Eliminacja tła fluorescencyjnego w rezonansowej i spontanicznej mikrospektroskopii Ramana

Celem niniejszej procedury jest konstrukcja całkowicie optycznej bramki, która przepuszcza światło rozproszone Ramanowsko, jednocześnie odrzucając sygnały fluorescencyjne. Jest to osiągane poprzez wstępne wzbudzenie i spolaryzowanie rozproszenia Ramanowskiego. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie wiązki pompowania do obsługi bramki.

Po trzecie, należy dostroić pompę, taran oraz impulsy tak, aby na siebie nachodziły. Ostatnim krokiem procedury jest pozyskanie widm z bramkowaniem czasowym. W rezultacie można uzyskać wyniki pozwalające na ilościową analizę biochemiczną i klasyfikację poprzez analizę sygnałów ramen o wysokim stosunku sygnału do szumu.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak programowe usuwanie tła fluorescencyjnego, jest znacząca redukcja szumu śrutowego generowanego przez fluorescencję. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach biologii i biomedycyny, takich jak nieinwazyjna charakterystyka składu chemicznego endogennych fluoroforów w komórkach bakteryjnych i tkankach, a także zrozumienie procesów komórkowych i chorób, takich jak nowotwory, schorzenia naczyniowe czy choroby neurodegeneracyjne, przy użyciu markerów wewnętrznych. Metoda ta może również wspomóc opracowanie nowych sond, które mogłyby służyć zarówno jako znaczniki fluorescencyjne, jak i RAM, a także stworzenie nieinwazyjnych czujników medycznych do analizy krwi.

Choć metoda ta może dostarczyć cennych informacji o systemach biologicznych dla inżynierii biomedycznej, może być ona również zastosowana w innych dziedzinach, takich jak badania nad biopaliwami czy przemysł telekomunikacyjny. Próbki biologiczne umieszcza się zazwyczaj na szkiełku nakrywce o grubości numer 1, zamocowanym w komorze ATO Fluor.

Próbki ciekłe, w szczególności te toksyczne dla ludzi, umieszcza się w małej szklanej buteleczce z deactivate szkiełkiem przedmiotowym przyklejonym do otworu za pomocą epoksydu silikonowego; buteleczkę tę następnie odwraca się do pomiaru, umieszczając próbki na wtórnym stoliku zamontowanym na górze stolika mikroskopu, który posiada własną niezależną kontrolę ostrości. Aby zarejestrować widma ramen z bramkowaniem czasowym, w pierwszej kolejności należy odpowiednio przygotować wiązkę wzbudzenia. Proces rozpoczyna się od światła emitowanego przez strojony impulsowy laser szafirowy GI o mocy 2,4 W. Każdy impuls w pociągu impulsów o częstotliwości 80 MHz powinien posiadać energię 30 nJ, szerokość czasową 140 fs oraz widmo centrowane na 808 nm z szerokością spektralną około 6 nm. Aby zapobiec powrotowi odbić do rezonatora lasera, światło powinno przejść przez izolator Faradaya; przed izolatorem Faradaya należy umieścić płytkę półfalową, aby umożliwić ciągłe strojenie całkowitej mocy wprowadzonej do układu.

Ponieważ szerokość pasma wynosząca sześć nanometrów jest zbyt duża, aby rozdzielić większość modów Ramanowskich, wiązka jest przepuszczana przez bardzo wąski filtr pasmowy. Ustaw go na 808 nanometrów. Następnie użyj dubletu achromatycznego, aby skupić światło na pięciomilimetrowym kryształu boranu beta-baru.

Kryształ podwajający częstotliwość skraca długość fali z 808 nanometrów do 404 nanometrów. Umieść kryształ beta boranu baru w uchwycie z regulacją nachylenia i kąta (tip i tilt), zamontowanym na stole translacyjnym. Aby zmaksymalizować wydajność konwersji długości fali, kryształ musi zostać umieszczony precyzyjnie symetrycznie względem ogniska dubletu, a jego oś krystalograficzna musi być wyrównana z polaryzacją wiązki wejściowej.

Ponieważ wydajność konwersji długości fali zależy od polaryzacji, kontrolę nad ilością światła kierowanego na próbkę można uzyskać poprzez umieszczenie drugiej płytki ćwierćfalowej za izolatorem Faradaya. Poprzez obracanie tej płytki można regulować natężenie światła wysyłanego do próbki niezależnie od natężenia wiązki pompowej. Światło o przekonwertowanej długości fali jest następnie ponownie kolimowane przez drugi achromatyczny dublet, dobrany tak, aby wiązka wzbudzająca była wystarczająco duża, by wypełnić tylną aperturę obiektywu mikroskopu, a następnie kierowane do mikroskopu odwróconego za pomocą dwóch luster sterujących.

Obiektyw mikroskopu definiuje oś optyczną, do której należy wyrównać wiązkę wzbudzenia. W płaszczyźnie próbki mikroskopu należy umieścić lustro. Następnie iteracyjnie dostraja się dwa lustra sterujące, obserwując wstecznie odbitą wiązkę lasera na kamerze CCD podłączonej do portu obrazowania mikroskopu.

