Name: Zogniskowane mielenie wiązki jonów i skaningowa mikroskopia elektronowa tkanki mózgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj metodę zogniskowanego mielenia wiązki jonów i skaningowej mikroskopii elektronowej do trójwymiarowego obrazowania tkanki mózgowej z żywicy. Technika ta umożliwia uzyskanie obrazów seryjnych z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Fixacja próbek i zatapianie w żywicy
<ol>
<li>Próbki świeżej tkanki i komórek utrwalono przez co najmniej 2 godziny w 2% paraformaldehydzie i 2,5% glutaraldehydzie w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4. Grubość próbki nie powinna przekraczać 0,150 mm, aby umożliwić odpowiednią penetrację utrwalacza; nie należy pozostawiać próbek w utrwalaczu dłużej niż przez 12 godzin.</li>
<li>Próbki umieszczono w 20 ml szklanych fiolkach do scyntylacji i przepłukano trzykrotnie, po 5 minut każdorazowo, w 0,1 M buforze kakodylanowym.</li>
<li>Barwienie przeprowadzono przy użyciu 1,5% (w/v) ferryjanku potasu i 1% (w/v) tetrautlenku osmu w 0,1 M buforze kakodylanowym (0,1 M, pH 7,4) przez 30 minut.</li>
<li>Barwienie przeprowadzono przy użyciu 1,0% (w/v) tetrautlenku osmu w 0,1 M buforze kakodylanowym przez 30 minut.</li>
<li>Jednorazowo przepłukano wodą dwukrotnie destylowaną przez 3 minuty.</li>
<li>Barwienie przeprowadzono przy użyciu 1% (w/v) octanu uranylu w wodzie dwukrotnie destylowanej przez 30 minut.</li>
<li>Przekroje przepłukano przez 5 minut w wodzie dwukrotnie destylowanej, a następnie odwodniono w serii alkoholi o rosnącym stężeniu, zmieniając roztwór co 2 minuty (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%).</li>
<li>Zatopiono w rosnących stężeniach żywicy Durcupan zmieszanej z etanolem, zmieniając roztwór co 30 minut, zaczynając od 50% Durcupan w etanolu, a następnie: 70%, 90%, 95% i 100%.</li>
<li>Wymieniono medium na świeżą żywicę Durcupan i powoli mieszano przez 4 godziny.</li>
<li>Za pomocą drewnianych wykałaczek przeniesiono przekroje na szklane szkiełka mikroskopowe pokryte środkiem oddzielającym od formy i umieszczono w piecu w temperaturze 65° C na 24 godziny.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki do FIB/SEM
<ol start="11">
<li>Oddzielić warstwę żywicy zawierającą próbki od dwóch szkiełek przedmiotowych i dokładnie wypłukać, aby usunąć pozostałości środka rozdzielającego formy.</li>
<li>Użyć mikroskopu światła przechodzącego z obiektywami o małym powiększeniu lub mikroskopu stereoskopowego z oświetleniem przechodzącym, aby zidentyfikować obszar zainteresowania w plastrze żywicy.</li> 
<li>Wyciąć mały kwadrat (3 mm x 3 mm) wokół obszaru zainteresowania za pomocą żyletki i przykleić go do góry pustego bloku żywicznego klejem akrylowym (Rysunek 1). Odczekać 5 minut do stwardnienia kleju, a następnie przejść do następnego kroku.</li>
<li>Zacisnąć blok w uchwycie ultramikrotomu i, korzystając z dołączonego stereomikroskopu, przyciąć materiał wokół obszaru zainteresowania za pomocą żyletki, aż pozostanie jedynie mała piramida materiału.</li>
<li>Dalszo przyciąć blok za pomocą noża szklanego zamocowanego w ultramikrotomie, tak aby obszar zainteresowania można było precyzyjnie zlokalizować względem wymiarów powierzchni bloku (Rysunek 1). Wyciąć jedną krawędź bloku, blisko obszaru zainteresowania, tak aby przez próbkę przebiegał prostopadły stopień (Rysunek 1 i 2). Stopień ten tworzy powierzchnię obrazowania (Rysunek 2).</li> 
<li>Wyjąć blok z ultramikrotomu i sfotografować obszar zainteresowania wewnątrz bloku, używając mikroskopu światła przechodzącego.</li>
<li>Odciąć przyciętym blok od pozostałego trzpienia żywicznego. Należy to zrobić za pomocą piłki jubilerskiej, aby upewnić się, że do FIB/SEM zostanie wprowadzony jedynie mały blok. Całkowita wysokość tego bloku nie powinna przekraczać 5 mm.</li>
<li>Przykleić blok do aluminiowego trzpienia pastą węglową, dbając o to, aby strona przeznaczona do obrazowania znajdowała się na zewnętrznej krawędzi (Rysunek 1).</li>
