Wzorowanie ogniw na optycznie przezroczystych elektrodach z tlenku indu i cyny

Cześć, jestem Isha. Jestem studentem drugiego roku studiów magisterskich w laboratorium dr Zena. Jesteśmy tutaj, na Wydziale Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis.

Dzisiaj pokażę Wam sterowanie Ianem na mikro wytwarzanych optycznie przezroczystych elektrodach z tlenku indu 10 w inżynierii tkankowej i regeneracji, podjęto wysiłki mające na celu naśladowanie mikrośrodowiska narządu. Aby stworzyć to mikrośrodowisko in vitro, konieczne jest przestrzenne i czasowe odizolowanie komórek na podłożu. Interesuje nas projektowanie powierzchni, na których możemy kontrolować lokalizację różnych typów komórek wątroby.

W dzisiejszym eksperymencie wykorzystamy modyfikację powierzchni, mikrofabrykację i elektrochemię, aby uformować powierzchnię, którą można zmienić z nieadhezyjnej na ogniwową warstwę klejową. Pierwszym krokiem jest fotolitografia. Oto diagram przepływu pokazujący, jak ten proces będzie działał.

Niebieski to światło szkła, zielony to tlenek indu 10, który jest pokryty na wierzchu szkła. Po pierwsze, to, co zamierzamy zrobić, to odporna na czerwień fotograficzna powłoki wirowej, pokazana tutaj na świetle szkła pokrytego tlenkiem indu 10. Następnie przepuścimy to przez maskę fotograficzną do światła ultrafioletowego, a odsłonięte obszary zostaną rozwinięte w roztworze rozwijającym.

Regiony ITO, które nie są chronione przez fotorezyst, zostaną usunięte w IT. A na koniec cała pozostała fotorezystu zostanie usunięta w acetonie, aby utworzyć nasze elektrody ITO. Oto diagram przepływu pozostałych trzech kroków.

Najpierw zmodyfikujemy całą powierzchnię za pomocą cyliny kołka. To sprawi, że powierzchnia nie będzie zanieczyszczona i żadne komórki ani białka nie będą się z nią wiązać. Następnie użyjemy elektrochemii, aby specyficznie wchłonąć cylinę peg z dwóch elektrod, które wykonaliśmy wcześniej.

I wreszcie, zamierzamy inkubować fibroblasty na powierzchni i będą one selektywnie wiązać się tylko z obszarami paskowymi. Teraz jesteśmy gotowi do rozpoczęcia naszego eksperymentu. Pierwszym krokiem jest fotolitografia, która zostanie przeprowadzona w pomieszczeniu czystym.

Więc chodźmy dalej i wejdźmy do czystego pokoju. Więc teraz jesteśmy tutaj, w naszym czystym pokoju. Zanim rozpoczniemy nasz eksperyment, zamierzamy upiec nasze próbki z tlenku indu i cyny lub ITO w temperaturze 200 C w naszym piekarniku.

W ten sposób możemy odwodnić wszystkie nasze powierzchnie. A po upieczeniu go w temperaturze 200 C zamierzamy umieścić go na naszej technologii wirowania i faktycznie nałożyć fotorezystor. Więc po odwodnieniu naszego podłoża ITO, weźmiemy je i umieścimy na uchwycie technologii wirowania.

Ten uchwyt jest wystarczająco duży, aby pomieścić jedną czwartą szklanej lampy. Potem zamierzamy, zastosujemy próżnię. Następnie nakładamy na podłoże pozytywny ton, fotorezystancję.

Po nałożeniu fotorezystu po prostu idziemy dalej i zaczynamy. Składa się to z dwóch kroków. Pierwszym z nich jest rozprowadzanie, a drugim powlekanie wirowe na etapie rozprowadzania.

Uchwyt obraca się z prędkością 800 obr./min, co po prostu równomiernie rozprowadza fotorezystor na całej powierzchni. Jednak kolejnym z nich jest krok wirowania, który odbywa się przy 4 000 RPN i przy 4 000 RPM tworzy naprawdę cienką warstwę. Mówiąc o cienkim, mam na myśli około jednego mikrona.

Jeśli podzielisz słowo zdjęcie, oprzyj się, zmieni się ono w zdjęcie i opór. Jest aktywowany przez światło. W związku z tym pracujemy w czystym pomieszczeniu i używamy przefiltrowanego światła, aby nasz rezystor do drzwi fotograficznych nie aktywował się pod wpływem światła i był odporny na zasoby, które będziemy mieć właściwość, którą wykorzystamy później, gdy wykonamy trawienie.

