Wzorcowanie komórek na optycznie przezroczystych elektrodach z tlenku indu i cyny

Cześć, jestem Isha. Jestem studentką drugiego roku studiów magisterskich w laboratorium dr. Zen. Znajdujemy się w Departamencie Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis.

Dzisiaj zaprezentuję kontrolę jonów na mikrofabrykowanych, optycznie przezroczystych elektrodach z tlenku indu i cyny. W badaniach nad inżynierią i regeneracją tkanek podjęto próby odtworzenia mikrośrodowiska narządu. Aby stworzyć takie mikrośrodowisko in vitro, niezbędna jest izolacja komórek na podłożu w wymiarze przestrzennym i czasowym. Naszym celem jest zaprojektowanie powierzchni, które pozwolą nam kontrolować rozmieszczenie różnych typów komórek wątroby.

W dzisiejszym doświadczeniu wykorzystamy modyfikację powierzchni, mikrowytwarzanie oraz elektrochemię do stworzenia powierzchni, której właściwości można przełączać z nieadhezyjnych dla komórek na adhezyjne. Pierwszym krokiem jest fotolitografia. Oto schemat blokowy przedstawiający przebieg tego procesu.

Kolor niebieski oznacza szklany podłoże, a zielony to tlenek indu 10 pokrywający szkło. W pierwszej kolejności naniesiemy metodą spin-coatingu fotorezist czerwony, pokazany tutaj, na szklane podłoże pokryte tlenkiem indu 10. Następnie poddamy go działaniu światła ultrafioletowego przez fotomaskę, a obszary naświetlone zostaną wywołane w roztworze wywołującym.

Regiony ITO niechronione fotorezystem zostaną usunięte podczas trawienia ITO. Następnie cały pozostały fotorezyst zostanie usunięty w acetonie w celu uformowania elektrod ITO. Poniżej znajduje się schemat blokowy trzech pozostałych kroków.

W pierwszej kolejności zmodyfikujemy całą powierzchnię za pomocą peg-cylicyny. Sprawi to, że powierzchnia stanie się odporna na osadzanie (non-fouling), dzięki czemu nie będą do niej wiązać się komórki ani białka. Następnie wykorzystamy elektrochemię, aby specyficznie zaabsorbować peg-cylicynę z dwóch elektrod I, które przygotowaliśmy wcześniej.

Na koniec inkubujemy fibroblasty na powierzchni, przy czym będą one wiązać się selektywnie wyłącznie z obszarami prążków. Jesteśmy zatem gotowi do rozpoczęcia eksperymentu. Pierwszy krok obejmuje fotolitografię, która zostanie przeprowadzona w pomieszczeniu typu clean room.

Przejdźmy zatem do pomieszczenia czystego. Jesteśmy już w pomieszczeniu czystym. Przed rozpoczęciem eksperymentu nasze próbki powlekane tlenkiem indu i cyny (ITO) zostaną wypalone w temperaturze 200 C w piecu.

W ten sposób możemy odwodnić wszystkie nasze powierzchnie. Po wypaleniu w temperaturze 200 C umieścimy podłoże na powlekarce rotacyjnej i nałożymy fotorezyst. Zatem po odwodnieniu podłoża ITO, weźmiemy je i umieścimy na uchwycie powlekarki rotacyjnej.

Uchwyt ten jest wystarczająco duży, aby utrzymać jedną czwartą szklanej lampy. Następnie zastosujemy próżnię. Po tym kroku nałożymy na podłoże pozytywny fotorezyst.

Po nałożeniu fotorezistu przechodzimy do kolejnych działań. Proces ten składa się z dwóch etapów: najpierw następuje rozprowadzenie, a następnie powlekanie wirowe w kroku rozprowadzania.

Uchwyt obraca się z prędkością 800 RPM, co pozwala na równomierne rozprowadzenie fotorezystu na całej powierzchni. Następnie następuje etap wirowania z prędkością 4 000 RPM, podczas którego tworzy się bardzo cienka warstwa. Przez cienką mam na myśli grubość około jednej mikrona.

Jeśli rozbijemy nazwę photoresist (fotorezyst), dzieli się ona na „photo” oraz „resist”. Jest on aktywowany przez światło. Dlatego pracujemy w pomieszczeniu czystym i korzystamy z filtrowanego światła, aby nasz fotorezyst nie został aktywowany przypadkowo. Jest on odporny na odczynniki trawiące, co jest właściwością, którą wykorzystamy później podczas procesu trawienia.

