Name: 1,5-godzinna procedura identyfikacji gatunków Enterococcus bezpośrednio na podstawie posiewów krwi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-10T20:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Poznaj szybką identyfikację gatunków Enterococcus z posiewów krwi metodą PNA FISH. Ta technika hybrydyzacji fluorescencyjnej umożliwia precyzyjną diagnostykę bakterii w ciągu 1,5 godziny, wspierając szybkie decyzje terapeutyczne w leczeniu sepsy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania były sponsorowane przez AdvanDx.

1. Pobieranie i przygotowanie próbek
<ol>
<li>Pobrać krew żylną od pacjentów z podejrzeniem sepsy i umieścić ją w dwóch butelkach do posiewów krwi BACTEC (BD, Sparks, MD) – jednej tlenowej i jednej beztlenowej – które razem tworzą jeden zestaw do posiewu krwi.</li>
<li>Umieścić butelki w urządzeniu BACTEC 9240 w temperaturze 35°C.</li>
<li>Inkubować do momentu uruchomienia alarmu przez urządzenie w wyniku wzrostu organizmów w butelce z posiewem krwi.</li>
<li>Wyjąć butelkę z urządzenia do posiewów krwi.</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynników przed barwieniem
<ol>
<li>Przygotuj roztwór do płukania, dodając 4 mL 60x Wash Solution, a następnie 240 mL świeżej wody dejonizowanej lub destylowanej bezpośrednio do kuwety do barwienia.</li>
<li>Umieść kuwetę do barwienia w kąpieli wodnej o temperaturze 55°C w celu ogrzania.</li>
<li>Pozostały koncentrat przechowuj w temperaturze 2-8°C.</li>
<li>Wyjmij Medium Montażowe z lodówki i doprowadź do temperatury pokojowej.</li>
</ol>
3. Barwienie metodą Grama
<ol>
<li>Delikatnie zakręć butelką z posiewem krwi.</li>
<li>Za pomocą igły i strzykawki lub urządzenia do pasażowania pobierz krew (około 5 mL) z butelki i przelej do sterylnej probówki z nakrętką.</li>
<li>Za pomocą sterylnej pipety nanieś jedną dużą kroplę krwi na szkiełko przedmiotowe.</li>
<li>Wysusz szkiełko na powietrzu i utrwal w metanolu przez 10 sekund.</li>
<li>Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu.</li>
<li>Wykonaj barwienie metodą Grama na rozmazie krwi, aby określić morfologię organizmu rosnącego w butelce z posiewem krwi.</li>
<li>Obejrzyj szkiełko przy użyciu obiektywu imersyjnego. Obecność dodatnich koków Grama w parach i krótkich łańcuchach w barwieniu metodą Grama jest najbardziej charakterystyczna dla gatunków enterokoków.</li>
<li>Wynik barwienia metodą Grama determinuje wybór odpowiedniego zestawu sond PNA FISH do identyfikacji bakterii. Ten posiew krwi zostanie zabarwiony przy użyciu barwnika PNA FISH E. faecalis/OE.</li>
</ol>
4. Barwienie PNA FISH
<ol>
<li>Przed przygotowaniem rozmazu delikatnie wymieszaj zawartość probówki z krwią, obracając ją okrężnie.</li>
<li>Nanieś jedną kroplę roztworu utrwalającego (Fixation Solution) na wgłębienie szkiełka przedmiotowego do PNA FISH.</li>
<li>Przenieś 10 μL lub jedną małą kroplę z probówki z dodatnią hodowlą krwi do roztworu utrwalającego i delikatnie wymieszaj, aby uzyskać emulsję.</li>
<li>Utrwal rozmazy, podgrzewając je przez 20 min w temperaturze 55°C na płycie grzejnej.</li>
</ol>
5. Materiał kontroli jakości
Wraz z każdą partią preparatów do barwienia należy przetestować jeden slajd kontroli jakości dodatniej i jeden ujemnej.
<ol>