<li>Po wyschnięciu kleju pokryć blok cienką warstwą złota (&gt; 20 nm; system naparowy Cressington).</li>
</ol>
3. Obrazowanie w FIB/SEM
<ol start="20">
<li>Przy niskim powiększeniu, korzystając z obrazowania elektronów wtórnych ( 5 kV, 0,5 nAmp), ustaw bloczek tak, aby wybrany obszar zainteresowania i bok bloczka przeznaczony do obrazowania były zwrócone w stronę operatora (Rycina 2 c, d).</li>
<li>Ustaw bloczek tak, aby powierzchnia przeznaczona do obrazowania leżała równolegle do wiązki trawiącej. Oznacza to, że wiązka elektronów będzie zorientowana pod kątem 54 ° do tej powierzchni (Rycina 2 b).</li>
<li>Używając prądu wiązki jonowej 13 - 27 nAmps przy 30 kV, usuń wąski pas żywicy z przodu obszaru przeznaczonego do obrazowania.</li>
<li>Przełącz na tryb obrazowania elektronów wstecznie rozproszonych, aby zobaczyć wytrawioną powierzchnię nad obszarem zainteresowania.</li>
<li>Korzystając z referencyjnego obrazu z mikroskopii świetlnej (wykonanego w kroku 16) oraz obrazu wytrawionej powierzchni, zlokalizuj dokładny obszar na bloczku, który ma zostać wytrawiony i obrazowany (Rycina 2).</li>
<li>Za pomocą systemu wtrysku gazowego mikroskopu nanieś warstwę ochronną (o grubości około 1 mikrona) węgla (lub metalu) na powierzchnię bloczka nad obszarem zainteresowania (Rycina 2).</li>
<li>Używając prądu 700 picoAmps, precyzyjnie wytraw obszar bloczka, w którym zostaną wykonane końcowe obrazy.</li>
<li>Pozostaw wiązkę trawiącą do całkowitego wytrawienia tej powierzchni obrazowania, aż na powierzchni nie będą widoczne żadne artefakty trawienia. Całkowite wytrawienie powierzchni sprawdza się, obserwując zmiany na każdym kolejnym obrazie w całym polu widzenia. Niedostateczne trawienie może objawiać się jako białe smugi lub „kurtyny” pojawiające się pionowo na obrazie.</li>
<li>Pozostaw mikroskop na co najmniej 2 godziny, aby wszelkie zmiany termiczne uległy rozproszeniu. Zmniejsza to ryzyko dryftu powierzchni bloczka podczas obrazowania, co mogłoby skutkować przesunięciem obrazów.</li>
<li>Wybierz parametry mikroskopu do seryjnego obrazowania powierzchni. Upewnij się, że napięcie wiązki elektronów jest wystarczająco niskie, aby obrazować jedynie bardzo płytką warstwę materiału na powierzchni bloczka. Powinno to być również znacznie płycej niż grubość warstwy przeznaczonej do usunięcia. Typowe parametry obrazowania to napięcia od 1,2 - 2,0 kV przy rozmiarach piksela od 4 - 20 nm. Czas przebywania wiązki na pikselu powinien wynosić około 10 μsecs, aby całkowity czas wytrawienia powierzchni i pozyskania jednego obrazu nie przekroczył 2 minut (Rycina 3).</li>
</ol>
4. Klucze do sukcesu
Krok 1) Należy upewnić się, że próbki nie są grubsze niż 150 micronów. Umożliwi to odpowiednią penetrację różnych barwników i żywicy w głąb materiału. Można to osiągnąć poprzez cięcie próbek w wibrotomie bezpośrednio po utrwaleniu. Taka grubość jest odpowiednia dla tkanki mózgowej. W przypadku innych tkanek konieczne jest przeprowadzenie testów w celu zapewnienia prawidłowego utrwalenia i barwienia.
Krok 3) Podczas wprowadzania tego wtórnego utrwalacza próbki muszą być swobodnie rozłożone w całym roztworze, a nie skupione w jednej części fiolki. Zapewni to maksymalną penetrację próbki i ograniczy ryzyko jej zniekształcenia podczas procesu utrwalania. Osiąga się to poprzez delikatne zamieszanie próbek w fiolce bezpośrednio po dodaniu roztworu.
Krok 15) Upewnij się, że obszar zainteresowania znajduje się bezpośrednio poniżej (&lt; 30 micronów) powierzchni bloku. Pozwoli to ograniczyć zakres trawienia wiązką jonową podczas fazy akwizycji obrazu.
Krok 22) Czas skanowania wiązki jonowej musi być odpowiedni, aby zapewnić całkowite wytrawienie całej powierzchni obrazowania. Niewystarczające wytrawienie objawi się w postaci białych smug lub „kurtyn” przebiegających pionowo w dół powierzchni obrazowania.