Proces nanoszenia warstwy metodą spin-coatingu jest już zakończony, a na powierzchni znajduje się fotorezyst; teraz wyjmiemy próbkę i przejdziemy do następnego etapu. Po wypiekaniu próbki przez 1 minutę i 45 sekund, zdejmiemy ją z płyty grzejnej i przeniesiemy do urządzenia Canon mask aligner. Wybieramy odpowiednią maskę, a następnie umieszczamy ją na podłożu, aby zapewnić kontaktowy druk między podłożem z fotorezystem a maską; dla dociśnięcia elementów kładziemy na wierzchu szklany wafer o średnicy 4 cali.

Po zakończeniu tego etapu nakładamy z powrotem migawkę, a następnie poddajemy próbkę działaniu światła UV. Po zakończeniu naświetlania zdejmujemy pokrywę w odwrotnej kolejności. Wyjmujemy szklaną płytkę, zdejmujemy maskę, a następnie wyjmujemy podłoże i przenosimy je do wywoływania.

Po naświetleniu próbki umieszczamy ją w roztworze wywołującym. W wyniku naświetlenia próbki światłem UV powstały jony wodoru, które zostały zneutralizowane przez zasadę w roztworze wywołującym i usunięte z powierzchni. Dlatego podczas przetwarzania próbki należy pamiętać o ciągłym poruszaniu podłożem.

Wtedy można zauważyć, że w ciągu pierwszej minuty lub półtorej minuty obszary wystawione na działanie światła zostają wywołane i usunięte z powierzchni. Jednak aby wywołanie było pełne, pozostawiamy próbkę w roztworze wywołującym na około pięć minut. Po zakończeniu wywoływania wyjmujemy ją, płuczemy w wodzie DI, a następnie osuszamy za pomocą pistoletu azotowego.

Po wysuszeniu próbki przeniesiemy ją w celu wizualizacji pod mikroskopem. Tutaj obserwujemy próbkę pod mikroskopem. Została ona właśnie wyjęta po pięciominutowym wywoływaniu.

Widoczne są tutaj dwa obszary: ciemniejszy obszar pokryty fotorezystem oraz jaśniejszy obszar, z którego fotorezyst został usunięty. W odniesieniu do maski użytej wcześniej, ciemniejsze obszary na masce odpowiadają ciemniejszym obszarom widocznym obecnie pod mikroskopem, natomiast obszary jasne były przezroczyste na masce. Jeden z przedstawionych tutaj projektów to macierze o różnych rozmiarach, od 500 do 50 mikronów, natomiast drugi projekt to połączone ze sobą okręgi o średnicy 1000 mikronów.

Oto inny projekt wykonany zgodnie z tą samą procedurą. W tym przypadku mamy do czynienia z elektrodami adresowalnymi indywidualnie. Oznacza to, że poszczególne obszary ITO są ze sobą połączone i mogą być aktywowane w różny sposób.

Na przykład w tym przypadku centralne obszary okrągłe są połączone z tym polem elektrycznym, podczas gdy zewnętrzne obszary prostokątne są połączone z innym polem elektrycznym. W ten sposób możemy stymulować te dwie różne powierzchnie w różnych punktach czasowych. Po obejrzeniu próbek przechodzimy do następnego kroku, którym jest trawienie próbki.

Wszystkie obszary, które nie są chronione przez maskę fotograficzną, zostaną usunięte podczas trawienia ITO. Przed przystąpieniem do tego procesu musimy upewnić się, że mamy na sobie odpowiednią odzież ochronną, ponieważ trawienie ITO wymaga użycia kwasów. Po założeniu fartucha kwasoodpornego oraz przyłbicy, naleję nieco trawienia ITO do zlewki szklanej.

Trawienie ITO składa się z 20% chlorowodoru, 5% kwasu azotowego, a resztę stanowi woda dejonizowana. Następnie należy przenieść próbkę i umieścić ją w roztworze trawiącym. Wcześniej, podczas obserwacji pod mikroskopem, zauważyliśmy, że niektóre obszary nie zostały zabezpieczone fotorezystem.

Kwasy stosowane do trawienia ITO zaatakowały te obszary, powodując ich wytrawienie. W miarę jak ITO powoli ulega degradacji z powierzchni, zmienia ono barwę. Tutaj widać, że zmieniła się ona z pierwotnego niebieskawego odcienia na purpurowy, a obecnie przechodzi w odcień żółty.

