Name: Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania Open Source (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Naucz się obrazowania zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopii DIC i fluorescencji z oprogramowaniem open-source. Ten protokół pokazuje przygotowanie próbek, kalibrację optyki i analizę dynamiki komórkowej w żywych organizmach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez wewnętrzne fundusze instytucjonalne oraz program Biological Sciences Scholars Program na Uniwersytecie w Michigan.

Przygotowanie nicieni
<ol>
	<li>Przenieść larwy robaków w stadium L4 na odpowiednie płytki od 18 do 24 godzin przed obrazowaniem.22Zapewni to dostęp do jajnosnych osobników dorosłych, co umożliwi pozyskanie odpowiedniej ilości wczesnych embrionów.</li>
	<li>Przygotuj probówki z wazeliną i agarozą. Przygotowujemy kilka probówek typu Falcon o pojemności 15 ml, rozpuszczając wazelinę w zlewce w kuchence mikrofalowej i rozlewając ją w ilości 4–5 ml na probówkę. W podobny sposób rozpuść 2–3% (w/v) agarozy w buforze (bufor M9 lub bufor jajeczny) i rozlej po 4–5 ml do probówek typu Falcon. Należy uważać, aby nie doprowadzić do nadmiernego wrzenia, co pozwoli zminimalizować parowanie. W dniu obrazowania rozpuść jedną probówkę wazeliny w 65-70°C użyć bloku grzewczego i rozpuścić 1 probówkę agarozy w mikrofalówce, pamiętając o zachowaniu ostrożności, aby zapobiec wykipieniu. Przechowywać probówki w bloku grzewczym, aby utrzymać wazelinę i agarozę w stanie ciekłym.</li>
	<li>Przygotowanie podkładki agarozowej. Umieść nowy preparat szkiełkowy pomiędzy dwiema szkiełkami prowadzącymi, które są oklejone pojedynczą warstwą zwykłej taśmy laboratoryjnej na górnej i dolnej krawędzi każdego szkiełka. Używając pipety Pasteura z odłamanym końcem, nanieś 2-3 krople stopionej agarozy na nowy preparat. Przykryj to 2nd przesuń go prostopadle do pierwotnego slajdu, tak aby przykrył i pomógł rozprowadzić agarozę w celu utworzenia cienkiej, kwadratowej płytki. 2nd slajd powinien spoczywać nad taśmą na prowadnicach slajdów. Stężenie agarozy można zwiększyć do 5% w przypadku grubszych podkładek.</li>
	<li>Używając stereomikroskopu i platynowej igły, przenieś 2 dorosłe nicienie do 9-12μL kropla pożywki M9 lub buforu do jajeczek (Egg Buffer) na szkiełku nakrywce o wymiarach 18 mm x 18 mm.</li>
	<li>Przetnij dżdżownice igłą (stosujemy igły 27G1/2) lub skalpelem, aby uwolnić zarodki. Staraj się przecinać dżdżownice w ich środkowej części.</li>
	<li>Połóż żel agarowy (stroną z agarem dołu) na szkiełku nakrywkowe o wymiarach 18x18 mm zawierającym embriony. Odetnij wystający poza krawędź szkiełka agar za pomocą żyletki.</li>
	<li>Uszczelnij szkiełko nakrywką, nakładając za pomocą pędzelka lub cienkiego drewnianego patyczka roztopioną wazelinę na wszystkie cztery krawędzie szkiełka nakrywki.</li>
</ol>
Alternatywą dla preparatów w agarze są krople zawieszone23, jeśli embriony są wrażliwe na nacisk (np. gdy skorupa jaja nie formuje się prawidłowo). Obrazowanie można również przeprowadzić in utero, aby śledzić zapłodnienie lub wczesne zdarzenia, takie jak mejoza. Nicienie należy znieczulić lewamisolem24. Aby zwiększyć liczbę embrionów z konkretnego etapu rozwoju, można jednocześnie przeprowadzić sekcję kilku nicieni, a następnie delikatnie umieścić embriony razem, używając pipety z cienką końcówką, pędzelka z rzęs lub pipetując ustami.
Filmy 4D DIC (Differential Interference Contrast) metodą Nomarskiego
<ol start="8">
	<li>Włącz mikroskop Olympus BX61. Ponieważ kamera jest wrażliwa na fale elektromagnetyczne emitowane przez inne urządzenia, włącza się ją na samym końcu, natomiast żarówkę rtęciową (jeśli jest wymagana do obrazowania GFP lub fluorescencji) w pierwszej kolejności. Po włączeniu wszystkich urządzeń uruchom program Micro-Manager. Wybierz odpowiedni plik konfiguracyjny dla obrazowania DIC lub fluorescencyjnego. Główną różnicą jest to, że plik DIC nie obejmuje sterowania migawką fluorescencyjną. Każdy plik wybiera również odpowiednią kostkę filtru oraz ustawienie wzmocnienia kamery.</li>
	<li>Zlokalizuj embriony pod mikroskopem, korzystając z obiektywu 10x. Szukaj grup młodych embrionów w pobliżu ciał nicieni, aby uchwycić wiele zarodków w jednym polu widzenia. Aby uzyskać najlepsze obrazy, unikaj embrionów znajdujących się wewnątrz organizmu nicienia.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania przełącz na obiektyw o większym powiększeniu (od 40x do 10x) i rozdzielczości (N.A. od 0,9 do 1,4) w celu wykonania obrazowania.</li>
	<li>Regulacja optyki DIC Nomarskiego (poniższe strony internetowe zawierają pomocne wyjaśnienia dotyczące optyki DIC oraz zastosowanej terminologii; <a href="http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html">Kontrast interferencyjny różnicowy (DIC)

