Test klonogenny: Komórki adherentne

Cześć, mam na imię Lum i obecnie robię doktorat w Instytucie Serca i Cukrzycy BE IDI pod kierunkiem dr Toma Carianne, który jest szefem Laboratorium Medycyny Epigenomicznej. W tym filmie zademonstruję procedurę znaną jako Clon Genic Survival Assay. Jest to 50-letnia technika, która umożliwia ocenę wpływu różnych metod leczenia, takich jak narażenie na promieniowanie lub czynniki chemiczne, na żywotność reprodukcyjną komórek.

Test przeżycia kongenicznego jest centralną techniką w biologii radiacyjnej służącą do oceny wrażliwości na promieniowanie różnych linii komórkowych i testowania skuteczności różnych związków radioochronnych lub radioczułych. W przypadku stosowania linii komórkowej przylegającej do A, test przeżycia kriogenicznego składa się z trzech faz. Po pierwsze, leczenie monowarstwy przylegających komórek.

Po drugie, przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki i posiew ze znanej liczby komórek i pomalowanych szalek, a po trzecie, barwienie, liczenie i kolonie utworzone po okresie inkubacji. W tym filmie będę używał unieśmiertelnionych, ludzkich komórek miejsca cyno, aby zademonstrować, w jaki sposób poligeniczny test biblijny może być wykorzystany do określenia właściwości ochrony radiowej naturalnego przeciwutleniacza. 1225 M flas wysiewa się z komórek w pożywce o grubości pięciu mililitrów, tak aby w dniu eksperymentu w kolbie znajdował się 1 milion komórek.

50 mikrolitrów leku dodaje się w różnych stężeniach do pięciu mililitrów pożywki w każdej odpowiednio oznakowanej kolbie, aby osiągnąć wymagane stężenie, stosuje się pięć stężeń, a także jedną kontrolę nośnika w tym przypadku, PBS. Po dodaniu leku komórki inkubuje się przez godzinę w warunkach odpowiednich dla używanej linii komórkowej Po inkubacji. Strumień, z wyłączeniem grupy kontrolnej, jest napromieniowywany wybraną dawką, która w tym przypadku wynosi cztery szare wytwarzane przez źródło cezu emitujące promieniowanie gamma.

Po napromieniowaniu pożywki wylewa się i każdą kolbę przemywa się dwoma mililitrami PBS przez pięć minut. Po odlaniu PBS do każdej kolby dodaje się dwa milisy 0,05% trypsyny, aby odłączyć przylegające komórki A od kolby. Dolne pięć mililitrów DMEM zawierających 10% płodowej surowicy bydlęcej dodaje się następnie do każdej kolby w celu dezaktywacji trypsyny.

Pełna zawartość fasc jest następnie przenoszona do oznakowanych 10-mililitrowych tubek Falcon. Po zakończeniu probówki te są wirowane przez pięć minut, po czym supinator jest ostrożnie wyrzucany, nie naruszając podniebienia, a do każdej probówki dodaje się pięć mililitrów pożywki krecyjnej. Stężenie komórek w każdej próbce oblicza się ENC, podobnie jak objętość potrzebną każdej próbki do osiągnięcia końcowego stężenia komórek, które należy rozsiać na pięciu szalkach Petriego na próbkę z pięcioma mililitrami pożywki każda.

Na przykład w grupie kontrolnej 100 komórek jest platerowanych na naczynie, więc objętość potrzebna do osiągnięcia 500 komórek na 25 mililitrów jest obliczana dla bardziej skoncentrowanych próbek, należy przeprowadzić 10-krotne rozcieńczenie lub 100-krotne rozcieńczenie szeregowe, aby zminimalizować błąd związany z użyciem objętości mniejszych niż 100 mikrolitrów. Teraz wcześniej obliczoną objętość przygotowuje się do probówki Falcon zawierającej 25 mililitrów pożywki na każdą próbkę. Próbki można teraz przenieść do wcześniej oznakowanych naczyń wstępnych, dodając pięć mililitrów do każdej naczynia w celu łatwiejszej obsługi i transportu.

Przechowuj naczynia w dużym, sterylnym lub zdezynfekowanym pojemniku. Naczynia umieszcza się następnie w nawilżonym inkubatorze w odpowiednich warunkach i inkubuje przez osiem dni. Jeśli używasz keratynocytów po ośmiu dniach, ostrożnie wyjmij naczynia z inkubatora i ułóż je wszystkie jedna po drugiej w dygestorium.

Uważaj, aby obchodzić się z tym miejscem delikatnie, aby żadne kolonie, które się uformowały, nie zostały naruszone. Zdejmij pokrywki i dodaj pięć ml 0,9% soli fizjologicznej do każdego naczynia, aby je umyć. Skieruj końcówkę do przygotowania w róg naczynia i unikaj dotykania dna naczynia, aby żadne kolonie nie zostały przypadkowo zeskrobane.

Po pięciu minutach ostrożnie odessaj sól fizjologiczną. Teraz kolonie są mocowane za pomocą trzech mililitrów 4% formuły, a przewody należy wymienić, aby uniknąć parowania. Po 15 minutach do pół godziny preparat jest odsysany i odpowiednio usuwany.

Kolonie są teraz gotowe do barwienia 0,1% fioletem krystalicznym, do każdego naczynia dodaje się pięć mililitrów, a pokrywki wymienia się po pół godzinie do jednej godziny. Barwnik jest następnie zmywany wodą destylowaną, a naczynia są odwracane i pozostawiane do wyschnięcia na noc. Kolonie są teraz gotowe do policzenia.

Kolonie można liczyć ręcznie za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Każde skupisko komórek zawierające 50 lub więcej komórek jest uważane za kolonię. I na tym kończymy naszą demonstrację testu przeżycia kongenicznego.

Główną zaletą tego testu w porównaniu z innymi technikami jest to, że jest niezwykle czuły i może wykryć przeżycie w dużym zakresie nawet po sześciu logarytmach zabicia komórki. To, ta czułość jest osiągana poprzez powlekanie większej liczby komórek. Ten esej można z łatwością wykorzystać do innych celów, takich jak testowanie, takie jak testowanie cytotoksyczności.

Dzięki za oglądanie.