Name: Demonstracja zastosowań nowego spektrometru sił grawitacyjnych do rozciągania i pomiaru białek włóknistych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-19T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: Poznaj zastosowanie nowego spektrometru sił grawitacyjnych do rozciągania i pomiaru białek włóknistych na poziomie pojedynczych cząsteczek. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę oddziaływań molekularnych w neurobiologii i biofizyce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejszy materiał powstał w ramach prac finansowanych przez National Science Foundation w ramach grantu nr 0842736.

Wprowadzenie do nowej konfiguracji GFS
GFS składa się z kilku niezbędnych elementów: zwykłego mikroskopu świetlnego, montażu paralaktycznego, kamery oraz komputera [Rysunek 1]. Zgodnie z konstrukcją GFS, niezbędna jest również szczelna komora przepływowa, w której znajduje się próbka. Mikroskop świetlny jest zamontowany na montażu paralaktycznym, co umożliwia obracanie urządzenia w różnych orientacjach w przestrzeni. Zdolność ta pozwala na wykorzystanie statycznego wektora grawitacji, dzięki czemu próbki mogą być dynamicznie orientowane względem wektora, co pozwala sile grawitacji wywierać na próbki obciążenia siłowe z zakresu piconewtonów. Kamera zastępuje okular mikroskopu świetlnego, aby mogła rejestrować zmiany orientacji próbki. Te surowe dane są digitalizowane i przetwarzane przez komputer w celu interpretacji danych na rzeczywiste pomiary siły i odległości. Szczelna komora przepływowa została zaprojektowana tak, aby umożliwić pełną swobodę ruchu w przestrzeni bez utraty próbki. W komorze znajduje się cząsteczka próbki, która jest przytwierdzona jednym końcem do „zakotwiczonego” koralika przyklejonego do powierzchni komory. Przeciwny koniec jest przytwierdzony do koralika „mobilnego”, który nie styka się z powierzchnią komory. To właśnie ten koralik mobilny, swobodnie zawieszony w buforze do analizy, może podlegać działaniu siły grawitacji, rozciągając w ten sposób przytwierdzoną cząsteczkę przy tak niskich obciążeniach siłowych [Rysunek 2]. Pod mikroskopem próbka wygląda po prostu jak para mikrosfer, choć potrzeba pewnego doświadczenia, aby odróżnić użyteczne pary połączone cząsteczką od par, w których oba koraliki spoczywają na powierzchni komory przepływowej. Jedną z modyfikacji systemu jest dodanie pływającej platformy, na której znajduje się GFS, zawieszonej na sprężynach. W tej konfiguracji, po obróceniu próbki do pozycji, w której siła grawitacji może na nią działać, platformę wraz ze wszystkimi komponentami można opuścić przeciwko stałej sprężystości. W stanie zbliżonym do swobodnego spadania siła działająca na koralik mobilny jest bliska zeru, a przy maksymalnym rozciągnięciu sprężyn siła grawitacji zostaje zwiększona nawet dwukrotnie. W ten sposób można wykreślić stopniową odpowiedź siła/odległość, aby zmierzyć zachowanie pojedynczej cząsteczki przy różnych obciążeniach siłowych.
1. Przygotowanie mikrosfer
<ol>
<li>Zanurzyć około 10 mg kulek szklanych lub krzemionkowych w 0,04% 3-aminopropylotrietoksysilanie (rozcieńczonym w acetonie) na dwie minuty.</li>
<li>Przepłukać dwukrotnie wodą dwukrotnie destylowaną, a następnie wirować w celu osadzenia przy 2000 X G przez 5 minut. Odlać nadsącz.</li>
<li>Dodać 5 mL buforu sprzęgającego (0,01 M pirydyny rozcieńczonej wodą dwukrotnie destylowaną z pH dostrojonym do 6,0) i energicznie wstrząsnąć mieszaniną. Wirować zgodnie z powyższym opisem. Powtórzyć ten krok trzy razy.</li>
<li>Do wilgotnego osadu kulek dodać 2 mL 5% roztworu aldehydu glutarowego (rozcieńczonego w buforze sprzęgającym). Energicznie wstrząsnąć.</li>
<li>W dygestorium rotować mieszaninę kulek i aldehydu glutarowego przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Wirować jak wyżej i odessać nadsącz.</li>
<li>Przemyć kulki w 5 mL buforu sprzęgającego, energicznie wstrząsając, a następnie wirować i odessać nadsącz. Powtórzyć tę czynność jeszcze trzy razy.</li>
<li>Dodać do kulek około 15 μL pożądanego przeciwciała i energicznie wstrząsnąć. Kulki należy rotować przez 16-24 godziny.</li>
<li>W dygestorium dodać 5 mL 1 M roztworu wygaszającego glicyny (rozcieńczonej wodą dwukrotnie destylowaną z pH dostrojonym do 7,0). Energicznie wstrząsnąć mieszaniną i rotować przez 30 minut.</li>
<li>Wirować i odessać nadsącz.</li>
<li>Dodać 5 mL buforu piorącego (0,01 M Tris, pH 7,0; 0,1% azydku sodu; 0,1% BSA; 0,15 M NaCl oraz 0,001 M EDTA). Energicznie wstrząsnąć, wirować i odessać nadsącz. Powtórzyć ten krok jeszcze trzy razy.</li>
<li>Zmienić bufor na bufor niskosolny (0,1 M KCl; 0,02 M imidazol; 5 mM MgCl2; pH dostrojone do 7,0). Powtórzyć trzy razy.</li>
</ol>
2. Przyczepianie próbek do mikrosfer
<ol>
<li>Pobrać niewielką ilość przygotowanych kuleczek (około 2 μL z każdego aglomeratu kuleczek, jednak w przypadku dużej różnicy w średnicy między partiami korzystnie jest zastosować stosunek kuleczek dużych do małych wynoszący około 8:1) i dodać je do probówki do mikrocentryfugi zawierającej bufor do analizy. Zmniejszyć stężenie białka do około 5 μM, korzystając z buforu do analizy. Przygotować objętość całkowitą wynoszącą co najmniej 400 μL, wliczając bufor, białko oraz kuleczki.</li>