Krok 26) Końcowa sfrezowana powierzchnia musi być większa od powierzchni obrazowanej. Wynika to z faktu, że sfrezowana żywica jest wyrzucana z bloku i ponownie osadza się na jego powierzchni w bezpośrednim sąsiedztwie. Ponowne osadzenie to może naruszyć pole widzenia obrazowania, czego można uniknąć, frezując obszar znacznie większy niż ten, który jest obrazowany. W przypadku okna obrazowania o szerokości 20 µm, szerokość sfrezowanej powierzchni bloku powinna przekraczać 30 µm.
Krok 29) Kluczowe jest, aby parametry wiązki elektronów były tak dobrane, by obraz był generowany przez elektrony pochodzące z zaledwie kilku pierwszych nanometrów powierzchni bloku. Osiąga się to poprzez zminimalizowanie napięcia poniżej 2 kV, co zapobiega zbyt głębokiej penetracji elektronów. Pomocne jest również zastosowanie napięcia siatki na detektorze, dzięki czemu do końcowego obrazu przyczyniają się tylko elektrony o najwyższych energiach. Typowo, dla napięcia obrazowania 1,5 kV, stosuje się napięcie siatki 1,3 kV.
5. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="Przygotowanie próbek neurologicznych, przekroje tkanki mózgowej; proces implantacji mikroelektrod." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Przygotowanie bloku żywicznego. a) Przekrój koronowy mózgu dorosłego szczura zatopiony w żywicy (grubość 80 mikronów) oglądany w stereomikroskopie. Obraz wyraźnie pokazuje różne obszary mózgu, które można wyciąć z przekroju (b) za pomocą ostrza skalpela. W tym przypadku wycinany jest kwadrat o boku 1 mm z kory mózgowej, a następnie (c) przyklejany do pustego bloku żywicznego. d) Blok żywiczny jest następnie przycinany nożem szklanym zamontowanym w ultramikrotomie, a po zredukowaniu bloku tak, aby pozostał jedynie obszar zainteresowania (e), wycina się stopień prostopadle do przedniej powierzchni zatopionego materiału. f) Cały przycięty obszar zostaje następnie wycięty z pozostałej części żywicy i zamocowany na aluminiowym stubie, przygotowany do napylania metalem i obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym.
<img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="Schemat statycznej równowagi nanostruktury z pomiarem kąta; analiza z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Przygotowanie powierzchni bloku do obrazowania FIB/SEM. a) i b) przedstawiają ilustracje bloku oraz krawędzi, która jest frezowana w celu utworzenia powierzchni obrazowania (oznaczonej czarną strzałką dwustronną). Położenie wiązki jonowej (biała) pokazano równolegle do powierzchni obrazowania, a wiązka elektronowa (szara) uderza w powierzchnię pod kątem 54° względem wiązki jonowej. c) przedstawia widok bloku uzyskany za pomocą wiązki elektronowej i obrazowany z wykorzystaniem elektronów wtórnych. Wzdłuż tej strony bloku ciemniejszy obszar (oznaczony przerywaną białą ramką) pokazuje fragment powierzchni, który został wstępnie wyfrezowany (oznaczony czarną strzałką dwustronną), aby odsłonić znajdującą się poniżej próbkę. d) Gdy ten obszar jest obrazowany wyłącznie z wykorzystaniem elektronów wstecznie rozproszonych, widoczna jest zatopiona tkanka. Tutaj pełna szerokość sekcji zatopionej tkanki jest zaznaczona białą strzałką dwustronną. Pasek skali na c) wynosi 100 microns.
<img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="Analiza struktury neuronu za pomocą trójwymiarowej mikroskopii elektronowej; obrazowanie ujawnia szczegółową anatomię komórkową." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Obrazowanie objętości tkanki mózgowej z izotropowymi wokselami. a) Obraz z odwróconym kontrastem uzyskanym metodą rozproszonych elektronów (backscattered image) z powierzchni bloku, przedstawiający ultrastrukturę w obszarze mózgu szczura. Widoczne są wszystkie błony oraz duże struktury makromolekularne. b) Zebrano łącznie 1600 obrazów z odstępem 5 nm, co pozwoliło na uzyskanie stosu obrazów z izotropowymi wokselami. c) Stos ten można obrazować w dowolnej płaszczyźnie z tą samą rozdzielczością. Obraz przedstawia pojedyncze połączenie synaptyczne obrazowane w płaszczyźnie x y oraz w płaszczyźnie y z.

