Procedura trwająca 1,5 godziny służąca do identyfikacji gatunków Enterococcus bezpośrednio z posiewów krwi
10 lutego 2011
Szybki protokół bezpośredniej identyfikacji Enterococcus faecalis oraz innych gatunków Enterococcus z dodatniej posiewu krwi z wykorzystaniem testu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z użyciem kwasów nukleinowych peptydowych (PNA FISH).
Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybka identyfikacja gatunków enterokoków z dodatnich butelek z posiewami krwi przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ kwasów nukleinowych (PNA-FISH). Po przygotowaniu posiewów krwi i wykonaniu barwienia metodą Grama w celu potwierdzenia obecności kultur Enterococci, próbki utrwala się na szkiełkach mikroskopowych do PNA-FISH. Następnie szkiełka inkubuje się z sondami PNA specyficznymi dla badanych organizmów.
Po hybrydyzacji sond przeprowadza się rygorystyczne płukanie w celu usunięcia nadmiaru niezhybrydyzowanej sondy. Na preparaty nanosi się medium montażowe, a następnie zamyka je szkiełkami nakrywkowymi. Gatunki enterokoków obecne w próbce można zidentyfikować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Niniejszy protokół identyfikacji metodą PNA-FISH jest wyjątkowy, ponieważ zapewnia szybką i specyficzną metodę identyfikacji enterokoków z posocznicy. Próbki krwi pacjenta z posiewu: inkubuj dwie butelki do posiewu krwi, jedną tlenową i jedną beztlenową, zawierające krew żylną pacjenta z podejrzeniem sepsy, w automatycznym urządzeniu do posiewów krwi w temperaturze 35 stopni Celsjusza. Gdy urządzenie wskaże wykrycie wzrostu drobnoustrojów, wyjmij butelkę i delikatnie zakręć nią, aby równomiernie resuspender bakterie.
Następnie, używając sterylnej strzykawki i igły, aseptycznie przenieś około pięciu mililitrów krwi z każdej butelki do oddzielnej probówki z nakrętką. Po rozdzieleniu wszystkich próbek, za pomocą sterylnej pipety nanieś kroplę krwi z każdej probówki na oddzielne szkiełko przedmiotowe. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu przez około 15 minut.
Następnie, gdy szkiełko całkowicie wyschnie, zanurz je w metanolu w celu utrwalenia próbki. Po utrwaleniu szkiełkach należy je wypłukać i przeprowadzić standardowe barwienie metodą Grama, aby określić morfologię organizmów obecnych w każdej posiewie krwi. Zabarwione preparaty należy zbadać pod mikroskopem z użyciem obiektywu imersyjnego.
Wprowadzone gatunki koków będą widoczne jako gronkowce dodatnie, zazwyczaj zgrupowane w pary lub krótkie łańcuchy. Nanieś jedną kroplę roztworu utrwalającego do dołka w p i na szkiełko mikroskopowe. Delikatnie wymieszaj probówkę z posiewem krwi przeznaczoną do badania.
Następnie przenieś 10 µL hodowli do kropli roztworu utrwalającego i pipetuj ciecz w górę i w dół, aby zemulgować próbkę. Umieść slajdy na płycie grzejnej w temperaturze 55 °C na 20 minut, aby utrwalić mazaki w każdym teście. Pamiętaj o uwzględnieniu slajdów z kontrolą pozytywną i negatywną w celu oceny jakości analizy.
Pozytywne i negatywne lamestrki kontrolne można zakupić od firmy Van DX lub przygotować przy użyciu kultur referencyjnych. Gdy rozmaz będzie gotowy, nanieś jedną kroplę EFI callous O-E-P-N-A do dołka zawierającego próbkę hodowli krwi, a także do dołków kontroli dodatniej i ujemnej. Aby uniknąć zanieczyszczenia roztworu zapasowego sondy, należy dopilnować, aby końcówka buteleczki z zakraplaczem nie dotykała rozmazu krwi.