<li>W tym celu należy użyć slajdów kontrolnych E. faecalis/OE zakupionych w AdvanDx lub przygotować mazaki z kultur płynnych szczepów referencyjnych E. faecalis i E. faecium jako kontroli pozytywnej, albo na osobnych slajdach, albo zmieszanych na jednym slajdzie, oraz Staphylococcus spp lub Streptococcus spp jako materiału kontroli negatywnej.</li>
</ol>
Wyniki kontroli jakości powinny umożliwiać monitorowanie odpowiednich warunków testowych, w szczególności tych wpływających na rygorystyczność hybrydyzacji oraz penetrację ściany komórkowej, ponieważ metodologia PNA została zaprojektowana w celu optymalizacji penetracji ściany komórkowej
6. Hybrydyzacja
<ol>
<li>Do dołka na szkiełku mikroskopowym z preparatem rozmazowym dodać jedną kroplę E. faecalis/OE PNA.</li>
<li>Nałożyć szkiełko nakrywkowe, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
<li>Inkubować przez 30 ± 5 min w temperaturze 55 ± 1°C na płycie grzejnej.</li>
<li>Po inkubacji umieścić szkiełka w statywie.</li>
</ol>
7. Rygorystyczne przemywanie
<ol>
<li>Zanurz uchwyt do szkiełek w podgrzanym do 55°C roztworze piorącym i ostrożnie zdejmij szkiełko podstawowe. Często szkiełko podstawowe zsuwa się samo podczas delikatnego potrząsania preparatem w roztworze piorącym. Czasami konieczne jest delikatne odepchnięcie szkiełka podstawowego za pomocą pęsety.</li>
<li>Inkubuj w roztworze piorącym przez 30 ± 5 min. w temperaturze 55 ± 1°C.</li>
<li>Wyjmij szkiełka z roztworu piorącego</li>
<li>Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu</li>
</ol>
8. Montowanie preparatów
<ol>
<li>Nanieś jedną kroplę medium montującego na każdy preparat</li>
<li>Nałóż szkiełko nakrywkowe. Unikaj pęcherzyków powietrza.</li>
<li>Zbadaj preparat pod mikroskopem fluorescencyjnym w ciągu 2 godzin.</li>
<li>Nie wystawiaj preparatów na bezpośrednie działanie światła słonecznego ani innych silnych źródeł światła, ponieważ może to prowadzić do wygaszenia fluorescencji.</li>
</ol>
9. Interpretacja wyników
Mikroskop fluorescencyjny używany do badania preparatów musi być wyposażony w filtr AdvanDx Dual Band oraz obiektyw olejowy 60x lub 100x. W pierwszej kolejności należy zbadać preparaty kontroli jakości (QC), aby potwierdzić, że doszło do hybrydyzacji. E. faecalis powinny być widoczne jako jaskrawozielone fluorescencyjne przączki w wielu polach widzenia, natomiast E. faecium będą widoczne jako jaskrawoczerwone przączki. Preparat kontrolny z nie-enterokokami nie powinien wykazywać fluorescencji. Po potwierdzeniu poprawności działania systemu na kontrolach można przystąpić do badania preparatów pacjentów. Początkowo rozmaz krwi będzie wydawał się czerwony, ale jaskrawoczerwone i zielone przączki będą wyraźnie widoczne. 
<img src="/files/ftp_upload/2616/2616fig1.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórek bakteryjnych; fluorescencja zielona i czerwona; analiza żywotności komórek." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Reprezentatywne przykłady wyników testów: dodatni wynik dla zielonej fluorescencji E. faecalis (po lewej), dodatni wynik dla czerwonej fluorescencji E. faecium (środek) oraz wynik negatywny (po prawej).
10. Reprezentatywne wyniki
Trzy instytucje zostały włączone do wieloośrodkowego badania klinicznego oceniającego to barwienie PNA FISH i porównującego protokół 2,5-godzinny ze skróconym protokołem 1,5-godzinnym, który został właśnie omówiony. W badaniach uwzględniono łącznie 152 butelki z posiewami krwi dodatnimi pod kątem rutynowych dodatnich koków Grama występujących w parach i łańcuchach (GPC). Odnotowano 100% (152/152) zgodności między wynikami zmodyfikowanej a oryginalnej procedury badania dla E. faecalis/OE PNA FISH: 41/41 E. faecalis; 33/33 inne enterokoki oraz 78/78 inne GPC (Tabela 1). Metoda barwienia ta wykazała wyjątkową czułość i swoistość podczas tego badania klinicznego (Tabela 2).
