Frezowanie wiązką jonową (FIB) i skaningowa mikroskopia elektronowa tkanki mózgowej

Celem niniejszej procedury jest wykonanie serii obrazów z określonego obszaru tkanki mózgowej przy użyciu skupionej wiązki jonów oraz skaningowego mikroskopu elektronowego. Osiąga się to poprzez wstępne pocięcie mózgu na plastry, które zostają zabarwione, a następnie zatopione w żywicy. W drugim kroku obszar zainteresowania zostaje wycięty z zatopionego przekroju mózgu i zamocowany na pustym bloku żywicznym.

Trzecim krokiem jest przycięcie bloku żywicznego za pomocą ultramikrotomu i wykorzystanie wiązki jonowej mikroskopu do wyizolowania wyłącznie obszaru przeznaczonego do obrazowania. Ostatnim etapem jest seryjne obrazowanie powierzchni bloku żywicznego przy użyciu wiązki jonowej do wielokrotnego usuwania cienkich warstw przed wykonaniem każdego zdjęcia. W rezultacie można uzyskać seryjne obrazy przedstawiające wybrany obszar zainteresowania.

Seria obrazów jest zbierana automatycznie, a zbiór danych zazwyczaj składa się z izotropowych wokseli, dzięki czemu struktury obrazu można oglądać pod dowolnym kątem w stosie. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak transmisyjna mikroskopia elektronowa seryjnych przekrojów, jest możliwość uzyskania znacznie wyższej rozdzielczości w osi Z. W porównaniu do tomografii elektronowej pozwala ona na obrazowanie znacznie większych objętości przy optymalnej rozdzielczości dla próbek zatopionych w żywicy.

Procedurę rozpoczyna się od wyjęcia utrwalonego mózgu z znieczuplonego i perfundowanego szczura. Mózg należy zatopić w ciepłym 5% aerosie w plastikowej formie, ustawiając go pod odpowiednim kątem przed zastygnięciem aerosu. Następnie blok aerosu z mózgiem wewnątrz montuje się na uchwycie do próbek za pomocą wibratomu. Wycinane są 80 µm przekroje koronalne w liczbie wystarczającej do objęcia obszaru zainteresowania.

Następnie umieść próbki w 20 mililitrowych szklanych fiolkach izolacyjnych. Do jednej fiolki należy włożyć maksymalnie 10 sekcji. Przepłucz próbki trzykrotnie przez pięć minut każdorazowo w 0,1 molarnym buforze K coate.

Następnie próbki barwi się 1,5% cyjankiem potasu i 1% czetrotlenkiem osmu w 0,1 M buforze K coate przez 30 minut. Kontynuuje się barwienie próbek 1% czetrotlenkiem osmu w 0,1 M buforze K coate przez 30 minut. Po tym czasie próbki płucze się raz wodą dwukrotnie destylowaną przez trzy minuty, a następnie barwi 1% octanem aluminium w wodzie dwukrotnie destylowanej przez 30 minut.

Następnie płucz przekroje przez pięć minut w wodzie dwukrotnie destylowanej, a następnie odwodnij je w szeregu alkoholi o rosnącym stężeniu, poświęcając dwie minuty na każdą zmianę. Kolejnym krokiem jest zatopienie przekrojów w rosnących stężeniach żywicy Duran zmieszanej z alkoholem, z 30-minutowymi odstępami między zmianami. Rozpocznij od proporcji etanolu do żywicy 50 do 50, następnie 30 do 70, potem 10 do 90, aż w końcu pozostaw przekroje w 100% żywicy na 30 minut.

Następnie zastąp medium 100% świeżą żywicą duran. Mieszaj powoli przez jedną godzinę na mieszalniku walcowym. Po zatopieniu użyj drewnianego wykałaczkowego patyczka, aby umieścić przekroje na szklanych podstawkach mikroskopowych, które zostały wcześniej pokryte środkami oddzielającymi od formy.

Umieść na szkiełkach tak wiele sekcji, jak to możliwe, dbając jednocześnie o to, aby nie były one przepełnione. Upewnij się, że między szkiełkami do mikroskopu umieszczono etykietę identyfikacyjną. Umieść szkiełka w piecu w temperaturze 65 °C na 24 godziny.

Następnego dnia wyjmij próbki z pieca. Delikatnie wsuń żyletkę pomiędzy szklane okładki mikroskopowe i, trzymając palcami warstwę żywicy, wyjmij ją wraz z próbkami z pomiędzy okładki. Delikatnie opłucz próbkę pod bieżącą wodą.

