Name: Test klonogenny: Komórki adherentne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Poznaj test klonogenny dla komórek adherentnych w biologii radiacyjnej. Ta metoda ocenia żywotność reprodukcyjną komórek po napromieniowaniu lub ekspozycji na czynniki chemiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania kierujemy do Australian Institute of Nuclear Science and Engineering za udzielone wsparcie. TCK otrzymał nagrody AINSE. Epigenomic Medicine Lab jest wspierany przez National Health and Medical Research Council of Australia (566559). HR jest wspierany przez australijskie stypendium dla doktorantów oraz nagrody BakerIDI bright spark. Praca ta jest finansowana przez CRC for Biomedical Imaging Development Ltd (CRC-BID), powołany i wspierany w ramach programu Cooperative Research Centres rządu Australii. CO jest laureatem australijskiego stypendium dla doktorantów oraz dodatkowego stypendium CRC-BID.

1. Hodowla komórkowa i przygotowanie eksperymentalne
<ol>
<li>Ludzkie keratynocyty hoduje się jako monowarstwy w kolbach do hodowli tkankowej o powierzchni 75 cm2 zawierających 15 mL pożywki keratinocyte-SFM (K-SFM) (GIBCO, pożywka bezsurowicza) uzupełnionej o L-glutaminę (2 mM), czynnik wzrostu naskórka (5 ng/ mL), ekstrakt z przysadki bydlęcej (40 μg/ mL) oraz gentaomycynę (20 mg/ mL). Komórki hoduje się w warunkach zwiększonej wilgotności w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37°C.</li>
<li>Komórki wysiewa się do 12 kolb do hodowli tkankowej o powierzchni 25 cm2 zawierających 5 mL pożywki K-SFM.</li>
</ol>
Zawiesiny pojedynczych komórek przygotowuje się poprzez trypsynizację. Komórki przemywa się solą fizjologiczną buforowaną fosforanem i inkubuje z 0,05% roztworem trypsyny / EDTA przez 5-10 minut. Gdy komórki zaczną stawać się okrągłe, a około 30% z nich oddzieli się od podłoża, dodaje się 3 objętości medium Eagle'a modyfikowanego przez Dulbecco zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej, aby zneutralizować trypsynę. Komórki oddziela się poprzez pipetowanie w górę i w dół (20 razy). Liczbę komórek wyznacza się przy użyciu hemocytometru.
Odpowiednią liczbę komórek wysiewa się zgodnie z czasem podwojenia danej linii komórkowej (około 20 godzin dla ludzkich keratynocytów FEP-1811). Celem jest uzyskanie ~90% konfluencji (~106 komórek na kolbę) w dniu przeprowadzenia eksperymentu.
Eksperyment obejmujący 12 kolb jest optymalny dla pojedynczego testu klonogennego (sześć kolb kontrolnych nienapromieniowanych i sześć kolb napromieniowanych), który można przeprowadzić w ciągu około czterech godzin.


2. Traktowanie i naświetlanie
<ol>
<li>Traktuj komórki przez odpowiedni czas odpowiednim związkiem modyfikującym działanie promieniowania, a następnie poddaj je działaniu promieniowania jonizującego: promieniowania γ lub promieni rentgenowskich.</li>
</ol>
Zazwyczaj sześć kolb służy jako kontrole wydajności wysiewu (nieleczone) oraz kontrole z samym lekiem. Pozostałe sześć kolb poddawanych jest napromieniowaniu.
W tym przykładzie ludzkie keratynocyty poddano działaniu różnych stężeń Cinnulin PF (CPF; Integrity Nutraceuticals International, Spring Hill, TN, US; poniżej przedstawiono reprezentatywne dane dla 20 μg/mL), rozpuszczalnej w wodzie naturalnej formulacji przeciwutleniającej, przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Komórki naświetlono dawką 4 Gy przy użyciu źródła 137Cs (naświetlacz Gammacell 1000 Elite; Nordion International, ON, Canada; 1,6 Gy/min).

3. Wysiewanie
<ol>
<li>Po zakończeniu zabiegu uzyskuje się zawiesiny pojedynczych komórek zgodnie z wcześniejszym opisem.</li>
<li>Liczbę komórek w każdej próbce należy starannie odliczyć za pomocą hemocytometru, a następnie rozcieńczyć zawiesinę tak, aby do szalek Petriego wysiać odpowiednią liczbę komórek (pięć powtórzeń dla każdej próbki w szalkach 15 mm). 
Przy określaniu liczby komórek do wysiania na płytkę należy wziąć pod uwagę przewidywaną wydajność wysiewu i/lub frakcję przeżycia. Celem jest uzyskanie liczby kolonii w przedziale od 20 do 150.</li>
</ol>
Szalki Petri umieszcza się w plastikowym, nawilżonym pudełku do klonowania i inkubuje w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37°C w celu formowania kolonii.
Czas inkubacji niezbędny do formowania kolonii wynosi od 1 do 3 tygodni w zależności od linii komórkowej; przyjmuje się, że czas ten musi odpowiadać co najmniej sześciu podziałom komórkowym. W tym przykładzie szalki kontrolne dla ludzkich keratynocytów wymagają ośmiu dni, aby utworzyły dostatecznie duże klony składające się z 50 lub więcej komórek.