Mikroskopia DIC (kontrast interferencyjny różnicowy) jest techniką obrazowania, która pozwala na uzyskanie wysokiego kontrastu w próbkach przezroczystych i bezbarwnych bez konieczności stosowania barwników lub utrwalania próbek. Technika ta tworzy obraz, który wygląda, jakby próbka była trójwymiarowa i oświetlona z boku, co pozwala na wyraźne uwidocznienie krawędzi i struktur wewnętrznych.

Zasada działania DIC

W przeciwieństwie do standardowej mikroskopii pola jasnego, gdzie światło przechodzi bezpośrednio przez próbkę, mikroskopia DIC wykorzystuje zjawisko polaryzacji i interferencji światła. 

Kluczowe komponenty systemu DIC obejmują:

1. Polaryzator: Przekształca światło z lampy w światło spolaryzowane liniowo.
2. Pryzmat Nomarskiego (lub pryzmat Wollaston): Rozdziela wiązkę światła na dwie oddzielne wiązki, przesunięte względem siebie o bardzo małą odległość (mniejszą niż rozdzielczość mikroskopu).
3. Próbka: Gdy dwie równoległe wiązki przechodzą przez próbkę, każda z nich przechodzi przez nieco inny obszar. Jeśli w próbce występują różnice w gęstości lub współczynniku załamania światła, prędkość wiązek zmienia się w różny sposób.
4. Analizator: Drugi polaryzator, który łączy obie wiązki z powrotem. W miejscach, gdzie nastąpiła zmiana fazy z powodu przejścia przez próbkę, wiązki interferują ze sobą, co generuje obraz o wysokim kontraście.

Zalety mikroskopii DIC

- Obrazowanie żywych komórek: Ponieważ nie wymaga barwienia, DIC jest idealny do obserwacji dynamicznych procesów w żywych organizmach.
- Efekt 3D: Dzięki gradientom jasności obraz przypomina rzeźbę, co ułatwia analizę morfologiczną.
- Wysoka rozdzielczość osiowa: DIC pozwala na uzyskanie lepszego kontrastu w grubszych próbkach w porównaniu do mikroskopii fazowej.
- Brak pierścieni fazowych: W przeciwieństwie do mikroskopii fazowej, obraz DIC nie posiada charakterystycznych pierścieni (halo) wokół obiektów, co pozwala na dokładniejszą obserwację krawędzi.

