Zogniskowane mielenie wiązki jonów i skaningowa mikroskopia elektronowa tkanki mózgowej

Celem tej procedury jest zebranie obrazów seryjnych przez określony obszar tkanki mózgowej za pomocą skupionej wiązki jonów i skaningowego mikroskopu elektronowego. Osiąga się to poprzez najpierw podzielenie mózgu na plasterki, które są barwione, a następnie zatapiane w żywicy. Drugim krokiem jest wycięcie obszaru zainteresowania z osadzonej sekcji mózgu i zamontowanie go na pustym bloku żywicy.

Trzecim krokiem jest przycięcie bloku żywicy za pomocą ultramikrotomu i użycie wiązki jonów mikroskopu do wyizolowania tylko obszaru, który ma być obrazowany. Ostatnim krokiem jest seryjne zobrazowanie powierzchni bloku żywicy za pomocą wiązki jonów do wielokrotnego usuwania cienkich warstw przed wykonaniem każdego obrazu. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują obrazy seryjne przez obszar zainteresowania.

Seria obrazów jest zbierana automatycznie, a zestaw danych zazwyczaj zawiera woksele izotropowe, dzięki czemu struktury obrazu można oglądać pod dowolnym kątem w stosie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transmisyjna mikroskopia elektronowa o przekroju szeregowym, jest to, że jest w stanie osiągnąć znacznie wyższą rozdzielczość Z. W porównaniu z tomografią elektronową jest w stanie obrazować znacznie większe objętości w optymalnej rozdzielczości dla próbek zanurzonych w żywicy.

Procedura rozpoczyna się od wypreparowania nieruchomego mózgu od znieczulonego szczura z perfuzją. Osadź mózg w ciepłym 5% aeros w plastikowej formie, ustaw mózg pod odpowiednim kątem, zanim aros ustawi się na stałe, zamontuj blok aeros z mózgiem w środku na uchwycie na próbkę za pomocą plastra vibrato. Przekroje koronalne o grubości 80 mikronów wycinają tyle sekcji, ile jest potrzebnych, aby objąć obszar zainteresowania.

Następnie umieść próbki w 20-mililitrowych szklanych fiolkach izolacyjnych. Umieścić do 10 odcinków w jednej fiolce. Przepłukać próbki trzy razy przez pięć minut każda w 0,1 molowym buforze K coate.

Następnie wybarwić próbki 1,5% cyjankiem potasu i 1% tetratlenkiem osmu w 0,1-molowym buforze K coate przez 30 minut. Kontynuować barwienie próbek 1% tetratlenkiem osmu w 0,1-molowym buforze K coate przez 30 minut. Następnie płukać raz podwójnie destylowaną wodą przez trzy minuty, a następnie barwić 1% octanem w podwójnej wodzie destylowanej przez 30 minut.

Następnie płucz sekcje przez pięć minut w podwójnie destylowanej wodzie, a następnie odwadniaj je w serii stopniowanych alkoholi, pozostawiając dwie minuty na każdą zmianę. Kolejnym krokiem jest zatopienie skrawków w rosnących stężeniach żywicy Duran zmieszanej z alkoholem, pozostawiając 30 minut między zmianami. Zacznij od 50 do 50 etanolu do żywicy, następnie od 30 do 70, następnie od 10 do 90, a na końcu na sekcjach do 100% żywicy przez 30 minut.

Następnie zastąp podłoże 100% świeżą żywicą duran. Mieszaj powoli przez godzinę na mieszalniku rolkowym. Po osadzeniu za pomocą drewnianego patyczka koktajlowego umieść skrawki na szklanych szkiełkach mikroskopowych, które zostały wcześniej pokryte środkami oddzielającymi pleśń.

Umieść jak najwięcej sekcji na slajdach, ale uważaj, aby nie przepełnić slajdów. Upewnij się, że między szkiełkami mikroskopu znajduje się również etykieta identyfikacyjna. Umieść szkiełka w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza na 24 godziny.

Następnego dnia wyjmij próbki z piekarnika. Delikatnie wepchnij żyletkę między szklane szkiełka mikroskopowe i usuń warstwę żywicy zawierającą próbki spomiędzy szkiełek, przytrzymując palcami warstwę żywicy. Delikatnie umyj próbkę pod bieżącą wodą.

Aby usunąć wszelkie środki oddzielające pleśń, umieść próbkę pod mikroskopem preparacyjnym z przechodzącym oświetleniem przy użyciu obiektywu o małej mocy. Zaznacz obszar zainteresowania cienką igłą. Użyj żyletki, aby wyciąć mały kwadrat o wymiarach trzy milimetry na trzy milimetry wokół obszaru zainteresowania.

