Pomiar koordynacji ruchowej u myszy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar koordynacji ruchowej u myszy. Jest to realizowane poprzez przeprowadzenie testu na rotarodzie z przyspieszeniem, a następnie badanie koordynacji ruchowej na drążku tonalnym.

Zwierzę można również poddać testowi na prętach statycznych. Na koniec można zmierzyć wydajność na drążkach równoległych. W rezultacie można uzyskać dane wskazujące, czy u myszy występują jakiekolwiek zaburzenia koordynacji ruchowej.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką napotykają trudności ze względu na skomplikowanie poprawnego umieszczania myszy na aparaturze podczas wszystkich poniższych testów. Należy wprowadzić myszy do pomieszczenia doświadczalnego od 5 do 20 minut przed badaniem, aby upewnić się, że są one w pełni rozbudzone. Przedstawiony tutaj zestaw do testu rotarod został zbudowany na Uniwersytecie Oksfordzkim.

Pręt ma trzy centymetry średnicy i posiada na powierzchni szereg równoległych rowków, które pomagają myszom w bardziej efektywnym chwycie. Kołnierz po każdej stronie zapobiega zsunięciu się myszy z pręta. Mają one 30 centymetrów średnicy i są oddalone od siebie o sześć centymetrów.

Pręt zostaje zamocowany 30 centymetrów od podstawy aparatury. Przed rozpoczęciem próby u podstawy umieszcza się miękką, wyściełaną powierzchnię, aby amortyzować ewentualne upadki. Przygotuj rotor rod, ustawiając prędkość początkową na cztery obroty na minutę oraz tempo przyspieszenia na 20 obrotów na minutę.

Na początek należy chwycić mysz za ogon i unieść ją w stronę pręta pod kątem 45 stopni poniżej poziomu. Zwierzę należy szybko puścić w momencie, gdy niemal dotyka ono pręta. Alternatywnie mysz można opuścić na kołek, a następnie za pomocą kołka przenieść zwierzę na pręt.

Rozpocznij akcelerację 10 sekund po umieszczeniu myszy na pręcie i odnotuj prędkość, przy której mysz spadnie. Jeśli mysz spadnie przed upływem pięciu sekund i jest to prawdopodobnie spowodowane błędnym umieszczeniem zwierzęcia przez eksperymentatora, wynik nie powinien zostać zapisany; w przypadku upadku przed upływem 10 sekund należy powtórzyć próbę. Odnotuj czas i pozwól zwierzęciu na dwie kolejne próby.

W przypadku zwierząt, które utrzymują się powyżej 10 sekund, należy zarejestrować prędkość, z jaką zwierzę spada. Sporadycznie mysz może przestać iść i w konsekwencji krążyć wokół pręta przed ostatecznym upadkiem. Warto odnotować prędkość występowania tego zjawiska.

Wydajność oblicza się jako średnią prędkość pomiędzy próbami. Na przykład, w przypadku myszy, która raz spadnie przed upływem 10 sekund, a następnie utrzyma się na urządzeniu do osiągnięcia 12 obrotów na minutę, wynik z drugiej próby to suma czterech i 12 podzielona przez dwa, co daje osiem obrotów na minutę.

Test poprzeczki poziomej służy do pomiaru siły i koordynacji kończyn tylnych, przy czym najczęściej stosuje się pręt o średnicy 2 mm. Pręty o większej średnicy mogą pozwolić na uzyskanie bardziej precyzyjnych wyników wydajności. Mosiężne pręty o długości 38 cm są utrzymywane na wysokości 49 cm nad powierzchnią stołu laboratoryjnego za pomocą drewnianej kolumny wspierającej.

Pręty są utrzymywane pod napięciem, gdy zostaną osadzone w wycięciach podpór, które są lekko zbliżane do siebie. Testowanie należy rozpocząć od pręta o grubości dwóch milimetrów. Chwyć mysz za ogon i umieść ją na stole laboratoryjnym przed aparaturą.

Przesuń go szybko. Cofnij o około 20 centymetrów, aby błyskawicznie ustawić jego ciało prostopadle do pręta. Podnieś zwierzę, pozwalając mu chwycić poziomy pręt w centralnej części za pomocą samych czterech porów.

Zwolnij ogon, jednocześnie uruchamiając stoper. Jeśli mysz nie chwyci drążka, przyczyną może być sposób umieszczenia zwierzęcia przez eksperymentatora. W takim przypadku nie zapisuj upadku i powtórz test po krótkim odpoczynku zwierzęcia.

Jeśli mysz spadnie przed upływem pięciu sekund i nie wynika to ewidentnie z błędnego umieszczenia zwierzęcia przez eksperymentatora, powtórz próbę do trzech razy w celu uzyskania wyniku powyżej pięciu sekund. Zapisz czas spadku myszy lub czas do momentu, w którym jeden z czterech błędnych dotyków nastąpi w kolumnie, przy maksymalnym czasie testu wynoszącym 30 sekund; przyjmij najlepszy wynik jako daną dotyczącą poprzeczki poziomej. Jeśli masa spadnie w czasie od jednej do pięciu sekund, przypisz wynik jeden; w czasie od sześciu do 10 sekund.

