Name: Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z znakowaniem fluorescencyjnym skierowanym w miejsce (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Poznaj metodę badania dynamiki konformacyjnej białek błonowych z znakowaniem fluorescencyjnym skierowanym w miejsce na powierzchni pojedynczych komórek. Technika ta pozwala korelować zmiany intensywności fluorescencji z kinetyką transportu jonów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Cole, K. S., Moore, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+Ion+Current+in+the+Squid+Giant+Axon%3A+Dynamic+Characteristic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Potassium Ion Current in the Squid Giant Axon: Dynamic Characteristic.</a> Biophys. J. 1, 1-14 (1960).</li>
<li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+voltage+clamp+to+record+small%2C+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li>
<li>Dempski, R. E., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+subunit+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+follows+the+conformational+state+of+the+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme.</a> J. Gen. Physiol. 125, 505-520 (2005).</li>
<li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> BBA - Biomembranes. 1465, 343-358 (2000).</li>
<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Voltage-Dependent+Conformational+Changes+in+the+Shaker+K%2B+Channel+with+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterizing Voltage-Dependent Conformational Changes in the Shaker K+ Channel with Fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li>
<li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Physical+Measure+of+Conformational+Rearrangement+Underlying+Potassium+Channel+Gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Physical Measure of Conformational Rearrangement Underlying Potassium Channel Gating.</a> Science. 271, 213-216 (1996).</li>
<li>Koch, H. P., Larsson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+molecular+motions+accomplish+glutamate+uptake+in+human+glutamate+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Small-scale molecular motions accomplish glutamate uptake in human glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 25, 1730-1736 (2005).</li>
<li>Dempski, R. E., Hartung, K., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorometric+Measurements+of+Intermolecular+Distances+between+the+%CE%B1-+and+%CE%B2-Subunits+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorometric Measurements of Intermolecular Distances between the α- and β-Subunits of the Na+/K+-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 281, 36338-36338 (2006).</li>
<li>Geys, S. A., Bamberg, E., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-Dependent+Effects+on+the+Conformational+Equilibrium+of+the+Na%2B%2CK%2B-ATPase+As+Monitored+by+Voltage+Clamp+Fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ligand-Dependent Effects on the Conformational Equilibrium of the Na+,K+-ATPase As Monitored by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Biophys. J. 96, 4561-4561 (2009).</li>
<li>Geibel, S., Kaplan, J. H., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Dynamics+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+Probed+by+Voltage+Clamp+Fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Conformational Dynamics of the Na+/K+-ATPase Probed by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 964-969 (2003).</li>
<li>Lorenz, L., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li>
<li>Mruk, K., Kobertz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+Novel+Activator+of+KCNQ1-KCNE1+K%2B+Channel+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Discovery of a Novel Activator of KCNQ1-KCNE1 K+ Channel Complexes.</a> Biophys. J. 177a, (2009).</li>
<li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+diplaying+the+hydropathic+character+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for diplaying the hydropathic character of a protein.</a> J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).</li>
<li>Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+movement+by+the+Na%2FK+pump+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes.</a> J. Gen. Physiol. 101, 117-144 (1993).</li>
<li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85, 564-569 (2009).</li>
<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+implications+of+fluorescence+quenching+in+the+Shaker+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Structural implications of fluorescence quenching in the Shaker K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 112, 391-391 (1998).</li>
<li>Förster, T. Ann Physik. 2, 55-75 (1948).</li>
<li>Dong, X., Stothard, P., Forsythe, I. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PlasMapper%3A+a+web+server+for+drawing+and+auto-annotating+plasmid+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PlasMapper: a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps.</a> Nucleic Acids Res. 32, W660-W664 (2004).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Opisane przez nas podejście eksperymentalne łączy specyficzne dla danej lokalizacji znakowanie fluoroforem oraz metodę clampowania napięcia z użyciem dwóch elektrod, aby zbadać związek między strukturą a funkcją białek błonowych. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania informacji o rozdzielczości czasowej na temat dynamiki konformacyjnej białek błonowych podczas transportu jonów. Co więcej, podejście to można dostosować do pracy z różnymi białkami, takimi jak pompy jonowe, kanały jonowe i transportery.
Oprócz badania dynamiki konformacyjnej w konkretnym residuum, możliwe jest również wykorzystanie transferu energii rezonansowej fluorescencji do określenia ograniczeń odległości w obrębie holoenzymu. Wyznaczanie odległości między residuami, a także pomiar względnego ruchu między podjednostkami, może pomóc w rozwiązaniu kluczowych pytań dotyczących mechanizmów bramkowania.

