+improve+assisted+reproduction+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Technology requirements for preimplantation genetic diagnosis to improve assisted reproduction outcomes.</a> Fertil. Steril. 94, 408-430 (2010).</li>
<li>Wilton, L., Williamson, R., McBain, J., Edgar, D., Voullaire, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+a+healthy+infant+after+preimplantation+confirmation+of+euploidy+by+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Birth of a healthy infant after preimplantation confirmation of euploidy by comparative genomic hybridization.</a> N. Engl. J. Med. 345, 1537-1541 (2001).</li>
<li>Wells, D., Alfarawati, S., Fragouli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+comprehensive+chromosomal+screening+for+embryo+assessment%3A+microarrays+and+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Use of comprehensive chromosomal screening for embryo assessment: microarrays and CGH.</a> Mol. Hum. Reprod. 14, 703-710 (2008).</li>
<li>Handyside, A. H., Harton, G. L., Mariani, B., Thornhill, A. R., Affara, N., Shaw, M. A., Griffin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyomapping%2C+a+universal+method+for+genome+wide+analysis+of+genetic+disease+based+on+mapping+crossovers+between+parental+haplotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Karyomapping, a universal method for genome wide analysis of genetic disease based on mapping crossovers between parental haplotypes.</a> J. Med. Genet. 47, 651-658 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Zastosowanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do pojedynczej komórki embrionalnej (blastomeru) wiąże się ze szczególnymi wyzwaniami, zarówno w kwestiach praktycznych, jak i w interpretacji wzoru sygnałów. Pobrana podczas biopsji komórka musi zostać rozprzestrzeniona w obrębie zdefiniowanego obszaru na szkiełku, aby ułatwić jej lokalizację po przeprowadzeniu FISH; należy zachować szczególną ostrożność, aby upewnić się, że komórka została zlizowana, cytoplazma rozproszona, a jądro jest widoczne i nienaruszone; ponadto, ponieważ diagnoza zależy od wyników uzyskanych z tej jednej komórki, należy stosować rygorystyczne wytyczne dotyczące oceny i interpretacji. Jednak w rękach doświadczonego specjalisty FISH jest niezawodną techniką stosowaną w diagnostyce preimplantacyjnej (PGD) w praktyce klinicznej. Zasada PGD metodą FISH polega na wykorzystaniu specyficznych dla celu sond DNA, znakowanych różnymi fluorochromami lub haptenami, do oznaczenia liczby kopii konkretnych loci, a tym samym wykrycia niezrównoważenia chromosomowego związanego z segregacją meiotyczną rearanżacji chromosomowych (1), w tym translokacji Robertsona, translokacji wzajemnych, inwersji i rearanżacji złożonych (2). FISH może być również wykorzystywany do selekcji embrionów żeńskich w rodzinach z chorobami sprzężonymi z chromosomem X, dla których nie istnieje test specyficzny dla danej mutacji (3, 4). Bardziej kontrowersyjnie, FISH stosowano również do przesiewowego wykrywania sporadycznych aneuploidii chromosomowych w celu próby zwiększenia efektywności wspomaganej prokreacji (5, 6); jednak wartość prognostyczna tego testu z użyciem FISH jest prawdopodobnie nieakceptowalnie niska w większości przypadków i nie jest on zalecany do rutynowego stosowania w klinice (7). Niniejszy artykuł koncentruje się na aspektach technicznych i ograniczeniach metody FISH stosowanej w klinicznej diagnostyce pojedynczej komórki.
Metody rozprzestrzeniania i utrwalania pojedynczych blastomerów obejmują zastosowanie metanolu/kwasu octowego (5, 8), Tween/HCl (9) oraz kombinacji Tween/HCl i metanolu/kwasu octowego (10). Warianty tych metod obejmują traktowanie komórek roztworem hipotonicznym przed rozprzestrzenianiem i/lub traktowanie pepsyną i paraformaldehydem po utrwaleniu. Metoda powinna zostać odpowiednio zwalidowana w danym laboratorium (14). Metoda Tween/HCl jest szczegółowo opisana w niniejszym artykule. Metoda Tween/HCl jest prosta technicznie i wykazuje wysoką powtarzalność w różnych laboratoriach. Metoda ta może być stosowana do przygotowania pojedynczych jąder do diagnostyki FISH w celu określenia płci oraz wykrycia rearanżacji chromosomowych z akceptowalną dokładnością diagnostyczną (7).
