Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania Open Source

Protokół ten pokazuje, jak obrazować dynamiczne zdarzenia we wczesnych zarodkach CL egana za pomocą optyki Norky DIC lub fluorescencji, korzystając z powszechnie dostępnych mikroskopów i oprogramowania open source. Protokół rozpoczyna się od opisania, jak przeprowadzić sekcję zarodków CL gans i zamontować je do obrazowania. Następnie sprawdzane jest prawidłowe ustawienie optyki DIC ani masky, aby zapewnić optymalne obrazy o najwyższej szczegółowości.

Kalibracja szerokokątnej fluorescencji epi i oświetlenia jest również sprawdzana pod kątem zbierania dobrych danych obrazu fluorescencyjnego w połączeniu z oprogramowaniem open source. Dobra mikroskopia może uwidocznić dynamikę komórkową w rozwijającym się zarodku. Wizualne ilustracje tej metody mają kluczowe znaczenie, ponieważ prawidłowe ustawienie optyki D iic jest trudne, ponieważ terminologia może być myląca, a właściwa technika jest trudna do opisania w formie pisemnej.

Ponadto badacze powinni zachować ostrożność, aby zminimalizować ekspozycję na światło podczas wykonywania obrazowania fluorescencyjnego. Aby ograniczyć fototoksyczność i fotowybielanie Aby przygotować zarodki do obrazowania, najpierw wykonaj dwa roztwory montażowe. Jeden to stopiona wazelina, a drugi to od dwóch do 3% aros w buforze.

Gęstsze aros można uzyskać, jeśli struktury, które mają być obrazowane, są bardzo delikatne, uważając, aby uniknąć wrzenia. Oba roztwory podstawowe topi się w kuchence mikrofalowej, a następnie przechowuje w postaci podwielokrotności o pojemności od czterech do pięciu mililitrów. W dniu obrazowania rozpuść podwielokrotność roztworu wazeliny w bloku grzewczym o temperaturze od 65 do 70 stopni Celsjusza i rozpuść jedną porcję powstałego roztworu w kuchence mikrofalowej.

Ponownie, unikając gotowania. Następnie, aby utrzymać te roztwory w stanie stopionym, przechowuj je w bloku grzewczym. Następnie przykryj górną i dolną część dwóch szkiełek paskiem taśmy laboratoryjnej i umieść czysty slajd między dwoma przyklejonymi slajdami.

Teraz wylej kilka kropel stopionego aros na czyste szkiełko i przykryj je kolejnym czystym szkiełkiem. Aros rozprzestrzenia się na cienkiej kwadratowej podkładce z przygotowaną podkładką ślimakową. Użyj lunety sekcyjnej i platynowego drucianego szpikulca, aby przenieść dwa dorosłe robaki do kropli buforu o pojemności od 9 do 12 mikrolitrów na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 18 na 18 milimetrów.

Następnie wytnij. Otwórz robaki igłą lub skalpelem, aby uwolnić zarodki stroną agarro do dołu. Umieść podkładkę ślimakową na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 18 na 18 milimetrów i zetrzyj zwisający agar.

Na koniec, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe, nałóż stopiony roztwór wazeliny wzdłuż jego obwodu za pomocą pędzla lub wykałaczki. Komórki są teraz gotowe do obrazowania. Umieszczając szkiełko na mikroskopie, upewnij się, że dwa polaryzatory są ustawione prostopadle do siebie.

Upewnij się, że zarówno ściany, jak i pryzmaty znajdują się poza ścieżką światła. Jeśli pole nie jest ciemne, obróć polaryzator poniżej kondensatora, aż znajdzie się teraz. Znajdź zarodki, korzystając z celu 10 razy.

Szukaj w pobliżu ciał robaków grup młodych zarodków, aby uzyskać wiele zarodków w polu obrazowania. Unikaj zarodków wewnątrz robaka, aby uzyskać najlepsze obrazy. Po zlokalizowaniu najlepszych zarodków przełącz się na cel o wyższej mocy.

Teraz przełącz kostkę filtra na DIC. Następnie włóż górny pryzmat walstone obiektywu do ścieżki światła i obróć tartę na kondensatorze, aby wybrać dolny pryzmat walstone, który pasuje do obiektywu. Po umieszczeniu pryzmatów wyreguluj suwak pod tą wieżyczką, aby dopasować go do apertury numerycznej obiektywu.

Aby uzyskać optymalne oświetlenie Kohlera, ustaw ostrość kondensatora, aż krawędź membrany skraplacza będzie najostrzejsza. Najostrzejsza jest wtedy, gdy granica między jasną czernią jest najbardziej wyraźna lub ostra. Aby uzyskać optymalny kontrast, wyreguluj ścianę jabłka i pryzmat, obracając pokrętło na suwaku.