<table border="1">
<tbody >
 <tr >
 <td > </td >
 <td >Metody rutynowe</td >
 <td >E. faecalis / Standardowa procedura PNA FISH OE</td >
 <td >E. faecalis/ Skrócona procedura PNA FISH OE</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >E. faecalis</td >
 <td >41</td >
 <td >41 (Dodatni zielony)</td >
 <td >41 (Dodatni zielony)</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >E. faecium</td >
 <td >27</td >
 <td >27 (Dodatni czerwony)</td >
 <td >27 (Dodatni czerwony)</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >E. casseliflavus</td >
 <td >2</td >
 <td >2 (Dodatni czerwony)</td >
 <td >2 (Dodatni czerwony)</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >E. gallinarum</td >
 <td >2</td >
 <td >2 (Dodatni czerwony)</td >
 <td >2 (Dodatni czerwony)</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >Inne Enterococcus spp.</td >
 <td >2</td >
 <td >2 (Dodatni czerwony)</td >
 <td >2 (Dodatni czerwony)</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >S. pneumoniae</td >
 <td >17</td >
 <td >17 (Ujemny)</td >
 <td >17 (Ujemny)</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >S. viridans</td >
 <td >33</td >
 <td >33 (Ujemny)</td >
 <td >33 (Ujemny)</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >S. mitis</td >
 <td >1</td >
 <td >1 (Ujemny)</td >
 <td >1 (Ujemny)</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >S. pyogenes</td >
 <td >3</td >
 <td >3 (Ujemny)</td >
 <td >3 (Ujemny)</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >S. bovis</td >
 <td >2</td >
 <td >2 (Ujemny)</td >
 <td >2 (Ujemny)</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >S. salivarius</td >
 <td >1</td >
 <td >1 (Ujemny)</td >
 <td >1 (Ujemny)</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >S. sanguinis</td >
 <td >2</td >
 <td >2 (Ujemny)</td >
 <td >2 (Ujemny)</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >S. agalagtae</td >
 <td >7</td >
 <td >7 (Ujemny)</td >
 <td >7 (Ujemny)</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >Inne Streptococcus spp.</td >
 <td >7</td >
 <td >7 (Ujemny)</td >
 <td >7 (Ujemny)</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >Abiotrophia spp.</td >
 <td >3</td >
 <td >3 (Ujemny)</td >
 <td >3 (Ujemny)</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >Peptostrepococcus spp.</td >
 <td >2</td >
 <td >2 (Ujemny)</td >
 <td >2 (Ujemny)</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >Suma</td >
 <td >152</td >
 <td >152/152 
 100% zgodności</td >
 <td >152/152 
 100% zgodności</td >
 </tr >
</tbody >
</table >
Tabela 1. Lista bakterii przetestowanych przy użyciu standardowego (2,5 h) oraz szybkiego (1,5 h) protokołu.
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Czułość *E. faecalis*</td>
 <td>Czułość Inne Enterococcus spp.</td>
 <td>Specyficzność</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% (41/41) 
 95% CI (93,0-100)</td>
 <td>100% (33/33) 33/33 
 95% CI (91,3-100)</td>
 <td>100% (78/78) 
 95% CI (96,2-100)</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
Tabela 2. Czułość i swoistość 1,5-godzinnego protokołu PNA FISH.

