Rekonstrukcja kompleksu egzosomu w mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek metodą losowego pochylenia stożkowego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie trójwymiarowej struktury kompleksu egzosomu przy użyciu metody losowego stożkowego pochylenia. Osiąga się to poprzez najpierw nałożenie cienkiej warstwy filmu węglowego na świętą siatkę węglową, aby w drugim kroku stworzyć substrat podporowy dla kompleksu białkowego i barwienia. Próbkę i plamę nakłada się na siatkę, która zakopuje próbkę w solach metali ciężkich.

Następnie przeprowadza się mikroskopię elektronową w celu uzyskania par nachylenia mikrofotografii próbki. Finalnie uzyskuje się wyniki, które pokazują trójwymiarową strukturę kompleksu egzosomu na podstawie analizy obrazu metodą losowego stożkowego pochylenia. Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ czasami dobre przygotowanie próbki do metody losowego stożkowego pochylenia jest trudne, podobnie jak procedura przetwarzania obrazu, która następuje po View.

Demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania gatunku i próbki są trudne do nauczenia się bez ilustracji oceny próbki. Zasada metody losowego pochylenia stożkowego wymaga pobrania pary mikrofotografii tego samego obszaru próbki wewnątrz mikroskopu elektronowego. Jedno zdjęcie jest wykonywane jako próbka w pozycji niepochylonej, a drugie zdjęcie jest wykonywane dla próbki przechylonej pod kątem od 50 do 70 stopni Za pomocą komputera zdigitalizowana para mikrofotografii jest umieszczana obok siebie i na tej ilustracji wybierane są obrazy z tych samych cząstek.

Obrazy te są oznaczone liczbami we współrzędnych trójwymiarowych. Obrazy nienachylonych cząstek i ich nachylonych partnerów są skorelowane ze sobą przez kierunek osi nachylenia i kąt nachylenia. Wyrównanie nienachylonych obrazów cząstek przenosi obrazy nachylonych cząstek do ich odpowiednich lokalizacji jako aMule przy użyciu wielu obrazów nachylonych cząstek wypełniających przestrzeń azymutalną, trójwymiarową strukturę cząsteczki można zrekonstruować za pomocą algorytmu projekcji wstecznej, aby najpierw wytworzyć siatki, przygotuj 0,5% roztwór VAR, dodając 0,45 grama żywicy poliwinylowo-formalnej, i 90 mililitrów chloroformu do szklanej zlewki o pojemności 100 mililitrów.

W dygestorium przykryj zlewkę folią aluminiową i rozpuść żywicę z formy. Z ośmioma małymi mieszadłami i mieszadłem magnetycznym, żywica rozpuszcza się po około 15 minutach. W międzyczasie wyczyść wstępnie oczyszczone szkiełka mikroskopowe w metanolu i chusteczkami Kim.

Po uformowaniu żywica var jest całkowicie rozpuszczona. W chloroformie dodaj jeden mililitr 50% glicerolu na powierzchnię roztworu. Regulacja objętości dodanego glicerolu wpływa na gęstość w świętym węglu.

Wsyp końcówkę ultradźwięków do roztworu. Na głębokości około jednego cala użyj maksymalnej mocy do sonikacji przez jedną minutę, co spowoduje powstanie emulsji kropelek glicerolu w postaci naszego roztworu. Dłuższa sonikacja spowoduje mniejszy rozmiar w świętym węglu.

Po tym kroku roztwór staje się mleczny. Bezpośrednio po zanurzeniu sonikacyjnym czyste szkło wsuwa się pionowo do emulsji. Na jedną sekundę wyjmij je i osusz spód szkiełek za pomocą bibuły filtracyjnej, aby utworzyć cienką folię z tworzywa sztucznego na powierzchni szkiełków.

Po odparowaniu chloroformu sprawdź gęstość i rozmiar otworów w folii pod mikroskopem świetlnym. Opisane tutaj warunki przygotowania powinny wytworzyć od 10 do 20 otworów w każdym kwadracie siatki o oczkach 400 i średnicach od trzech do czterech mikrometrów. Po wyschnięciu szkiełek odetnij krawędź folii z tworzywa sztucznego na powierzchni szkiełka.

Usuń folię na powierzchni wody destylowanej, zanurzając szkiełko pionowo w wodzie. Cienką warstwę na powierzchni wody można zaobserwować pod kątem patrzenia na odbicie światła. Umieść 400 miedzianych siatek na folii, jeden po drugim, gładką powierzchnią siatki skierowaną w dół.

