Rekonstrukcja kompleksu egzosomu metodą kriotomografii elektronowej pojedynczych cząsteczek z wykorzystaniem metody losowych przechyłów stożkowych

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest uzyskanie trójwymiarowej struktury kompleksu egzosomów przy użyciu metody losowego nachylenia stożkowego. Osiąga się to poprzez naniesienie w pierwszym kroku cienkiej warstwy błony węglowej na ażurową siatkę węglową, aby stworzyć podłoże wspierające dla kompleksu białkowego, a w drugim kroku poprzez zastosowanie barwnika. Preparat oraz barwnik nanosi się na siatkę, co powoduje zanurzenie preparatu w solach metali ciężkich.

Następnie przeprowadzana jest mikroskopia elektronowa w celu uzyskania par mikrografii próbki pod różnymi kątami nachylenia. W końcowym etapie, na podstawie analizy obrazów z wykorzystaniem metody losowego nachylenia stożkowego, otrzymuje się wyniki obrazujące trójwymiarową strukturę kompleksu egzosomów. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ przygotowanie odpowiedniej próbki do metody losowego nachylenia stożkowego, jak i następująca po nim procedura przetwarzania obrazów, bywają wymagające.

Demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy oceny jakości oraz przygotowania próbek są trudne do opanowania bez ilustracji procesu oceny próbki. Zasada metody losowego nachylenia stożkowego wymaga wykonania pary mikrofotografii tego samego obszaru próbki wewnątrz mikroskopu elektronowego. Jedno zdjęcie wykonuje się w pozycji bez nachylenia, a drugie po nachyleniu próbki pod kątem od 50 do 70 stopni. Za pomocą komputera zdigitalizowana para mikrofotografii jest zestawiana obok siebie, a w niniejszej ilustracji wyselekcjonowano obrazy tych samych cząstek.

Obrazy te są oznaczone numerami w współrzędnych trójwymiarowych. Obrazy cząstek niepochylonych oraz ich odpowiedników pochylonych są ze sobą powiązane kierunkiem osi pochylenia oraz kątem pochylenia. Wyrównanie obrazów cząstek niepochylonych przenosi obrazy cząstek pochylonych w ich odpowiadające lokalizacje asMule; wykorzystując wiele obrazów cząstek pochylonych wypełniających przestrzeń azymutalną, można zrekonstruować trójwymiarową strukturę cząsteczki za pomocą algorytmu wstecznej projekcji. Aby przygotować siatki, najpierw sporządzić 0,5% roztwór formVAR, dodając 0,45 g żywicy poliwinyloformalu oraz 90 ml chloroformu do szklanego zlewki o pojemności 100 ml.

W dygestorium przykryć zlewkę folią aluminiową i rozpuścić żywicę formvar. Przy użyciu małego mieszadła magnetycznego i mieszania magnetycznego rozpuszczanie żywicy trwa około 15 minut. W tym czasie oczyścić uprzednio oczyszczone szkiełka mikroskopowe w metanolu za pomocą chusteczek Kim wipes.

Po całkowitym rozpuszczeniu żywicy formvar w chloroformie, nanieś jeden mililitr 50% glicerolu na powierzchnię roztworu. Regulacja objętości dodanego glicerolu wpływa na gęstość otworów w porowatym węglu.

Zanurz końcówkę sonikatora w roztworze. Na głębokości około jednej cala, przy użyciu maksymalnej mocy, przeprowadź sonikację przez jedną minutę, co pozwoli na stworzenie emulsji kropli glicerolu w naszym roztworze. Dłuższa sonikacja spowoduje zmniejszenie rozmiaru otworów w porowatym węglu.

Po tym kroku roztwór staje się mętny. Niezwłocznie po kąpieli sonikacyjnej, czyste szkiełka przedmiotowe zanurza się pionowo w emulsji. Po jednej sekundzie należy je wyjąć i osuszyć dół szkiełek za pomocą papieru filtracyjnego, aby na ich powierzchni utworzyła się cienka warstwa plastikowa.

Po odparowaniu chloroformu należy sprawdzić gęstość i rozmiar otworów w błonie pod mikroskopem świetlnym. Opisane tutaj warunki przygotowania powinny zapewnić od 10 do 20 otworów w każdym kwadracie siatki o oczkach 400 mesh, o średnicach od trzech do czterech mikrometrów. Gdy szkiełka przedmiotowe wyschną, należy odciąć krawędź plastikowej błony na powierzchni szkiełka.

Wprowadzić preparat pionowo do wody destylowanej, aby film uniósł się na jej powierzchni. Cienki film na powierzchni wody można zaobserwować pod małym kątem względem odbicia światła. Na filmie należy kolejno umieszczać miedziane siatki o gęstości 400 mesh, tak aby gładka strona siatki była skierowana w dół.