Na próbkę nałóż szkiełko nakrywkowe, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Następnie inkubuj preparat w bloku grzewczym w temperaturze 55 °C przez 30 minut. Aby umożliwić hybrydyzację PNA po inkubacji, umieść preparaty w kasecie do szkiełek.
Zanurz załadowany uchwyt do szkiełek w naczyniu do barwienia zawierającym podgrzany do 55 °C Roztwór Przemywający. Aby usunąć nadmiar PNA z próbki, delikatnie zdejmij szkiełko podstawowe poprzez potrząsanie szkiełkiem w buforze lub za pomocą pęsety. Inkubuj szkiełko w roztworze przemywającym w temperaturze 55 °C przez 30 minut.
Następnie wyjmij preparat z naczynia do barwienia i pozostaw go do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu preparatu nanieś na niego jedną kroplę medium montażowego o temperaturze pokojowej i ostrożnie nałóż szkiełko nakrywką na próbkę. Przeanalizuj preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym z użyciem filtra dwupasmowego w ciągu dwóch godzin od przygotowania.
Stosując tę metodę, próbkę iffy, callus, zaznaczoną na zielono po lewej stronie, można odróżnić od eum zaznaczonej na czerwono. Na środkowym panelu po prawej stronie przedstawiono wynik negatywny. Aby uzyskać pomyślne rezultaty, należy pamiętać o trzech kwestiach; temperatury urządzenia muszą być utrzymane na ustawionych wartościach.
Należy ściśle przestrzegać procedury barwienia opisanej w ulotce dołączonej do zestawu. Na koniec niezbędny jest doświadczony specjalista, który przeprowadzi dokładną analizę preparatu na szkiełku. Niniejszy protokół jest przydatny przy podejmowaniu decyzji terapeutycznych w leczeniu sepsy wywołanej przez enterokoki.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szybki protokół identyfikacji Enterococcus faecalis oraz innych gatunków Enterococcus z dodatnich posiewów krwi przy użyciu testu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ kwasów nukleotydowych z peptydami (PNA FISH). Metoda ta umożliwia szybką i specyficzną identyfikację, co wspomaga leczenie sepsy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Diagnostyka kliniczna
- Choroby zakaźne
Wstęp
- Gatunki Enterococcus są istotnymi patogenami w zakażeniach krwi.
- Szybka identyfikacja z posiewów krwi jest kluczowa dla skutecznego leczenia.
- Metoda PNA FISH oferuje specyficzny sposób identyfikacji tych organizmów.
- Protokół został opracowany tak, aby był wydajny i niezawodny.
Cel badania
- Opracowanie szybkiej metody identyfikacji gatunków Enterococcus.
- Zwiększenie szybkości diagnostyki w warunkach klinicznych.
- Wsparcie w podejmowaniu terminowych decyzji terapeutycznych w leczeniu sepsy.
Zastosowane metody
- Przygotowanie posiewów krwi i barwienie metodą Grama w celu potwierdzenia obecności Enterococcus.
- Wykorzystanie sond PNA specyficznych dla gatunków Enterococcus.
- Mikroskopia fluorescencyjna do wizualizacji zhybrydyzowanych próbek.
- Włączenie szkiełek kontrolnych do oceny jakości.
Główne wyniki
- Skuteczna identyfikacja gatunków Enterococcus przy użyciu metody PNA FISH.
- Mikroskopia fluorescencyjna pozwala na efektywne rozróżnienie gatunków.
- Szybkie uzyskanie wyników ułatwia terminowe podejmowanie decyzji klinicznych.
- Protokół wykazuje wysoką specyficzność i niezawodność.
Wnioski
- Protokół PNA FISH jest cennym narzędziem w diagnostyce mikrobiologicznej.
- Przyspiesza on identyfikację patogenów w posiewach krwi.
- Metoda ta może mieć znaczący wpływ na leczenie sepsy.