Dwa punkty za czas od 11 s do 20 s. Trzy punkty za czas od 21 s do 30 s. Cztery punkty w przypadku spadnięcia po 30 s lub pozostania na drążku do 30 s.

Otrzymuje pięć punktów, a mysz również otrzymuje pięć punktów, jeśli dotknie końca. Podtrzymuj za pomocą czterech portów w dowolnym momencie podczas testowania. Jeśli na pręcie o grubości 2 mm zostanie osiągnięty wynik pięciu punktów, zwierzę może zostać poddane testom na grubszych prętach po krótkim odpoczynku.

System punktacji dla prętów o średnicy czterech i sześciu milimetrów jest taki sam jak dla pręta o średnicy dwóch milimetrów, a wynik końcowy stanowi suma skumulowana. Zatem mysz, która uzyska pięć punktów na pręcie o średnicy dwóch milimetrów, a następnie spadnie z pręta o średnicy czterech milimetrów po 13 sekundach, otrzymuje wynik pięć plus trzy, co daje łącznie osiem.

W tym teście koordynacji ruchowej drewniane kołki lub pręty o różnej grubości (o średnicach odpowiednio 35, 28, 22, 15 i 9 mm), każdy o długości 60 cm, są przymocowane za pomocą ścisku stolarskiego do laboratoryjnej półki znajdującej się 60 cm nad podłogą. W odległości 10 cm od końca pręta przylegającego do blatu nanosi się oznaczenie wyznaczające linię mety. Aby rozpocząć test, należy umieścić mysz na przeciwległym końcu najszerszego pręta, przodem do strony przeciwnej niż półka; należy następnie odnotować czas, w jakim zwierzę zorientuje się w stronę półki oraz całkowity czas przejścia.

Jeśli podczas orientacji mysz odwróci się do góry nogami i zacznie zwisać pod prętem, przypisz jej arbitralnie maksymalną wartość 120 sekund. Zwierzę nie jest poddawane testom na pozostałych prętach i otrzymuje również maksymalną wartość czasu przejścia. Jeśli mysz spadnie lub osiągnie maksymalny czas testu wynoszący 120 sekund po dokonaniu orientacji, nie należy poddawać jej testom na węższych prętach.

Maksymalna liczba punktów jest również przyznawana, jeśli mysz wywróci się do góry nogami podczas przechodzenia przez pręt po zorientowaniu się; w takim przypadku należy zwrócić mysz do klatki domowej i pozwolić jej odpocząć przed dalszym testowaniem. Następnie należy użyć kolejnego, mniejszego pręta. Umieść zwierzę na mniejszym pręcie, tak jak pokazano wcześniej.

Jeśli mysz spadnie przed upływem pięciu sekund, należy ją zastąpić i dopuścić do dwóch kolejnych prób. Należy zarejestrować czas potrzebny na odwrócenie pręta lub czas do momentu spadnięcia myszy. Aby przygotować poręcze równoległe, należy zamocować dwa pręty o długości jednego metra i średnicy czterech milimetrów w odstępach 30 mm na drewnianym wsporniku.

Słupki znajdują się 60 centymetrów nad podłogą. Umieść mysz w centrum między dwiema prętami, tak aby jej oś podłużna była prostopadła do prętów. Obie przednie łapy powinny spoczywać na jednym pręcie, a obie tylne łapy na drugim pręcie.

Punktacja jest analogiczna do tej stosowanej dla prętów statycznych. Pomiarom podlegają dwie wartości: czas do momentu, w którym mysz zorientuje się pod kątem 90 stopni względem pozycji startowej, oraz czas do momentu dotarcia do jednego z podpór końcowych. Podobnie, orientacja i przejście muszą zostać osiągnięte bez odwracania się zwierzęcia do góry nogami; w przeciwnym razie przypisuje się czas maksymalny.

Jeśli zwierzę spadnie przed upływem pięciu sekund, wynika to prawdopodobnie z niewłaściwego umieszczenia i należy powtórzyć test. Pręt statyczny był pierwotnie wykorzystywany do monitorowania postępu choroby u myszy mutantów z wzbogaceniem środowiskowym w klatkach domowych lub bez niego. Program wzbogacenia znacząco opóźnił wystąpienie dysfunkcji motorycznych na pręcie, co korelowało z opóźnieniem wystąpienia nieprawidłowego chwytania tylnymi łapami.

Ogólnym objawem neurologicznym u zainfekowanych myszy był spadek wyników w próbie z poziomą belką od 16. tygodnia po iniekcji, w teście rotarod od 18. tygodnia oraz w próbie z prętami statycznymi co najmniej od 19. tygodnia. Uszkodzenia hipokampa nie miały wpływu na żadną z miar sprawności ruchowej, jednak myszy 1 2 9 s two SV wykazywały upośledzenie w stosunku do szczepu C 57 black six w testach rotarod i prętach statycznych po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom choroby Huntingtona do analizy efektów wzbogacenia środowiskowego u mutantowych myszy z chorobą Huntingtona.