Mieszaniny sond mogą składać się z sond znakowanych bezpośrednio i pośrednio, a także z sond pochodzących od różnych producentów. Należy unikać sond dla znanych polimorficznych regionów chromosomów (11, 12) oraz tych, które wykazują znaczną hybrydyzację krzyżową z innymi chromosomami (13), choć mogą one zostać zastosowane, jeśli wcześniejsze badania obojga partnerów potwierdzą ich specyficzność i przydatność do PGD. Dostępne fluorochromy/hapteny oraz strategie rozróżniania sond obejmują następujące opcje: Texas Red (TR), izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, sondy biotynilowane wykrywane za pomocą TR-awidyny, FITC-awidyny lub streptawidyny Cy-5 (wizualizowane przy użyciu filtra FarRed), mieszankę sond czerwonych i zielonych w celu uzyskania sygnału żółtego, drugą rundę hybrydyzacji oraz trzeci kolor uzyskany poprzez sekwencyjne wychwytywanie SpectrumOrange przy użyciu filtra TexasRed oraz filtra SpectrumGold).
Do określania płci zaleca się zestaw sond zawierający trzy sondy specyficzne dla regionów centromerycznych chromosomów X i Y oraz jednego autosomu (14); sonda autosomalna służy do ustalenia ploidii, a tym samym do rozróżnienia między trisomią X (2n, 47,XXX) a triploidią (3n, 69,XXX) oraz między tetrasomią X (48,XXXX) a tetraploidią (4n, 92,XXXX). Typowym zestawem sond stosowanym w takich przypadkach jest mieszanina Abbott AneuVysion zawierająca satelity alfa X, Y oraz 18; wykazano, że zestaw ten charakteryzuje się bardzo niskim stopniem polimorfizmu, w związku z czym wstępna analiza partnerów w zakresie reprodukcji nie jest wymagana (14).
Mieszanina sond dla konkretnej rearanżacji powinna: w idealnym przypadku zawierać sondy wystarczające do wykrycia wszystkich oczekiwanych produktów rearanżacji z niezrównoważeniem chromosomowym. Jeśli nie jest to możliwe, dopuszczalne mogą być mieszaniny sond, w których niewykryte produkty niezrównoważone zostały ocenione jako niezdolne do przeżycia w rozpoznawalnej ciąży i prawdopodobnie mają bardzo niską częstość występowania (14). Zostać przetestowana na metafazach hodowlanych limfocytów obojga partnerów reprodukcyjnych. Przynajmniej dziesięć preparatów metafaz powinno zostać zbadane pod kątem swoistości sond, polimorfizmów i hybrydyzacji krzyżowej, a w przypadku nosiciela rearanżacji chromosomowej, aby upewnić się, że sondy hybrydyzują zgodnie z oczekiwaniami z różnymi segmentami rearanżacji. Dodatkowo, należy ocenić co najmniej 100 jąder interfazowych z tych preparatów, aby ocenić swoistość, jasność i dyskretność sygnałów (14).
Dostępne są komercyjne zestawy sond PGS (np. Abbott MultiVysion PB lub PGT), celujące w chromosomy najczęściej wykazujące aneuploidię w produktach poczęcia i zawierające jedną sondę na każdy badany chromosom. Zazwyczaj jądro może zostać poddane drugiej hybrydyzacji z sondami dla dodatkowych chromosomów, co zapewnia analizę chromosomów 13, 15, 16, 18, 21, 22 oraz XY (14). Wartość predykcyjna tego testu z wykorzystaniem opisanej tutaj techniki rozcierania i FISH jest prawdopodobnie nieakceptowalnie niska w przypadku większości użytkowników, w związku z czym nie jest on zalecany do rutynowego stosowania w praktyce klinicznej (7, 15).
Techniki takie jak porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) stosowana do pojedynczych komórek pozwalają na badanie liczby kopii każdego chromosomu (Wilton et al. 2001), a wykorzystanie macierzy polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) i analizy ilościowej (Wells et al. 2008) lub genotypowania metodą „karyomappingu” (Handyside et al. 2009) stanowią obiecujące alternatywne techniki wykrywania aneuploidii chromosomowej. Jednakże granica rozdzielczości i dokładność w przypadku niezrównoważenia segmentów pozostają niepewne i prawdopodobne jest, że FISH nadal będzie preferowaną techniką w badaniu rearanżacji chromosomowych obejmujących małe segmenty.