Zastosowania

Mikroskopia DIC jest powszechnie stosowana w biologii komórkowej, embriologii oraz badaniach nad tkankami do analizy struktur wewnątrzkomórkowych, takich jak jądra komórkowe, mitochondria czy granice błon komórkowych, w ich naturalnym stanie.</a> 
	http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html)
	<ol class="lalpha">
		<li>W naszym mikroskopie Olympus BX61 najważniejszymi elementami są:
		<ol>
			<li>Polaryzator – suwak pod kondensorem</li>
			<li>Pryzmat Wollastona w kondensorze – obrotowa głowica kondensora, znajdująca się bezpośrednio pod stolikiem.</li>
			<li>Pryzmat Wollastona w obiektywie – suwak poniżej kostek filtrów</li>
			<li>2nd Polaryzator (analizator) - kostka filtru w pozycji DIC</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przełącz kostkę filtra na DIC, aby ustawić analizator (2nd polaryzator) na drodze światła (oprogramowanie powinno wykonać tę czynność podczas uruchamiania).</li>
		<li>Należy upewnić się, że dwa polaryzatory są odpowiednio ustawione (skrzyżowane). Gdy oba pryzmaty Wollastona znajdują się poza drogą światła, pole widzenia powinno być ciemne. W razie potrzeby należy obracać polaryzator pod kondensorem, aż zostanie osiągnięty prawidłowy efekt.</li>
		<li>Wprowadź pryzmat Wollastona (górny) do toru optycznego.</li>
		<li>Obróć pierścień kondensora, aby wybrać pryzmat Wollastona dopasowany do używanego obiektywu.</li>
		<li>Przesuń suwak pod tym obiektywem, aby dopasować go do apertury numerycznej (NA) soczewki.</li>
		<li>Ustaw ostrość kondensora, aby uzyskać optymalne oświetlenie Koehlera.</li>
		<li>Wyreguluj górny pryzmat Wollastona, obracając pokrętło na suwaku, aby uzyskać optymalny kontrast.</li>
		<li>Inne ustawienia kontrolowane podczas uruchamiania oprogramowania obejmują wzmocnienie kamery (ustawione na 0) oraz przełączenie zapisu plików na 8-bitowe, a nie 16-bitowe pliki tiff.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj poziom oświetlenia w celu uzyskania wysokiej jakości obrazu (zazwyczaj stosuje się napięcie 4,7 V; sterowanie odbywa się za pomocą oprogramowania). Zaleca się oświetlenie próbki w taki sposób, aby najjaśniejsze piksele znajdowały się tuż poniżej poziomu nasycenia. 
	Prawidłowo ustawiona optyka DIC pozwala uzyskać obraz o trójwymiarowym wyglądzie, w którym ziarna żółtka w zarodku są wyraźnie zaznaczone. Alternatywnie można to opisać tak, jakby światło oświetlające próbkę padało pod kątem, w wyniku czego jedna strona próbki (lub jej elementów) jest mocno oświetlona, a strona przeciwna znajduje się w cieniu i wydaje się ciemniejsza.</li>
	<li>Wybierz obszar zainteresowania (ROI), aby objąć embriony, które chcesz zobrazować, a następnie kliknij przycisk set ROI, aby zawęzić okno.</li>
	<li>Otwórz okno akwizycji wielowymiarowej. Wybierz stosy Z (warstwy) oraz punkty czasowe.</li>
	<li>Użyj pokrętła ostrości mikroskopu, aby zlokalizować dół zarodka (ostatnia płaszczyzna ogniskowania, w której widoczne są ziarna żółtka). Kliknij Select bottom. Powtórz tę czynność, aby zidentyfikować i ustawić górną część zarodka. Zazwyczaj stosujemy krok 1 mikrona, co pozwala uzyskać około 20 płaszczyzn ogniskowania. Generalnie zbieramy wiele płaszczyzn ogniskowania w każdym punkcie czasowym, ponieważ zarodki i komórki są stosunkowo grube. Ponadto, szczególnie gdy komórki zaczynają dzielić się w różnych orientacjach, mogą one przemieszczać inne komórki w obrębie zarodka, wypychając je poza pierwotną płaszczyznę ogniskowania lub wprowadzając w jej obszar. Jeśli Twój mikroskop nie posiada silnika napędowego ostrości, możesz ręcznie regulować ostrość, aby śledzić interesującą Cię komórkę lub proces.</li>
	<li>Wprowadź liczbę punktów czasowych oraz wymagany odstęp czasu. Zazwyczaj stosujemy odstęp 15 sekund i ustawiamy maksymalną liczbę 50 punktów czasowych. Rozpoczynamy od większej liczby punktów czasowych, niż będzie potrzebne, a akwizycję zatrzymujemy w pożądanym momencie. W przypadku obrazowania wielu płaszczyzn ogniskowania należy upewnić się, że czas potrzebny na zarejestrowanie wszystkich płaszczyzn ogniskowania mieści się w odstępie między punktami czasowymi.</li>
	<li>Wybierz lub utwórz folder do zapisu danych. Upewnij się, że oprogramowanie jest ustawione w trybie wyświetlania tylko ostatniego obrazu. Nadaj plikowi nazwę i kliknij Acquire. Monitoruj zautomatyzowany proces akwizycji obrazów przez pierwsze kilka punktów czasowych, aby upewnić się, że system działa prawidłowo.</li>
	<li>Kliknij stop, gdy chcesz przerwać akwizycję, przełącz na obiektyw 10x i przygotuj kolejny preparat.</li>
	<li>Po zakończeniu obrazowania należy usunąć komponenty DIC z drogi optycznej. W razie potrzeby należy oczyścić obiektyw z oleju. Wyłączyć wszystkie urządzenia, zaczynając od kamery.</li>
</ol>
Filmy GFP
<ol start="20">
	<li>Uruchom mikroskop i zlokalizuj zarodki zgodnie z powyższą instrukcją. Użyj pliku konfiguracyjnego zawierającego programowe sterowanie migawką fluorescencyjną.</li>
	<li>Upewnij się, że górny pryzmat DIC (suwak) nie znajduje się na drodze światła.</li>
	<li>Przełącz kostkę filtra na FITC/GFP (ustawiane automatycznie przy uruchomieniu).</li>
	<li>Zmień wzmocnienie kamery (gain) na 25, a format pliku obrazu na 16-bitowy Tiff (ustawiane automatycznie przy uruchomieniu z tym plikiem konfiguracyjnym).</li>
	<li>Wyłącz światło białe.</li>
	<li>Kliknij Live Imaging, aby wyświetlić podgląd obrazu. Pracuj szybko, aby zminimalizować ekspozycję na światło. Alternatywnie użyj Snap Image, aby zarejestrować pojedynczy obraz.</li>