<ol><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li>
<li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope%3A+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li>
<li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Technika FIB/SEM działa optymalnie, gdy obszar zainteresowania nie jest zbyt duży. Górna granica obrazowanej objętości zależy od wiązki jonowej i obszaru, który można konsekwentnie i wielokrotnie trawić przez wiele godzin. Do tej pory osiągnięto to dla obszarów o wymiarach około 60 x 60 mikronów, jednak obrazowanie całego tego obszaru z odpowiednią rozdzielczością nie jest możliwe, głównie ze względu na czas potrzebny na zarejestrowanie tak dużego obrazu. Przykładowo, pozyskanie obrazu 4 k x 4 k przy czasie przebywania piksela 10 mikrosekund zajęłoby 2 minuty i 40 sekund, co przy polu widzenia 60 mikronów dałoby rozmiar piksela wynoszący zaledwie 15 nm. Do obrazowania ultrastruktury komórek i tkanek bardziej odpowiedni jest mniejszy rozmiar piksela, zazwyczaj między 4 a 10 nm / piksel. Dla obszaru 60 x 60 mikronów obraz byłby pozyskiwany przez 10 godzin, nawet gdyby mikroskop posiadał taką możliwość. Z tych powodów mikroskop ten jest idealnym narzędziem do obrazowania objętości rzędu 10 x 10 x 10 mikronów lub istotnych fragmentów całych komórek. Można to łatwo zrealizować w ciągu 48 godzin na próbkach, które wykazują dobry kontrast przy zastosowaniu tej procedury.
Do tej pory protokół ten był stosowany głównie w przypadku tkanki mózgowej, a także różnych typów hodowlanych komórek ssaków przylegających do szkiełek podstawowych. Niemniej jednak procedura fiksacji i barwienia może być wykorzystana w wielu innych typach materiału biologicznego, w tym materiału roślinnego, w celu uzyskania stosów obrazów o równie dobrym kontraście.
Zatem główną zaletą tej techniki jest możliwość obrazowania objętości z izotropowymi wokselami. Stosy obrazów tego typu pozwalają na analizę objętości 3D przy użyciu obrazów pobranych z dowolnej płaszczyzny stosu. Korzyścią z tego rozwiązania jest umożliwienie obserwatorowi obrazowania cech w serii obrazów z dowolnego kierunku oraz zapewnienie większej szczegółowości obrazu (Rycina 3).