<li>Mieszać tę mieszaninę w rotatorze z prędkością około 1 RPM przez 3 godziny (zbyt intensywne mieszanie białka doprowadzi do jego agregacji i utraty aktywności).</li>
</ol>
3. Przygotowanie komory na szkiełku
<ol>
<li>Pokryć grube szkiełko przedmiotowe 0,01% nitrocelulozą (w octanie amylu). Pozostawić szkiełko do wyschnięcia na około 10 minut.</li>
<li>Za pomocą ostrego przecinaka do szkła wyciąć szkiełko nakrywkowe w taki sposób, aby utworzyć komorę. Wymaga to czterech pasków szkła.</li>
<li>Wykorzystać fabryczną krawędź szkła i przeciągnąć ją przez smar próżniowy po obu stronach krawędzi.</li>
<li>Docisnąć pokryte smarem paski do wysuszonego szkiełka pokrytego nitrocelulozą, aby utworzyć ramkę na powierzchni szkiełka.</li>
<li>Nanieść pipetą około 2 μL mieszaniny kuleczek/białek, dotykając końcówką pipety powierzchni szkła wewnątrz ramki.</li>
<li>Dodać około 20-400 μL buforu niskosolowego, w zależności od wielkości komory.</li>
<li>Docisnąć na wierzchu ramki szkiełko nakrywkowe, które zostało uprzednio pokryte smarem próżniowym, aby ukończyć tworzenie szczelnej i buforowanej komory.</li>
<li>Pozostawić szkiełko w poziomym ustawieniu, aby kuleczki miały wystarczająco dużo czasu na zakotwiczenie się w nitrocelulozie.</li>
</ol>
4. Pozyskiwanie danych GFS
<ol>
<li>Zamocuj preparat na stoliku GFS</li>
<li>Monitoruj obraz z kamery GFS i szukaj właściwych „par kuleczek”, w których mała mikrosfera jest przyczepiona w pobliżu równika dużej mikrosfery.</li>
<li>Po znalezieniu potencjalnej pary kuleczek, sprawdź głębię ostrości, aby upewnić się, że kuleczka „ruchoma” nie spoczywa na powierzchni szkiełka.</li>
<li>Po zidentyfikowaniu odpowiedniej pary, zanotuj kąt odchylenia kuleczki ruchomej od dmax (dmax = maksymalna odległość między centroidami sprzężonych mikrosfer). Przesuń mikroskop do pozycji umożliwiającej rejestrację wideo.</li>
<li>Kąt przesunięcia GFS powinien być wystarczający do zarejestrowania dmin, dmax i ponownie dmin, co w zależności od długości cząsteczki może wymagać zakresu od 25 do 90 stopni.</li>
<li>NAGRAJ przebieg ruchu pary od dmin do dmax i z powrotem do dmin.</li>
<li>Zaleca się również nagranie filmu tła, aby móc go później odjąć podczas analizy.</li>
<li>W przypadku wykonywania zrzutu GFS, przesuń mikroskop z powrotem do dmax i nagraj zrzut z częstotliwością co najmniej 60 klatek na sekundę. Kluczowa jest pierwsza oscylacja, jednak dłuższy czas nagrywania może być wykorzystany do badań dynamicznych.</li>
</ol>
5. Analiza danych GFS
<ol>
<li>Przekształć surowe nagranie w cyfrowo „zaprogowany” obraz i uruchom makro w programie ImageJ, aby wyznaczyć pozycję centroidu każdego koralika w każdej klatce filmu. Należy to zrobić również dla filmu z kroplą.</li>
<li>Przenieś dane X, Y oraz powierzchnię z programu ImageJ do programu Excel i wykreśl punkty.</li>
<li>Jeśli w filmie zarejestrowano właściwą parę koralików, wyraźne wybrzuszenie na wykresie wskazuje, że koraliki znajdują się najbliżej siebie (dmin), a wierzchołek wykresu odpowiada pozycji dmax.</li>
<li>Wykorzystując te dane, należy precyzyjnie wyznaczyć w programie ImageJ promień każdego koralika, a następnie wprowadzić wszystkie te informacje do zagnieżdżonego równania: 
d = [(g sin α)2 + (g cos α + dmax - g)2]0.5 
g = [dmin2 + rb 2 - (ra + rb)2]0.5 = rb sin β 
c = dmax - ra - g 
(d = odległość między centroidami; g = siła grawitacji; α = kąt w stopniach równoległy do obiektywu; rb = promień koralika ruchomego; ra = promień koralika zakotwiczonego; β = kąt przyczepienia poza osią równika koralika zakotwiczonego).</li>
<li>Wykorzystując dopasowany promień koralika ruchomego, który pozwala również wyznaczyć jego objętość, oraz znając gęstość koralika, można obliczyć siłę, jaką koralik ruchomy wywiera na cząsteczkę w piconewtonach, po odjęciu wyporności rozpuszczalnika. Metoda ta mierzy siłę działającą na przywiązaną cząsteczkę w piconewtonach i oblicza bezwzględną długość cząsteczki między punktami przyczepienia przeciwciał w nanometrach. F = V (d-b) a (F = siła, V = objętość, d = gęstość szklanej mikrosfery, a = przyspieszenie ziemskie, b = gęstość wypartej wody).</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Jeśli przygotowanie kulek zostanie wykonane prawidłowo, agregacja będzie minimalna, choć nadal mogą wystąpić sporadyczne skupiska kulek. Podczas obserwacji pod mikroskopem w komorze powinien być widoczny odpowiedni rozkład kulek, niezależnie od tego, czy występują one w parach.
Ważne jest, aby w maksymalnym stopniu zminimalizować wibracje; w tym celu do izolacji drgań można wykorzystać stół pneumatyczny, specjalne stopy amortyzujące do statywu utrzymującego montaż EQ lub system wykorzystujący sprężyny.
Kolejną przydatną wskazówką dotyczącą uszczelnionej komory przepływowej jest pozostawienie jej na około pięć minut na płaskim stole po całkowitym zmontowaniu. Pozwala to nieprzymocowanym, większym kuleczkom opaść przez bufor i osiąść w warstwie nitrocelulozy. Gdyby preparat zamontowano bezpośrednio po zakończeniu prac, badacz musiałby nieustannie mierzyć się z kuleczkami dosłownie przelatującymi przez pole widzenia; jeśli dzieje się to podczas rejestracji wideo, może to zafałszować wynik eksperymentu. Prawidłowe przeprowadzenie tej czynności znacząco minimalizuje przemieszczanie się kuleczek, co przekłada się na czystsze nagrania wideo.