	<li>Dostosuj moc lampy rtęciowej/filtry neutralne oraz czas ekspozycji, aby uzyskać wysokiej jakości obraz. Generalnie należy stosować minimalne natężenie światła docierającego do próbki niezbędne do pozyskania danych, aby ograniczyć fotouszkodzenia komórek i fotowyblaknięcie sygnałów fluorescencyjnych.</li>
	<li>Ustaw odstępy czasowe, liczbę punktów czasowych oraz liczbę płaszczyzn ogniskowych. Często stosuje się interwały 5–10 sekund i 1–3 płaszczyzny ogniskowej.</li>
	<li>Wybierz ROI i ustaw parametry akwizycji obrazu zgodnie z opisem w krokach 13–19.</li>
</ol>
Analiza filmów
<ol start="29">
	<li>Dane zostaną zapisane w folderze o nazwie, którą wprowadzono, i będą zawierać serię plików tiff dla każdego obrazu stosu 4D, plik tekstowy oraz plik xml zawierający metadane, takie jak poziomy ekspozycji i interwały czasowe.</li>
	<li>Obrazy tiff można otwierać w programie ImageJ dwiema metodami. Pierwsza (metoda a) jest najprostsza i odczyta również metadane każdego pliku. Druga (metoda b) umożliwia wykorzystanie pamięci wirtualnej do otwierania plików większych niż ilość pamięci przydzielonej do programu ImageJ, ale nie zawiera ona metadanych.
	<ol class="lalpha">
		<li>Użycie wtyczki Micro-Manager
		<ol>
			<li>Micro-Manager jest zbudowany na bazie programu ImageJ i korzysta z niego (instaluje nową wersję programu ImageJ, która będzie różnić się od jakiejkolwiek innej wersji zainstalowanej wcześniej) oraz zawiera wtyczkę do otwierania danych. Alternatywnie można skopiować zawartość folderu Micro-Manager-1.3/plugins do folderu plugins innej wersji programu ImageJ.</li>
			<li>Przejdź do menu Plugins, wybierz Micro-Manager, a następnie Open Micro-Manager File.</li>
			<li>Wybierz folder zawierający dane, które chcesz wyświetlić, i kliknij ok.</li>
			<li>Przejrzyj wymiary Z i T.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Użycie wtyczki LOCI do otwierania filmów za pomocą BioFormats Importer.
		<ol>
			<li>Przenieś pliki xml i txt z folderu zawierającego pliki tiff i zmień nazwy obu plików tak, aby odpowiadały nazwie zestawu danych.</li>
			<li>W programie ImageJ przejdź do menu rozwijanego Plugins, wybierz LOCI, a następnie Data Browser lub Bio-Formats Importer.</li>
			<li>Znajdź folder ze stosami tiff. Kliknij pierwszy plik tiff, a następnie wybierz open.</li>
			<li>Wyświetl stos za pomocą Hyperstack. W sekcji Dataset organization: wybierz Group Files with Similar names, Swap dimensions oraz Open all series. W sekcji Memory management: wybierz Use virtual stack (szczególnie w przypadku dużych zestawów danych). Kliknij ok.</li>
			<li>Wtyczka określi wymiary zestawu danych (liczbę punktów czasowych i płaszczyzn ogniskowych) i wyświetli zakres w nawiasach &lt;&gt;. Kliknij ok lub zmień liczbę punktów czasowych i/lub płaszczyzn ogniskowych do otwarcia.</li>
			<li>Potwierdź, który wymiar odpowiada każdej serii.</li>
			<li>Przejrzyj wymiary Z i T.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig1.jpg" alt="Mikroskopia poklatkowa podziału komórki; sekwencyjne klatki obrazujące przebieg mitozy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Klatki z filmu DIC Nomarskiego ilustrujące prawidłowe procesy komórkowe we wczesnej fazie C. elegans rozwój zarodka: migracja jąder przednich (0-5:45), asymetryczny pierwszy podział (6:45-14:45) i asynchroniczny drugi podział (14:45-27:0). Dane zebrano przy użyciu obiektywu 60x NA 1,35. Co 15 sekund rejestrowano 20 płaszczyzn ogniskowych w odstępach 1 mikrona przy użyciu 40 μs ekspozycja. Obrazy zostały obrócone tak, aby część tylna znajdowała się po prawej stronie, a brzuszna na dole. Pasek skali odpowiada 10 mikronom.
<img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig2.jpg" alt="Mikroskopia poklatkowa mitozy komórkowej, sześć etapów, proces podziału komórkowego, obrazowanie biologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Klatry z filmu fluorescencyjnego ilustrujące dynamiczne ruchy oznakowanej białkiem GFP podjednostki kompleksu pasażerskiego chromosomów (AIR-2), obecnej na chromosomach od metafazy do wczesnej anafazy (A–C), a następnie pojawiającej się w strefie środkowej wrzeciona w anafazie aż do zakończenia cytokinezy (C–F). Dane zebrano przy użyciu obiektywu 60x o aperturze numerycznej (NA) 1,35. Pojedynczą płaszczyznę ogniskową rejestrowano co 10 sekund przy użyciu 50 μsec ekspozycja. Obrazy zostały obrócone tak, aby część tylna znajdowała się po prawej stronie. Pasek skali odpowiada 10 mikronom.
Film 1 Obrazowanie nomarskie embrionu typu dzikiego. 
Film odpowiadający Rysunkowi 1. Strona tylna znajduje się w prawym dolnym rogu, a strona brzuszna w lewym dolnym rogu. Przedstawiono pojedynczą płaszczyznę ogniskowania z oryginalnego zestawu danych. Obrazy były zbierane co 15 sekund, a prędkość odtwarzania ustawiono na 14 klatek na sekundę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie1.mp4">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo</a>
Film 2 Film fluorescencyjny zarodka typu dzikiego wykazującego ekspresję GFP::AIR-2. 
Film odpowiadający Rysunkowi 2. Strona tylna znajduje się w prawym górnym rogu. Film został zarejestrowany w jednej płaszczyźnie ogniskowania. Obrazy były pobierane co 10 sekund, a prędkość odtwarzania ustawiono na 14 klatek na sekundę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie2.mp4">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo</a>