Podnieś plastikową folię z siatką za pomocą kawałka papieru. Odwróć papier i pozostaw go do wyschnięcia. W szalce Petri zanurz papier w metanolu, aby usunąć resztki glicerolu z otworów, a następnie pozostaw papier do wyschnięcia na powietrzu.

Użyj naparowarki węglowej, aby pokryć siatki warstwą węgla o grubości około 20 nanometrów. Pożądaną grubość kontroluje się poprzez czas naparowywania. Grubość można określić na podstawie szarego koloru węgla w porównaniu z szarym kolorem warstwy węglowej o znanej grubości.

Namocz siatki z warstwą węglową w chloroformie w szklanej płytce Petri przez pół godziny w celu usunięcia formvaru; wysuszenie siatek w ten sposób pozwala na otrzymanie własnych ażurowych siatek węglowych. Następnie naparuj cienką warstwę węgla o grubości około 5 nm na świeżo rozłupaną powierzchnię miki. Potem ostrożnie umieść ażurowe siatki węglowe na fragmencie papieru filtracyjnego pod wodą destylowaną.

W domowej konstrukcji aparatu wypłyń cienką warstwę węgla z powierzchni miki na powierzchnię wody, a następnie powoli osadź ją na ażurowych siatkach węglowych. Podnieś papier filtracyjny z naniesionymi siatkami i pozostaw do wyschnięcia. W dygestorium rozpocznij negatywne barwienie kompleksu egzosomów, przygotowując świeży 2% roztwór mrachianu uranylu.

Zgodnie z opisem w procedurze pisemnej, należy przykryć probówkę z roztworem kawałkiem folii aluminiowej. Aby zapobiec ekspozycji na światło, roztwór musi zostać użyty tego samego dnia. Wykonaj wyładowanie żarowe cienkiej warstwy węgla na całej siatce węglowej, używając aparatury do wyładowań żarowych. Następnie połóż czysty papier filtrujący na blacie i nanieś pipetą trzy krople po 50 µL roztworu barwiącego formianem mocznika na powierzchnię papieru. Rozcieńcz kompleks egzosomów do stężenia około 50 nM, używając buforu do rozcieńczania. Nanieś pipetą 4 µL rozcieńczonego białka na siatkę poddaną wyładowaniu żarowemu.

Pozostaw próbkę na siatce przez jedną minutę, a następnie za pomocą pęsety odsącz pozostały roztwór kawałkiem papieru filtracyjnego. Natychmiast odwróć siatkę na pierwszą kroplę barwnika i przemyj ją, przesuwając siatkę kilka razy w przód i w tył przez około 10 sekund. Powtórz ten proces dla każdej z trzech kropli barwnika; po ostatnim płukaniu pozostaw barwnik na siatce na dodatkową jedną minutę.

Następnie należy usunąć barwnik za pomocą kawałka papieru filtracyjnego. Pozostaw cienką warstwę roztworu barwnika na powierzchni siatki i pozwól jej wyschnąć w dygestorium. Umieść siatkę z próbką w uchwycie, a następnie wprowadź uchwyt do mikroskopu elektronowego FEI TE nine 12.

Sprawdź siatkę z próbką przy niskim powiększeniu, aby znaleźć najlepiej zabarwione pola. Odpowiednie pole powinno zawierać kilkanaście otworów o wymiarach od około jednego do dwóch mikrometrów z ciemno zabarwionymi obszarami w ich wnętrzu. Włącz tryb niskiej dawki (low dose mode) w interfejsie użytkownika FEI, a następnie ustaw ostrość wyszukiwania oraz pozycję ekspozycji w trybie niskiej dawki.

Ustaw tryb wyszukiwania w trybie frakcyjnym przy długości kamery 1,5 metra. Ustaw ostrość na powiększenie 150 K, a obszar ekspozycji na powiększenie 50 K z czasem ekspozycji pomiarowej wynoszącym jedną sekundę. Zazwyczaj do przeprowadzenia wyrównania wykorzystuje się rozpoznawalny element na siatce, widoczny zarówno w trybie wyszukiwania, jak i w trybie ekspozycji.

W trybie wyszukiwania zlokalizuj otwory z dobrym barwieniem i zapisz ich położenie. Wykonaj zdjęcie kwadratu za pomocą kamery CCD. Przechyl próbkę pod kątem 55 stopni i wykonaj kolejne zdjęcie.

Porównaj oba obrazy i zidentyfikuj odpowiadające sobie otwory na obu mikrografiach. Przechyl stół z powrotem do poziomu zero stopni. Użyj zestawu do niskiej dawki (low dose kit), aby wykonać zdjęcia każdego otworu zidentyfikowanego w trybie wyszukiwania przy dużym powiększeniu i defokusie wynoszącym około -0,7 µm.