Gdy operator GFS zidentyfikuje potencjalną parę kulek, warto poddać ją wstępnej rotacji, aby monitorować zachowanie tej pary. Rzadko zdarza się, że większa kulka nie jest mocno przymocowana do szkiełka. W takim przypadku nie ma sensu wykorzystywać tej pary, ponieważ kluczowe jest, aby większa, zakotwiczona kulka pozostawała w stałej pozycji przez cały czas trwania akwizycji. Jeśli para jest stabilna i nie wykazuje zjawiska „toczenia się zakotwiczonej kulki”, nadaje się ona do eksperymentów.
Do oceny pozyskanych danych można wykorzystać wykres odległości separacji kulek w funkcji zmiany kąta względem siły grawitacji. Reprezentatywny wynik powinien wykazać niewielką separację na plateau, a w miarę uwalniania się ruchomej kulki od kulki zakotwiczonej pod wpływem grawitacji, wykres będzie wskazywał coraz większą separację. Proces ten trwa aż do osiągnięcia wyraźnego szczytu, zwanego dmax, po czym krzywa zaczyna ponownie opadać, powracając do linii bazowej dmin [Rycina 1]. W idealnych warunkach sygnatura ta jest symetryczna. Wynik niereprezentatywny objawiałby się wykresem z niespójnymi wzorami, w których nie występuje wyraźny schemat dmin-dmax-dmin; lub wskazywałby separacje o rzędy wielkości zbyt wysokie dla pojedynczej cząsteczki, co sugerowałoby obecność zanieczyszczeń (np. pyłu) między kulkami lub fakt, że ruchoma kulka w ogóle nie była przytwierdzona. Proces wyszukiwania pary, jej obrazowania, przetwarzania i analizy zawiera wiele etapów kontrolnych, na których odrzucane są nieprawidłowe pary kulek. Zatem, jeśli po przejściu całego procesu długość cząsteczki jest zgodna z poprzednimi wynikami, można mieć dużą pewność, że pierwotna para kulek była reprezentatywna i może zostać wliczona do wyników. Przy pomyślnym przebiegu eksperymentu około połowa obrazowanych par kulek może stać się wiarygodnym punktem danych. Na przykład wiadomo z danych EM i AFM, że długość zwiniętej helisy (coiled coil) miozyny między przeciwciałami MF20 a MF30 wynosi około 100 nm 2,7,8,9. Jeśli wynik jest kilkukrotnie większy od tej wartości, oznacza to agregację próbki. Przedstawione tutaj wyniki pochodzą ze standardowych eksperymentów rotacyjnych GFS i wykazują odległość 96 nm ± 5 nm [Rycina 2], co jest blisko zgodne z odległością separacji przeciwciał MF30 (wiążącego się z N-końcem subfragmentu-2 miozyny) i MF20 (wiążącego się z lekką meromiozyną) na miozynie, wywnioskowaną z wartości literaturowych [Rycina 3].
<img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig1.jpg" alt="Wykres odległości centroidów kulek w funkcji kąta, przedstawiający analizę mobilności." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Konfiguracja GFS. Oznaczono główne elementy GFS.
<img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig2.jpg" alt="Analiza dynamiki obrotowej, schemat z rotacją GFS, wektorem grawitacji oraz układem eksperymentalnym do badania." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Schemat zasady działania GFS. Lewa strona przedstawia środek ciężkości ruchomej kuleczki w minimalnej odległości od środka ciężkości kuleczki zakotwiczonej. Podczas obrotu GFS ruchoma kuleczka ustawia się zgodnie z wektorem grawitacji, który przebiega równolegle do osi przywiązanegot cząsteczki. W tej pozycji odległość między środkami ciężkości kuleczki ruchomej i zakotwiczonej jest maksymalna. W prawym górnym rogu znajduje się reprezentatywny kadr z filmu GFS. W prawym dolnym rogu widoczny jest obraz GFS poddanego rotacji.
<img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig3.jpg" alt="Wykres równowagi statycznej; odległość względem kąta; analiza danych; pomiary w mikronach, radianach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Reprezentatywny wynik pokazujący dmin po lewej stronie wykresu; dmax przy względnym oddaleniu 17,78 mikronów; oraz powrót do dmin w okolicach linii bazowej wynoszącej około 17,75 mikronów względnego oddalenia między kuleczkami.
<img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig4.jpg" alt="Wykres równowagi statycznej przedstawiający zależność siły od długości sznurka w nanometrach, analiza danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Reprezentatywny wynik eksperymentu rotacji GFS, wykazujący, że średnia odległość między przeciwciałami MF20 i MF30 wynosi 96 nm. Odpowiada to przybliżonej długości S2.
<img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig5.jpg" alt="Schemat oddziaływania miozyny z aktyną, przedstawiający przeciwciała MF20, MF30, strukturę białka oraz punkty przegubowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> Rycina 5. Dimer miozyny II wykorzystany do pokazania możliwych miejsc przyłączenia do GFS, w tym przyłączeń przeciwciał i/lub aktyny. Różne możliwości przyłączenia pozwalają na zastosowanie różnych strategii GFS w celu pomiaru różnych regionów lub przyłożenia siły prostopadle lub równolegle do domeny pręcikowej dimeru miozyny.