Więc teraz skończyliśmy z powłoką wirową, fotorezystancją na powierzchni i po prostu ją wyjmujemy i przechodzimy do następnego kroku. Tak więc po pieczeniu próbki przez minutę i 45 sekund, weźmiemy ją z gorącej płyty i przeniesiemy do naszej wkładki do maski armatniej. Tutaj bierzemy maskę, której potrzebujemy, a następnie kładziemy maskę na wierzchu naszego podłoża, aby uzyskać nadruk kontaktowy między naszym podłożem z rezystancją portu a maską, umieszczamy ją za pomocą czterocalowego szklanego wafla, aby dodać jej wagi.

A kiedy już z tym skończymy, po prostu ponownie zakładamy migawkę, a następnie wystawiamy próbkę na działanie światła UV. Po zakończeniu ekspozycji po prostu odsuwamy pokrywę w odwrotnej kolejności. Wyjmujemy szklany wafel, wyjmujemy maskę, a następnie usuwamy podłoże i przejmujemy je do wywołania.

Po uwidocznieniu próbki umieszczamy ją w rozwiązaniu deweloperskim. Kiedy próbka została wystawiona na działanie światła UV, pojawiły się jony wodorowe, które zneutralizowały się z zasadą i roztworem wywoływacza i faktycznie zostały usunięte z powierzchni. Więc teraz chcesz mieć pewność, że podczas pobierania próbki stale odchylasz podłoże.

A kiedy to zrobisz, możesz zobaczyć, że w ciągu pierwszej minuty lub półtorej minuty eksponowane obszary są faktycznie rozwinięte i usunięte z powierzchni. Aby jednak doszło do pełnego rozwoju, pozwalamy mu siedzieć w rozwiązaniu deweloperskim przez około pięć minut. Po zakończeniu prac rozwojowych wyjmiemy go, umyjemy i podlejemy wodą, a następnie wysuszymy za pomocą pistoletu do azotu.

Po wysuszeniu naszej próbki przejmiemy ją i zobrazujemy pod naszym mikroskopem. Tutaj patrzymy na próbkę pod mikroskopem. Po prostu wyjęliśmy go po wywołaniu go przez pięć minut.

Istnieją dwa obszary, które można tutaj zobaczyć, ciemniejszy obszar pokryty fotorezystem i jaśniejszy obszar, w którym fotorezystor został usunięty. W odniesieniu do maski, której używaliśmy wcześniej, ciemniejsze obszary na masce były ciemniejszymi obszarami, które widzimy teraz pod mikroskopem, podczas gdy jasne obszary, które widzimy tutaj, były przezroczyste na masce. Jeden z pokazanych tutaj projektów to po prostu tablice o różnych rozmiarach, od 500 do 50 mikronów, podczas gdy drugi projekt to jeden okrąg o długości 1000 mikronów, który jest po prostu ze sobą połączony.

Mamy więc tutaj inny projekt, który został wykonany przy użyciu tej samej procedury. Tutaj mamy indywidualnie adresowane elektrody. Mam na myśli to, że różne regiony ITO są ze sobą połączone i mogą być aktywowane w różny sposób.

Na przykład tutaj, centralne obszary okrągłe, są one połączone z jednym padem elektrycznym, podczas gdy najbardziej zewnętrzne prostokątne regiony są połączone z innym padem elektrycznym. W ten sposób możemy stymulować te dwie różne powierzchnie w różnych punktach czasowych. Po przyjrzeniu się naszym próbkom, następnym krokiem, do którego przechodzimy, jest wytrawienie próbki.

Wszelkie regiony, które nie są chronione przez zdjęcia, zostaną wytrawione w akwaforty ITO. Zanim to zrobimy, musimy upewnić się, że założyliśmy odpowiednią odzież, ponieważ trawienie ITO zawiera kwasy. A teraz, po włożeniu mojego kwasowego fartucha ochronnego, założeniu przyłbicy, zamierzam wlać trochę wytrawiania ITO do szklanej zlewki.

Wytrawianie ITO składa się z 20% chlorowodoru, 5% kwasu azotowego, a reszta to woda DI. A następnie przynieś moją próbkę i umieść ją w trawieniu. Wcześniej w mikroskopie zauważyliśmy, że niektóre obszary nie były chronione przez podbicia zdjęć.

Kwasy w trawieniu ITO zaatakowały te regiony i spowodowały wytrawienie ITO z tych regionów. Gdy ITO powoli degraduje się z powierzchni, zmienia kolor. Tutaj możesz zobaczyć, że zmienił się z niebieskawej zmiany, którą pierwotnie miał, na tę fioletową zmianę, a teraz przechodzi na żółtą wymianę.