<table><tbody><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy: Leica MZ8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>żywica Durcupan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskop FIB/SEM (Zeiss, NVision 40)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka histologiczne</td><td>Menzel-Glaser</td><td>AA00008032E</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do wycinania noży szklanych: Leica EM KMR2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklane fiolki scyntylacyjne (20 ml)</td><td>EMS</td><td>72634</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>EMS</td><td>16222</td><td></td></tr><tr><td>Jubiler&amp;rsquo;piła tarczowa</td><td>EMS</td><td>72010</td><td></td></tr><tr><td>Środek rozdzielający do form</td><td>Glorex, Szwajcaria</td><td>62407445</td><td></td></tr><tr><td>Tetrotlenek osmu</td><td>EMS</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>RT 19208</td><td></td></tr><tr><td>Sole fosforanowe do buforu fosforanowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71642 i 71496</td><td></td></tr><tr><td>Kacodylan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20840</td><td></td></tr><tr><td>Sputter coater z tarczą złota</td><td>Cressington Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bufor Tris (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1378</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom: Leica UCT</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>EMS</td><td>RT 22451</td><td></td></tr></tbody></table>

frezowanie wiązką jonową (fib) i skaningowa mikroskopia elektronowa tkanki mózgowej

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania próbek biologicznych, takich jak tkanka mózgowa, w trzech wymiarach przy użyciu skupionej wiązki jonów i skaningowego mikroskopu elektronowego (FIB/SEM). Próbki utrwalane są aldehydami, a następnie barwione metalami ciężkimi przy użyciu czwartotlenku osmu i octanu uranylu. Następnie poddawane są odwodnieniu alkoholem oraz infiltracji żywicą, która jest następnie utwardzana. Przy użyciu mikroskopu świetlnego i ultramikrotomu z nożami szklanymi przygotowywany jest niewielki blok zawierający obszar zainteresowania znajdujący się blisko powierzchni. Blok ten umieszcza się w FIB/SEM, a następnie za pomocą wiązki jonów wykonuje się wstępne frezowanie pionowej płaszczyzny wzdłuż jednej strony bloku, w pobliżu tego obszaru. Wykorzystując elektrony wstecznie rozproszone do obrazowania struktur pod powierzchnią, frezowana jest mniejsza płaszczyzna za pomocą cieńszej wiązki jonów, a powierzchnia jest dokładniej analizowana w celu ustalenia dokładnego obszaru płaszczyzny do obrazowania i frezowania. Parametry mikroskopu są następnie ustawione tak, aby płaszczyzna była wielokrotnie frezowana i obrazowana, co pozwala na gromadzenie obrazów seryjnych z całej objętości bloku. Stos obrazów zazwyczaj zawiera izotropowe woksele o wymiarach tak małych jak 4 nm w każdym kierunku. Taka jakość obrazu w dowolnej płaszczyźnie obrazowania umożliwia użytkownikowi analizę ultrastruktury komórek pod dowolnym kątem widzenia w obrębie stosu obrazów.

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i obrazowania w trzech wymiarach tkanki mózgowej zatopionej w żywicy przy użyciu skupionej wiązki jonów oraz skaningowego mikroskopu elektronowego.

Frezowanie wiązką jonową (FIB) i skaningowa mikroskopia elektronowa tkanki mózgowej

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania próbek biologicznych, takich jak tkanka mózgowa, w trzech wymiarach z wykorzystaniem skupionej wiązki jonów/skaningowego mikroskopu elektronowego...