Często zadawane pytania
Zastosowanie w Przemyśle
Szybka identyfikacja gatunkowa Enterococcus z posiewów krwi wspiera terminowe zarządzanie antybiotykoterapią i nadzór nad opornością w leczeniu sepsy. Rozróżnienie E. faecalis od E. faecium pozwala na wczesne podejmowanie decyzji terapeutycznych, biorąc pod uwagę odmienne profile oporności. Ten 1,5-godzinny test PNA FISH umożliwia ograniczenie ryzyka związanego z wyborem empirycznej terapii w programach badawczych nad chorobami zakaźnymi na etapie odkrywania.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących gatunkowych mechanizmów wirulencji w modelach bakteremii.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowaną identyfikację drobnoustrojów dla powtarzalnych przedklinicznych badań nad sepsą.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w doborze celu poprzez powiązanie identyfikacji gatunkowej z różnicowymi profilami odpowiedzi na leki.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Generuje ilościowe wyniki fluorescencji do walidacji trafień w kaskadach przesiewowych przeciwdrobnoustrojowych.
- Powtarzalność: Zawiera wbudowane kontrole pozytywne i negatywne, zapewniające solidność analizy niezależnie od operatora.
- Skalowalność: Kompatybilny z wysokoprzepustowym przetwarzaniem preparatów do profilowania bibliotek związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście chorób: Modeluje patofizjologię ludzkiej bakteriemii, umożliwiając charakterystykę modelu sepsy z rozbiciem na poszczególne gatunki.
- Ciągłość translacyjna: Łączy walidację celów in vitro z badaniami skuteczności in vivo z wykorzystaniem klinicznie istotnych szczepów drobnoustrojów.
- Minimalizacja ryzyka: Ogranicza błędne przypisywanie efektów terapeutycznych do niewłaściwych celów drobnoustrojowych w modelach sepsy.
Integracja potoków i przepływów pracy
Wskazuje identyfikację drobnoustrojów jako kluczowy etap pośredniczący między walidacją celu a optymalizacją związku wiodącego w procesie odkrywania leków przeciwinfekcyjnych.
- Biologia odkrywcza: Potwierdza aktywność w obrębie celu poprzez weryfikację gatunków sprawczych w modelach infekcji przed wyjaśnieniem mechanizmu działania.
- Przesiewy: Umożliwiają oznaczenie gatunkowo swoistego MIC w celu dokładnej oceny mocy związku.
- Analityka: Dostarcza binarnych wyników dla poszczególnych gatunków, co pozwala na stratyfikację związków hit pod kątem spektrum aktywności.
- Badania translacyjne: Zapewniają, że modele przedkliniczne odzwierciedlają różnorodność izolatów klinicznych w celu uzyskania trafności prognostycznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Możliwość adaptacji do innych patogenów Gram-dodatnich poprzez przeprojektowanie sond w celu zastosowania w całej platformie.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w interpretacji modelu sepsy dzięki precyzyjnej identyfikacji patogenów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy mikrobiologicznej w zespołach badawczych i przedklinicznych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez eliminację błędnej identyfikacji gatunków jako czynnika zakłócającego dane dotyczące skuteczności.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia zaawansowanie kandydatów o wąskim i szerokim spektrum działania w oparciu o stratyfikację ryzyka wynikającą z epidemiologii oporności.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej oraz technik hybrydyzacji kwasów nukleinowych.
- Zależność od sprzętu do cyklizacji termicznej umożliwiającego utrzymanie temperatury 55°C podczas etapów fiksacji, hybrydyzacji i przemywania.
- Wymaga zastosowania znormalizowanych protokołów przygotowania preparatów w celu zapewnienia spójnej fiksacji próbek i dostępności sond.
- Wymagana walidacja na różnych szczepach Enterococcus w celu potwierdzenia specyficzności sond w globalnych panelach izolatów.
- Ograniczenie do gatunków wykrywalnych przy użyciu dostępnych sond PNA; nowe lub rzadkie gatunki mogą wymagać metod uzupełniających.