<ol><li>Gerlich, D., Koch, B., Dupeux, F., Peters, J. M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+a+stable+cohesin-chromatin+interaction+after+but+not+before+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals a stable cohesin-chromatin interaction after but not before DNA replication.</a> Curr Biol. 16, 1571-1578 (2006).</li>
<li>Nabeshima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+centromeres+during+metaphase-anaphase+transition+in+fission+yeast%3A+Dis1+is+implicated+in+force+balance+in+metaphase+bipolar+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle.</a> Mol Biol Cell. 9, 3211-3225 (1998).</li>
<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li>
<li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Cell division.</a> WormBook. , 1-40 (2006).</li>
<li>Heuvel, S. vanden <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle regulation.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li>
<li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li>
<li>Gonczy, P., Rose, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+cell+division+and+axis+formation+in+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Asymmetric cell division and axis formation in the embryo.</a> WormBook. , 1-20 (2005).</li>
<li>Nance, J., Lee, J. Y., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Gastrulation in C. elegans.</a> WormBook. , 1-13 (2005).</li>
<li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>O'Connell, K. F., Leys, C. M., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+temperature-sensitive+cell-division+mutants+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for temperature-sensitive cell-division mutants of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 149, 1303-1321 (1998).</li>
<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans+%5Bsee+comments%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [see comments].</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Jansen, G., Hazendonk, E., Thijssen, K. L., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+by+chemical+mutagenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics by chemical mutagenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Genet. 17, 119-121 (1997).</li>
<li>Liu, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+isolation+of+Caenorhabditis+elegans+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput isolation of Caenorhabditis elegans deletion mutants.</a> Genome Res. 9, 859-867 (1999).</li>
<li>Bazopoulou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NemaGENETAG+initiative%3A+large+scale+transposon+insertion+gene-tagging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">The NemaGENETAG initiative: large scale transposon insertion gene-tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Genetica. 137, 39-46 (2009).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol Cell Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Piano, F., Schetter, A. J., Mangone, M., Stein, L., Kemphues, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+analysis+of+genes+expressed+in+the+ovary+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 10, 1619-1622 (2000).</li>
<li>Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+cell+division+in+C.+elegans+using+RNAi+of+genes+on+chromosome+III%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III.</a> Nature. 408, 331-336 (2000).</li>
<li>Sonnichsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-genome+RNAi+profiling+of+early+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Full-genome RNAi profiling of early embryogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 434, 462-469 (2005).</li>
<li>Mohler, W. A., Isaacson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+embryonic+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging embryonic development in Caenorhabditis elegans.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Bembenek, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+granule+exocytosis+in+C.+elegans+is+regulated+by+cell+cycle+components+including+separase%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cortical granule exocytosis in C. elegans is regulated by cell cycle components including separase.</a> Development. 134, 3837-3848 (2007).</li>
<li>Poteryaev, D., Squirrell, J. M., Campbell, J. M., White, J. G., Spang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+actin+cytoskeleton+and+homotypic+membrane+fusion+in+ER+dynamics+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Involvement of the actin cytoskeleton and homotypic membrane fusion in ER dynamics in Caenorhabditis elegans.</a> Mol Biol Cell. 16, 2139-2153 (2005).</li>