Celem niniejszej procedury jest wykonanie serii obrazów konkretnego obszaru tkanki mózgowej przy użyciu skupionej wiązki jonów oraz skaningowego mikroskopu elektronowego. Osiąga się to poprzez wstępne pocięcie mózgu na plastry, które są następnie barwione i zatapiane w żywicy. W drugim kroku obszar zainteresowania zostaje wycięty z zatopionego przekroju mózgu i zamocowany na pustym bloku żywicznym.Trzecim krokiem jest przycięcie bloku żywicznego za pomocą ultramikrotomu oraz wykorzystanie wiązki jonowej mikroskopu do wyizolowania wyłącznie obszaru przeznaczonego do obrazowania. Ostatnim etapem jest seryjne obrazowanie powierzchni bloku żywicznego przy użyciu wiązki jonowej do wielokrotnego usuwania cienkich warstw przed wykonaniem każdego obrazu. W rezultacie można uzyskać serie obrazów przedstawiających obszar zainteresowania.Seria obrazów jest gromadzona automatycznie, a zbiór danych zazwyczaj posiada izotropowe woksle, co umożliwia oglądanie struktur obrazowych pod dowolnym kątem w stosie. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak transmisyjna mikroskopia elektronowa sekcji seryjnych, jest możliwość uzyskania znacznie wyższej rozdzielczości w osi Z. W porównaniu natomiast do tomografii elektronowej, pozwala ona na obrazowanie znacznie większych objętości przy optymalnej rozdzielczości dla próbek zatopionych w żywicy.Procedurę rozpoczyna się od wyjęcia utrwalonego mózgu z znieczuplonego i perfundowanego szczura. Mózg należy zatopić w ciepłym 5% aeros w plastikowej formie, ustawiając go pod odpowiednim kątem przed zastygnięciem aerosu. Następnie blok aeros z mózgiem wewnątrz montuje się w uchwycie do próbek za pomocą wibratomu. Wycina się koronalne skrawki o grubości 80 micron, przygotowując tyle sekcji, ile jest koniecznych do objęcia obszaru zainteresowania.Następnie umieść próbki w 20 mililitrowych szklanych fiolkach izolacyjnych. Umieść do 10 przekrojów w jednej fiolce. Przepłucz próbki trzykrotnie po pięć minut każdorazowo w 0,1 molarnym buforze K coate.Następnie próbki barwi się 1,5% cyjankiem potasu i 1% czwórtotlenkiem osmu w 0,1 M buforze K coate przez 30 minut. Kontynuuje się barwienie próbek 1% czwórtotlenkiem osmu w 0,1 M buforze K coate przez 30 minut. Po tym czasie próbki płucze się raz wodą dwukrotnie destylowaną przez trzy minuty, a następnie barwi 1% octanem aluminium w wodzie dwukrotnie destylowanej przez 30 minut.Następnie płucz skrawki przez pięć minut w wodzie dwukrotnie destylowanej, a potem odwadniaj je w szeregu alkoholi o rosnącym stężeniu, poświęcając dwie minuty na każdą zmianę. Kolejnym krokiem jest zatopienie skrawków w rosnących stężeniach żywicy Duran zmieszanej z alkoholem, zachowując 30 minut odstępu między zmianami. Rozpocznij od proporcji 50 do 50 etanolu do żywicy, następnie 30 do 70, potem 10 do 90, a na koniec pozostaw skrawki w 100% żywicy przez 30 minut.Następnie zastąp medium 100% świeżą żywicą Duran. Mieszaj powoli przez jedną godzinę na mieszalniku rolkowym. Po zatopieniu, za pomocą drewnianego wykałaczki, umieść przekroje na szklanych przedmiotach do mikroskopu, które zostały wcześniej pokryte środkami oddzielającymi od formy.Umieść na szkiełkach tak wiele sekcji, jak to możliwe, dbając jednocześnie o to, aby nie były one zbyt gęsto rozmieszczone. Upewnij się, że między szkiełkami mikroskopowymi umieszczono etykiety identyfikacyjne. Umieść szkiełka w inkubatorze w temperaturze 65 °C na 24 godziny.Następnego dnia wyjmij próbki z pieca. Ostrożnie wsuń żyletkę między szkiełka przedmiotowe i, trzymając warstwę żywicy palcami, wyjmij ją wraz z próbkami spomiędzy szkiełek. Delikatnie opłucz próbkę pod bieżącą wodą.Aby usunąć pozostałości środków rozdzielających formę, umieść próbkę pod stereomikroskopem z oświetleniem przechodzącym, korzystając z obiektywu o małym powiększeniu. Zaznacz obszar zainteresowania za pomocą cienkiej igły. Użyj żyletki, aby