<table><tbody><tr><td>Kwas solny, 2,5 l</td><td>VWR International</td><td>101254H</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu, 5 kg</td><td>VWR international</td><td>443827W</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu, 250 g</td><td>VWR international</td><td>26764.232</td><td></td></tr><tr><td>bezwodny wodorofosforan sodu(I), 500 g</td><td>VWR international</td><td>102494C</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan potasu, 500 g</td><td>VWR international</td><td>10203 4B</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu w granulkach, 500 g</td><td>VWR international</td><td>28245.265</td><td></td></tr><tr><td>Tween20, 500 ml</td><td>VWR international</td><td>663684B</td><td></td></tr><tr><td>etanol, 2,5 l</td><td>VWR international</td><td>8.18760.2500</td><td>Opłacone cło</td></tr><tr><td>cytrynian trisodu, 5 kg</td><td>VWR International</td><td>27833.363</td><td></td></tr><tr><td>Guma krowia, 250 ml</td><td>Cow Proofings Ltd.</td><td>Już niedostępne</td><td>Stare zapasy można wciąż znaleźć w sklepach plastycznych</td></tr><tr><td>DAPI/Antifade ES, 0,125&amp;mu;g/ml, 500 µl</td><td>Cytocell Ltd.</td><td>DES500L</td><td>150&amp;#x03BC;fiolka z odczynnikiem&amp;rsquo;dołączony do każdej sondy Cytocell TEL</td></tr><tr><td>lakier do paznokci, 12 ml</td><td>Buty</td><td>10088316001</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka aminowane, 25 szt.</td><td>Genetix</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, 0,1 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield, 10 ml</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>awidyna znakowana Texas Red, 0,001 ml</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2016</td><td></td></tr><tr><td>awidyna-FITC, 0,001 ml</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna Cy-5, 0,001 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>PA45001</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugi, 1,75 ml, opakowanie 500 szt.</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentrifugi, 0,6 ml, opakowanie 1000 szt.</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-060-C-CS</td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki uniwersalne 30 ml, opakowanie 400 szt.</td><td>Sterylina</td><td>128B</td><td>Dostępne w NHS Supply Chain, nr kat. KCP053</td></tr><tr><td>Blok grzejny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>palnik spirytusowy gniazdo palnika spirytusowego knot palnika spirytusowego</td><td>VWR international</td><td>451-0107 451-3112 451-3111</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pipety z korkiem</td><td>Fisher Scientific</td><td>PMK-300-052R</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki higieniczne, 100 opakowań</td><td>NHS SUPPLY CHAIN</td><td>MJT058</td><td></td></tr><tr><td>Metalowe tace hodowlane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe tace melaminowe</td><td>VWR international</td><td>682-009</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipety ustnej</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>HAE3700</td><td></td></tr><tr><td>Przewody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>filtr strzykawkowy, 0,2 µm&amp;mu;porowatość m, średnica 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FDM-340-010U</td><td></td></tr><tr><td>Rylec diamentowy</td><td>VWR international</td><td>818-0021</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzejny do szkiełek przedmiotowych</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HBOSBB</td><td></td></tr><tr><td>Komora do hybrydyzacji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rolka tkanki</td><td>ŁAŃCUCH DOSTAW NHS</td><td>MJT004</td><td></td></tr><tr><td>Słoik Schieferdeckera</td><td>VWR international</td><td>631-9313</td><td></td></tr><tr><td>Słoik Coplina</td><td>VWR international</td><td>631-9331</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta precyzyjna</td><td>VWR international</td><td>232-2123</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta tępa</td><td>VWR international</td><td>232-2113</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka 1000 ml</td><td>VWR international</td><td>213-1642</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fazowo-kontrastowy</td><td>Nikon Instruments</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>Karty do transferu bezwłókniste, opakowanie 100 szt.</td><td>Fisher Scientific</td><td>SDE1</td><td></td></tr><tr><td>Przedmioty szkiełka przedmiotowe z niebieskim matowym polem, pudełko 100 szt.</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3022</td><td></td></tr><tr><td>Łaseczki, 18x18 mm, nr 1, opakowanie 200 szt.</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3110</td><td></td></tr><tr><td> Kryszalki, 22x22 mm, nr 0, opakowanie 200 szt.</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3104</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, 22x50 mm, nr 0, opakowanie 100 szt.</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3206</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml, opakowanie 100 szt.</td><td>NHS Supply Chain</td><td>FWC045</td><td></td></tr><tr><td>Napiwek do pipety 1 ml, 10 stojaków po 1000 szt.*</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-T-1000-C-L-R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>LEEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Wyposażenie z grantu</td><td>W22</td><td></td></tr><tr><td>Termometr alkoholowy</td><td></td><td></td><td>Dostępne są różne źródła</td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Jenway</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda pH</td><td>VWR international</td><td>662-1759</td><td>Wtyk BNC pasujący do pH-metru Jenway 3305</td></tr><tr><td>Mieszadło z podgrzewaniem</td><td>Bibby</td><td>HC502</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura 1 ml, opakowanie 500 szt.</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>PIP4202</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm, 50 mm x 75 m</td><td>VWR international</td><td>291-1214</td><td></td></tr></tbody></table>