Teraz mikroskop jest prawie gotowy do użycia. Nadszedł czas, aby kontrolować dodatkowe parametry obrazowania na komputerze za pomocą mikromenedżera i oprogramowania open source. Zacznij od ustawienia wzmocnienia kamery na zero.

Następnie przełącz się na zapisywanie plików w formacie ośmiobitowym, a nie 16-bitowym. Pliki TIFF mogą być później analizowane przez oprogramowanie typu open source, takie jak Image J.Następnie dostosuj poziom światła do miejsca, w którym najjaśniejsze piksele znajdują się tuż poniżej poziomów nasycenia. Jeśli wszystko zostało wykonane poprawnie, obraz będzie wyglądał na 3D, a światło będzie świecić pod kątem.

Teraz, gdy obraz wygląda genialnie, wybierz zarodki, które chcesz zobrazować, i narysuj interesujący Cię obszar. Jeśli mikroskop jest wyposażony w silnik ostrości, należy go używać do zbierania wielu płaszczyzn ogniskowych za każdym razem. Wskaż otwórz okno akwizycji wielowymiarowej i ustaw górną i dolną płaszczyznę stosu Z, regulując pokrętło ostrości, aby znaleźć pierwszą i ostatnią płaszczyznę ogniskowej z niektórymi granulkami jarzma w ostrości.

Ustaw rozmiar kroku. Określi to liczbę zbieranych płaszczyzn ogniskowych. Teraz ustaw przedział czasu, który jest wystarczająco długi, aby uzyskać wszystkie płaszczyzny ogniskowe.

Maksymalne punkty czasowe można ustawić bardzo wysoko, aby oprogramowanie robiło zdjęcia do momentu ręcznego zatrzymania. Ustaw oprogramowanie tak, aby wyświetlało tylko ostatnio uzyskany obraz, aby można było monitorować proces. Teraz nadaj obrazom nazwę pliku i rozpocznij pobieranie obrazów.

Analiza obrazu zostanie pokrótce omówiona na końcu następnej sekcji. Konstruowanie filmu GFP jest bardzo podobne do tworzenia czterech DIC w D ani Musky, ale używany jest plik konfiguracyjny, który zawiera programową kontrolę roztrzasku fluorescencyjnego. Zamiast tego, gdy zarodki są zlokalizowane, upewnij się, że górny pryzmat z kamienia włoskiego nie znajduje się na ścieżce światła i przełącz kostkę filtra na F-I-T-C-G-F-P.

Jeśli nie zostało to automatycznie ustawione Podczas uruchamiania za pomocą oprogramowania, upewnij się, że wzmocnienie kamery jest ustawione na 255. Plik obrazu jest ustawiony na 16-bitowy format tiff. Teraz wyłącz źródło światła przechodzącego i kliknij obrazowanie na żywo.

Dostosuj intensywność źródła światła UV i czas ekspozycji, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu dla sygnału fluorescencji, jednak utrzymuj ekspozycję na światło na minimalnym poziomie, aby zachować komórki. Następnie ustaw przedział czasu. Liczba punktów czasowych i liczba płaszczyzn ogniskowych postępują teraz zgodnie z wcześniejszym opisem.

Aby przeanalizować filmy, użyj oprogramowania typu open source. Obraz J z zainstalowaną wtyczką micromanager Bardzo duże filmy można również importować do Image J za pomocą wtyczki loci. Jest to zarodek typu dzikiego schwytany za pomocą optyki DIC.

Tylna znajduje się w prawym dolnym rogu, a brzuszna w lewym dolnym rogu. Film pokazuje sekwencję obrazów pojedynczej płaszczyzny ogniskowej zbieranych co 15 sekund. Odtwarzanie jest ustawione na 14 klatek na sekundę.

Ten zarodek wyraża fluorescencję podczas pierwszego podziału zarodka, tutaj z tyłu znajduje się w prawym górnym rogu. Ten film pokazuje zmiany w pojedynczej płaszczyźnie ogniskowej co 10 sekund. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obrazować żywe zarodki przy użyciu zarówno optyki DIC Naski, jak i epifluorescencji do badania dynamicznych zdarzeń.

Mamy nadzieję, że lepiej rozumiesz, jak skonfigurować optykę DIC Nomar, aby uzyskać optymalne obrazy i zdajesz sobie sprawę, że możesz uzyskać wysokiej jakości dane fluorescencyjne za pomocą oświetlenia fluorescencyjnego epi i nie zawsze jesteś zależny od bardziej zaawansowanych mikroskopów. Możesz również zastosować te techniki obrazowania do badania zarodków pozbawionych określonej funkcji genu, aby dokładniej zbadać wymagania genetyczne dotyczące twoich ulubionych wydarzeń podczas podziału lub rozwoju komórki.