Test funkcji mięśni psów in vivo

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar i charakterystyka właściwości mechanicznych mięśni kończyn tylnych u żywego psa z wykorzystaniem metod nieinwazyjnych. Jest to realizowane poprzez odpowiednie ułożenie psa w aparaturze fizjologicznej. Drugim krokiem procedury jest pomiar i zapis izometrycznego momentu obrotowego skurczu pojedynczego oraz tytanicznego momentu obrotowego zgięcia stępu.

Trzecim krokiem procedury jest wykonanie skurczów ekscentrycznych. Ostatnim krokiem procedury jest pomiar i zapis skurczu pojedynczego (isometric twitch), momentu obrotowego (torque) oraz momentu obrotowego przy skurczu tężcowym (titanic torque) podczas wyprostu stawu skokowego. W rezultacie, za pomocą nieinwazyjnej metody fizjologicznej, można uzyskać wyniki obrazujące siłę mięśni kończyn tylnych oraz ich odpowiedź na powtarzane skurcze ekscentryczne.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak badania ex vivo na izolowanych mięśniach, które mają charakter badań terminalnych, jest możliwość wielokrotnego powtarzania zastosowanej tutaj metody w czasie, ponieważ jest ona nieinwazyjna i dobrze tolerowana. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu fizjologii mięśni, takie jak reakcja mięśni na uraz indukowany skurczem lub zmęczenie. Zastosowania tej techniki obejmują terapię lub diagnostykę dystrofi mięśniowych, ponieważ metoda ta pozwala na pomiar funkcji mięśni u psów lub innych dużych ssaków.

Tak duże zwierzęta są wymagane w badaniach przedklinicznych wielu nowych terapii przed rozpoczęciem badań klinicznych z udziałem pacjentów. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat modeli psich, można ją również zastosować do innych systemów modeli zwierzęcych, takich jak naczelne niebędące ludźmi. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności ze względu na staranność wymaganą przy rozmieszczaniu elektrod stymulujących oraz konieczność wiedzy na temat oczekiwanego przebiegu zapisu momentu obrotowego. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy pozycjonowania elektrod są trudne do opanowania ze względu na precyzję wymaganą do wywołania maksymalnej odpowiedzi momentu obrotowego z mięśni.

W ramach badania do zdefiniowania parametrów stymulacji oraz rejestrowania danych wykorzystuje się dwa protokoły zapisane w oprogramowaniu dynamic muscle control (DMC). Pierwszy protokół, protokół skurczu izometrycznego, jest stosowany zarówno dla skurczów pojedynczych (twitch), jak i tężcowych. Drugi protokół, nazwany protokołem uszkodzenia przez rozciąganie ekscentryczne, jest wykorzystywany do skurczów ekscentrycznych; ustawienia stymulatora oraz sekwencje oprogramowania stosowane dla każdego protokołu przedstawiono w widocznej tutaj tabeli. Skurcze pojedyncze wywołuje się stymulacją o częstotliwości 1 Hz.

Skurcze tetaniczne i ekscentryczne wywołuje się stymulacją o częstotliwości 50 hertz. W przypadku skurczu ekscentrycznego na kurczący się mięsień nakłada się rozciąganie. Eksperymenty te polegają na wywoływaniu kilku rodzajów skurczów mięśni poprzez stymulację nerwu strzałkowego w celu wywołania skurczu pojedynczego, tetanicznego lub ekscentrycznego mięśnia zginacza, oraz stymulację nerwu piszczelowego w celu wywołania skurczu pojedynczego lub tetanicznego mięśnia prostownika.

Po znieczuleniu psa należy sprawdzić odruch mrugania, aby upewnić się, że zwierzę znajduje się w głębokiej narkozie. Należy ściśle monitorować poziom dwutlenku węgla, pulsoksymetrię oraz temperaturę. W trakcie procedury należy ogolić sierść w bocznej części stawu kolanowego w miejscu, w którym zostaną umieszczone elektrody stymulujące.

Następnie umieść psa na stole fizjologicznym. W pozycji grzbietowej ułóż kończynę miedniczną tak, aby kość udowa i piszczel tworzyły kąt prosty, a piszczel była równoległa do blatu stołu; sprawdź, czy pedał siły może obracać się bezpiecznie. Podczas przesuwania go ręcznie powinien on stawiać opór.

Następnie włącz zestaw do badań fizjologicznych i aktywuj pedał. Ruch pedału jest sterowany przez serwomotor, który z kolei jest kontrolowany przez komputer. Teraz delikatnie umieść łapę psa na pedale, zmierz i zapisz długość łapy psa od osi obrotu do końca bocznego palca.

Następnie unieruchom łapę psa w pedale za pomocą elastycznej bandażowej opaski samoprzylepnej. Przetwornik w pedale rejestruje siłę skurczów mięśni kończyny. Przygotuj elektrody stymulujące, podłączając ekranowane elektrody monopolarne o rozmiarze 24 gauge do izolatora stymulatora.