fish w diagnostyce preimplantacyjnej

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis 

Diagnostyka preimplantacyjna (PGD) jest uznaną alternatywą dla diagnostyki prenatalnej i polega na wyborze embrionów przed implantacją z kohorty uzyskanej dzięki technikom wspomaganego rozrodu (ART). Taka selekcja może być konieczna z powodu rodzinnej choroby monogenowej (np. mukowiscydozy) lub w przypadku, gdy jeden z partnerów jest nosicielem rearanżacji chromosomowej (np. dwustronnej translokacji wzajemnej). PGD jest dostępna dla par, które miały wcześniej dzieci z wadami i/lub w przypadku rearanżacji chromosomowych, nawracających poronień lub niepłodności. Oocyty aspiracyjne po stymulacji jajników są zapładniane poprzez imersję w nasieniu in vitro (IVF) lub poprzez wstrzyknięcie pojedynczego spermatozoonu do cytoplazmy (ICSI). Embriony w stadium przedimplantacyjnego podziału są poddawane biopsji, zwykle poprzez usunięcie pojedynczej komórki w 3. dobie po zapłodnieniu, a pobrana komórka jest badana w celu ustalenia statusu genetycznego embrionu. Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH) na utrwalonych jądrach pobranych komórek z wykorzystaniem specyficznych sond DNA jest preferowaną techniką wykrywania niezrównoważenia chromosomowego związanego z rearanżacjami chromosomowymi oraz selekcji embrionów żeńskich w rodzinach z chorobą sprzężoną z chromosomem X, dla której nie istnieje test specyficzny dla danej mutacji. Metoda FISH była również stosowana do przesiewowego badania embrionów w kierunku spontanicznej aneuploidii chromosomowej (znanej również jako PGS lub PGD-AS) w celu próby zwiększenia efektywności wspomaganego rozrodu; jednak wartość predykcyjna tego testu z wykorzystaniem opisanej tutaj techniki rozprzestrzeniania i FISH jest prawdopodobnie nieakceptowalnie niska w większości ośrodków i nie jest ona zalecana do rutynowego stosowania klinicznego. Opisujemy dobór odpowiednich sond do metody FISH w pojedynczej komórce, techniki rozprzestrzeniania jąder blastomerów oraz hybrydyzację in situ i ocenę sygnałów w zastosowaniu do PGD w warunkach klinicznych.