4. Fixowanie i barwienie kolonii
Następujące kroki należy wykonać w dygestorium.
<ol>
<li>Ostrożnie usuń pożywkę z każdej z płytek za pomocą aspiratora.</li>
<li>Przemyj każdą płytkę 5 mL 0,9% soli fizjologicznej.</li>
<li>Utrwal kolonie, stosując 5 mL 10% neutralnego buforowanego formaliny przez 15-30 minut.</li>
<li>Barwi przez 30-60 minut, używając 5 mL 0,01% (w/v) fioletu krystalicznego w dH2O.</li>
<li>Przemyj nadmiar fioletu krystalicznego dH2O i pozostaw płytki do wyschnięcia.</li>
</ol>
5. Liczenie kolonii
Stereomikroskop
<ol>
<li>Kolonie zawierające więcej niż 50 pojedynczych komórek są zliczane przy użyciu stereomikroskopu.</li>
</ol>
Obrazowanie cyfrowe i zliczanie przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu
<ol>
<li>Cyfrowe obrazy kolonii pozyskuje się za pomocą kamery lub skanera</li>
<li>Kolonie są liczone przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, zgodnie z poniższym opisem.</li>
</ol>
Liczenie komórek przy użyciu programu ImageJ (Fiji Wersja 1.44a)
<ol>
<li>Otwórz plik obrazu w programie Fiji, wybierając File -> Open.</li>
<li>W razie potrzeby przekonwertuj obraz na format 8-bitowy, przechodząc do Image -> Adjust...-> Threshold.</li>
<li>Dostosuj próg (threshold), aby zredukować poziom nieswoistego tła, tak aby wykryte zostały tylko kolonie.</li>
<li>Policz kolonie w następujący sposób: przejdź do Process -> Binary -> Find maxima.</li>
</ol>
W przypadku tego formatu obrazu tolerancję szumu można ustawić na 0. Należy upewnić się, że zaznaczono opcję jasnego tła, a następnie wyświetlić podgląd wykrytych maksimów, aby sprawdzić, czy wszystkie kolonie komórek zostały prawidłowo zarejestrowane.

<ol><li>Puck, T. T., Marcus, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+x-rays+on+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Action of x-rays on mammalian cells.</a> J Exp Med. 103, 653-666 (1956).</li>
<li>Hurlin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

W tym przykładzie ludzkie keratynocyty FEP-181 poddano działaniu różnych stężeń CPF do 100 μg/mL; dane przedstawiono dla stężenia 20 μg/mL CPF przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Po zakończeniu inkubacji komórki napromieniowano dawką 4 Gy przy użyciu źródła 137Cs (naświetlacz Gammacell 10 Elite; Nordion International, ON, Kanada; 1,6 Gy/min). W przypadku kontroli nieleczonej oraz prób tylko z lekiem, w każdej szalce Petriego wysiano 10 komórek, natomiast dla próbek napromieniowanych wysiano 10 komórek na szal...

<table><tbody><tr><td>Bezsierwatkowe pożywka dla keratynocytów</td><td>Pożywka wzrostowa</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>Uzupełniona o 2mM L-glutaminy, 20&amp;#x03BC;g/ml gentamycyny, czynnik wzrostu naskórka i ekstrakt z przysadki bydlęcej.</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>0,05% trypsyny / EDTA do odrywania komórek adherentnych; roztwór stok 10x rozcieńczony w PBS bez Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Modyfikowana pożywka podstawowa Dulbecco&amp;rsquo;s</td><td>Pożywka wzrostowa</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td>Uzupełniona o 10% FBS i 20&amp;#x03BC;g/ml gentamycyny; stosowana do neutralizacji trypsyny/EDTA.</td></tr><tr><td>0,09% roztwór soli fizjologicznej</td><td>Roztwór</td><td></td><td></td><td>Stosowany do przemywania kolonii.</td></tr><tr><td>10% neutralny buforowany roztwór formaliny</td><td>Roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>~4% formaldehydu; stosowany do fiksacji kolonii.</td></tr><tr><td>Fiolet krystaliczny</td><td>Proszek</td><td>SPI Supplies</td><td>02577-MB</td><td>0,01% roztwór fioletu krystalicznego, przygotowany w dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, stosowany do barwienia kolonii.</td></tr><tr><td>Naświetlacz Gammacell 1000 elite</td><td></td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>60 x 15 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td></td><td>Hawksley; Medical and Laboratory Equipment</td><td>AC1000</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik do klonowania</td><td></td><td></td><td></td><td>Plastikowy pojemnik z otworami w przeciwległych stronach pokrywy; do przechowywania szalek Petriego podczas długotrwałej inkubacji w celu tworzenia kolonii.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Typ 102</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Stosowany do zliczania kolonii składających się z &amp;gt;50 komórek.</td></tr></tbody></table>