Zakładając, że obraz na kamerze jest wycentrowany w polu widzenia mikroskopu, wiązka znajduje się na osi. Dzieje się tak, gdy plamka ogniskowa jest wycentrowana na chipie mikroskopu, a przesunięcie obiektywu wzdłuż osi Z nie powoduje zmian. Punkt centralny rozproszenia Ramana rozogniskowanej wiązki występuje, gdy próbka jest umieszczona w płaszczyźnie próbki i naświetlana światłem laserowym.

Filtr dichroiczny umieszczony pod obiektywem mikroskopu oddziela rozproszone światło ramanowskie, przesunięte w długości fali, od wiązki wzbudzenia, kierując rozproszone światło ramanowskie do bocznego portu mikroskopu. Mikroskop został zmodyfikowany poprzez usunięcie wszystkich soczewek na tej drodze, tak aby światło sygnałowe opuszczało mikroskop bezkolizyjnie, ponieważ wiązka sygnałowa wychodząca z mikroskopu jest większa niż otwór przelotowy dławika.

Do zwężenia wiązki wykorzystuje się polaryzatory Thompsona oraz teleskop o powiększeniu 0,47x, zbudowany z dwóch dubletów achromatycznych. Światło sygnałowe jest następnie polaryzowane przez polaryzator Thompsona z dławikiem, zorientowany pod kątem zero stopni względem pionu w układzie laboratoryjnym, i kierowane na lustro dichroiczne, gdzie zostaje ponownie połączone z wiązką pompową. Wiązka pompująca jest kierowana do linii opóźniającej składającej się z dwóch luster ustawionych pod kątem prostym względem siebie, z których oba umieszczone są na liniowym stole przesuwnym, umożliwiającym regulację w celu zapewnienia nakładania się w czasie impulsów pompy i sygnału.

Po linii opóźniającej wiązka przechodzi przez płytkę półfalową i polaryzator ustawione pod kątem 45 stopni względem pionu w układzie laboratoryjnym. Zapewnia to właściwy stan polaryzacji wiązki pompowania w momencie dotarcia do ośrodka nieliniowego. Następnie światło jest odbijane od dwóch luster sterujących, z czego jedno posiada sterowanie piezoelektryczne, które należy wykorzystać do końcowej regulacji położenia wiązki pompowania w taki sposób, aby pokrywała się ona przestrzennie z wiązką sygnałową.

Aby uzyskać tę nakładkę, należy obserwować wiązki pompową i sygnałową w dwóch miejscach, jednym blisko i jednym daleko od lustra dichroicznego, w którym wiązki są łączone, wykorzystując pierwsze lustro sterujące do nałożenia obu wiązek w punkcie bliskim oraz lustro piezoelektryczne do nałożenia wiązek w punkcie dalekim; w ten sposób wiązka pompową może zostać ustawiona dokładnie koliniowo z wiązką sygnałową. Następnie należy skonfigurować układ kolimacji i zbierania, aby zmaksymalizować zbierany sygnał z bramkowaniem czasowym. W tym celu wiązki pompową i sygnałową przepuszcza się najpierw przez filtr dichroiczny o gęstości optycznej OD równej sześciu przy 404 nanometrach, aby zapobiec wzbudzaniu i rozpraszaniu resztkowego światła wzbudzenia w ośrodku nieliniowym.

Wiązki pompowania i sygnałowe są następnie ogniskowane przez achromatyczny dublet do kwarcowej kuwety o długości ścieżki wynoszącej jeden centymetr zawierającej materiał nieliniowy; można wykorzystać dowolny materiał nieliniowy o odpowiednio wysokim współczynniku nieliniowości i odpowiednio krótkim czasie odpowiedzi czasowej. W niniejszych eksperymentach zastosowano dwusiarczek węgla. Światło jest następnie ponownie kolimowane przez drugi dublet o ogniskowej identycznej z pierwszym.

Następnie wiązki przechodzą przez analizator Glanda-Thompsona na obrotowym uchwycie, a następnie przez zestaw filtrów absorpcyjnych i interferencyjnych, które łącznie mają OD równą 10 przy 808 nanometrach. Na koniec światło sygnału jest ogniskowane przez dublet achromatyczny do 50 mikronowego wielomodowego światłowodu, przy czym światłowód jest zamontowany w stoliku umożliwiającym przesuwanie w osiach X, Y i Z. Następnie światłowód zostaje sprzęgnięty z komercyjnym spektrografem obrazującym z dołączoną kamerą CCD w celu wyrównania układu zbierającego dla maksymalizacji zbieranego sygnału, ustawienia analizatora na zero stopni i umieszczenia próbki testowej toluenu w płaszczyźnie próbki, a następnie optymalizacji zebranego sygnału Ramana poprzez regulację sterowników X, Y i Z uchwytu światłowodu, aby zapewnić odpowiednie nakładanie się przestrzenne i czasowe wiązek pompowych i sygnałowych. W płaszczyźnie próbki mikroskopu należy umieścić lustro.