Niniejszy artykuł opisuje dobór odpowiednich sond do techniki single-cell FISH, metody preparowania jąder blastomerów, a także hybrydyzację in situ i ocenę sygnałów w kontekście diagnostyki przedimplantacyjnej (PGD) stosowanej w warunkach klinicznych.

FISH w diagnostyce preimplantacyjnej

Diagnostyka preimplantacyjna (PGD) jest ugruntowaną alternatywą dla diagnostyki prenatalnej i polega na selekcji embrionów przed implantacją z...

Celem niniejszej procedury jest zastosowanie techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu określenia statusu chromosomów płci lub translokacji w ludzkich embrionach in vitro obarczonych ryzykiem wad genetycznych. Osiąga się to poprzez lizę pojedynczej komórki pobranej podczas biopsji z embrionu w trzeciej dobie na szkiełku przedmiotowym i wysuszenie jądra komórkowego na powietrzu. Drugim krokiem jest denaturacja i hybrydyzacja DNA docelowego jądra z sondami DNA znakowanymi fluorochromami o różnych kolorach.Następnie nadmiar sondy jest usuwany poprzez rygorystyczne przemywanie, a jądro komórkowe jest barwione specyficznym dla DNA barwnikiem fluorescencyjnym. Ostatnim krokiem jest obserwacja jądra przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego oraz wykonanie obrazów cyfrowych. W rezultacie można uzyskać wyniki obrazujące liczbę kopii docelowych regionów chromosomowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką napotykają trudności, ponieważ znajduje się ona na samej granicy możliwości metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Na 24 godziny przed badaniem należy przygotować bufor do lizy komórek niezbędny do rozlewania preparatów. Roztwór należy przefiltrować i rozdzielić w aliquotach po 1 ml do 10–15 sterylnych probówek do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml; probówki należy zamknąć i opisać przed zamrożeniem w temperaturze -20 °C bezpośrednio przed procedurą biopsji.Rozmrozić bufor do lizy w temperaturze pokojowej. Za pomocą diamentowego rysika narysować mały okrąg o średnicy około pięciu milimetrów na spodniej stronie szkiełka powlekanego aminą, a następnie, używając twardego ołówka 4H, opisać szkiełko jako BLO, mając na dłoni rękawiczkę lateksową. Aby usunąć pył grafitowy, należy użyć osobnego szkiełka dla każdego lustra blastora w kolejności numerycznej.Następnie nanieś niewielką objętość buforu lizującego w obrębie okręgu. Przenieś biopsy blaster do buforu lizującego. Dodaj bufor lizujący w ilości niezbędnej do lizy komórki.Obserwuj jądro komórkowe, aby upewnić się, że pozostaje ono wewnątrz okręgu i nie zostanie utracone. Jeśli komórka nie posiada jądra lub ma wiele jąder, pobierz biopsję z innej komórki. Pozostaw preparat do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej.W pierwszej kolejności należy wstępnie przemyć próbki w słoikach Coplan, używając soli fizjologicznej z buforem fosforanowym przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy dwukrotnie przepłukać próbki w sterylnej wodzie destylowanej, odwodnić za pomocą serii stężeń etanolu przez dwie minuty dla każdego stopnia w temperaturze pokojowej i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Należy upewnić się, że preparaty są całkowicie zanurzone, a jeśli na powierzchni pojawi się pył grafitowy, należy go usunąć za pomocą czystej chusteczki.Zapisz położenie jądra w obrębie okręgu, wizualizując je za pomocą mikroskopu fazowo-kontrastowego. Następnie odwodnij próbki 100% etanolem przez dwie minuty w temperaturze pokojowej i wysusz na powietrzu. Teraz nanieś dwa µL mieszaniny sond i przykryj szkiełkiem podstawowym o wymiarach 9 x 9 mm.Krawędzie szkiełka nakrywkowego uszczelnij cementem gumowym. Przeprowadź denaturację. Inkubuj na bloku grzejnym w temperaturze 75 °C przez pięć minut, a następnie przeprowadź