Zmiana koloru wskazuje, że ITO jest wytrawiany. Więc teraz mamy 15 minut. Całe ITO, to jest całkowicie wytrawione.

A to, co teraz widzisz, to zdjęcia to chronione regiony ITO. Tak więc po zakończeniu trawienia na powierzchni nadal pozostają pewne kwasy. Aby usunąć ten kwas, umieścimy go w roztworze węglanu sodu, który zneutralizuje cały kwas.

Po zneutralizowaniu kwasów wyjmujemy go i czyścimy wodą DI, a następnie suszymy z gotowym azotem. Więc teraz skończyliśmy z trawieniem kwasem. Koniec z kwasem, wychodzę z mojej gorącej sukni

Wyjmiemy go, przeniesiemy i zobrazujemy pod naszym mikroskopem. Teraz obserwujemy próbkę pod mikroskopem. Dzieje się tak po tym, jak wykonaliśmy trawienie ITO.

W tym przypadku ciemniejsze obszary to obszary szkła, z których ITO zostało wytrawione. A jaśniejsze obszary to ITO, które są w tym przypadku chronione przez fotorezystor. Po raz kolejny są to tablice od 500 do 50 mikronów, aw drugim przypadku mamy nasze połączone ze sobą okręgi po tysiąc mikronów każdy.

Spojrzeliśmy więc pod mikroskop i zobaczyliśmy, że są obszary szklane i obszary ITO, ale obszary ITO były chronione przez fotorezyst. Teraz musimy wyjąć ten fotorezyst. Więc wszystko, co zamierzamy zrobić, to wziąć nasz substrat, umieścić go w acetonie, a następnie umieścić go w sonikacji i po prostu sonikować przez 10 minut.

Gwarantuje to, że cała zdjęta fotorezystancja może być używana jako tony same w sobie, ale przez uderzenie dźwiękowe, które wykorzystuje fale dźwiękowe do uderzenia i zapewnia prawidłowe usunięcie fotorezystu. Po wyjęciu go z powietrza sonicznego myje się w wodzie DI, ponownie suszy w azocie i teraz można wyraźnie zobaczyć wzory na szklanym podłożu. Były to wzory, które początkowo były chronione przez fotorezystor.

Teraz, gdy przyjrzeliśmy się naszym próbkom i znaleźliśmy lub stworzyliśmy nasze wzorce ITO, zamierzamy rozpocząć drugą fazę eksperymentu. Faza ta polega na modyfikacji powierzchni za pomocą samoorganizującej się monowarstwy cykliny PEG. Ale zanim to zrobimy, musimy upewnić się, że powierzchnia jest reaktywna.

W tym celu umieszczamy go w myjce plazmowej. To wprowadza grupy hydroksylowe na powierzchnię, a tym samym sprawia, że jest reaktywny. W tym celu po prostu umieszczamy naszą próbkę w myjce plazmowej, a następnie włączamy pompę próżniową.

Włączamy tlen, włączamy główne zasilanie. Moc ta jest wykorzystywana do przekształcania gazowego tlenu w plazmę, która jest następnie wprowadzana i w ten sposób tworzy rowki hydroksylowe. A kiedy już włączymy zasilanie, idziemy dalej i wciskamy start.

Więc teraz, po zakończeniu procesu, wyjmujemy nasze podłoże, przechowujemy je w naczyniu i wychodzimy na zewnątrz czystego pomieszczenia de farown i przechodzimy do następnego kroku. Teraz, gdy wyszliśmy z czystego pomieszczenia i zakończyliśmy nasze idealne wzory, zamierzamy zmodyfikować powierzchnię, którą właśnie ułożyliśmy, za pomocą glikolu polietylenowego, CYLIN lub PEG Cylin. Ważne jest, aby wiedzieć, że cylin kołka reaguje na wilgoć.

Dlatego wszystko, czego używamy: drewno musi być wolne od wilgoci. Szkło, którego tutaj używaliśmy, dania dla zwierząt, zostały upieczone w temperaturze stu stopni przez noc. A kadziowa, której użyjemy jako rozpuszczalnika, jest również bezwodna.

Nie zawiera wilgoci. Więc teraz zamierzam wlać kadzię, bezwodny tolu do obu tych szklanych głośników, z których jeden ma w sobie naszą próbkę. Teraz musimy użyć dwóch szalek Petriego, ponieważ jedna z nich jest miejscem, w którym zamierzamy dokonać modyfikacji.