wyciąć niewielki kwadrat o wymiarach 3 mm na 3 mm wokół obszaru zainteresowania.Użyj kleju akrylowego, aby przymocować mały blok żywiczny do góry pustego bloku żywicznego. Następnie zamocuj blok w uchwycie ultramikrotomu. Patrząc przez podłączony stereomikroskop, przycinaj obszar wokół regionu zainteresowania za pomocą żyletki, aż pozostanie jedynie mała piramida materiału.Odetnij krawędź bloczka w pobliżu obszaru zainteresowania, prowadząc cięcie pod kątem do górnej powierzchni bloczka za pomocą noża szklanego zamocowanego w ultramikrotomie. Dalszo przytnij bloczek tak, aby obszar zainteresowania można było precyzyjnie zlokalizować względem wymiarów powierzchni bloczka. Wyjmij bloczek z ultramikrotomu i umieść go pod mikroskopem świetlnym w prześwietleniu.Wykonaj zdjęcie obszaru zainteresowania. Za pomocą piłki jubilerskiej odetnij przyciętą kostkę od pozostałego kikuta żywicy z farbą węglową. Przytwierdź oddzieloną kostkę SA do uchwytu próbek SEM i zorientuj ją tak, aby strona przeznaczona do obrazowania była skierowana w stronę zewnętrznej krawędzi.Po wyschnięciu kleju przenieś preparat do systemu napylania próżniowego i pokryj bloczek cienką warstwą złota o grubości powyżej 20 nanometrów. Bloczek tkankowy zatopiony w żywicy jest teraz gotowy do obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym z wiązką zogniskowanych jonów. Wprowadź próbkę wraz z uchwytem do mikroskopu przy niskim powiększeniu i korzystając z obrazowania elektronów wtórnych, zorientuj bloczek tak, aby obszar zainteresowania oraz strona bloczka przeznaczona do obrazowania były skierowane w stronę detektora.Operator orientuje blok w taki sposób, aby powierzchnia przeznaczona do obrazowania znajdowała się równolegle do wiązki trawiącej. Dzięki temu wiązka elektronów jest skierowana pod kątem 54 stopni do tej powierzchni, przy zastosowaniu prądu wiązki jonowej od 13 do 27 nA i napięciu 30 kV.Usuń wąski pas żywicy z przedniej części obszaru przeznaczonego do obrazowania. Następnie przełącz na tryb obrazowania elektronów wstecznie rozproszonych, aby obejrzeć sfrezowaną powierzchnię nadległą względem obszaru zainteresowania. Korzystając z wcześniej wykonanego referencyjnego obrazu z mikroskopii świetlnej oraz obrazu sfrezowanej powierzchni, zlokalizuj dokładny obszar na bloku, który ma zostać sfrezowany i obrazowany, używając systemu wtrysku gazu w mikroskopie.Nanieś ochronną warstwę węgla lub metalu o grubości około jednego mikrona na powierzchnię bloku powyżej obszaru zainteresowania, stosując prąd 700 picoamps. Na koniec wytraw wiązką obszar bloku, w którym zostaną wykonane końcowe obrazy. Pozostaw wiązkę trawiącą do całkowitego wytrawienia tej powierzchni obrazowania, aż na jej powierzchni nie będą widoczne żadne artefakty trawienia.Wybierz parametry mikroskopu do obrazowania seryjnego powierzchni próbki. Typowe parametry to napięcia od 1,2 do 2 kV oraz rozmiary pikseli od 4 do 20 nm. Czas przebywania wiązki na pikselu powinien wynosić około 10 µs, aby całkowity czas obróbki powierzchni i pozyskania jednego obrazu nie przekraczał dwóch minut.Pozostaw mikroskop na co najmniej dwie godziny w celu ustabilizowania zmian termicznych. Następnie rozpocznij proces frezowania i obrazowania w celu uzyskania obrazów seryjnych z obszaru zainteresowania. Na tej rycinie przedstawiono obraz elektronów wstecznie rozproszonych w odwróconym kontraście, ukazujący ultrastrukturę w obrębie regionu mózgu.Widoczne są wszystkie błony, jak również duże struktury makromolekularne. Rycina ta składa się z łącznie 1 600 obrazów zebranych z odstępem pięciu nanometrów, co daje stos obrazów z izotropowymi wokselami. Stos ten można obrazować w dowolnej płaszczyźnie z tą samą rozdzielczością.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować tkankę mózgu do obrazowania seryjnego z wykorzystaniem skupionej wiązki skaningowego mikroskopu elektronowego.