<table><tbody><tr><td>Źródło światła wolframowego 100W</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1B150F-4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.0-4.0 Ethicon Vicryl</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr wzbudzenia 475AF40</td><td>Omega Optical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne 505DRLP</td><td>Omega Optical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macherey-Nagel</td><td>Omega Optical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr wzbudzenia 535DF50</td><td>Omega Optical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne 560DRLP</td><td>Omega Optical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisji 565ALP</td><td>Omega Optical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisji 565EFLP</td><td>Omega Optical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne 570DRLP</td><td>Omega Optical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linos Phtonics Inc.</td><td>Omega Optical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Axio Examiner</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warner Instruments</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System akwizycji danych Digidata 1440A</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dpn I</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fluoresceina-5-maleimid</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji PCR High-Pure</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw mMessage mMachine</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji plazmidów Nucleospin</td><td>Macherey-Nagel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica mikropipet PC-10</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie pCLAMP 10</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA PfuTurbo</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotodioda PIN-022A</td><td>United Detector Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtry polaryzacyjne</td><td>Linos Phtonics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej QuickChange</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora fluorescencyjna RC-10</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tetrametylorodamina-6-maleimid</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komórki elektrokompetentne TOP10</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz Turbo Tec-05X</td><td>npi electronic</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Elektrofizjologia z użyciem dwuodsłonowej metody zaciskania napięcia (TEVC) jest potężnym narzędziem do badania mechanizmów transportu jonowego1 dla szerokiej gamy białek błonowych, w tym kanałów jonowych2, pomp jonowych3 oraz transporterów4. Ostatnie osiągnięcia połączyły swoiste znakowanie fluoroforami z metodą TEVC, aby jednocześnie badać dynamikę konformacyjną w konkretnych resztach aminokwasowych oraz funkcję tych białek na powierzchni pojedynczych komórek.
Opiszemy metodę badania dynamiki konformacyjnej białek błonowych poprzez jednoczesne monitorowanie zmian fluorescencji i prądu z wykorzystaniem fluorometrii z zaciskiem napięcia (voltage-clamp fluorometry). Podejście to może być wykorzystane do badania ruchów molekularnych białek błonowych w konkretnych miejscach po zastąpieniu cysteiny i specyficznie ukierunkowanym znakowaniu fluoroforami5,6. Ponadto metoda ta umożliwia wyznaczenie ograniczeń odległości między konkretnymi resztami7,8. Osiąga się to poprzez selektywne przyłączenie fluoroforów donora i akceptora do dwóch wybranych zmutowanych reszt cysteiny.
Krótko mówiąc, eksperymenty te są przeprowadzane po funkcjonalnej ekspresji pożądanego białka na powierzchni oocytów Xenopus laevis. Duża powierzchnia tych oocytów umożliwia łatwe pomiary funkcjonalne i uzyskanie silnego sygnału fluorescencyjnego5. Możliwa jest również szybka zmiana warunków zewnątrzkomórkowych, takich jak pH, ligandy lub kationy/aniony, co może dostarczyć dodatkowych informacji na temat mechanizmu działania białek błonowych4. Wreszcie, ostatnie osiągnięcia umożliwiły manipulację wybranymi jonami wewnętrznymi po koekspresji z drugim białkiem9.
Nasz protokół został opisany w kilku częściach. Po pierwsze, przeprowadzono mutagenezę skanującą cysteiną, a następnie znakowanie fluoroforami reszt znajdujących się na styku domen transbłonowej i zewnątrzkomórkowej. Kolejne eksperymenty zostały zaprojektowane w celu zidentyfikowania reszt wykazujących znaczne zmiany natężenia fluorescencji (&lt;5%)3 podczas zmiany konformacyjnej białka. Po drugie, zmiany te w natężeniu fluorescencji są porównywane z parametrami kinetycznymi białka błonowego, aby skorelować dynamikę konformacyjną z funkcją białka10. Umożliwia to rygorystyczną analizę biofizyczną ruchu molekularnego białka docelowego. Na koniec, dwie reszty holoenzymu mogą zostać znakowane fluoroforem donorem i akceptorem w celu określenia ograniczeń odległości przy użyciu metod fotodestrukcji donora. Możliwe jest również monitorowanie względnego ruchu podjednostek białka po znakowaniu fluoroforem donorem i akceptorem.