Zmiana koloru wskazuje, że ITO ulega trawieniu. Jesteśmy teraz w 15. minucie. Całe ITO zostało całkowicie wytrawione.

To, co Państwo teraz widzą, to zdjęcia obszarów ITO chronionych maską. Po zakończeniu trawienia na powierzchni wciąż pozostają resztki kwasów. Aby je usunąć, umieścimy próbkę w roztworze węglanu sodu, który zneutralizuje wszystkie kwasy.

Po zneutralizowaniu kwasów wyjmiemy próbkę, przemyjemy ją wodą dejonizowaną, a następnie osuszymy strumieniem azotu. Tym samym kończymy proces trawienia kwasem. Ponieważ nie używamy już kwasów, mogę zdjąć fartuch ochronny.

Wyjmiemy go, przeniesiemy i poddamy wizualizacji pod mikroskopem. Obecnie obserwujemy próbkę pod mikroskopem po przeprowadzeniu trawienia ITO.

W tym przypadku ciemniejsze obszary to fragmenty szkła, z których wytrawiono ITO. Natomiast jaśniejsze obszary to ITO, które w tym przypadku zostało zabezpieczone fotorezystem. Ponownie, są to matryce od 500 do 50 mikronów, a w drugim przypadku mamy połączone ze sobą kręgi o średnicy tysiąca mikronów każdy.

Właśnie sprawdziliśmy próbkę pod mikroskopem i zauważyliśmy występowanie obszarów szklanych oraz obszarów ITO, przy czym obszary ITO były chronione przez fotorezyst. Teraz musimy usunąć ten fotorezyst. W tym celu umieszczamy podłoże w acetonie, a następnie wkładamy je do myjki ultradźwiękowej i sonikujemy przez 10 minut.

Zapewnia to usunięcie całego fotorezystu. Można by go usunąć w inny sposób, jednak zastosowanie myjki ultradźwiękowej, która wykorzystuje fale dźwiękowe, gwarantuje prawidłowe usunięcie fotorezystu. Po wyjęciu z kąpieli ultradźwiękowej próbkę płucze się w wodzie DI, ponownie osusza azotem, a następnie można wyraźnie dostrzec wzory na podłożu szklanym. Są to wzory, które początkowo były chronione przez fotorezyst.

Po przeanalizowaniu próbek oraz zlokalizowaniu lub przygotowaniu wzorów ITO, przystępujemy do drugiej fazy eksperymentu. Faza ta obejmuje modyfikację powierzchni za pomocą samoporządkującej się monowarstwy cykliny PEG. Przed jej wykonaniem musimy jednak upewnić się, że powierzchnia jest reaktywna.

W tym celu umieszczamy go w czyszczarce plazmowej. Powoduje to wprowadzenie grup hydroksylowych na powierzchnię, dzięki czemu staje się ona reaktywna. Aby to osiągnąć, umieszczamy próbkę w czyszczarce plazmowej, a następnie włączamy pompę próżniową.

Włączamy dopływ tlenu, a następnie zasilanie główne. Energia ta jest wykorzystywana do konwersji gazowego tlenu w plazmę, która jest następnie wprowadzana, co prowadzi do uformowania się rowków hydroksylowych. Po włączeniu zasilania klikamy przycisk start.

Po zakończeniu procesu wyjmujemy podłoże, umieszczamy je w naczyniu, opuszczamy pomieszczenie czyste, zdejmując odzież ochronną, i przechodzimy do następnego etapu. Po wyjściu z pomieszczenia czystego i zakończeniu wzorowania idealnego zmodyfikujemy naniesiony właśnie wzór za pomocą glikolu polietylenowego, silanizowanego PEG lub PEG-silanu. Kluczowe jest, aby pamiętać, że PEG-silan reaguje z wilgocią.

Z tego względu wszystko, czego używamy, musi być wolne od wilgoci. Szkło laboratoryjne użyte w tym doświadczeniu oraz szalki Petriego zostały wypalone w temperaturze 100 °C przez całą noc. Toluen, którego użyjemy jako rozpuszczalnika, jest również bezwodny.

Nie zawiera on wilgoci. Teraz wleję bezwodny toluen do obu tych kolb szklanych, z których jedna zawiera naszą próbkę. Musimy użyć dwóch szalek Petriego, ponieważ w jednej z nich przeprowadzimy modyfikację.