<ol><li>Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+coiled-coil+is+a+truly+elastic+protein+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure.</a> Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).</li>
<li>Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coiled-coil+nanomechanics+and+uncoiling+and+unfolding+of+the+superhelix+and+alpha-helices+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin.</a> Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).</li>
<li>Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbinding+force+of+a+single+motor+molecule+of+muscle+measured+using+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers.</a> Nature. 377, 251-254 (1995).</li>
<li>Gawalapu, R. K., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+labeling+and+computational+analysis+of+the+strut+of+myosin%27s+50+kDa+cleft%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin's 50 kDa cleft.</a> Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).</li>
<li>Kellermayer, M. S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+manipulating+individual+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+Physiol.+Meas%22%5BJournal%5D)">Visualizing and manipulating individual protein.</a> Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).</li>
<li>Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+arrangement+of+the+myosin+rod+in+vertebrate+thick+filaments%3A+immunoelectron+microscopy+with+a+monoclonal+antibody+to+light+meromyosin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin.</a> J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).</li>
<li>Godfrey, J. E., Harrington, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-association+in+the+myosin+system+at+high+ionic+strength.+I.+Sensitivity+of+the+interaction+to+pH+and+ionic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment.</a> Biochemistry. 9, 886-893 (1970).</li>
<li>Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+docking+of+myosin+and+actin+observed+with+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer.</a> Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).</li>
<li>Xu, J., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Selection+during+Weak+Binding+at+the+Actin+and+Myosin+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface.</a> Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).</li>
<li>Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+base+pair+resolution+by+single+molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podczas konwersji filmu na reprezentację z progowaniem cyfrowym kluczowe jest, aby obraz po progowaniu zachowywał ten sam obszar w każdej klatce wideo. Ponieważ koraliki w parze poruszają się niezależnie od siebie, wszelki dryft w obszarach poddanych progowaniu może również spowodować dryft względnych odległości między centroidami koralików i wprowadzić znaczący błąd. Kontrola obszaru progowania pozwoliła pięciokrotnie zredukować błąd w pomiarach odległości, z 26 nm do 5 nm. Równie istotne jest uzyskanie dokładnego pomia...

