Odrzucenie tła fluorescencyjnego w rezonansowej i spontanicznej mikrospektroskopii Ramana

Omawiamy budowę i działanie złożonego nieliniowego urządzenia optycznego system wykorzystujący ultraszybkie, całkowicie optyczne przełączanie do izolowania Ramana od fluorescencji Sygnały. Za pomocą tego systemu jesteśmy w stanie z powodzeniem oddzielić ramanowskie i fluorescencyjne sygnały wykorzystujące energie impulsów i średnie moce, które pozostają biologicznie bezpieczne.

Celem tej procedury jest skonstruowanie całkowicie optycznego chodu, który przepuszcza rozproszone światło Ramana, jednocześnie odrzucając sygnały fluorescencyjne. Osiąga się to poprzez pierwsze wzbudzenie i polaryzację rozpraszania Ramana. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie belki pompy do obsługi bramy.

Po trzecie, pompa i suwak oraz impulsy muszą być wyregulowane tak, aby zachodziły na siebie. Ostatnim etapem procedury jest uzyskanie widm bramkowanych czasowo. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują biochemiczną kwantyfikację i klasyfikację poprzez analizę sygnałów ramen o wysokim stosunku sygnału do szumu.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak programowe usuwanie tła fluorescencyjnego, jest to, że szum strzału wytwarzany przez fluorescencję jest znacznie zredukowany. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii i biomedycyny, takie jak nieinwazyjna charakterystyka składu chemicznego endogennego fluoru w komórkach i tkankach bakteryjnych, zrozumienie procesów komórkowych i chorób, takich jak rak, choroby naczyniowe lub neurodegeneracyjne, za pomocą wewnętrznych markerów. Metoda ta może również pomóc w opracowaniu nowych sond, które mogłyby być wykorzystywane zarówno jako znaczniki fluorescencyjne i RAM, jak i jako nieinwazyjne czujniki medyczne do analizy krwi.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w systemy biologiczne dla inżynierii biomedycznej. Może być również stosowany w innych dziedzinach, takich jak biopaliwa, badania naukowe lub przemysł telekomunikacyjny. Próbki biologiczne są zwykle umieszczane na szkiełku nakrywkowym o dużej grubości jeden, zamontowanym w komorze ogniw fluorowych ATO.

Próbki ciekłe, szczególnie te toksyczne dla ludzi, umieszcza się w małej szklanej butelce z szkiełkiem nakrywkowym przycementowanym do otworu za pomocą silikonowej żywicy epoksydowej, która jest następnie odwracana w celu pomiaru, umieszczając próbki na wtórnym stoliku zamontowanym na stoliku mikroskopowym, który ma własną niezależną kontrolę ostrości w celu pobrania bramkowanych w czasie widm ramen, Po pierwsze, wiązka wzbudzająca musi być odpowiednio przygotowana. Zacznij od światła wydobywającego się z 2,4-watowego, przestrajalnego, pulsacyjnego lasera szafirowego GI. Każdy impuls w ciągu impulsów 80 megaherców powinien mieć 30 nanodżuli energii, szerokość czasową 140 femtosekund i widmo wyśrodkowane na 808 nanometrach z szerokością pasma widmowego około sześciu nanometrów, aby zapobiec ponownemu przedostawaniu się odbić wstecznych do wnęki lasera, światło powinno być przepuszczane przez izolator Faradaya, półfalową płytkę przed izolatorem Faradaya, aby umożliwić ciągłe dostrajanie całkowitej mocy wysyłanej do system.

Ponieważ sześć nanometrów to zbyt szerokie pasmo, aby rozwiązać większość modów ramenu, wiązka jest przesyłana przez bardzo wąski filtr pasmowo-przepustowy. Wyślij go w 808 nanometrach. Następnie użyj aromatycznego dubletu, aby skupić światło na pięciomilimetrowym otworze beta baru.

Osiem kryształów do połowy długości fali od 808 nanometrów do 404 nanometrów. Umieść kryształ bate beta baru w uchwycie z elementami sterującymi końcówką i nachyleniem zamontowanymi na stoliku translacyjnym. Aby zmaksymalizować wydajność konwersji długości fali, kryształ musi być umieszczony dokładnie symetrycznie względem ogniska dubletu i z osią kryształu wyrównaną do polaryzacji przychodzącej wiązki.

Ponieważ wydajność konwersji długości fali jest zależna od polaryzacji, kontrolę nad ilością światła wysyłanego do próbki można uzyskać, umieszczając drugą płytkę półfalową za izolatorem Faradaya. Obracając tę płytę falową, intensywność światła wysyłanego do próbki można regulować niezależnie od intensywności wysyłanej w wiązce pompy. Światło przekształcone w długość fali jest następnie ponownie skolimowane przez drugi dublet aromatyczny wybrany w taki sposób, aby wiązka wzbudzająca była wystarczająco duża, aby wypełnić tylny otwór obiektywu mikroskopu i kierowana do odwróconego mikroskopu za pomocą dwóch lusterek sterujących.