<ol><li>Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes. Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. 42rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, San Diego, , (2002).</li>
<li>Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures. Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. 103rd Annual Meeting of American Society, 2003, Washington DC, , (2003).</li>
<li>Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes. Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. 104th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2005, New Orleans, LA, , (2005).</li>
<li>Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH & C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles. Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, , (2006).</li>
<li>Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications. Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, , (2006).</li>
</ol>

Produkcja tego artykułu wideo była sponsorowana przez AdvanDx. Benjamin Crystal jest pracownikiem firmy AdvanDx, która produkuje narzędzia i odczynniki wykorzystane w niniejszym artykule.

Test PNA FISH E. faecalis/OE w kierunku enterokoków pozwala na identyfikację patogenu o 2-3 dni szybciej niż standardowe metody hodowlane. Skrócona procedura testu (1,5 godziny) zapewnia szybką identyfikację, która może zostać wykorzystana do lepszego doboru terapii przeciwdrobnoustrojowej i poprawy rokowań pacjenta. Badanie potwierdzające tę tezę zostało przeprowadzone przez Forrest et al. (6). Przez dwa kolejne lata, poczynając od 2005 roku, laboratorium mikrobiologiczne identyfikowało za pomocą konwencjonalnych metod mikrobiologicznych dodatnie Gramem kokusy występujące w parach i łańcuchach, rosnące w butelkach do posiewów krwi, a w 2006 roku wdrożono dodatkowo test PNA FISH E. faecalis/OE. Ponadto opracowano algorytm leczenia stworzony przez instytucjonalny zespół przeciwdrobnoustrojowy (AMT), aby w odpowiednim czasie efektywnie wykorzystać dane z testu PNA FISH generowane przez laboratorium. Głównym ocenianym punktem końcowym był czas od pobrania krwi do wdrożenia skutecznej terapii przeciwdrobnoustrojowej przed i po wprowadzeniu PNA FISH do workflow laboratorium. Mierzono również ciężkość choroby, miejsce pobytu pacjenta oraz empiryczną terapię przeciwdrobnoustrojową. Oceniono łącznie 224 pacjentów z bakterymią enterokokową nabytą w szpitalu, z czego 129 w okresie przed interwencją i 95 w okresie stosowania PNA FISH. Test PNA FISH zidentyfikował E. faecalis o 3 dni szybciej niż konwencjonalne posiewy (1,1 vs. 4,1 dnia, p&lt;0,001). PNA FISH zidentyfikował E. faecium medianowo o 2,3 dnia szybciej (1,1 vs. 3,4 dnia, p&lt;0,001) i wiązało się to ze statystycznie istotnym skróceniem czasu do rozpoczęcia skutecznej terapii (1,3 vs. 3,1 dnia, p&lt;0,001) oraz zmniejszeniem śmiertelności w ciągu 30 dni (26% vs. 45%, p=0,04). Grupa badawcza wyciągnęła wniosek, że test PNA FISH E. faecalis/OE w połączeniu z algorytmem leczenia AMT doprowadził do wcześniejszego wdrożenia odpowiedniej empirycznej terapii przeciwdrobnoustrojowej u pacjentów z bakterymią E. faecium nabytą w szpitalu.
<ol>
<li>Odczynników nie należy stosować po dacie ważności podanej na etykietach; nie powinny być one w żaden sposób modyfikowane. Gdy nie są używane, powinny być przechowywane w lodówce, aby nie straciły swojej aktywności.</li>
<li>Butelki z posiewem krwi należy wymieszać przed pobraniem próbek.</li>