focussed-ion-beam-milling-scanning-electron-microscopy-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Skupione łuczy jonowe i skaningowa mikroskopja elektronowa tkanki mózgu

Weź stały odcinek tkanki korowej mózgu myszy z aksonami neuronalnymi i dendrytami. Dendryty posiadają wypukłości, znane jako kolce dendrytyczne, które tworzą synapsy z aksonami. Inkubuj tkankę z żelazocyjankiem osmu, który wiąże się z lipidami, a następnie ponownie zastosuj osm, który zwiększa kontrast strukturalny do obrazowania. Barwnik ze związkiem metalu ciężkiego, który wiąże się z makrocząsteczkami i zwiększa kontrast. Odwodnić za pomocą zwiększających się stężeń alkoholu do zatapiania...

Skaningowa mikroskopia elektronowa ze skupioną wiązką jonów do rekonstrukcji 3D neuronów połączonych synaptycznie

Ten film demonstruje metodę badania uszkodzeń mózgu larw danio pręgowanego za pomocą wielkoskalowej skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM), techniki, która łączy elementy zarówno skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), jak i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości. Przedstawiono w nim etapy związane z przygotowaniem próbek i pozyskiwaniem obrazów STEM o wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji uszkodzenia mózgu.

Badanie uszkodzenia mózgu u larw danio pręgowanego za pomocą wielkoskalowej skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Wielkoskalowa mikroskopia elektronowa 2D (EM), czyli nanotomia, to ogólnotkankowe zastosowanie nanoskalowej rozdzielczości EM. W tym miejscu opisujemy uniwersalną metodę nanotomii stosowaną do badania mózgu larw danio pręgowanego w zdrowiu i po nieinwazyjnym uszkodzeniu mózgu.

Wielkoskalowa skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (nanotomia) mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego

Wizualizacja i analiza mitochondriów z tkanki mózgowej ssaków to trudne zadanie. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób trójwymiarowa (3D) analiza rekonstrukcji z seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBFSEM) może być wykorzystana do uzyskania wglądu w morfologiczną i wolumetryczną analizę tego krytycznego organcelli generującej energię.

Analiza mitochondriów mózgowych z wykorzystaniem seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej z obrazowaniem powierzchni bloku (SBF-SEM)

Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.

Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt

Tutaj prezentujemy protokół efektywnego łączenia mikroskopii elektronowej ze skaningową wiązką bloków szeregowych i skupionej wiązki jonów, aby dotrzeć do interesującego obszaru. Pozwala to na sprawne wyszukiwanie, w trzech wymiarach i lokalizowanie rzadkich zdarzeń w dużym polu widzenia.

Ukierunkowane badania z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej z blokiem szeregowym i mikroskopią elektronową ze zogniskowaną wiązką jonów

Wykazaliśmy, że wytrawianie nano-architektury w wewnątrzkorowych urządzeniach mikroelektrodowych może zmniejszyć reakcję zapalną i ma potencjał do poprawy zapisów elektrofizjologicznych. Opisane w niniejszym dokumencie metody nakreślają podejście do wytrawiania nanoarchitektur na powierzchni niefunkcjonalnych i funkcjonalnych mikroelektrod krzemowych z pojedynczym trzpieniem wewnątrzkorowym.

Litografia z użyciem skupionej wiązki jonów do wytrawiania nanoarchitektur w mikroelektrodach

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Ten proces umożliwia produkcję lamelli, ukierunkowaną na fluorescencyjne struktury biologiczne, które są małe (&lt;1 μm w zasięgu osiowym) i rzadkie (1 kopia na komórkę) przy użyciu kriogenicznej platformy obrazowania trójkokocyklnego. Ta platforma integruje mikroskopię fluorescencyjną, frezowanie wiązką jonową skupioną oraz skaningową mikroskopię elektronową w jednej pozycji ogniskowej, umożliwiając jednoczesną mikroskopię fluorescencyjną podczas frezowania.

Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Wprowadziliśmy nowatorską technikę obrazowania zwaną Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), która umożliwia bezstronne obrazowanie wszystkich komórek w próbkach mózgu na mezoskali i może być płynnie zintegrowana z procesem obrazowania taśmowej szeregowej skaningowej mikroskopii elektronowej na tej samej próbce.

Metoda optycznego obrazowania zgodna z mikroskopią skaningową do mezoskopowego mapowania mózgu w całych komórkach

Poznaj metodę zogniskowanego mielenia wiązki jonów i skaningowej mikroskopii elektronowej do trójwymiarowego obrazowania tkanki mózgowej z żywicy. Technika ta umożliwia uzyskanie obrazów seryjnych z wysoką rozdzielczością.

Frezowanie wiązką jonową (FIB) i skaningowa mikroskopia elektronowa tkanki mózgowej

Przeglądaj więcej filmów