Obiektyw mikroskopu definiuje oś optyczną, aby wyrównać wiązkę wzbudzenia z tą osią. Umieść lustro w płaszczyźnie próbki mikroskopu. Dwa lusterka sterujące są następnie iteracyjnie dostrajane podczas obserwacji odbitej wstecznie wiązki laserowej na kamerze CCD podłączonej do portu obrazowania mikroskopu.

Zakładając, że obraz na kamerze jest wyśrodkowany w polu widzenia mikroskopu, wiązka znajduje się na osi. Gdy ognisko jest wyśrodkowane na chipie mikroskopu, a przesunięcie obiektywu wzdłuż osi Z nie ulega zmianie. Punkt środkowy rozpraszania rozogniskowanej wiązki ramen występuje, gdy próbka jest umieszczona w płaszczyźnie próbki i jest naświetlana światłem laserowym.

Filtr dichroiczny umieszczony pod obiektywem mikroskopu oddziela przesuniętą falę. Ramen rozpraszał światło z wiązki wzbudzającej, kierując światło rozproszone ramen do bocznego portu mikroskopu. Mikroskop został zmodyfikowany w celu usunięcia wszelkich soczewek znajdujących się na tej ścieżce, tak że światło sygnalizacyjne wyłania się z mikroskopu pokrytego, ponieważ wiązka sygnałowa wychodząca z mikroskopu jest większa niż przezroczysta apertura dławika.

Polaryzatory Thompsona, teleskop 0,47 razy zbudowany z dwóch aromatycznych dubletów, służy do zmniejszania wiązki. Światło sygnalizacyjne jest następnie polaryzowane przez polaryzator Thompsona zorientowany pod kątem zera stopni w stosunku do pionu w ramie laboratoryjnej i kierowany do lustra dichroicznego, gdzie jest rekombinowany z wiązką pompy. Wiązka pompy jest wysyłana do linii opóźniającej składającej się z dwóch luster ustawionych pod kątem prostym do siebie, oba umieszczone na liniowym stopniu translacji, który można dostroić tak, aby zapewnić czasowe nakładanie się pompy i impulsów sygnałowych.

Po linii opóźniającej wiązka jest przesyłana przez półkierunkową płytkę i polaryzator zorientowany pod kątem 45 stopni w stosunku do pionu w ramie laboratoryjnej. Zapewnia to prawidłowy stan polaryzacji belki pompy w momencie dotarcia do medium nieliniowego. Światło jest następnie odbijane od dwóch lusterek kierowniczych, jednego z piezoelektrycznymi elementami sterującymi, które należy wykorzystać do ostatecznego wyregulowania położenia wiązki pompy tak, aby pokrywała się przestrzennie z wiązką sygnałową.

Aby uzyskać to nakładanie się, obserwuj pompę i wiązki sygnałowe w dwóch miejscach, jednym blisko i jednym daleko od zwierciadła dichroicznego, w którym wiązki są łączone, używając pierwszego lusterka sterującego do nakładania się dwóch wiązek w bliższym punkcie i lustra pizo do nakładania się wiązek w odległym punkcie, wiązka pompy może być dokładnie równoległa z wiązkami sygnałowymi. Następnie należy skonfigurować system tektury falistej i zbierania, aby zmaksymalizować zebrany sygnał bramkowany czasowo. Aby to zrobić, pompa i wiązki sygnałowe są najpierw przepuszczane przez filtr diyczny, który ma średnicę zewnętrzną sześć przy 404 nanometrach, aby zapobiec wzbudzeniu i rozproszeniu szczątkowego światła wzbudzenia w ośrodku nieliniowym.

Pompa i wiązki sygnałowe są następnie skupiane przez aromatyczny dublet w jednocentymetrową ścieżkę kwarcową zawierającą materiał nieliniowy, można wykorzystać dowolny materiał nieliniowy, o odpowiednio wysokim wskaźniku nieliniowym i odpowiednio krótkiej odpowiedzi czasowej. Tu. Do tych eksperymentów używamy siarczku węgla i di. Światło jest następnie ponownie kolimowane przez drugi dublet o ogniskowej identycznej z pierwszą.

Wiązki są następnie przepuszczane przez dławnicowy analizator Thompsona na obrotowym uchwycie, a następnie przez zestaw filtrów absorpcyjnych i interferencyjnych, które łącznie mają OD 10 przy 808 nanometrach. Na koniec światło sygnalizacyjne jest skupiane przez aromatyczny dublet w światłowodzie wielomodowym o grubości 50 mikronów, gdzie światłowód jest montowany w stopniu, który umożliwia translację w X, Y i Z. Światłowód jest następnie sprzężony z komercyjnym spektrografem obrazowania z dołączoną kamerą CCD w celu wyrównania systemu zbierania w celu maksymalizacji zebranego sygnału, ustawić analizator na zero stopni i umieścić próbkę testową toluenu w płaszczyźnie próbki, zoptymalizuj zebrany sygnał Ramana, dostosowując elementy sterujące X, Y i Z mocowania światłowodu, aby zapewnić prawidłowe przestrzenne i czasowe nakładanie się pompy i wiązek sygnałowych. Umieść lustro w płaszczyźnie próbki mikroskopu.

