Procedura trwająca 1,5 godziny służąca do identyfikacji gatunków Enterococcus bezpośrednio z posiewów krwi

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybka identyfikacja gatunków enterokoków z dodatnich butelek z posiewami krwi przy użyciu hybrydyzacji fluorescencyjnej kwasów nukleinowych z peptydami (PNA-FISH). Po przygotowaniu posiewów krwi i wykonaniu barwienia metodą Grama w celu potwierdzenia obecności kultur enterokoków, próbki utrwala się na szkiełkach mikroskopowych do PNA-FISH. Następnie szkiełka inkubuje się z sondami PNA specyficznymi dla badanych organizmów.

Po hybrydyzacji sond przeprowadza się rygorystyczne płukanie w celu usunięcia nadmiaru niezhybrydyzowanej sondy. Na preparaty nanosi się medium montażowe, a następnie przykrywa je szkiełkami podstawowymi. Gatunki enterokoków obecne w próbce można zidentyfikować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Niniejszy protokół identyfikacji PNA Fish jest unikalny, ponieważ zapewnia szybką i swoistą metodę identyfikacji enterokoków z posocznicy. Próbki posiewów krwi pacjenta: dwie butelki do posiewu krwi, jedną tlenową i jedną beztlenową, zawierające krew żylną pobraną od pacjenta z podejrzeniem sepsy, inkubuje się w automatycznym analizatorze posiewów krwi w temperaturze 35 °C. Gdy urządzenie wskaże wykrycie wzrostu drobnoustrojów, należy wyjąć butelkę i delikatnie nią zakręcić, aby równomiernie resuspender bakterie.

Następnie, używając sterylnej strzykawki i igły, aseptycznie przenieś około 5 ml krwi z każdej butelki do osobnej probówki z nakrętką. Po rozdzieleniu wszystkich próbek, za pomocą sterylnej pipety przenieś kroplę krwi z każdej probówki na osobne szklane szkiełko mikroskopowe. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu przez około 15 minut.

Następnie, gdy preparat całkowicie wyschnie, zanurz go w metanolu w celu utrwalenia próbki. Po utrwaleniu preparatów należy je wypłukać i przeprowadzić standardowe barwienie metodą Grama, aby określić morfologię organizmów obecnych w każdej posiewie krwi. Pomalowane preparaty należy zbadać pod mikroskopem z użyciem obiektywu imersyjnego.

Wprowadzony gatunek caucus pojawi się jako gronkowce dodatnio barwiące się, zazwyczaj zgrupowane w pary lub krótkie łańcuchy. Nanieś jedną kroplę roztworu utrwalającego do wgłębienia na szkiełku przedmiotowym p i a fish. Delikatnie wymieszaj probówkę z posiewem krwi przeznaczoną do badania.

Następnie przenieś 10 µL hodowli do kropli roztworu utrwalającego i pipetuj próbkę w górę i w dół, aby ją zemulgować. Umieść preparaty na płycie grzejnej w temperaturze 55 °C przez 20 minut w celu utrwalenia rozmazów w każdym teście. Pamiętaj o dołączeniu slajdów kontroli pozytywnej i negatywnej do oceny jakości analizy.

Jeśli szkiełka kontrolne z obecnością drobnoustrojów nie są dostępne w zakupie od firmy Van DX, można je przygotować przy użyciu kultur referencyjnych. Gdy preparat jest gotowy, nanieś jedną kroplę EFI callous O-E-P-N-A do dołka zawierającego próbkę posiewu krwi, a także do dołków kontroli dodatniej i ujemnej. Aby uniknąć zanieczyszczenia roztworu zapasowego sondy, należy dopilnować, aby końcówka buteleczki z zakraplaczem nie dotykała preparatu z krwi.

Na próbkę nałóż szkiełko nakrywkowe, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Następnie inkubuj preparat w bloku grzejnym w temperaturze 55 °C przez 30 minut. Aby umożliwić hybrydyzację PNA po inkubacji, umieść preparaty w kasecie do szkiełek.

Zanurz załadowany uchwyt do szkiełek w kuwecie do barwienia zawierającej podgrzany do 55 °C roztwór do płukania. Aby usunąć nadmiar PNA z próbki, ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkę, potrząsając szkiełkiem w buforze lub używając pincety. Inkubuj szkiełko w roztworze do płukania w temperaturze 55 °C przez 30 minut.

Następnie należy wyjąć preparat z kuwety do barwienia i pozostawić go do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu preparatu nanieść na niego jedną kroplę medium montażowego o temperaturze pokojowej i ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe na próbkę. Preparaty należy zbadać pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu filtra dwupasmowego w ciągu dwóch godzin od przygotowania.

Stosując tę metodę, można odróżnić iffy, callous, zaznaczone na zielono po lewej stronie, od eum zaznaczonego na czerwono. Na środkowym panelu po prawej stronie widoczny jest wynik negatywny. Trzy kwestie należy pamiętać, aby osiągnąć pomyślne wyniki: temperatury urządzenia muszą zostać utrzymane na poziomach zadanych.

Należy ściśle przestrzegać procedury barwienia opisanej w ulotce dołączonej do zestawu. Na koniec niezbędny jest doświadczony specjalista, który przeprowadzi dokładną analizę preparatu na szkiełku. Protokół ten jest pomocny w podejmowaniu decyzji terapeutycznych w leczeniu sepsy wywołanej przez enterokoki.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.