Drugą porcję wykorzystamy później, po zakończeniu modyfikacji, do przemycia podłoża. Po umieszczeniu ich w szklanych naczyniach typu pizza, przeniosę je do śluzy w naszym pierścieniu ochronnym (glove box). Po zamknięciu śluzy wprowadzimy do niej azot.

Główna komora jest już wypełniona azotem. W związku z tym nie należy otwierać tej komory, dopóki nie zostanie ona wypełniona azotem. Gdy obie komory zostaną wypełnione azotem, przeniesiemy wszystkie nasze próbki za pomocą pipety.

Przygotujemy uchwyt oraz pęsetę, których użyjemy później do przenoszenia próbek. Następnie założymy rękawiczki, otworzymy komorę i powoli oraz ostrożnie przeniesiemy wszystko z śluzy do komory głównej. Jest to szalka Petri z podłożem oraz szalka Petri zawierająca wyłącznie toluen, którego użyjemy do przemywania.

Dostępny pxi został zapakowany w atmosferze azotu i butelki tej nie należy otwierać, chyba że znajduje się w środowisku azotowym. Dlatego po wyjęciu próbki należy ją ponownie umieścić w torbie. Następnie należy wyjąć cylinder; stężenie, którego będziemy używać, to 2% w toluenie.

Wyjmij próbkę, umieść ją w wysokim naczyniu i wymieszaj. Użyj do tego komory, aby upewnić się, że zawartość jest dobrze wymieszana, a następnie inkubuj próbkę w Toin przez dwie godziny. Po upływie dwóch godzin inkubacji w Pxi wyjmij próbkę i przenieś ją do świeżego roztworu toin, w którym zostanie krótko przemyta poprzez delikatne wymieszanie, a następnie przenieś ją do komory śluzy powietrznej.

Gdy próbka znajdzie się w śluzie powietrznej, otwieramy komorę, wyjmujemy zmodyfikowaną powierzchnię i przemieszczamy ją za pomocą pistoletu azotowego. Ponownie umieszczamy ją w czystej, suchej szalce Petriego, a następnie przenosimy do piekarnika i suszymy w temperaturze 100 °C przez kolejne dwie godziny. Po wyjęciu próbek wypalanych w piekarniku w temperaturze 100 °C przez dwie godziny, przystępujemy do podłączenia przewodów do przygotowanych elektrod.

Robimy to, przygotowując mieszaninę epoksydu srebrowego i utwardzacza w stosunku jeden do jednego. To jest epoksyd srebrowy, a teraz dodajemy do niego taką samą ilość utwardzacza. Musimy go dobrze wymieszać, a następnie użyjemy tej substancji do przymocowania przewodów.

Następnie umieszczamy drut na elektrodach, których chcemy użyć, a potem go mocujemy. Lutowanie nie sprawdza się w przypadku ITO, dlatego musimy zastosować epoksyd srebrowy oraz utwardzacz. Następnie próbkę wypalamy, aby usunąć użyty wcześniej utwardzacz, co powoduje stwardnienie połączenia i pozwala na wykorzystanie go jako elektrody.

Po zakończeniu dwóch faz przechodzimy do trzeciego etapu eksperymentu, którym jest przeprowadzenie pomiarów elektrochemicznych. W tym celu pobierzemy próbkę i umieścimy ją w celi elektrochemicznej. Następnie na górze próbki umieścimy oring.

Pozwoli to wyizolować obszar, w którym zajdzie proces elektrochemiczny, a następnie po prostu uszczelnimy ogniwo. Próbka z przymocowanym przewodem została umieszczona w ogniwie elektrochemicznym. Teraz jestem gotowy do użycia potencjostatu w celu przyłożenia napięcia.

Zatem biały przewód przymocuję tutaj do elektrody odniesienia, czerwony do elektrody pomocniczej, a na koniec zielony do naszej elektrody roboczej. Po podłączeniu wszystkich elektrod dodam do komory elektrochemicznej roztwór 1x buforu fosforanowo-solnego (PBS). Aby to wyjaśnić: w tej chwili cała powierzchnia jest zmodyfikowana pxi.

Zatem wszystkie elektrody, wliczając w to otaczające je obszary szklane, są zmodyfikowane za pomocą pxi. Po przyłożeniu napięcia w każdym miejscu, w którym występuje ITO, czyli w obszarach zaprojektowanych jako elektrody, wyspa PEG zostanie usunięta wyłącznie z tych powierzchni, a obszary otaczające pozostaną niezakłócone. W ten sposób selektywnie usuwamy wyspę PEG z naszego podłoża.