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Elektrofizjologia z użyciem dwuelektrodowego zacisku napięciowego (TEVC) jest potężnym narzędziem do badania mechanizmów transportu jonowego1 dla szerokiej gamy białek błonowych ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego na powierzchni pojedynczych komórek. Osiąga się to poprzez wstępne wprowadzenie pojedynczych mutacji reszt na styku domen pozakomórkowej i transbłonowej na cysteinę, co zasygnalizowano czerwonym C. Następnie należy określić, czy reszta ta może zostać oznakowana fluoroforem reagującym z cysteiną. Drugim krokiem procedury jest zbadanie, czy mutogeneza cysteinowa i/lub znakowanie fluoroforem wpływa na kinetykę i/lub stan konformacyjny białka.Procedurę tę wykonuje się przy użyciu przedstawionego układu. Trzecim krokiem procedury jest porównanie i zestawienie zmian natężenia fluorescencji z parametrami kinetycznymi białka docelowego. Tutaj przedstawiono typowy zapis fluorescencji.Ostatnim krokiem procedury jest znakowanie zmutowanych par cysteiny za pomocą donorowych Fluor fours lub par donor-akceptor Fluor fours w celu pomiaru szybkości fotodestrukcji równolegle z pomiarami metodą clampa napięciowego, aby określić ograniczenia dystansu. Na tej rycinie szybkość fotodestrukcji donora w obecności akceptora przedstawiono kolorem czarnym, a szybkość fotodestrukcji donora w obecności akceptora – kolorem czerwonym. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące, że zmiany intensywności fluorescencji, będące wynikiem zmian konformacyjnych białek, mogą być korelowane z funkcją białek błonowych za pomocą fluorometrii z clampem napięciowym.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu transportu jonów przez błony, takie jak wpływ zmian stanu konformacyjnego białka na ułatwienie transportu małych cząsteczek i jonów przez błonę komórkową. Procedurę należy rozpocząć od klonowania pompy sodowo-potasowej do wektora odpowiedniego dla ekspresji w oocytach Xenopus laevis. Następnym krokiem jest wprowadzenie mutacji cysteinowych w resztach zlokalizowanych na styku domen transbłonowej i zewnątrzkomórkowej, zgodnie z opisem w towarzyszącym artykule.Po zakończeniu należy potwierdzić wstawienie mutacji za pomocą sekwencjonowania DNA po transkrypcji plazmidowego DNA do mRNA, zgodnie z opisem w towarzyszącym artykule, a następnie określić ilość uzyskanego mRNA za pomocą spektrofotometru przed operacją. Żaba powinna być głodzona przez 12 godzin, aby zapobiec wymiotom podczas zabiegu. Aby rozpocząć operację następnego dnia, należy zanurzyć żabę w roztworze anestetyka, aż przestanie ona reagować na uciśnięcie palca.Wyjmij żabę z roztworu anestetycznego i połóż ją stroną grzbietową w dół na chłonnej stronie podkładu pieluchomajowego. Połóż na żabie mokry ręcznik papierowy, aby utrzymać jej wilgotność. Ponadto, jeśli oczy żaby są otwarte, nawilżaj je roztworem soli fizjologicznej.Wykonaj niewielkie nacięcie wzdłuż linii środkowej żaby z jednej strony. Zlokalizuj jajnik i wyciągnij go na zewnątrz ciała żaby. Unikaj kontaktu jajnika ze skórą.Usuń jajnik i umieść go w szalce Petriego zawierającej roztwór Ringera. Sprawdź, czy w pozostałej tkance występuje krwawienie, przed umieszczeniem jej z powrotem w jamie brzusznej. W przypadku wystąpienia krwawienia wywieraj ucisk za pomocą sterylnego patyczka higienicznego do czasu jego ustąpienia.Zakończ operację, zaszywając nacięcie za pomocą szwów przerywanych. Przenieś żabę do terrarium, aby mogła dojść do siebie po znieczuleniu, używając nożyczek. Podziel wyizolowany płat jajnika na mniejsze części.Przenieś grudki do roztworu Ringera z dodatkiem wapnia i kolagenazą. Następnie delikatnie wstrząsaj roztwór trawienny przez dwie godziny w temperaturze 18 °C. Gdy większość cytów zostanie oddzielona, przemyj oocyty roztworem Ringera bez wapnia.Następnie inkubuj oocyty przez 10 minut w roztworze Ringera