test klonogenny: komórki adherentne

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Test klonogenny (lub test tworzenia kolonii) został opracowany ponad 50 lat temu; oryginalna publikacja opisująca tę technikę ukazała się w 1956 roku1. Poza udokumentowaniem metody, to przełomowe badanie pozwoliło na wyznaczenie pierwszej krzywej odpowiedzi na dawkę promieniowania dla komórek ssaczych (HeLa) w kulturze, naświetlanych promieniami rentgenowskimi1. W zasadzie test klonogenny umożliwia ocenę różnic w żywotności reprodukcyjnej (zdolności komórek do wytwarzania potomstwa; tzn. zdolności pojedynczej komórki do utworzenia kolonii liczącej 50 lub więcej komórek) pomiędzy niepoddanymi działaniu kontrolnymi komórkami a komórkami, które zostały poddane różnym zabiegom, takim jak ekspozycja na promieniowanie jonizujące, działanie różnych związków chemicznych (np. czynników cytotoksycznych) lub w innych przypadkach manipulacje genetyczne. Test ten stał się najszerzej akceptowaną techniką w radiobiologii i jest powszechnie stosowany do oceny radiowrażliwości różnych linii komórkowych. Ponadto test klonogenny jest powszechnie wykorzystywany do monitorowania skuteczności związków modyfikujących odpowiedź na promieniowanie oraz do określania wpływu czynników cytotoksycznych i innych leków przeciwnowotworowych na zdolność do tworzenia kolonii w różnych liniach komórkowych. Typowy eksperyment przeżywalności klonogennej z użyciem adherentnych linii komórkowych składa się z trzech odrębnych etapów: 1) traktowania monowarstwy komórek w kolbach do hodowli tkankowych, 2) przygotowania zawiesin pojedynczych komórek i wysiewu odpowiedniej liczby komórek na szalki Petriego oraz 3) utrwalania i barwienia kolonii po odpowiednim okresie inkubacji, który w zależności od linii komórkowej może trwać od 1 do 3 tygodni. W niniejszej pracy prezentujemy ogólną procedurę przeprowadzania testu klonogennego z adherentnymi liniami komórkowymi przy użyciu unieśmiertelnionej linii komórek keratynocytów ludzkich (FEP-1811)2. Naszym celem jest również opisanie wspólnych cech testów klonogennych, w tym obliczania wydajności wysiewu i frakcji przeżywalności po narażeniu komórek na promieniowanie, a także zilustrowanie modyfikacji odpowiedzi na promieniowanie z wykorzystaniem naturalnego preparatu antyoksydacyjnego.

Zastosowanie testu kolonogennego do oceny żywotności reprodukcyjnej jest uznane od ponad 50 lat. W niniejszym materiale przedstawiamy ogólną procedurę przeprowadzania testu kolonogennego z wykorzystaniem komórek adherentnych.

Test klonogenny: komórki adherentne

Test klonogenny (lub test tworzenia kolonii) został opracowany ponad 50 lat temu; pierwotna praca opisująca tę technikę została opublikowana w 1956 roku1. ...

Cześć, nazywam się Lum i obecnie przygotowuję doktorat w BE IDI Heart and Diabetes Institute pod kierunkiem dr Tom Carianne, która kieruje Epigenomic Medicine Lab. W tym filmie zaprezentuję procedurę znaną jako Clon Genic Survival Assay. Jest to technika opracowana 50 lat temu, która umożliwia ocenę wpływu różnych działań, takich jak ekspozycja na promieniowanie lub czynniki chemiczne, na zdolność komórek do reprodukcji.Test przeżywalności kogenicznej jest kluczową techniką w radiobiologii, służącą do oceny wrażliwości radiacyjnej różnych linii komórkowych oraz testowania skuteczności różnych związków radioprotekcyjnych lub radiosensybilizujących. W przypadku użycia adhezyjnej linii komórkowej, test przeżywalności kriogenicznej składa się z trzech etapów. Pierwszym z nich jest potraktowanie monowarstwy komórek adhezyjnych.Po drugie, przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek oraz wysiew znanej liczby komórek na szalki, a po trzecie, barwienie, liczenie i ocena kolonii utworzonych po okresie inkubacji. W tym filmie wykorzystam unieśmiertelnione ludzkie komórki cynocytów, aby zademonstrować, w jaki sposób test poligeniczny może być użyty do określenia właściwości radioprotekcyjnych

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test klonogenny: Komórki adhezywne

Niniejszy protokół wideo demonstruje sposób rozróżniania i zliczania rzeczywistych komórek macierzystych układu nerwowego w mieszanej populacji komórek prekursorowych układu nerwowego z wykorzystaniem testu tworzenia kolonii neuronalnych.