W rękawiczkach oczyścić skórę psa alkoholem i palcem zlokalizować nerw strzałkowy wspólny, badając go metodą palpacyjną tuż za odcinkiem dystalnym bocznej części proksymalnej strzałki. Oznaczając obszar przebiegu nerwu, ostrożnie wprowadzić pod skórę czarną elektrodę katody, a następnie, tuż nad okostną, umieścić pod skórą czerwoną elektrodę anody równolegle i nieco bardziej dystalnie względem katody. Obie elektrody powinny znajdować się teraz wewnętrznie względem nerwu strzałkowego wspólnego, tuż za głową strzałki. Następnie uruchomić stymulator z częstotliwością 1 Hz i obserwować reakcję drgania mięśnia na monitorze.

W razie potrzeby wprowadź niewielkie korekty w położeniu elektrod, aby uzyskać jak największą amplitudę drgnięcia. Po prawidłowym ustawieniu elektrod uruchom oprogramowanie DMC w celu zarejestrowania odpowiedzi drgowej. Kolejnym krokiem jest wywołanie skurczu tetanicznego bez przesuwania elektrod.

Ustaw stymulator zgodnie z parametrami podanymi w tabeli dla skurczu tężcowego. Następnie uruchom w oprogramowaniu protokół skurczu izometrycznego, aby wywołać izometryczny skurcz tężcowy mięśnia. Kolejny eksperyment, protokół urazu w wyniku rozciągania ekscentrycznego, jest również przeprowadzany bez przesuwania elektrod.

Ustaw stymulator na skurcz ekscentryczny i rozpocznij stymulację. W tym protokole nerw jest stymulowany 10 razy z częstotliwością 50 hertz przez jedną sekundę. W ciągu tej jednej sekundy mięśnie zginacze kurczą się izometrycznie przez pierwsze 800 milisekund, a następnie mięsień jest rozciągany przez ostatnie 200 milisekund.

Po jednej serii 10 skurczów ekscentrycznych należy pozostawić mięsień do odpoczynku na cztery minuty. Następnie protokół urazu poprzez rozciąganie ekscentryczne należy powtórzyć jeszcze dwukrotnie, z czterominutową przerwą między każdą serią. Aby stymulować mięsień prostownik, należy przenieść elektrody na nerw piszczelowy, wprowadzając je prostopadle do skóry, proksymalnie względem pierwotnego miejsca umieszczenia elektrod stosowanego przy zgięciu. Przybliżony punkt umieszczenia znajduje się wzdłuż linii dwisiekającej kąta 90 stopni utworzonego przez kolano.

Nerw piszczelowy znajduje się głębiej i przyśrodkowo w stosunku do wspólnego nerwu strzałkowego. Przesuń elektrody w razie potrzeby, aby wywołać optymalne potencjały drgań. Po umieszczeniu elektrod wywołaj maksymalne drgnienie, stosując protokół izometryczny bez przesuwania elektrod.

Zmień ustawienia stymulatora zgodnie ze specyfikacją dla skurczów tężcowych. Następnie wywołaj i zarejestruj skurcz tężcowy mięśnia prostownika palców stopy. Program dynamicznej analizy mięśni (DMA) służy do analizy momentu obrotowego oraz informacji czasowych dotyczących skurczów mięśni.

Na tej rycinie stymulacja nerwu piszczelowego z częstotliwością 1 Hz aktywowała pojedyncze skurcze mięśni prostowników stawu skokowego piszczelowych; w celu analizy danych położenia trzech kursorów ustawiono w następujący sposób. Kursor niebieski ustawiono w punkcie, w którym moment obrotowy wzrasta w stosunku do momentu spoczynkowego. Kursor żółty umieszczono w miejscu, w którym moment obrotowy powraca do wartości spoczynkowej.

Po fazie relaksacji biały kursor nie jest już potrzebny, dlatego zostaje umieszczony na prawo od kursora żółtego. Rysunek ten przedstawia izometryczną stymulację tężcową nerwu piszczelowego, w której seria impulsów o częstotliwości 50 Hz trwająca 1,5 sekundy spowodowała skurcz tężcowy mięśnia prostownika palców stopy. Do analizy danych zastosowano kursory niebieski i żółty.

W odniesieniu do analizy drgań przedstawionej na tej rycinie, skurcze ekscentryczne wywołano w zginaczach piszczelowo-skokowych. Przezskórna stymulacja nerwu sromowego aktywowała wstępny skurcz izometryczny trwający 800 milisekund, po którym nastąpiło wymuszone rozciągnięcie nogi. W tej analizie danych niebieski kursor został ustawiony w punkcie, w którym moment obrotowy izometryczny zaczyna wzrastać względem momentu spoczynkowego.

Żółty kursor zostaje umieszczony w punkcie, w którym moment obrotowy podczas rozciągania ekscentrycznego zaczyna rosnąć z poziomu plateau izometrycznego. Biały kursor umieszcza się w miejscu, w którym moment obrotowy powraca do wartości spoczynkowej. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w około jedną godzinę, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby korzystać z wydrukowanego protokołu z punktami kontrolnymi krok po kroku, postępując zgodnie z opisaną procedurą.

W celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak typ włókien mięśniowych czy ekspresja transgenu po jego wprowadzeniu, można przeprowadzić inne metody, np. biopsje mięśni. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie fizjologii mięśni do analizy odpowiedzi na wysiłek fizyczny u psów z dystrofią mięśniową. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania nieinwazyjnego badania fizjologii mięśni u psów.