Następnie wyjmij filtr 404 nm z systemu. Obróć analizator o 90 stopni, tak aby odbita wiązka o długości 404 nanometrów została wysłana do spektrografu z intensywnością dostosowaną tak, aby nie nasyciła kamery. Teraz, gdy wiązka pompy jest wyłączona, obróć analizator, aby zminimalizować przesyłany sygnał 404 nanometrów.

Następnie ponownie włącz wiązkę pompy i powoli wyreguluj opóźnienie stage, aż transmisja światła 404 nanometra zacznie się zwiększać. Następnie iteracyjnie obróć stopień opóźniający, zwierciadło piezoelektryczne oraz elementy sterujące X, Y i Z światłowodu, aby zmaksymalizować sygnał, ponieważ odbita wiązka 404 nanometrów i światło rozproszone Ramana mogą obrać nieco inne ścieżki w systemie. Dokonaj ostatecznych korekt, umieszczając silny rozpraszacz Ramana, taki jak toluen, na stoliku próbki, wymieniając filtr Ramana i nieznacznie dostosowując wyrównanie, zmieniając zwierciadło elektryczne pizo stopnia opóźniającego oraz elementy sterujące X, Y i Z światłowodu, aby zoptymalizować sygnał Ramana.

Teraz system jest gotowy do zbierania widm. Wymaga to najpierw pozyskania kilku krzywych tła w celu skorygowania artefaktów systemu. Najpierw, gdy analizator jest ustawiony na zero stopni, wiązka wzbudzenia jest włączona, a wiązka pompy wyłączona.

Uzyskaj widmo niezmienione, a następnie ustaw analizator na 90 stopni i zbierz widmo tła reprezentujące światło rozproszone przeciekające przez polaryzatory. Następnie, gdy analizator pozostaje pod kątem 90 stopni, wyłącz wiązkę ramenu i włącz wiązkę pompy. Zbierz drugie widmo tła reprezentujące ilość światła pompy przeciekającego przez filtry dichroiczne.

Na koniec, przy wyłączonych wszystkich laserach, zbierz podstawowe ciemne widmo reprezentujące poziom ciemnego prądu kamery i elektroniki. Na koniec włącz wszystkie wiązki i zbierz bramkowane widmo. Aby uzyskać prawdziwe widmo tylko światła przez bramę, dwa widma tła i ciemne widmo muszą zostać odjęte od tego bramkowanego widma.

Tutaj widzimy schemat ideowy systemu tektury falistej. Ścieżka wiązki pompy jest pokazana jako ciągła czerwona linia, podczas gdy ścieżka SHG jest pokazana jako ciągła linia granatowa. Ścieżka, na której ramen i fluorescencja nakładają się na siebie, jest pokazana na zielono.

Podczas gdy ścieżka, w której fluorescencja została tymczasowo odfiltrowana, jest pokazana na żółto. Tutaj widzimy surowe widma kumaryny rozpuszczonej w olejku immersyjnym. Czerwona krzywa pokazuje widmo pobrane przy otwartej bramce, a krzywa pokazuje widmo zmierzone z analizatorem ustawionym na minimalną transmisję i przyłożoną wiązką pompy.

Niebieska krzywa pokazuje widmo pobrane z analizatorem ustawionym na minimalną transmisję i bez zastosowanej wiązki pompy, a zielona krzywa pokazuje widmo pobrane z przyłożoną tylko wiązką pompy. Wszystkie widma zostały wygładzone dzięki 11-punktowemu filtrowi gole KY trzeciego rzędu. Przerywane karmazynowe linie wskazują obszar widmowy pokazany na poniższym wykresie.

Tutaj widzimy widma kumaryny rozpuszczonej w olejku immersyjnym po odjęciu tła fluorescencji. Czerwona krzywa to widmo z otwartą bramą, a niebieska krzywa to bramkowane widmo. Bramkowane widmo wyraźnie pokazuje zawiłą wysoką liczbę fal, szczyt charakterystyczny dla olejów.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że laser musi najpierw mieć wystarczającą energię impulsu, aby napędzać ga, a system wymaga znakomitego przestrzennego i czasowego nakładania się dwóch impulsów. Po obejrzeniu tego filmu i przeczytaniu załączonego protokołu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozdzielić wiązkę laserową na wiązkę wzbudzenia i wiązkę krzywą. Jak nałożyć na siebie te dwie belki, zarówno przestrzennie, jak i czasowo.

Jak zarejestrować sygnał ramen za pomocą spektrografu i C, c, D, a także jak wizualizować i analizować sygnał ramen. Nie zapominaj, że praca z laserami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie gogli laserowych. Obowiązują dodatkowe zasady bezpieczeństwa w odniesieniu do stosowania materiału nieliniowego oraz w przypadku korzystania z konkretnej próbki.