<li>Należy uważać, aby końcówka buteleczki z zakraplaczem nie dotknęła rozmazu krwi, ponieważ może to spowodować kontaminację krzyżową materiału między slajdami lub zanieczyszczenie odczynnika.</li>
<li>Należy upewnić się, że kąpiel wodna oraz blok grzejny są utrzymywane w stałej temperaturze 55°C.</li>
<li>Nie należy używać innych filtrów niż filtr dwupasmowy (Dual Band Filter), w przeciwnym razie kolory nie będą wyraźnie rozróżnialne.</li>
<li>Nie należy używać innych szkiełek przedmiotowych niż dedykowane Microscope Slides, w przeciwnym razie nie dojdzie do hybrydyzacji.</li>
<li>Kluczowe jest, aby mikroskop funkcjonował prawidłowo. Należy upewnić się, że liczba godzin pracy żarówki mikroskopu mieści się w dopuszczalnym limicie.</li>
</ol>
<ul>
<li>Niektóre rzadko występujące gatunki Enterococcus nie są wykrywane przez sondę PNA hybrydyzującą z innymi gatunkami Enterococcus, takimi jak E. asinii, E. dispar, E. haemoperoxidus, E. cecorum, E. columbae, E. saccharolyticus, E. solitarius i E. sulfurous.</li>
<li>E. moraviensis jest identyfikowany jako E. faecalis ze względu na podobieństwo sekwencji.</li>
<li>Niektóre szczepy Streptococcus anginosus wykazują fałszywie dodatnią zieloną fluorescencję ze względu na podobieństwo sekwencji.</li>
<li>Butelki do posiewów krwi VersaTREK nie zostały poddane ocenie podczas badań klinicznych. Wydajność wykrywania E. faecalis oraz innych gatunków Enterococcus spp. przy użyciu butelek VersaTREK jest nieznana.</li>
<li>Może wystąpić fałszywie dodatnia zielona autofluorescencja w przypadku użycia standardowego filtra FITC zamiast filtra dwupasmowego (Dual Band Filter).</li>
<li>Fałszywie ujemne wyniki mogą sporadycznie występować z powodu mieszanego wzrostu drobnoustrojów lub błędów w technice przeprowadzania testu.</li>
<li>Typ i stan wykorzystanego instrumentarium wpływają na wizualny aspekt uzyskanego obrazu. Intensywność fluorescencji może się różnić w zależności od rodzaju użytego mikroskopu, źródła światła oraz poziomu rRNA w komórkach.</li>
<li>Izolacja na podłożach stałych jest niezbędna do odróżnienia wzrostu mieszanego z innymi organizmami oraz do identyfikacji dodatnich posiewów krwi, które dały wynik ujemny.</li>
<li>Produkt nie został zwalidowany dla materiałów innych niż posiewy krwi.</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Odczynniki&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;&lt;em&gt;*E. faecalis*&lt;/em&gt;/&amp;#8211; Zestaw PNA FISH składa się z następujących komponentów:&lt;/p&gt;&lt;ul&gt; &lt;li&gt;Roztwór utrwalający
Roztwór utrwalający
3 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym z detergentem.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;/&amp;#8211; PNA &lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;/&amp;#8211; 1,5 ml sond PNA w roztworze do hybrydyzacji. Zawiera 30% formamidu.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Roztwór płuczący 60x Roztwór płuczący 60x 50 mL Tris-buforowana sól fizjologiczna z detergentem&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Medium montażowe Medium montażowe 3 ml inhibitor fotoblaknięcia w glicerolu&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Preparaty do kontroli jakości&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;a href=&quot;http://www.advandx.com&quot;&gt;AdvanDX&lt;/a&gt;&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

procedura trwająca 1,5 godziny służąca do identyfikacji gatunków enterococcus bezpośrednio z posiewów krwi