Podnieś plastikową folię z siatkami za pomocą kawałka papieru. Odwróć papier i pozostaw do wyschnięcia. Na szalce Petriego namocz papier w metanolu, aby usunąć resztki glicerolu z otworów i pozostaw papier do wyschnięcia na powietrzu.

Użyj parownika węglowego, aby pokryć siatki warstwą węgla o grubości około 20 nanometrów. Wykorzystanie czasu parowania do kontroli pożądanej grubości. Grubość można określić na podstawie szarego koloru węgla w porównaniu z szarym kolorem warstwy węgla o znanej grubości.

Namocz siatki warstwowe węgla z chloroformem na szklanej szalce Petriego przez pół godziny, aby usunąć usunięcie formy var form var, a następnie wysuszyć siatki, w wyniku czego uzyskasz domowe święte siatki węglowe. Następnie odparuj cienką warstwę węgla o grubości około pięciu nanometrów na świeżo rozszczepioną powierzchnię miki. Następnie ostrożnie umieść święte siatki węglowe na kawałku bibuły filtracyjnej pod wodą destylowaną.

W domowym aparacie wynieś cienki węgiel z powierzchni miki na powierzchnię wody i powoli osadzaj go na świętych siatkach węglowych. Podnieś bibułę filtracyjną z kratkami i pozostaw do wyschnięcia. W dygestorium rozpocznij negatywne barwienie kompleksu egzosomu, przygotowując świeży 2% roztwór mrówczanu pisuaru.

Zgodnie z opisem w procedurze pisemnej przykryj probówkę z roztworem kawałkiem folii aluminiowej Aby zapobiec ekspozycji na światło, roztwór należy stosować tak samo. Blask dzienny wyładowuje jeden cienki węgiel nad całkowicie węglową siatką za pomocą aparatu do wyładowań jarzeniowych. Następnie umieść kawałek czystego perfumy na stole stołowym, odpipetuj trzy 50-mikrolitrowe kropelki roztworu barwienia mrówczanu pisuaru na wierzchu perfilu, rozcieńczyć kompleks egzosomów do stężenia około 50 nanomolowych Za pomocą pipety buforowej do rozcieńczania cztery mikrolitry rozcieńczonego białka, aż do rozładowania siatki żarzenia.

Pozostaw próbkę na siatce przez jedną minutę, a następnie osusz pozostały roztwór kawałkiem bibuły filtracyjnej za pomocą pęsety. Odwróć siatkę natychmiast na pierwszą kroplę plamy i opłucz siatkę, przesuwając ją kilka razy w przód iw tył przez około 10 sekund. Powtórz ten proces dla każdej z trzech kropelek plamy po ostatnim spłukaniu, pozwól plamie pozostać na siatce przez dodatkową minutę.

Następnie zetrzyj plamę kawałkiem bibuły filtracyjnej. Utrzymuj cienką warstwę roztworu plamy na powierzchni kratki i pozwól siatce wyschnąć w dygestorium. Umieść siatkę próbki w uchwycie na próbkę, a następnie umieść uchwyt w mikroskopie elektronowym FEI TE nine 12.

Sprawdź siatkę próbki w małym powiększeniu, aby znaleźć najlepiej poplamione kwadraty. Dobry kwadrat wydaje się mieć tuzin otworów o wymiarach około jednego do dwóch mikrometrów i ciemne poplamione w nich obszary. Włącz tryb niskiej dawki w interfejsie użytkownika FEI i wyrównaj ostrość wyszukiwania i pozycję ekspozycji w trybie niskiej dawki.

Ustaw wyszukiwanie w trybie ułamkowym z kamerą o długości 1,5 metra. Ustaw ostrość na powiększenie 150 K i ustaw naświetlane na powiększenie 50 K z zmierzonym czasem ekspozycji wynoszącym jedną sekundę. Zwykle do wyrównania używany jest rozpoznawalny obiekt na siatce zarówno w trybie wyszukiwania, jak i ekspozycji.

Znajdź z dobrym zabarwieniem w trybie wyszukiwania i zapisz lokalizacje. Zrób zdjęcie kwadratu na matrycy CCD. Przechyl próbkę do 55 stopni i zrób kolejne zdjęcie.

Porównaj dwa zdjęcia i zidentyfikuj sparowane otwory na dwóch mikrofotografiach. Przechyl stolik do tyłu do zera stopni. Użyj zestawu do pomiaru niskiej dawki, aby zrobić zdjęcia każdego otworu zidentyfikowanego w trybie wyszukiwania w dużym powiększeniu z rozmyciem około minus 0.7 mikrometra.