<li>Bianchi, L., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+embryonic+C.+elegans+cells+for+electrophysiological+and+pharmacological+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Culture of embryonic C. elegans cells for electrophysiological and pharmacological analyses.</a> WormBook. , 1-15 (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Kluczową kwestią w obrazowaniu live time-lapse jest zachowanie integralności i żywotności komórki oraz organizmu. Mikroskopia DIC daje tę zaletę, że próbka nie jest wystawiona na działanie światła ultrafioletowego ani nadmierne nagrzewanie z powodu źródła oświetlenia. Mikroskopia DIC doskonale nadaje się do wykrywania migracji komórek i zmian ich kształtu, takich jak cytokineza, a także do identyfikacji niektórych struktur wewnątrzkomórkowych, np. wrzeciona mitotycznego i błony jądrowej. Obrazowanie fluorescencyjne białek reporterowych uzupełnia mikroskopię DIC, umożliwiając identyfikację dodatkowych przedziałów wewnątrzkomórkowych i wizualizację konkretnych białek. Aby zminimalizować ryzyko fototoksyczności i uszkodzeń zarodka podczas obrazowania fluorescencyjnego, zazwyczaj zwiększamy wzmocnienie cyfrowe kamery, aby zrekompensować zmniejszoną intensywność światła UV i czas naświetlania. W przypadku słabo fluorescencyjnych reporterów transgenicznych, jakość zarejestrowanych obrazów można poprawić za pomocą algorytmów dekonwolucji w celu ponownego przypisania światła poza ogniskową lub algorytmów usuwania rozmycia w celu redukcji tła. Chociaż zaawansowane mikroskopy, takie jak systemy konfokalne lub wielofotonowe, są czasami niezbędne, stwierdziliśmy, że wiele reporterów fluorescencyjnych można obrazować przy użyciu tej konfiguracji mikroskopu epifluorescencyjnego, uzyskując wysokiej jakości obrazy.
Program Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), poza tym że jest bezpłatny, zapisuje pliki bezpośrednio w formacie tiff, zamiast w formatach zastrzeżonych dla wielu komercyjnych pakietów oprogramowania. Znacząco upraszcza to analizę naszych danych poprzez wyeliminowanie etapu konwersji plików, który byłby niezbędny do odczytania obrazów w programach ImageJ, Photoshop oraz innym oprogramowaniu do edycji obrazów.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop Olympus BX61 z kamerą Hamamatsu Orca-ER. Obiektywy 10x Plan Fluorite (NA 0,3) i 60x PlanAchromat (NA 1,35)</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager 1.3.46</td><td>Micro-Manager</td><td></td><td>http://www.micro-manager.org</td></tr><tr><td>Image J 1.43</td><td></td><td></td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>loci_tools.jar</td><td></td><td></td><td>http://www.loci.wisc.edu</td></tr><tr><td>Agaroza - stopień do biologii molekularnej/elektroforezy żelowej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamelki mikroskopowe Fisher Superfrost/Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Taśma laboratoryjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901</td><td></td></tr><tr><td>Kryszalki 18 mm x 18 mm #1.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M9 (242 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 40 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 9 mM g NaCl, 19 mM NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do jaj (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 25 mM HEPES, pH 7,3)&lt;sup&gt;25&lt;/sup&gt;.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wazelina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pędzelek/patyczek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blok grzejny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicienie&lt;sup&gt;22&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rylce z drutu platynowego&lt;sup&gt;22&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła precyzyjna Precision Glide 27G1/2 lub skalpel z małym ostrzem</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie zarodków c. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Procesy komórkowe, takie jak montaż chromosomów, segregacja i cytokineza, są z natury dynamiczne. Obrazowanie time-lapse żywych komórek z wykorzystaniem znakowanych fluorescencyjnie białek reporterowych lub mikroskopii kontrastowej różnicowej (DIC) umożliwia badanie czasowego przebiegu tych dynamicznych zdarzeń, który w przeciwnym razie jest wnioskowany z analizy próbek utrwalonych1,2. Ponadto badanie regulacji rozwojowej procesów komórkowych wymaga przeprowadzania eksperymentów time-lapse na nienaruszonym organizmie podczas rozwoju. Embrion Caenorhabditis elegans jest przezroczysty dla światła i posiada szybki, niezmienny program rozwojowy o znanej linii komórkowej3, co czyni go idealnym modelem eksperymentalnym do badania zagadnień z zakresu biologii komórki4,5 oraz rozwoju6-9. C. elegans poddaje się manipulacjom genetycznym za pomocą genetyki forward (opartej na randomowej mutagenezie10,11) oraz genetyki reverse w celu celowania w konkretne geny (opartej na interferencji RNAi i mutagenezie celowanej12-15). Dodatkowo można łatwo tworzyć zwierzęta transgeniczne wykazujące ekspresję białek lub reporterów znakowanych fluorescencyjnie16,17. Cechy te łącznie ułatwiają identyfikację ścieżek genetycznych regulujących fundamentalne procesy komórkowe i rozwojowe in vivo18-21. W niniejszym protokole przedstawiamy metody obrazowania na żywo embrionów C. elegans przy użyciu optyki DIC lub fluorescencji GFP w mikroskopie epifluorescencyjnym. Demonstrujemy, z jaką łatwością powszechnie dostępne mikroskopy, zazwyczaj stosowane do obrazowania próbek utrwalonych, mogą być również wykorzystywane do analizy time-lapse z użyciem oprogramowania open-source w celu automatyzacji procesu obrazowania.