Następnie należy usunąć z układu filtr 404 nm. Obrócić analizator o 90 stopni tak, aby wstecznie odbita wiązka 404 nm była kierowana do spektrografu z intensywnością dostosowaną w taki sposób, aby nie nasycić kamery. Teraz, przy wyłączonej wiązce pompowania, należy obrócić analizator tak, aby zminimalizować transmitowany sygnał 404 nm.

Następnie ponownie włącz wiązkę pompy i powoli reguluj stopień opóźnienia, aż transmisja światła o długości 404 nanometrów zacznie wzrastać. Następnie iteracyjnie dostrajaj stopień opóźnienia, lustro piezoelektryczne oraz pokrętła X, Y i Z światłowodu, aby zmaksymalizować sygnał, ponieważ wstecznie odbita wiązka 404 nanometrów i światło rozproszone Ramanowsko mogą przebiegać przez układ nieco innymi drogami. Wykonaj końcowe korekty, umieszczając na stoliku z próbką silny rozpraszacz ramanowski, taki jak toluen, wymieniając filtr Ramanowski i delikatnie korygując ustawienie poprzez zmianę stopnia opóźnienia, lustra piezoelektrycznego oraz pokręteł X, Y i Z światłowodu, aby zoptymalizować sygnał ramanowski.

System jest teraz gotowy do zbierania widm. Wymaga to w pierwszej kolejności zarejestrowania kilku krzywych tła w celu korekcji artefaktów systemowych. Najpierw, przy analizatorze ustawionym na zero stopni, włączonej wiązce wzbudzenia i wyłączonej wiązce pompy.

Uzyskaj widmo bez bramkowania, a następnie ustaw analizator pod kątem 90 stopni i zarejestruj widmo tła reprezentujące światło rozproszone przenikające przez polaryzatory. Następnie, pozostawiając analizator pod kątem 90 stopni, wyłącz wiązkę ramana i włącz wiązkę pompowania. Zarejestruj drugie widmo tła reprezentujące ilość światła pompowania przenikającego przez filtry dichroniczne.

Na koniec, przy wyłączonych wszystkich laserach, zarejestruj bazowe widmo ciemne reprezentujące poziom prądu ciemnego kamery i elektroniki. Następnie włącz wszystkie wiązki i zarejestruj widmo bramkowane. Aby uzyskać rzeczywiste widmo wyłącznie światła przechodzącego przez bramkę, od tego widma bramkowanego należy odjąć dwa widma tła oraz widmo ciemne.

Tutaj widzimy schemat układu korugującego. Droga wiązki pompowania jest przedstawiona jako ciągła czerwona linia, natomiast droga SHG jako ciągła granatowa linia. Ścieżka, w której sygnały ramanowskie i fluorescencyjne nakładają się na siebie, jest zaznaczona na zielono.

Podczas gdy ścieżka, z której fluorescencja została tymczasowo odfiltrowana, jest pokazana na żółto. Tutaj widzimy surowe widma kumaryny rozpuszczonej w oleju immersyjnym. Czerwka krzywa przedstawia widmo zarejestrowane przy otwartej bramce, natomiast czarna krzywa przedstawia widmo zarejestrowane przy analizatorze ustawionym na minimalną transmisję i zastosowanej wiązce pompowania.

Niebieska krzywa przedstawia widmo zarejestrowane przy analizatorze ustawionym na minimum transmisji i bez zastosowania wiązki pompowania, natomiast zielona krzywa przedstawia widmo zarejestrowane przy zastosowaniu wyłącznie wiązki pompowania. Wszystkie widma zostały wygładzone za pomocą 11-punktowego filtru KY gole trzeciego rzędu. Przerywane purpurowe linie wskazują obszar widmowy przedstawiony na poniższym wykresie.

Tutaj widzimy widma kumaryny rozpuszczonej w oleju imersyjnym po odjęciu tła fluorescencyjnego. Czerwona krzywa przedstawia widmo przy otwartej bramce, a niebieska krzywa to widmo bramkowane. Widmo bramkowane wyraźnie pokazuje splotowy pik o wysokiej liczbie falowej, charakterystyczny dla olejów.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że laser musi najpierw dysponować energią impulsu wystarczającą do wzbudzenia ga, a system wymaga precyzyjnego nakładania się obu impulsów w przestrzeni i czasie. Po obejrzeniu tego filmu i zapoznaniu się z załączonym protokołem powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu rozdzielenia wiązki lasera na wiązkę wzbudzającą i wiązkę krzywej oraz sposobu nakładania tych dwóch wiązek, zarówno przestrzennie, jak i czasowo.

Jak zarejestrować sygnał ramanowski za pomocą spektrografu oraz C, c, D, a także jak wizualizować i analizować sygnał ramanowski. Należy pamiętać, że praca z laserami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie gogli laserowych. Dodatkowe zasady bezpieczeństwa obowiązują w przypadku stosowania materiałów nieliniowych oraz konkretnych próbek.