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterokoki są częstą przyczyną bakteriemii, przy czym dominującym gatunkiem jest E. faecalis, a następnie E. faecium. Ponieważ oporność na ampicylinę i wankomycynę u E. faecalis jest wciąż rzadka w porównaniu z opornością u E. faecium, opracowanie szybkich testów pozwalających na rozróżnienie gatunków enterokoków jest istotne dla właściwej terapii i nadzoru nad opornością. Test E. faecalis OE PNA FISH (AdvanDx, Woburn, MA) wykorzystuje gatunkowo specyficzne sondy z kwasu nukleinowego peptydowego (PNA) w formacie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, oferując czas uzyskania wyników wynoszący 1,5 godziny oraz potencjał dostarczania istotnych informacji dla leczenia specyficznego dla danego gatunku. Przeprowadzono badania wieloośrodkowe w celu oceny skuteczności procedury E. faecalis/OE PNA FISH trwającej 1,5 godziny w porównaniu z oryginalną procedurą testową trwającą 2,5 godziny oraz standardowymi metodami bakteriologicznymi identyfikacji enterokoków bezpośrednio z dodatniego butelka z posiewem krwi.

Szybki protokół bezpośredniej identyfikacji Enterococcus faecalis oraz innych gatunków Enterococcus z dodatniej posiewu krwi z wykorzystaniem testu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z użyciem kwasów nukleinowych peptydowych (PNA FISH).

Procedura trwająca 1,5 godziny służąca do identyfikacji gatunków Enterococcus bezpośrednio z posiewów krwi