<table><tbody><tr><td>3-aminopropylotrietoksysilan</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>919-30-2</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>Pirydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7776</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Research Organics</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9682T</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Amresco</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMR-0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>niestabilność mikrosatelitarna</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Azotanu celulozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60443</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid</td><td>Wyodrębniono z dużego nowego</td><td>D4254</td><td></td></tr><tr><td>Miozyna II szkieletowa królika</td><td>króliki rasy nowozelandzkiej białej (7-8)</td><td>ND</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało MF30 (9-10)</td><td>Bank Hybrydom Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>MF30</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało MF20 (6)</td><td>Bank hybridomów</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop laboratoryjny</td><td>Borealny</td><td>WW57905M00</td><td></td></tr><tr><td>Montaż paralaktyczny</td><td>Celestron</td><td>CG-5</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera wideo</td><td>Sony Corporation</td><td>XCDV60</td><td></td></tr><tr><td>Zwolnienie zacisku</td><td>Cabelas</td><td>IA-415482</td><td></td></tr><tr><td>Sprężyna ściskania</td><td>Jones Spring Co.</td><td>723</td><td></td></tr><tr><td>Sprężyna rozciągająca</td><td>Jones Spring Co.</td><td>770</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>ND</td><td></td></tr><tr><td>Sterowniki Fire-i &amp;zastosowanie </td><td>Unibrain</td><td>3.80</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>ND</td><td></td></tr></tbody></table>