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Procesy komórkowe, takie jak montaż chromosomów, segregacja i cytokineza, są z natury dynamiczne. Obrazowanie time-lapse żywych komórek z wykorzystaniem...

Niniejszy protokół demonstruje sposób obrazowania dynamicznych zdarzeń we wczesnych embrionach C. elegans z wykorzystaniem optyki Norky DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów oraz oprogramowania otwartoźródłowego. Protokół rozpoczyna się od opisu sposobu preparowania embrionów C. elegans oraz ich montażu do obrazowania. Następnie omówiono prawidłową konfigurację optyki DIC Nor Masky, aby zapewnić uzyskanie obrazów o optymalnej jakości i najwyższym stopniu szczegółowości.Omówiono również kalibrację szerokopolowego mikroskopu epifluorescencyjnego oraz oświetlenia w celu gromadzenia wysokiej jakości danych obrazowania fluorescencyjnego przy użyciu oprogramowania open source. Dobra mikroskopia pozwala na wizualizację dynamiki komórkowej w rozwijającym się embrionie. Ilustracje wizualne tej metody są kluczowe, ponieważ prawidłowa konfiguracja optyki DIC jest trudna, gdyż terminologia może być myląca, a właściwa technika jest trudna do opisania w formie pisemnej.Ponadto badacze powinni dbać o zminimalizowanie ekspozycji na światło podczas obrazowania fluorescencyjnego. Aby ograniczyć fototoksyczność i fotoblaknięcie, w celu przygotowania embrionów do obrazowania, należy najpierw przygotować dwa roztwory montażowe. Pierwszym jest roztopiona wazelina, a drugim 2-3% agarozą w buforze.Gęstsze agarosy można przygotować, jeśli obrazowane struktury są bardzo delikatne, dbając przy tym o to, aby uniknąć wrzenia. Oba roztwory stokowe należy rozpuścić w kuchence mikrofalowej, a następnie przechowywać w aliquotach o objętości od czterech do pięciu mililitrów. W dniu obrazowania należy rozpuścić aliquot roztworu wazeliny w bloku grzewczym o temperaturze od 65 do 70 °C oraz rozpuścić jeden aliquot roztworu agarosy w kuchence mikrofalowej.Ponownie należy unikać doprowadzenia do wrzenia. Aby utrzymać te roztwory w stanie stopionym, należy przechowywać je w bloku grzejnym. Następnie górną i dolną powierzchnię dwóch szkiełek przedmiotowych należy zakleić paskiem taśmy laboratoryjnej i umieścić czyste szkiełko pomiędzy tymi dwoma zaklejonymi szkiełkami.Następnie nanieś pipetą kilka kropli stopionego agarosu na czyste szkiełko przedmiotowe i przykryj je drugim czystym szkiełkiem. Agaroz rozprzestrzenia się, tworząc cienką kwadratową warstwę, w której przygotowuje się podłoże dla nicieni. Używając stereomikroskopu i platynowej igły, przenieś dwa dorosłe nicienie do kropli buforu o objętości od 9 do 12 µL na szkiełku nakrywkowe o wymiarach 18 na 18 mm.Następnie należy wykonać cięcie. Rozciąć nicienie za pomocą igły lub skalpela, aby uwolnić embriony, trzymając stronę z agarem skierowaną w dół. Umieścić bloczek z nicieniami na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 18 na 18 milimetrów i odciąć nadmiar agaru za pomocą żyletki.Na koniec, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe, nanieś stopioną wazelinę wzdłuż jego obwodu za pomocą pędzla lub wykałaczki. Komórki są teraz gotowe do obrazowania. Umieszczając preparat na mikroskopie, upewnij się, że dwa polaryzatory są ustawione prostopadle względem siebie.Upewnij się, że zarówno przysłony, jak i pryzmaty znajdują się poza torami światła. Jeśli pole widzenia nie jest ciemne, obracaj polaryzator pod kondensorem, aż stanie się ciemne. Zlokalizuj zarodki, korzystając z obiektywu 10x.W poszukiwaniu większej liczby embrionów w polu obrazowania, należy szukać skupisk młodych embrionów w pobliżu ciał nicieni. Aby uzyskać najlepsze obrazy, należy unikać embrionów znajdujących się wewnątrz nicienia. Po zlokalizowaniu odpowiednich embrionów, należy przełączyć na obiektyw o większym powiększeniu.Teraz przełącz kostkę filtra na DIC. Następnie wsuń górny pryzmat Wollastona obiektywu do toru światła i obróć tarczę kondensora, aby wybrać dolny pryzmat Wollastona dopasowany do obiektywu. Po umieszczeniu pryzmatów dostosuj suwak pod tą tarczą do apertury numerycznej soczewki.Aby uzyskać optymalne oświetlenie Köhlera, ustaw ostrość kondensora, aż krawędź przysłony kondensora stanie się najostrzejsza. Najostrzejsza krawędź to taka, w której granica między światłem a czernią jest najbardziej wyraźna lub najlepiej wyostrzona. Aby uzyskać optymalny kontrast, wyreguluj ściankę aperturową i pryzmę, obracając pokrętło suwaka.Mikroskop jest już niemal gotowy do użycia. Nadszedł czas, aby za pomocą programu MicroManager oraz oprogramowania otwartoźródłowego kontrolować dodatkowe parametry obrazowania na komputerze. Rozpocznij od ustawienia wzmocnienia kamery na zero.Następnie zmień ustawienia zapisu plików na format TIFF 8-bitowy zamiast 16-bitowego. Pliki TIFF mogą być później analizowane za pomocą oprogramowania open source, takiego jak Image J. W kolejnym kroku dostosuj