Enterokoki są częstą przyczyną bakteremii, przy czym gatunkiem przeważającym jest *E. faecalis*, a następnie *E. faecium*. Ze względu na oporność na ampicylinę i ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybka identyfikacja gatunków enterokoków z dodatnich butelek z posiewami krwi przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ kwasów nukleinowych (PNA-FISH). Po przygotowaniu posiewów krwi i wykonaniu barwienia metodą Grama w celu potwierdzenia obecności kultur Enterococci, próbki utrwala się na szkiełkach mikroskopowych do PNA-FISH. Następnie szkiełka inkubuje się z sondami PNA specyficznymi dla badanych organizmów.Po hybrydyzacji sond przeprowadza się rygorystyczne płukanie w celu usunięcia nadmiaru niezhybrydyzowanej sondy. Na preparaty nanosi się medium montażowe, a następnie zamyka je szkiełkami nakrywkowymi. Gatunki enterokoków obecne w próbce można zidentyfikować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Niniejszy protokół identyfikacji metodą PNA-FISH jest wyjątkowy, ponieważ zapewnia szybką i specyficzną metodę identyfikacji enterokoków z posocznicy. Próbki krwi pacjenta z posiewu: inkubuj dwie butelki do posiewu krwi, jedną tlenową i jedną beztlenową, zawierające krew żylną pacjenta z podejrzeniem sepsy, w automatycznym urządzeniu do posiewów krwi w temperaturze 35 stopni Celsjusza. Gdy urządzenie wskaże wykrycie wzrostu drobnoustrojów, wyjmij butelkę i delikatnie zakręć nią, aby równomiernie resuspender bakterie.Następnie, używając sterylnej strzykawki i igły, aseptycznie przenieś około pięciu mililitrów krwi z każdej butelki do oddzielnej probówki z nakrętką. Po rozdzieleniu wszystkich próbek, za pomocą sterylnej pipety nanieś kroplę krwi z każdej probówki na oddzielne szkiełko przedmiotowe. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu przez około 15 minut.Następnie, gdy szkiełko całkowicie wyschnie, zanurz je w metanolu w celu utrwalenia próbki. Po utrwaleniu szkiełkach należy je wypłukać i przeprowadzić standardowe barwienie metodą Grama, aby określić morfologię organizmów obecnych w każdej posiewie krwi. Zabarwione preparaty należy zbadać pod mikroskopem z użyciem obiektywu imersyjnego.Wprowadzone gatunki koków będą widoczne jako gronkowce dodatnie, zazwyczaj zgrupowane w pary lub krótkie łańcuchy. Nanieś jedną kroplę roztworu utrwalającego do dołka w p i na szkiełko mikroskopowe. Delikatnie wymieszaj probówkę z posiewem krwi przeznaczoną do badania.Następnie przenieś 10 µL hodowli do kropli roztworu utrwalającego i pipetuj ciecz w górę i w dół, aby zemulgować próbkę. Umieść slajdy na płycie grzejnej w temperaturze 55 °C na 20 minut, aby utrwalić mazaki w każdym teście. Pamiętaj o uwzględnieniu slajdów z kontrolą pozytywną i negatywną w celu oceny jakości analizy.Pozytywne i negatywne lamestrki kontrolne można zakupić od firmy Van DX lub przygotować przy użyciu kultur referencyjnych. Gdy rozmaz będzie gotowy, nanieś jedną kroplę EFI callous O-E-P-N-A do dołka zawierającego próbkę hodowli krwi, a także do dołków kontroli dodatniej i ujemnej. Aby uniknąć zanieczyszczenia roztworu zapasowego sondy, należy dopilnować, aby końcówka buteleczki z zakraplaczem nie dotykała rozmazu krwi.Na próbkę nałóż szkiełko nakrywkowe, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Następnie inkubuj preparat w bloku grzewczym w temperaturze 55 °C przez 30 minut. Aby umożliwić hybrydyzację PNA po inkubacji, umieść preparaty w kasecie do szkiełek.Zanurz załadowany uchwyt do szkiełek w naczyniu do barwienia zawierającym podgrzany do 55 °C Roztwór Przemywający. Aby usunąć nadmiar PNA z próbki, delikatnie zdejmij szkiełko podstawowe poprzez potrząsanie szkiełkiem w buforze lub za pomocą pęsety. Inkubuj szkiełko w roztworze przemywającym w temperaturze 55 °C przez 30 minut.Następnie wyjmij preparat z naczynia do barwienia i pozostaw go do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu preparatu nanieś na niego jedną kroplę medium montażowego o temperaturze pokojowej i ostrożnie nałóż szkiełko nakrywką na próbkę. Przeanalizuj preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym z użyciem filtra dwupasmowego w ciągu dwóch godzin od przygotowania.Stosując tę metodę, próbkę iffy, callus, zaznaczoną na zielono po lewej stronie, można odróżnić od eum zaznaczonej na czerwono. Na środkowym panelu po prawej stronie przedstawiono wynik negatywny. Aby uzyskać pomyślne rezultaty, należy pamiętać o trzech kwestiach; temperatury urządzenia muszą być utrzymane na ustawionych wartościach.Należy ściśle przestrzegać procedury barwienia opisanej w ulotce dołączonej do zestawu. Na koniec niezbędny jest doświadczony specjalista, który przeprowadzi dokładną analizę preparatu na szkiełku. Niniejszy protokół jest przydatny przy podejmowaniu decyzji terapeutycznych w leczeniu sepsy wywołanej przez enterokoki.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

a-15-hour-procedure-for-identification-enterococcus-species-directly

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

1,5-godzinna procedura identyfikacji gatunków Enterococcus bezpośrednio z hodowlni krwi

Opracowanie prostego, jednodniowego schematu przepływu pracy w diagnostyce patogenów bakteryjnych umożliwia szybkie rozpoznanie zakażeń krwi. Uwzględnienie ośmiu istotnych klinicznie celów bakteryjnych oraz ich profili oporności na antybiotyki dostarcza lekarzowi wstępnych informacji tego samego dnia, co może prowadzić do zastosowania bardziej odpowiedniej terapii.

Jednodniowy schemat przepływu pracy dla wykrywania patogenów bakteryjnych i badania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe z posiewów krwi

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Zastosowanie spektrometrii mas (MS) z laserową desorpcją/jonizacją (MALDI-TOF) bezpośrednio do bulionu z hodowli krwi przyspiesza identyfikację bakterii. Przedstawiona metoda jest szybką i wiarygodną metodą identyfikacji bakterii Gram-ujemnych bezpośrednio z bulionu z posiewów krwi.