demonstracja zastosowań nowatorskiego spektrometru sił grawitacyjnych do rozciągania i pomiaru białek włóknistych

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

Badanie struktury makrocząsteczek stało się kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów i funkcji molekularnych. Istnieje kilka ograniczonych, lecz istotnych instrumentów bioanalitycznych zdolnych do testowania zależności cech strukturalnych białek od przyłożonej siły. Skala była parametrem ograniczającym dokładność, z jaką badacze mogą analizować nanomechaniczny świat cząsteczek, takich jak kwasy nukleinowe, enzymy i białka motorowe wykonujące niezbędne do życia prace. Mikroskopia sił atomowych (AFM) jest dobrze dostosowana do określania natywnych struktur białek włóknistych z rozdzielczością przestrzenną porównywalną z mikroskopią elektronową. Jednak w badaniach siłowych AFM stosowane siły są zazwyczaj znacznie wyższe niż te, których może doświadczyć pojedyncza cząsteczka 1, 2. Pułapki optyczne (OT) bardzo dobrze nadają się do wyznaczania względnej odległości między uwięzionymi kuleczkami i mogą wywierać bardzo małe siły 3. Nie pozwalają one jednak na precyzyjne określenie bezwzględnej długości badanych cząsteczek. Symulacje molekularne dostarczają pomocniczych informacji dla takich eksperymentów, ale ich możliwości są ograniczone w zakresie obsługi tak dużych rozmiarów cząsteczek i długich ram czasowych, a w przypadku braku innych dowodów pomocniczych nie przekonują niektórych badaczy2, 4.
Spektrometr siły grawitacyjnej (GFS) wypełnia krytyczną lukę w arsenale badacza, oferując unikalny zestaw możliwości. Instrument ten jest zdolny do generowania sił zazwyczaj z dokładnością 98% lub wyższą, w zakresie od femtonิวtonów do nanonิวtonów. Obecnie pomiary odległości pozwalają na wyznaczenie bezwzględnej długości cząsteczkowej z rozdzielczością do pięciu nanometrów oraz względnych odległości między parami kulek z precyzją zbliżoną do pułapki optycznej. Ponadto GFS może określać stopień rozciągania lub rozwijania w warunkach, gdy siła jest bliska stanu równowagi, lub dostarczać stopniowaną siłę w celu zestawienia jej ze zmierzonymi zmianami strukturalnymi. Możliwe jest nawet określenie liczby reszt aminokwasowych biorących udział w zdarzeniach rozwijania pod fizjologicznym obciążeniem siłą 2. W przeciwieństwie do innych metod, w których każdemu badaniu musi poprzedzać obszerna kalibracja siły, GFS nie wymaga takiej kalibracji 5. Uzupełniając zalety innych metod, GFS pozwoli wypełnić luki w rozumieniu nanomechaniki kluczowych białek i innych makromolekuł.

Niniejszym przedstawiamy przewodnik krok po kroku, prezentujący przeznaczenie, zasadę działania oraz reprezentatywne wyniki uzyskiwane za pomocą nowatorskiego spektrometru siły grawitacyjnej.

Demonstracja zastosowań nowatorskiego spektrometru sił grawitacyjnych do rozciągania i pomiaru białek włóknistych

Badanie struktury makrocząsteczkowej stało się kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów i funkcji molekularnych. Istnieje kilka ograniczonych, lecz ...