Po zrobieniu zdjęć wszystkich otworów przechyl stolik do 55 stopni, używając tego samego powiększenia. Wykonaj mikrofotografie pochylonej próbki z rozmyciem około minus 1,2 mikrometra. Zidentyfikuj odpowiednią parę mikrofotografii nachylenia na podstawie wzorów na mikrofotografiach o małym powiększeniu, używając nieregularnego wzoru domowych siatek ze świętego węgla.

Aby pomóc w korelacji, wybierz pary nachylenia mikrografu z cząstkami o równomiernym rozkładzie i bez aureoli wokół cząstek. Te mikrofotografie z widocznymi plamami wokół nich należy wyrzucić w celu przetworzenia danych. Rozpocznij od konfiguracji programu W procedurze.

Przetwarzanie obrazu zostanie zademonstrowane przy użyciu procesu 2D w pakiecie Eman. Aby zmienić format obrazu, pakiet iMagic Five do wyrównania 2D i pakiet pająka. Aby przeprowadzić rekonstrukcję i udoskonalenie 3D, przekonwertuj obraz cyfrowy DM three Gatan na format obrazu pająka.

Korzystając z polecenia procesu 2D, wybierz pary cząstek. Korzystając z programu internetowego dystrybuowanego w pakiecie programu pająka, program automatycznie zapisuje współrzędne cząstek i umieszcza wszystkie wybrane cząstki za pomocą skryptu pająka. Skrypt zapisuje przechylone i niepochylone stosy cząstek.

Przekształć cząstki nachylone przez UN do formatu IMAG pięć. Korzystając z przepustu pasmowego programu EM two EM, przefiltruj i zamaskuj nachylone cząstki UN za pomocą polecenia przygotowania InCorp w IMAG five i wyśrodkuj pasmo przepuszczające zamaskowane cząstki za pomocą polecenia center. W imag five wyrównaj i sklasyfikuj cząstki iteracyjnie w jednorodne klasy za pomocą skryptu wsadowego automatycznie wykonującego pięć programów IMAG.

Następnie użyj polecenia MSA names in class w IMAG 5, aby wygenerować tabelę przeglądową cząstek w klasie, wygeneruj plik wykresu dla wartości translacji i obrotu wyrównania dla każdej cząstki za pomocą polecenia header. W iMagic five przekonwertuj wyrównane cząstki do formatu pająka za pomocą programu EM two EM. Następnie zmień tabelę przeglądową klas na pliki dokumentów pająka.

Wartości translacji i obrotu wyrównania dla każdej cząstki są również przekształcane w filtr pasmowy pliku dokumentu pająka, maskuje i centruje nachylone cząstki, tak jak w przypadku nienachylonych cząstek w IMAG pięć, generuje nowy zestaw danych dla cząstek nachylonych centralnie. Pliki dokumentów kątowych można tworzyć z dokumentów linii trasowania z wieloma odniesieniami wygenerowanych na podstawie formatu IMAG five oraz plików DCB wygenerowanych przez program internetowy. Użyj skryptu projekcji wstecznej w pająku, aby uzyskać jeden początkowy model dla każdej średniej klasy.

Na koniec wykonaj udoskonalenie projekcji początkowej objętości za pomocą skryptu pająka na wszystkich nienachylonych cząstkach, aby uzyskać końcową objętość za pomocą RCT. Uzyskano około 50 rekonstrukcji egzosomu. Objętości są generowane z nachylonych cząstek odpowiadających każdej cząstce w 50 klasach cząstek nienachylonych.

Korzystając z projekcji wstecznej zaimplementowanej w pakiecie pająka, następnie przeprowadzono udoskonalenie dopasowania projekcji Używając tych objętości jako modeli początkowych, a wyświetlana objętość 3D egzosomu została wygenerowana w dodatkowej rozdzielczości około 18 ang, możemy następnie zanurzyć się w modelach atomowych różnych części kompleksu na mapie 3D. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać RCT, aby uzyskać trójwymiarowe rekonstrukcje, od generowania dobrej narracyjnej siatki próbki do mikrofotografii peer-to-peer, a na końcu do uzyskania rekonstrukcji przy użyciu technik analizy obrazu. Oprócz opisanego tutaj protokołu, istnieje kilka metod uzyskiwania ostatecznych rekonstrukcji w analizie obrazu.

Najważniejszym krokiem do uzyskania wiarygodnej, prawidłowej rekonstrukcji jest praca z dobrze przygotowanym preparatem.