Szybka identyfikacja bakterii Gram-ujemnych w bulionie z posiewu krwi przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF

Szybki preparat bakteryjny z dodatniego posiewu krwi może być użyty jako próbka do zastosowań takich jak identyfikacja za pomocą MALDI-TOF, barwienie metodą Grama, testowanie wrażliwości na antybiotyki i test oparty na PCR. Wyniki mogą być szybko przekazywane klinicystom w celu poprawy wyników leczenia pacjentów cierpiących na infekcje krwi.

Przygotowanie osadu do hodowli krwi w celu szybkiej identyfikacji bakterii i badania wrażliwości na antybiotyki

EUCAST opracował protokół bezpośredniego testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) dla automatycznych hodowli krwi. Jednak jego zależność od identyfikacji mikrobiologicznej opartej na spektrometrii mas można wyeliminować, stosując protokół bezpośredniego przygotowania inokulum w zautomatyzowanym systemie identyfikacji drobnoustrojów. Takie podejście może dostarczyć raporty AST w ciągu 24 godzin od pobrania próbki.

Bezpośrednia identyfikacja mikrobiologiczna przy użyciu zautomatyzowanego systemu identyfikacji drobnoustrojów w celu ułatwienia metody EUCAST RAST bez spektrometrii mas

Podczas procesu infekcji kluczowym etapem jest adhezja patogenów do komórek gospodarza. W większości przypadków etap adhezji ten zachodzi w obecności stresu mechanicznego generowanego przez przepływającą ciecz. Opisujemy technikę, która wprowadza naprężenie ścinające jako istotny parametr w badaniu adhezji bakteryjnej.

Wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną

Tutaj opisujemy protokół izolacji podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej.  Wystarczająca ilość i jakość kwasów nukleinowych może zostać wyekstrahowana z komórek i wykorzystana w kolejnych testach z wykorzystaniem DNA lub RNA.

Izolacja podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej

Członkowie rodzaju Burkholderia są patogenami o znaczeniu klinicznym.  Opisujemy metodę całkowitej ekstrakcji białek bakteryjnych, wykorzystującą mechaniczne rozerwanie i elektroforezę żelową 2D do późniejszej analizy proteomicznej.

Metody ekstrakcji białka całkowitego i elektroforezy żelowej 2D dla gatunków Burkholderia

Padlinożercy mają potencjał do przenoszenia zakaźnych prionów gąbczastej encefalopatii w swoim kale do obszarów wolnych od chorób.  Szczegółowo opisujemy metody stosowane do określenia, czy priony trzęsawki przystosowane do myszy pozostają zakaźne po przejściu przez przewód pokarmowy wron amerykańskich (Corvus brachyrhynchos), powszechnego konsumenta martwych zwierząt.

Procedury identyfikacji zakaźnych prionów po przejściu przez układ pokarmowy gatunku ptaków

Tutaj opisujemy skuteczną metodę izolacji, identyfikacji i oczyszczania mysich komórek nabłonka grasicy (TEC). Protokół może być wykorzystany do badań funkcji grasicy pod kątem prawidłowego rozwoju komórek T, dysfunkcji grasicy i rekonstytucji limfocytów T.

Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

Poznaj szybką identyfikację gatunków Enterococcus z posiewów krwi metodą PNA FISH. Ta technika hybrydyzacji fluorescencyjnej umożliwia precyzyjną diagnostykę bakterii w ciągu 1,5 godziny, wspierając szybkie decyzje terapeutyczne w leczeniu sepsy.

Procedura trwająca 1,5 godziny służąca do identyfikacji gatunków Enterococcus bezpośrednio z posiewów krwi

Przeglądaj więcej filmów