Układ do pomiaru siły grawitacyjnej składa się z podstawy epi, zwykłego mikroskopu świetlnego, kamery cyfrowej oraz komputera. Wykorzystujemy go do badania pojedynczych cząsteczek kwasu. Możemy rejestrować równowagę sił lub przyłożyć siłę stopniowo poprzez opuszczanie.Na początek musimy przygotować szkiełko mikroskopowe, aby można było przeprowadzić tego typu proces. Aby odważyć około 10 mg ziaren, których będziemy używać, zazwyczaj przygotowuję 2K. Tutaj mamy pięć ml, z których użyjemy trzech triologii.W tym miejscu pobierzemy nasz terminal Put One. Wymieszaj go dokładnie za pomocą pipety transferowej, a następnie przenieś 2 mL mieszaniny na wierzch kulek z agarozy (bead cakes). Pozostaw kulki z agarozy na 2 minuty, a następnie poddaj je dokładnemu mieszaniu w wirówce typu vortex przez 2 sekundy.Dół zjadł mokrą dwójkę. Potrzebna jest jedna puryna w wodzie dwukrotnie destylowanej. Sprzęganie przy pH 6.Należy po prostu dodać 5 mL buforu sprzęgającego do każdego zestawu kulek; proces ten umożliwia sprzęgnięcie kulek. Następnie dodaje się przeciwciała, ponownie wirując próbkę w vortexie przez minutę. Pozostawia się je na pięć minut, a jeśli zamrażarka pozwala na uzyskanie odpowiedniego stężenia, należy je rozcieńczyć do 5% za pomocą buforu sprzęgającego.Następnie pobieramy dwa mililitry tego roztworu i dodajemy go, co pozwoli na sprzężenie TER z terminalami znajdującymi się już w naszym wirCzerpaku. Wykonać to dwukrotnie, rotować przez trzy. Procedura buforu sprzęgającego.Ponownie dodaj pięć mililitrów buforu sprzęgającego do swojej kolumny z wypełnieniem. Ponownie wymieszaj, odwiruj i odessaj nadsącz. Przy czwartym razie pozostaw niewielką ilość nadsączu na górze wypełnienia, aby przeciwciało mogło swobodnie krążyć.Oto nasze przeciwciała. Odmierz tę objętość. Przeciwciała w roztworze, np. 1 µL, rozcieńczono w wodzie dwukrotnie destylowanej, a mieszaninę rotowano przez 30 minut lub przez odpowiedni czas.Aby zneutralizować cały niewykorzystany klej, oko w oko. Należy go odwirować, aby pozbyć się S. Następnie należy przygotować zawartość, którą stanowi protokół. Pobierz pięć mililitrów, weź kuleczki, oto kuleczki, włóż je do dołka.Powtórz ten krok trzy razy, a następnie postąp analogicznie w przypadku każdego wykonywanego testu. Aby rozpocząć przygotowania, w pierwszej kolejności musimy pobrać białko. W tym przypadku należy udać się do zamrażarki -70 °C, gdzie przechowywane jest białko; ważne jest, aby to białko pobrać i doprowadzić do odpowiedniej temperatury.To będzie teraz znacznie bardziej skoncentrowane niż to, czego chcemy użyć w naszym teście. Zatem zmniejszymy objętość do około piętnastu i pobierzemy to do końcówki. Jednakże musi to być dokładna objętość; po zmniejszeniu objętości do około 5 µL w przypadku dużych kulek, pobierzemy większą objętość, która w tym przykładzie z kuleczkami wyniesie 10 µL.I w ten sposób otrzymamy odpowiednią mieszankę; dodajemy około 350 µL buforu do testu do probówki typu microcentrifuge, aby uzyskać końcowe stężenie. Teraz wykonamy to w sposób analogiczny do poprzedniego kroku; obracamy probówkę i mieszamy zawartość. Nadszedł czas na właściwe przygotowanie przepływu, w którym znajdować się będą nasze kuleczki.Umieszczam standardne szkiełko przedmiotowe w 1%, które zostało docięte z użyciem kleju, aby kotwice mogły przytwierdzić się do powierzchni szklanego nacięcia oraz szkiełek przedmiotowych i nakrywek. Przygotowałem już krawędzie, a następnie nałożę ten cieńszy kawałek szkła na grubsze szkiełko. Komora ta będzie stosunkowo mała.Oto niewielki obszar, który jest uszkodzony. To jeden z tych przypadków spotykanych każdego dnia. Substancja czynna sprawia, że stan się poprawia, staje się lepszy.Tutaj przekażemy ostatnie dwie 25-letnie próbki do ewentualnej degustacji, zanim zaczniemy dodawać krakersy i ser. Pominięto słońce. Tylko nieliczni spróbowali, zaledwie kilku.A tutaj, przy bliższym przyjrzeniu się, można faktycznie zobaczyć kuleczkę. W kwestii końcówki, zaczynam od zwykłego opukiwania obszaru kuleczki, a następnie, po wykonaniu tego, wypełniam resztę powierzchni szkiełka przedmiotowego, mniej więcej do 40, abyśmy mogli umieszczać szkiełko w różnych orientacjach i nie martwić się o to, że kuleczki mogą przemieścić się w dół. Nie potrzebujecie żadnej śruby do pobrania próbek z mojego bukietu dla niektórych moich win, tył linii i mogę zamocować szkiełko, a następnie używam dodatkowego klipsa, aby zwiększyć stabilność. Teraz możemy założyć obiektyw.Jest to pilot zdalnego sterowania, którego używamy do pozycjonowania preparatu; wszystko zostało włączone, w tym kamera. Możemy rozpocząć monitorowanie pod kątem potencjalnych kulek, robiąc to po prostu poprzez obserwację ekranu wideo. Ten po lewej stronie ma mniejszą kulkę, która wygląda podobnie do innych mniejszych kulek znajdujących się na powierzchni pętli.Jednakże w przypadku pary kulek, mamy kuleczkę, która znajduje się w ogniskowej powierzchni kuleczki poza obszarem LOP, co wskazuje, że kuleczka ta znajduje się w innej płaszczyźnie ogniskowania niż pozostała kuleczka na preparacie; para ta, zatem kuleczka po prawej stronie A, pokazuje, w jaki sposób pary mogą funkcjonować na preparacie. Umieszczamy preparat, przechodząc przez rotację pod różnymi kątami, co pozwala uzyskać różne długości, a następnie wykorzystujemy rotację. Widzimy wizualizację tego, jak para kulek mogłaby wyglądać przy użyciu komputera.Znajdujemy oba. W tym przypadku obliczamy, że możemy pominąć podany pomiar, a tutaj pominięto F, a także usunięto. Dziękujemy za oglądanie.Powodzenia z zakłóceniem. Jest czas na taniec. Poza tym, nie myśl, że ktoś nie zdobędzie mojego.Moi znajomi są zajęci próbą zdobycia go. Wszystko zostaje w tyle za mną. Gdzie jest ta dziewczyna, z którą przyszedłem?Ona odchodzi z moim przyjacielem. Naprawdę tak uważa. Czyż ona nie zna prawdziwego mężczyzny?Jedź ponownie, w prawo ponownie, mechaniczny byk. Puść go. Prawo, prawo, prosto do Meksyku.Uwielbiam to, jak idzie nam dzisiaj w tych cholernych rundach. Mechaniczny byk. Nawet nie zwalniaj.Daj mi 5, kiedy skończysz z moją lewą ręką. Żebym mógł użyć prawej. Tak, z lewą ręką po prostu będę używać prawej.