Po wykonaniu zdjęć wszystkich otworów, przechyl stolik pod kątem 55 stopni, zachowując to samo powiększenie. Wykonaj mikrografie przechylonej próbki przy defokusie wynoszącym około -1,2 µm. Zidentyfikuj odpowiadającą parę mikrografii pod kątem, opierając się na wzorach w mikrografiach przy niskim powiększeniu, wykorzystując nieregularny wzór domowej roboty perforowanych siatek węglowych.

Aby ułatwić korelację, należy wybrać pary mikrografii o różnych kątach nachylenia, w których cząsteczki są rozmieszczone równomiernie i nie posiadają otoczek (halo) wokół siebie. Mikrografie z wyraźnymi otoczkami barwnika powinny zostać odrzucone podczas przetwarzania danych. Rozpocznij od konfiguracji programu w sekcji procedury.

Przetwarzanie obrazów zostanie zademonstrowane z wykorzystaniem procesu 2D w pakiecie Eman. W celu zmiany formatu obrazu należy użyć pakietu iMagic five do wyrównania 2D oraz pakietu spider. Aby przeprowadzić rekonstrukcję i doprecyzowanie 3D, należy przekonwertować cyfrowy obraz Gatan DM trzech na format obrazu spider.

Używając polecenia process 2D, wybierz pary cząstek. Dzięki programowi internetowemu dołączonemu do pakietu programu spider, program automatycznie zapisuje współrzędne cząstek i wycina wszystkie wybrane cząstki za pomocą skryptu spider. Skrypt zapisuje stosy cząstek nachylone i nienachylone.

Konwertuj niepochylone cząstki UN do formatu IMAG five. Używając programu EM two EM, zastosuj filtr pasmowy (band pass) oraz maskę dla niepochylonych cząstek UN, korzystając z polecenia InCorp prep w IMAG five, a następnie wycentruj cząstki z nałożonym filtrem pasmowym za pomocą polecenia center. W programie IMAG five wyrównaj i klasyfikuj cząstki iteracyjnie do klas homogenicznych, wykorzystując skrypt wsadowy automatycznie wykonujący programy IMAG five.

Następnie należy użyć polecenia msa names in class w programie IMAG five, aby wygenerować tabelę wyszukiwania klas dla cząsteczek, a następnie za pomocą polecenia header wygenerować plik wykresu wartości translacji i rotacji dopasowania dla każdej cząsteczki. W iMagic five należy przekonwertować dopasowane cząsteczki do formatu spider za pomocą programu EM two EM. Następnie należy przekształcić tabelę wyszukiwania klas w pliki dokumentów spider.

Wartości translacji i rotacji wyrównania dla każdej cząsteczki są również konwertowane do pliku dokumentu spider. Zastosuj filtr pasmowy, maskę i wyśrodkuj nachylone cząsteczki w taki sam sposób, jak w przypadku cząsteczek nienachylonych w programie IMAG five, a następnie wygeneruj nowy zestaw danych dla wyśrodkowanych cząsteczek nachylonych. Utwórz pliki dokumentów kątowych z dokumentów wyrównania wieloreferencyjnego wygenerowanych przez IMAG five oraz plików DCB wygenerowanych przez program internetowy. Użyj skryptu projekcji wstecznej (back projection) w programie spider, aby uzyskać jeden model początkowy dla każdej średniej klasy.

Na koniec, za pomocą skryptu spider, przeprowadź doprecyzowanie projekcji początkowej objętości względem wszystkich cząsteczek niepochylonych, aby uzyskać końcową objętość za pomocą RCT. Uzyskano około 50 rekonstrukcji egzosomu. Objętości zostały wygenerowane z cząsteczek pochylonych odpowiadających każdej cząsteczce w 50 klasach cząsteczek niepochylonych.

Wykorzystując wsteczną projekcję zaimplementowaną w pakiecie spider, przeprowadzono następnie doprecyzowanie dopasowania projekcji. Używając tych objętości jako modeli początkowych, wygenerowano wyświetlaną objętość 3D egzosomu o rozdzielczości około 18 Å; następnie do mapy 3D można było wprowadzić modele atomowe różnych części kompleksu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania RCT do uzyskiwania rekonstrukcji trójwymiarowych – od przygotowania odpowiedniej siatki preparatu, poprzez wykonanie mikrografii, aż po uzyskanie rekonstrukcji przy użyciu technik analizy obrazu. Poza opisanym tutaj protokołem, w analizie obrazu istnieje kilka innych metod uzyskiwania końcowych rekonstrukcji.

Kluczowym krokiem w celu uzyskania wiarygodnej i prawidłowej rekonstrukcji jest praca z dobrze przygotowanym preparatem.