Aby usunąć wszelkie środki rozdzielające formy, umieść próbkę pod stereomikroskopem z oświetleniem przechodzącym, używając obiektywu o małej powiększeniu. Zaznacz obszar zainteresowania cienką igłą. Użyj żyletki, aby wyciąć mały kwadrat o wymiarach 3 mm na 3 mm wokół obszaru zainteresowania.

Używając kleju akrylowego, przyklej mały blok żywicowy do górnej części pustego bloku żywicznego. Następnie zamocuj blok w uchwycie ultramikrotomu. Patrząc przez dołączony stereomikroskop, przytnij żyletką obszar wokół regionu zainteresowania, aż pozostanie jedynie niewielka piramida materiału.

Odetnij krawędź bloku blisko obszaru zainteresowania pod kątem do górnej powierzchni bloku, używając noża szklanego zamocowanego w ultramikrotomie. Dalsza obróbka bloku powinna być przeprowadzona w taki sposób, aby obszar zainteresowania mógł zostać precyzyjnie zlokalizowany względem wymiarów powierzchni bloku. Wyjmij blok z ultramikrotomu i umieść go pod mikroskopem światła przechodzącego.

Wykonaj zdjęcie obszaru zainteresowania. Używając piłki jubilerskiej, odetnij przyciętą kostkę od pozostałego kikutu żywicznego z farbą węglową. Przymocuj oddzielony blok SA do uchwytu próbek SEM i zorientuj go tak, aby strona przeznaczona do obrazowania była skierowana w stronę zewnętrznej krawędzi.

Po wyschnięciu kleju przenieś preparat do systemu napawania próżniowego i pokryj blok cienką warstwą złota o grubości powyżej 20 nanometrów. Blok tkankowy zatopiony w żywicy jest teraz gotowy do obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym z wiązką skupioną (FIB-SEM). Włóż próbkę wraz z uchwytem do mikroskopu przy niskim powiększeniu i korzystając z obrazowania elektronami wtórnymi, zorientuj blok tak, aby obszar zainteresowania oraz strona bloku przeznaczona do obrazowania były skierowane w stronę detektora.

Operator orientuje blok w taki sposób, aby powierzchnia przeznaczona do obrazowania znajdowała się równolegle do wiązki trawącej. Powoduje to, że wiązka elektronów jest skierowana pod kątem 54 stopni do tej powierzchni, przy zastosowaniu prądu wiązki jonowej od 13 do 27 nano amps. Przy napięciu 30 kilovolts.

Usuń wąski pas żywicy z przedniej części obszaru przeznaczonego do obrazowania. Następnie przełącz mikroskop w tryb obrazowania elektronów wstecznie rozproszonych, aby zobaczyć sfrazowaną powierzchnię znajdującą się nad obszarem zainteresowania. Korzystając z wcześniej wykonanego obrazu referencyjnego z mikroskopii świetlnej oraz obrazu sfrazowanej powierzchni, zlokalizuj dokładny region bloku do sfrazowania i obrazowania, wykorzystując system wtryskiwania gazu w mikroskopie.

Nanieś ochronną warstwę węgla lub metalu o grubości około jednego mikrona na powierzchnię bloku powyżej obszaru zainteresowania, stosując prąd 700 picoamps. Na koniec wykonaj milling regionu bloku, w którym zostaną wykonane ostateczne obrazy. Pozostaw wiązkę millingową do całkowitego wymillowania tej powierzchni obrazowania, aż na niej nie będą widoczne żadne artefakty millingowe.

Wybierz parametry mikroskopu do seryjnego obrazowania powierzchni. Typowe parametry to napięcia od 1,2 do 2 kV oraz rozmiary pikseli od 4 do 20 nm. Czas przebywania wiązki na pikselu powinien wynosić około 10 µs, aby całkowity czas obróbki powierzchni i wykonania jednego obrazu nie przekraczał dwóch minut.

Pozostaw mikroskop na co najmniej dwie godziny, aby ustabilizowały się wszelkie zmiany termiczne. Następnie rozpocznij proces frezowania i obrazowania w celu uzyskania serii obrazów z obszaru zainteresowania. Rysunek ten przedstawia obraz elektronów wstecznie rozproszonych w kontraście odwróconym, ukazujący ultrastrukturę w obrębie obszaru wrap brain.

Wszystkie błony są widoczne, podobnie jak duże struktury makromolekularne. Rysunek ten składa się z łącznie 1 600 obrazów zebranych w odstępach pięciu nanometrów, co daje stos obrazów z izotropowymi wokselami. Stos ten można obrazować w dowolnej płaszczyźnie z tą samą rozdzielczością.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania tkanki mózgowej do obrazowania seryjnego z wykorzystaniem skaningowego mikroskopu elektronowego z wiązką skupioną.