demonstrating-uses-novel-gravitational-force-spectrometer-to-stretch

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zademonstrowanie zastosowań nowego spektrometru sił grawitacji do rozciągania i pomiaru włóknistych białek

Techniki mikroskopii poklatkowej i przetwarzania obrazów zostały użyte do obserwacji i analizy zagęszczenia żelu za pośrednictwem fibroblastów i wyrównania włókien fibryny w bioreaktorze kontrolowanym przez środowisko przez okres 48 godzin.

Obserwacja i ilościowe określanie zagęszczenia fibryny w żelu za pośrednictwem fibroblastów

Celulosomy to kompleksy wieloenzymatyczne przeznaczone do trawienia celulozy. SMFS oparty na AFM wykorzystano do zbadania właściwości mechanicznych i konfiguracji fałdowania zespołów białkowych związanych z celulozonami. Przedstawiamy kompletny przepływ pracy do immobilizacji białek, pozyskiwania i analizy danych w celu zbadania interakcji poszczególnych kompleksów receptor-ligand zaangażowanych w składanie celulasomów.

Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

Analiza właściwości kurczliwych chemicznie skórowanych lub przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych oferuje potężny sposób oceny funkcji mięśni na poziomie pojedynczej komórki mięśniowej. W tym artykule przedstawiamy ważną i wiarygodną technikę przygotowania i badania przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych in vitro.

Pomiar maksymalnej siły izometrycznej generowanej przez przepuszczalne włókna mięśni szkieletowych

Przedstawiamy protokół zastosowania spektroskopii rozpraszania światła Brillouina do oczyszczonych elastyną i trypsyną włókien kolagenowych typu I macierzy zewnątrzkomórkowej w celu wydobycia ich pełnych właściwości elastycznych.

Przygotowanie włókien białkowych macierzy zewnątrzkomórkowej do spektroskopii Brillouina

Ostatnio opracowano wiele biosensorów siły opartych na FRET, które umożliwiają specyficzne dla białek rozwiązywanie siły wewnątrzkomórkowej. W tym protokole pokazujemy, w jaki sposób jeden z tych czujników, zaprojektowany dla łącznika białka kompleksu nukleoszkielet-cytoszkielet (LINC) Nesprin-2G, może być wykorzystany do pomiaru sił aktomiozyny w jądrowym kompleksie LINC.

Protokół wykorzystania biosensorów Förster Resonance Energy Transfer (FRET) do pomiaru sił mechanicznych w jądrowym kompleksie LINC

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Zespołowa spektroskopia sił (EFS) to solidna technika mechanicznego rozkładania i wykrywania w czasie rzeczywistym zestawu struktur biomolekularnych w polach biofizycznych i biosensorycznych.

Spektroskopia sił zespołowych za pomocą sił ścinających

Opracowano unikalną metodę inżynierii tkankowej w celu wydłużenia licznych włókien nerwowych w hodowli poprzez odtworzenie wzrostu aksonów indukowanego rozciąganiem; jest to forma wzrostu układu nerwowego, w której nerwy wydłużają się równocześnie ze wzrostem powiększającego się organizmu.

Wzrost aksonów indukowany rozciąganiem: mechanotransdukcja wzrostu neuronalnego

Poznaj zastosowanie nowego spektrometru sił grawitacyjnych do rozciągania i pomiaru białek włóknistych na poziomie pojedynczych cząsteczek. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę oddziaływań molekularnych w neurobiologii i biofizyce.

Demonstracja zastosowań nowatorskiego spektrometru sił grawitacyjnych do rozciągania i pomiaru białek włóknistych

Przeglądaj więcej filmów