Teraz naciśnę przycisk odtwarzania, co rozpocznie i przyłoży napięcie -1,4 V do naszej elektrody roboczej. Po przyłożeniu napięcia na elektrodach widoczna jest zmiana barwy. Zmienia się ona z przezroczystego, zielonkawo-niebieskiego odcienia, który mieliśmy wcześniej, na brązowy.

Podejrzewamy, że na elektrodach może zachodzić reakcja utleniania, która powoduje ich brązowienie. Jest to również jeden z wskaźników świadczących o tym, że pxi został rzeczywiście usunięty z powierzchni. I raz jeszcze: wszędzie tam, gdzie widać brązowy kolor, wyspa peg została usunięta.

Na otaczających obszarach szklanych wciąż osadzony jest PXI. Dlatego przykładamy napięcie -1,4 V przez 60 sekund. Daje to wystarczająco dużo czasu, aby usunąć cały PXI, który znajdował się na elektrodach.

Tę metodę można również wykorzystać do usuwania warstw z elektrod adresowanych indywidualnie. W tym przypadku do usunięcia przeznaczone były trzy rzędy okręgów. Możemy wybrać, które z nich chcemy oczyścić, korzystając z trzech różnych elektrod.

W ten sposób pomyślnie zakończyliśmy trzecią część elektrochemii, w której selektywnie usunęliśmy warstwę PG z naszych elektrod ITO. Krótko przemyłem je PBS oraz wodą DI, odłączyłem przewody i umieściłem próbki w standardowych płytkach 6-dołkowych. Teraz przejdziemy do hodowli komórek na tych elektrodach.

Znajdujemy się teraz w pomieszczeniu do hodowli tkankowej. W końcowej fazie eksperymentu wykorzystamy dzisiaj fibroblasty, komórki 3T3. Stężenie stosowane do wysiewu komórek wynosi od 0,5 do 1,5 miliona komórek/ml.

Po wysianiu komórek pozostawiamy je na próbce przez około 20 minut. Zapewni to wystarczającą ilość czasu na ich przytwierdzenie się do obszarów odwarstwionych. Następnie umieścimy próbkę w inkubatorze.

Minęło 20 minut i jesteśmy gotowi do obejrzenia komórek, które ułożyły się w wzory na obszarach ITO pozbawionych powłoki – brązowych obszarach, które widzieliśmy wcześniej. Komórki wiążą się specyficznie tylko z tymi obszarami i nie przyczepiają się nigdzie poza nimi. Tutaj widać, że brązowe obszary to regiony ITO, z których usunięto pxi. Dzięki zastosowaniu elektrochemii komórki przyczepiły się wyłącznie do tych brązowych obszarów, a nie do otaczających je fragmentów szkła.

W tym kolejnym kadrze ponownie widzimy, że komórki przywierają do obszarów pozbawionych powłoki. Są to obszary brązowe, natomiast nad nimi można ledwo dostrzec obszary z PEG na podłożu ITO, który nie został usunięty, w związku z czym żadne komórki do nich nie przywarły. To wszystko.

Zakończyliśmy protokół, a komórki utworzyły wzór na elektrodach z ITO, co było naszym celem. Przedstawiłem Państwu sposób kontrolowania adhezji komórek na mikrofabrykowanych, optycznie przezroczystych elektrodach z tlenku indu i cyny. Dzisiaj pokazałem, jak rozmieszczać fibroblast 3T3 na tych elektrodach.

Tę samą procedurę zastosowaliśmy również do tworzenia wzorów z komórek Hep G dwa, komórek satelitarnych oraz pierwotnych komórek szczura. Obecne techniki wzorowania komórek pozwalają jedynie na osadzanie dwóch typów komórek na powierzchni. Elastyczność tej metody umożliwi w przyszłości osadzanie na powierzchni wielu typów komórek, które będą od siebie odizolowane przestrzennie.

Planujemy wykorzystać tę technikę do przestrzennej izolacji trzech różnych typów komórek wątroby na podłożu ITO, aby naśladować mikrośrodowisko in vivo. Dzięki temu możemy przestrzennie odizolować komórki niedojrzałe lub komórki macierzyste wraz z komórkami dojrzałymi i komórkami wspierającymi. Stworzy to środowisko stymulujące wzrost i różnicowanie się komórek niedojrzałych.