A drugiego użyjemy później, gdy modyfikacja się skończy, aby faktycznie umyć nasze podłoże. Więc po włożeniu naszych szklanych naczyń na pizzę, po prostu przejmę je i przeniosę do naszej komory śluzy powietrznej tutaj, w schowku na rękawiczki. Po zamknięciu komory śluzy zamierzamy wprowadzić do niej azot.

Teraz główna komora jest już wypełniona azotem. Dlatego nie chcemy otwierać tej komory, jeśli nie jest ona wypełniona azotem. Gdy obie komory będą napełnione azotem, przeniesiemy wszystkie nasze próbki wraz z pipetą.

Będziemy mieli nasz kołek i pęsetę, których będziemy używać później do przenoszenia próbek. Założymy więc rękawice, otworzymy komorę i powoli, ostrożnie wyjmujemy wszystko, co mamy w naszej śluzie i umieszczamy w głównej komorze. To jest szalka Petriego z naszym podłożem i szalka Petriego tylko z toluenem, którego zamierzamy użyć do mycia.

Pxi, który jest obecny, został zapakowany w azot i nie należy otwierać tej butelki, chyba że znajdujesz się w środowisku azotu. Dlatego raz, gdy chcesz wyjąć próbkę, wkładasz ją z powrotem do torby. Więc wyjmujesz cylinę, a stężenie, którego użyjemy, wynosi 2% w toluenie.

Więc wyjmujesz, wkładasz do wysokiego, mieszamy. Dobrze również komorować i upewnić się, że jest dobrze wymieszany, a następnie pozwól próbce inkubować w Toin przez dwie godziny. Teraz, gdy minęły dwie godziny, nasza próbka była w Pxi, wyjmiemy próbkę i przeniesiemy ją do świeżego roztworu toiny, gdzie na krótko ją umyjemy, obrócimy i przeniesiemy do naszej komory śluzy.

Kiedy już znajdzie się w naszej komorze śluzy, po prostu otworzymy naszą komorę i wyjmiemy naszą zmodyfikowaną powierzchnię i będziemy mogli jeździć za pomocą pistoletu na azot. Ponownie umieszczamy go na czystej, suchej szalce Petriego i wkładamy do piekarnika w temperaturze stu stopni C na kolejne dwie godziny. Teraz, gdy próbki zostały upieczone w piekarniku w temperaturze stu stopni Celsjusza przez dwie godziny, weźmiemy i przymocujemy nasze druty do przygotowanych przez nas elektrod.

Robimy to, tworząc mieszankę jeden do jednego srebrnej żywicy epoksydowej i utwardzacza. To jest srebrna żywica epoksydowa, a teraz dodajemy do niej taką samą ilość utwardzania. Chcemy to dobrze wymieszać, a następnie weźmiemy to i użyjemy do przymocowania naszych przewodów.

Kładziemy więc nasz drut na elektrodach, których chcemy użyć, a następnie go kodujemy. nie działa na ITO, stąd musimy użyć srebrnej żywicy epoksydowej i utwardzacza. A potem pieczemy tak, aby cały utwardzacz, którego użyliśmy wcześniej, został usunięty i stwardniał i możemy go użyć jako elektrody.

Teraz, gdy zakończyliśmy dwie fazy, rozpoczniemy trzecią fazę eksperymentu, która polega na wykonaniu części elektrochemicznej. Aby to zrobić, weźmiemy próbkę i umieścimy ją w naszym ogniwie elektrochemicznym. Po umieszczeniu go w naszym ogniwie elektrochemicznym, po prostu umieścimy na nim O-ring

To wyizoluje obszar, w którym będzie się działo elektrochemia, a następnie po prostu uszczelnimy ogniwo. Umieściłem więc moją próbkę z drutem przymocowanym do ogniwa elektrochemicznego. Teraz jestem gotowy, aby użyć statystyki potencjału, aby zastosować napięcie.

Tak więc biały przewód, zamierzam go przymocować tutaj do elektrody odniesienia, czerwony do przeciwelektrody, a na końcu zielony, który zamierzam przymocować do naszej elektrody roboczej. Po podłączeniu wszystkich tych elektrod zamierzam po prostu dodać jeden x roztwór soli fizjologicznej buforu fosforanowo-fosforanowego lub PBS do samej elektrochemicznej. Teraz, aby to wyjaśnić, sposób, w jaki to będzie działać, polega na tym, że cała powierzchnia jest na razie modyfikowana za pomocą pxi.