Test tworzenia kolonii neuronalnych: metoda różnicowania rzeczywistych komórek macierzystych układu nerwowego od komórek progenitorowych układu nerwowego

Niniejszy protokół opisuje prosty test adhezji bakteryjnej, polegający na zliczaniu jednostek tworzących kolonie bakterii, które przylgnęły do hodowli komórkowych. Test ten jest wiarygodny, niezależny od badanej adhezyny, a jego liczne modyfikacje są stosowane w większości laboratoriów zajmujących się patogenezą bakteryjną.

In Vitro Analiza Adhezji Bakteryjnej do Komórek Nabłonkowych Ssaków

Ten film opisuje test tworzenia kolonii, który pomaga określić zdolność komórek raka płuc do rozmnażania się w nieskończoność i tworzenia indywidualnych kolonii. Możemy przeanalizować wpływ środka przeciwnowotworowego na komórki tworzące kolonie, analizując zmiany w liczbie i/lub wielkości powstałych kolonii.

Test tworzenia kolonii: ocena skuteczności środków przeciwnowotworowych na komórkach raka płuc tworzących kolonie

W tym filmie przeprowadzamy test klonogenny keratynocytów pobranych od dorosłych myszy, aby określić zdolność poszczególnych komórek do proliferacji i tworzenia kolonii. Ta technika zbierania keratynocytów jest przydatna do badania innych dalszych aspektów chemicznej kancerogenezy skóry i promocji guza.

Test tworzenia kolonii keratynocytów: test in vitro oceniający zdolność keratynocytów do wzrostu w kolonie

Opracowaliśmy model in vitro uśpienia w szpiku kostnym dla wrażliwych na estrogeny komórek raka piersi. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie wykorzystania modelu do badania biologii molekularnej i komórkowej stanu spoczynku oraz do generowania hipotez do późniejszych testów in vivo.

Model spoczynku in vitro wrażliwego na estrogeny raka piersi w szpiku kostnym: narzędzie do badań mechanizmów molekularnych i generowania hipotez

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) odnoszą się do komórek, które mogą samoodnawiać się i różnicować w trzy linie nerwowe. W tym miejscu opisujemy protokół określania częstości NSC w danej populacji komórek za pomocą tworzenia i różnicowania neurosfery w warunkach klonalnych.

Liczenie nerwowych komórek macierzystych za pomocą testów klonalnych

Opisujemy metodę stabilnego znakowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) cząstkami lentiwirusowymi wyrażającymi białko zielonej fluorescencji i reportery lucyferazy. Metoda ta pozwala na śledzenie wzrostu PDX w miejscu pierwotnym, a także wykrywanie spontanicznych i eksperymentalnych przerzutów za pomocą systemów obrazowania in vivo.

Znakowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi za pomocą identyfikowalnych reporterów do badań wzrostu guza i przerzutów

Celem tego protokołu jest wyizolowanie keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry dorosłych myszy do różnych dalszych zastosowań, takich jak biologia molekularna, biochemia, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i podstawowe zastosowania in vitro (np. keratynocyty klonogenne).

Izolacja keratynocytów naskórka myszy i ich klonogenna hodowla in vitro

Farmakologiczne celowanie w kanały jonowe jest obiecującym podejściem do leczenia guzów litych. Podano szczegółowe protokoły charakteryzujące funkcję kanałów jonowych w komórkach nowotworowych i oznaczające wpływ modulatorów kanałów jonowych na żywotność raka.

Badania przesiewowe kanałów jonowych w komórkach nowotworowych

Koncepcja, wykonanie i walidacja platformy dodatkowej, która zapewnia zwiększoną kontrolę nad przestrzennym i czasowym natlenieniem w płytce 6-dołkowej. Urządzenie jest dostosowane do wielu systemów hodowli i może być wykorzystywane do badania wpływu tlenu na gojenie ran.

Wytwarzanie i obsługa wkładki tlenowej do adherentnych kultur komórkowych

Poznaj test klonogenny dla komórek adherentnych w biologii radiacyjnej. Ta metoda ocenia żywotność reprodukcyjną komórek po napromieniowaniu lub ekspozycji na czynniki chemiczne.

Test klonogenny: komórki adherentne

Przeglądaj więcej filmów