Użyj kleju akrylowego, aby przymocować mały blok żywicy do górnej części pustego bloku żywicy. Następnie zaciśnij blok w uchwycie ultramikrotomu. Patrząc przez dołączony mikroskop stereoskopowy, użyj żyletki, aby przyciąć obszar zainteresowania, aż pozostanie tylko mała piramida materiału.

Przytnij krawędź bloku blisko obszaru zainteresowania pod kątem do górnej powierzchni bloku za pomocą szklanego noża przymocowanego do ultramikrotomu. Dalej przytnij blok tak, aby obszar zainteresowania mógł być precyzyjnie zlokalizowany w stosunku do wymiarów powierzchni bloku. Usuń blok z ultramikrotomu i umieść go pod mikroskopem światła przechodzącego.

Sfotografuj interesujący Cię obszar. Użyj piły jubilerskiej, aby odciąć przycięty blok od pozostałego kikuta żywicy za pomocą farby węglowej. Przyklej blok SA off do uchwytu na próbkę SEM i ustaw go tak, aby strona, która ma być obrazowana, była skierowana w stronę najbardziej zewnętrznej krawędzi.

Po wyschnięciu kleju przenieś preparat do systemu odparowywania w kształcie półksiężyca i próżni i pokryj blok cienką warstwą złota większą niż 20 nanometrów. Blok tkanki zatopiony w żywicy jest teraz gotowy do obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym ze skupioną wiązką jonów. Włóż próbkę w uchwycie do mikroskopu przy małym powiększeniu i za pomocą wtórnego obrazowania elektronów ustaw blok tak, aby obszar zainteresowania i strona bloku, który ma być obrazowany, były zwrócone w stronę.

Operator ustawia blok w taki sposób, aby powierzchnia, która ma być zobrazowana, leżała równolegle do belki frezującej. Powoduje to, że wiązka elektronów jest zorientowana pod kątem 54 stopni do tej powierzchni przy użyciu prądu wiązki jonów o natężeniu od 13 do 27 nanoamperów. Przy 30 kilowoltach.

Usuń wąski pas żywicy z przodu obszaru, który ma być sfotografowany. Następnie przełącz się na tryb obrazowania rozproszonego wstecznie, aby wyświetlić frezowaną powierzchnię, która pokrywa obszar zainteresowania. Korzystając z wykonanego wcześniej obrazu referencyjnego mikroskopii świetlnej i obrazu frezowanej powierzchni, zlokalizuj dokładny obszar na bloku, który ma być frezowany i zobrazowany za pomocą systemu wtrysku gazu mikroskopu.

Umieść warstwę ochronną węgla lub metalu o grubości około jednego mikrona na powierzchni bloku powyżej obszaru zainteresowania za pomocą prądu o natężeniu 700 pikoamperów. Na koniec wyfrezuj obszar bloku, w którym zostaną wykonane końcowe obrazy. Pozwól, aby belka frezująca całkowicie wyfrezowała tę powierzchnię obrazu, aż na powierzchni nie będzie widać żadnych artefaktów frezowania.

Wybierz parametry mikroskopu do seryjnego obrazowania twarzy. Typowe parametry to napięcia od 1,2 do dwóch kilowoltów przy rozmiarach pikseli od czterech do 20 nanometrów. Czas przebywania piksela powinien wynosić około 10 mikrosekund, aby całkowity czas frezowania powierzchni i uzyskania jednego obrazu wynosił poniżej dwóch minut.

Pozostaw mikroskop na co najmniej dwie godziny w celu usunięcia zmian termicznych. Aby rozproszyć się, rozpocznij proces mielenia i obrazowania w celu uzyskania obrazów seryjnych przez obszar zainteresowania. Ten rysunek pokazuje odwrotny kontrast wstecznie rozproszony obraz powierzchni bloku, pokazujący ultra strukturę w regionie mózgu owijanego.

Widoczne są wszystkie błony, a także duże struktury makromolekularne. Liczba ta składa się w sumie z 1600 obrazów zebranych w odstępach pięciu nanometrów, co daje stos obrazów z izotropowymi wokselami. Stos ten można obrazować w dowolnej płaszczyźnie z tą samą rozdzielczością.

Tak więc po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować tkankę mózgową do seryjnego obrazowania za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z naciskiem na wiązkę.