Tak więc wszystkie elektrody, w tym otaczające je obszary szkła, są modyfikowane za pomocą pxi. Gdy zastosuję napięcie wszędzie, gdzie jest obecny ITO, czyli w projektach elektrod, które wykonaliśmy, wyspa kołków odpadnie tylko od tych powierzchni i nic nie zostanie naruszone w okolicznych regionach. W związku z tym selektywnie usuwamy wyspę kołków z naszego podłoża.

Więc teraz zamierzam nacisnąć play, a to się uruchomi i przyłoży napięcie ujemne 1,4 V do naszej elektrody roboczej. Po przyłożeniu napięcia następuje zmiana koloru, którą można zobaczyć na elektrodach. Zmienia się z przezroczystego zielonkawo-niebieskiego odcienia, który musieliśmy zbrązowić.

Podejrzewamy, że w elektrodach może zachodzić reakcja utleniania, która powoduje ich brązowienie. Jest to również jeden ze wskaźników, że pxi z powierzchni zostało rzeczywiście usunięte z powierzchni. I po raz kolejny, gdziekolwiek zobaczysz brąz, to właśnie stamtąd usunięto wyspę kołków.

A otaczające szklane regiony nadal mają na nim zamontowane PXI. Przykładamy więc napięcie ujemne 1,4 wata przez 60 sekund. Daje to wystarczająco dużo czasu na usunięcie wszystkich pxi, które były obecne na elektrodach.

Możemy również użyć tej metody do usuwania elektrod, które są indywidualnie adresowane. W tym przypadku były trzy rzędy kół, które zostaną rozebrane. Możemy wybrać, co, które z nich chcemy zdjąć, używając wszystkich trzech różnych elektrod.

Tak więc teraz z powodzeniem zakończyliśmy naszą trzecią część elektrochemii, w której selektywnie usunęliśmy zakiszenie PG z naszych elektrod ITO. Umyłem go krótko, umyłem go wodą PBS i DI, usunąłem drut i umieściłem próbki w zwykłych płytkach sześciodołkowych. Teraz przejdziemy do On i hodowanych komórek na tych elektrodach.

A więc teraz jesteśmy w Sali Hodowli Tkankowej. W końcowej fazie eksperymentu użyjemy dziś fibroblastów, trzech limfocytów T trzy. Stężenie, którego używamy do wysiewu komórek, wynosi od 0,5 do 1,5 miliona komórek na promil.

Po wysianiu komórek wpuszczamy je na naszą próbkę na około 20 minut. To dałoby mu wystarczająco dużo czasu na przymocowanie go do ogołoconych obszarów. Więc umieścimy go w inkubatorze.

Minęło 20 minut i jesteśmy gotowi, aby przyjrzeć się komórkom, które wzorowały się na okrojonych regionach ITO, brązowych regionach, które widzieliśmy wcześniej, i tylko specyficznie wiązałyby się z tymi regionami i nie przyłączały się nigdzie poza tymi regionami. Tutaj możesz zobaczyć, że brązowe regiony były regionami ITO, które zostały pozbawione pxi. Korzystając z elektrochemii, komórki przyczepiły się tylko do tych brązowych obszarów, a nie do otaczających je obszarów szklanych.

W tym drugim kadrze, po raz kolejny, widzimy seltz przyczepiający się do ogołoconych obszarów. To są brązowe obszary, ale powyżej tych brązowych obszarów ledwo widać, a PEG projektu ITO nie został usunięty z tego projektu ITO, stąd nie ma do niego dołączonych komórek. Okej, to wszystko.

Skończyliśmy z protokołem, a ogniwa mają wzór na elektrodach ITO i to jest dokładnie to, czego chcieliśmy. Właśnie pokazałem ci kontrolę adhezji komórek na mikro wytwarzanych optycznie przezroczystych elektrodach z tlenku indu 10. Dzisiaj pokazałem Wam, jak na tych elektrodach wykonać wzór THREET trzech fibroblastów.

Użyliśmy również tej samej procedury do modelowania dwóch komórek HEP G, komórek satelitarnych i komórek pierwotnych szczura. Obecne techniki tworzenia wzorów komórek pozwalają na montaż tylko dwóch typów komórek na powierzchni. Elastyczność tej techniki pozwoli w przyszłości na montaż wielu typów komórek na powierzchni, które zostaną przestrzennie odizolowane.

Planujemy wykorzystać tę technikę do przestrzennej izolacji trzech różnych typów komórek wątroby na podłożu ITO w celu naśladowania mikrośrodowiska in vivo. W ten sposób możemy przestrzennie wyizolować niedojrzałe komórki lub komórki macierzyste wraz z dojrzałymi komórkami i komórkami podporowymi. Stworzy to pouczające środowisko dla niedojrzałych komórek do wzrostu i różnicowania.