poziom oświetlenia tak, aby najjaśniejsze piksele znajdowały się tuż poniżej poziomu nasycenia. Jeśli wszystkie czynności zostały wykonane prawidłowo, obraz będzie sprawiał wrażenie trójwymiarowego, z efektem światła padającego pod kątem.Gdy obraz będzie już wyraźny, należy wybrać embriony przeznaczone do obrazowania i wyznaczyć obszar zainteresowania (ROI). Jeśli mikroskop jest wyposażony w silnik ostrości, należy go wykorzystać do zarejestrowania wielu płaszczyzn ogniskowych w każdym punkcie czasowym. Otwórz okno akwizycji wielowymiarowej i ustaw górną oraz dolną płaszczyznę stosu Z, regulując pokrętło ostrości tak, aby odnaleźć pierwszą i ostatnią płaszczyznę ogniskową, na której widoczne są ziarnistości żółtka.Ustaw wielkość kroku. Określi to liczbę rejestrowanych płaszczyzn ogniskowych. Następnie ustaw przedział czasowy wystarczająco długi, aby możliwe było zarejestrowanie wszystkich płaszczyzn ogniskowych.Maksymalny czas trwania może zostać ustawiony na bardzo wysoką wartość, tak aby oprogramowanie wykonywało zdjęcia aż do momentu ręcznego zatrzymania. Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby wyświetlało tylko ostatnio wykonane zdjęcie, co umożliwi monitorowanie procesu. Następnie nadaj plikom z obrazami nazwę i rozpocznij akwizycję zdjęć.Analiza obrazów zostanie krótko omówiona na końcu następnej sekcji. Tworzenie filmu z GFP przypomina tworzenie filmu 4D w DIC, jednak stosowany jest plik konfiguracyjny obejmujący sterowanie programowe migawką fluorescencyjną. Po zlokalizowaniu embrionów należy upewnić się, że górny pryzmat nie znajduje się na drodze światła, a następnie przełączyć kostkę filtra na F-I-T-C-G-F-P.Jeśli nie zostało to ustawione automatycznie podczas uruchamiania oprogramowania, upewnij się, że wzmocnienie kamery jest ustawione na 255. Plik obrazu zostaje ustawiony w formacie 16-bitowym tiff. Teraz wyłącz źródło światła przechodzącego i kliknij obrazowanie na żywo.Dostosuj natężenie źródła światła UV oraz czas ekspozycji, aby uzyskać korzystny stosunek sygnału do szumu dla sygnału fluorescencyjnego, dbając jednocześnie o to, by ekspozycja na światło była minimalna w celu zachowania żywotności komórek. Następnie ustaw odstępy czasowe, liczbę punktów czasowych oraz liczbę płaszczyzn ogniskowych, a następnie przystąp do akwizycji obrazów zgodnie z wcześniejszym opisem.Do analizy filmów należy użyć oprogramowania open source. Image J z zainstalowaną wtyczką micromanager. Bardzo duże filmy można również zaimportować do Image J za pomocą wtyczki loci. Przedstawiony zarodek typu dzikiego został zarejestrowany przy użyciu nor masky i optyki DIC.Tył znajduje się w prawym dolnym rogu, a strona brzuszna w lewym dolnym rogu. Film przedstawia sekwencję obrazów z jednej płaszczyzny ogniskowej, rejestrowanych co 15 sekund. Szybkość odtwarzania wynosi 14 klatek na sekundę.Zarodek ten wykazuje fluorescencję podczas pierwszego podziału embrionalnego; koniec tylny znajduje się w prawym górnym rogu. Film przedstawia zmiany w jednej płaszczyźnie ogniskowania co 10 sekund. Po obejrzeniu tego materiału powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat obrazowania żywych zarodków z wykorzystaniem optyki DIC Naski oraz epi-fluorescencji w celu badania zjawisk dynamicznych.Mamy nadzieję, że lepiej rozumieją Państwo sposób konfiguracji optyki DIC Nomar w celu uzyskania optymalnych obrazów i zdali sobie sprawę, że wysokiej jakości dane fluorescencyjne można uzyskać dzięki oświetleniu epifluorescencyjnemu, nie będąc zawsze zależnym od bardziej zaawansowanych mikroskopów. Można również zastosować te techniki obrazowania do badania zarodków pozbawionych funkcji konkretnych genów, aby dalej badać wymagania genetyczne dla wybranych zdarzeń podczas podziału komórek lub rozwoju.

imaging-c-elegans-embryos-using-an-epifluorescent-microscope-open

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie C. elegans Zarodków przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania open source

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Ten protokół opisuje konfigurację mikroskopu z arkuszem świetlnym i jego implementację do obrazowania in vivo zarodków C. elegans.

Konfiguracja prostego mikroskopu z arkuszami świetlnymi do obrazowania in toto rozwoju C. elegans

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i montażu zarodków Caenorhabditis elegans, rejestrowania rozwoju pod mikroskopem 4D i śledzenia linii komórkowej.

Mikroskopia 4D: odkrywanie rozwoju embrionalnego Caenorhabditis elegans za pomocą mikroskopii Nomarskiego

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Naucz się obrazowania zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopii DIC i fluorescencji z oprogramowaniem open-source. Ten protokół pokazuje przygotowanie próbek, kalibrację optyki i analizę dynamiki komórkowej w żywych organizmach.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Przeglądaj więcej filmów