hybrydyzację przez noc w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C dla każdego słoika sprzęgającego.Równoważyć 50 mililitrów 0,4x SSC roztworu do rygorystycznego przemywania w łaźni wodnej o temperaturze 71°C. Umieścić butelkę z roztworem do rygorystycznego przemywania oraz pusty słoik do sprzęgania w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej, podgrzać do 71°C, dostosować pH roztworu do rygorystycznego przemywania i przelać go do słoików Cochina. Następnie ostrożnie usunąć klej gumowy z każdego preparatu i spłukać szkiełko nakrywkowe, używając 4x SSC 0,05% Tween 20 o pH 7 w temperaturze pokojowej.Próbki należy przemyć w roztworze do rygorystycznego płukania 0,4x SSC w temperaturze 71°C przez pięć minut, a następnie w roztworze 4x SSC z 0,05% Tween 20 w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. W przypadku sond znakowanych pośrednio należy odlać nadmiar cieczy z szkiełek, a następnie nanieść 20 µL przeciwciał sprzężonych z fluoresceincją, przykrywając je kwadratem paraformy o wymiarach 20 x 20 mm. Inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37°C przez 15 minut.Zdejmij folię Parafilm i wykonaj następujące etapy płukania w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Raz w roztworze 4× SSC z 0,05% tween 20 oraz dwukrotnie przez dwie minuty w PBS. Po odcieknięciu preparatów nałóż 6 µL medium montażowego Vector Shield zawierającego DPI na szkiełko 22 × 22 mm.Użyć szkiełka nakrywkowe nr 0 i odwrócić preparat nad nakrywką. Osuszyć nadmiar cieczy i zabezpieczyć krawędzie szkiełka nakrywkowego bezbarwnym lakierem do paznokci. Na koniec przeanalizować próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Każde jądro komórkowe powinno zostać ocenione przez dwóch niezależnych analityków. Należy również użyć oprogramowania do obrazowania, aby zarejestrować obraz jądra w celu potwierdzenia diagnozy wizualnej oraz archiwizacji obrazów w ramach laboratoryjnego zapewnienia jakości. Przedstawiona tutaj rozprawa metafazowa oraz jądro w interfazie, przygotowane z limfocytów krwi obwodowej, wskazują na nosiciela translokacji wzajemnej między krótkimi ramionami chromosomów pięć i dziewięć z punktami przełamania w 5p14.3 oraz 9p24.1.Sondy FISH uwidaczniają sygnały zarówno w segmentach translokowanych, jak i w segmencie centrycznym chromosomu 9. Jądra blastomerów w fazie interfazy z trzeciego dnia rozwoju embrionów mogą zostać zarejestrowane, a następnie połączone w celu utworzenia obrazu kompozytowego. Dwa sygnały dla każdej sondy wskazują na obecność dwóch kopii każdego locus, co jest zgodne z prawidłowym lub zrównoważonym zestawem chromosomów.W przypadku chromosomów z translokacją sygnały barwne wskazują na jedną kopię segmentu translokowanego chromosomu 5, trzy kopie segmentu translokowanego chromosomu 9 oraz dwie kopie segmentu centrycznego chromosomu 9. Dane te są zgodne z niezbalansowanym produktem monosomii dla 5p14.3 do 5pt oraz trisomii dla 9p24.1 do 9pt. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak analizować pojedynczą komórkę pobraną z biopsji zarodka ludzkiego i przygotować pojedyncze jądro komórkowe przy użyciu techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.Jest to istotne dla uzyskania powtarzalnych i optymalnych wyników testów służących do określenia komplementu chromosomów płci lub statusu translokacji zarodka.

fish-for-pre-implantation-genetic-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

FISH dla diagnostyki genetycznej przed implantacją

Funkcja genu może zostać zamaskowana w eksperymentach polegających na utracie funkcji, jeśli następuje kompensacja przez inny gen. Model rybki danio (zebrafish) zapewnia relatywnie wysokoprzepustowy sposób ujawniania takiej redundancji funkcjonalnej w żywych embrionach.

Podejście genetyki odwrotnej do badania redundancji funkcjonalnej podczas embriogenezy

Ten protokół opisuje metodę mutagenezy insercyjnej pułapki genowej przy użyciu Gal4-VP16 jako głównego reportera i GFP/RFP jako wtórnego reportera u danio pręgowanego. Około jedna na dziesięć ryb o wysokiej ekspresji F0 daje potomstwo pułapki genowej koeksprymujące GFP i RFP. Procedurę przesiewową można łatwo przeskalować, aby dostosować ją do wielkości laboratorium wykonującego badanie przesiewowe mutagenezy insercyjnej.

Pułapkowanie genów za pomocą Gal4 u danio pręgowanego

Danio pręgowany jest potężnym modelowym systemem do badań nad biologią rozwojową i chorobami ludzkimi ze względu na ich genetyczne podobieństwo do wyższych kręgowców. Protokół ten opisuje metodologię tworzenia haploidalnych zarodków danio pręgowanego, które można wykorzystać do strategii przesiewowych w celu identyfikacji recesywnych mutacji w genach niezbędnych do wczesnej embriogenezy.

Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro

Transgeniczne manipulacje i edycja genomu są kluczowe dla funkcjonalnego testowania ról genów i elementów cis-regulatorowych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji w celu generowania modyfikacji genomowych (w tym fluorescencyjnych konstruktów transgenów reporterowych za pośrednictwem Tol2, TALEN-ów i CRISPR) dla wyłaniającej się ryby modelowej, ciernika trójkolcowego.

Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych

Przedstawiono prosty i skuteczny protokół mikroiniekcji do edycji genów w zarodkach sumów kanałowych za pomocą systemu CRISPR/Cas9. W tym protokole przewodnikowe RNA i białko Cas9 zostały mikrowstrzyknięte do żółtka jednokomórkowych zarodków. Protokół ten został zweryfikowany poprzez wyeliminowanie dwóch genów związanych z odpornością suma kanałowego.

Mikroiniekcja białka CRISPR/Cas9 do suma kanałowego, Ictalurus punctatus, zarodków do edycji genów

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Danio pręgowany był używany jako wiarygodne modele genetyczne w badaniach biomedycznych, zwłaszcza wraz z pojawieniem się technologii edycji genów. Gdy spodziewane są fenotypy larw, ekstrakcja DNA i identyfikacja genotypu może być trudna. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę genotypowania larw danio pręgowanego, poprzez obcinanie ogonów, już po 72 godzinach od zapłodnienia.

Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

Tutaj wprowadzamy metodę sekwencjonowania półprzewodników do preimplantacyjnych testów genetycznych na aneuploidię (PGT-A) z zaletami krótkiego czasu realizacji, niskich kosztów i wysokiej przepustowości.

Sekwencjonowanie półprzewodników do preimplantacyjnych badań genetycznych w kierunku aneuploidii

Wczesny rozwój zależy od produktów dziedziczonych po matce, a rola wielu z tych produktów jest obecnie nieznana. W tym miejscu opisaliśmy protokół, który wykorzystuje CRISPR-Cas9 do identyfikacji fenotypów efektu matczynego w jednym pokoleniu.

Określanie roli genów ulegających ekspresji matki we wczesnym rozwoju za pomocą matczynych chrupek

Protokół przedstawia ogólne procedury laboratoryjne wymagane w preimplantacyjnych testach genetycznych na aneuploidię na platformie sekwencjonowania nowej generacji opartej na półprzewodnikach. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe etapy amplifikacji całego genomu, selekcji fragmentów DNA, budowy biblioteki, przygotowania szablonów i przepływu roboczego sekwencjonowania z reprezentatywnymi wynikami.

Preimplantacyjne badania genetyczne w kierunku aneuploidii na półprzewodnikowej platformie sekwencjonowania nowej generacji

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

Poznaj technikę FISH do preimplantacyjnej diagnostyki genetycznej w ludzkich zarodkach in vitro. Ta metoda umożliwia analizę chromosomów płci i translokacji z pojedynczych komórek.

FISH w diagnostyce preimplantacyjnej

Przeglądaj więcej filmów