bez wapnia w temperaturze pokojowej. Na tym etapie dokładnie przemyj komórki w roztworze Ringera z dodatkiem wapnia. Następnie przenieś oocyty do roztworu Ringera z wapniem w celu ich przechowywania przed iniekcją.W następnym kroku wyjmij zsyntetyzowane mRNA z zamrażarki ustawionej na -20°C. Dodaj 25 ng mRNA do objętości końcowej 50 nl. Następnie wstrzyknij mRNA do cytoplazmy komórek.Umieścić oocyty w roztworze Ringera z dodatkiem 1 mg/mL gentamycyny i inkubować je w temperaturze 18 °C w ciemności przez okres od trzech do siedmiu dni. Pozwala to na ekspresję pompy sodowo-potasowej w błonie plazmatycznej oocytu. W dniu eksperymentu wyjąć oocyty z inkubatora, umieścić je w buforze ładującym na 45 minut, a następnie w buforze poladowym na 45 minut.Zwiększa to wewnątrzkomórkowe stężenie sodu, aby ułatwić pomiar pracy pompy sodowo-potasowej. W przypadku pomiarów fluorescencyjnych inkubuj oocyty w buforze po ładowaniu zawierającym 5 µM wybranego fluoroforu, takiego jak TMRM lub FM, przez 5 do 10 minut w ciemności. Po znakowaniu fluoroforem dokładnie przemyj oocyty buforem po ładowaniu niezawierającym barwnika.Przechowywać oocyty w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu. W celu przygotowania do pomiarów metodą clampy napięciowej z użyciem dwóch elektrod, należy najpierw napełnić mikroelektrody roztworem KCl o stężeniu 3 M i sprawdzić ich oporność. Oporność powinna mieścić się w zakresie od 0,5 do 1,5 MΩ.W przypadku eksperymentów z mapowaniem cystein (cysteine scanning), wyposażyć mikroskop fluorescencyjny w filtr wzbudzenia 5 35 DF 50, filtr emisyjny 5 65 EFLP oraz lustro dichroiczne pięć 70 DRLP. Następnie umieścić oocyt w komorze RC 10 na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Następnie delikatnie wprowadzić obie mikroelektrody do oocytu, używając wzmacniacza do utrzymania potencjału błonowego na stałym poziomie.Zmierz strumień jonowy przez błonę, aktywując białko za pomocą odpowiedniej techniki, takiej jak wymiana roztworu lub zmiana potencjału błonowego. W przypadku jednoczesnych pomiarów fluorescencji użyj wolframowego źródła światła o mocy 100 W do wzbudzenia fluoroforu donora oraz 0 2 2, A photo DDE do wykrywania zmian natężenia fluorescencji w przypadku znakowania fluorescencyjnego. Następnie przeprowadź skanowanie cysteinowe.Zmierz zmianę intensywności fluorescencji przy prądzie stacjonarnym, stosując skoki napięcia kontrolowane przez oprogramowanie P clamp 10. Druga część protokołu obejmuje wykonywanie pomiarów anizotropii wraz z pomiarami odległości. Aby obliczyć zakres wartości kappa kwadrat, pomiar anizotropii określa względną mobilność fluoroforu wynikającą z rotacji.Szczegóły obliczeń znajdują się w towarzyszącym artykule. Do pomiaru ograniczeń odległości należy użyć holoenzymu, który posiada dwie dostępne pozakomórkowe reszty cysteiny, które można znakować fluoroforami. Dodać bufor do ładowania zawierający 1 µM FM i 4 µM TMRM.To jest donor i akceptor. Do jednej partii oocytów dodajemy tylko 1 µM FM. Jest to wyłącznie donor fluorescencyjny.Przygotuj kolejną partię oocytów. Inkubuj obie partie oocytów na lodzie przez 30 minut w ciemności. Pozwala to na przeprowadzenie pomiarów enzymów holo znakowanych z akceptorem fluoroforu i bez niego. Następnie wyposaż mikroskop w filtr wzbudzenia 475 DF 40, filtr emisyjny 530 DF 30 oraz lustro dichroiczne 505 DRLP.Następnie umieść oocyt w komorze na stole mikroskopu fluorescencyjnego. Przy zachowaniu ciągłego przepływu roztworu zmierz zależność czasu od wygaszania donora w obecności i w nieobecności flory akceptora. Wyniki te można wykorzystać do obliczenia odległości między dwoma resztami w pompie sodowo-potasowej, wykorzystując metodę Förstera.Pomiary metodą clampowania napięcia za pomocą dwóch elektrod powinny być wykonywane równolegle, aby upewnić się, że białko jest funkcjonalne. Wykorzystując funkcję clamp X w programie P clamp 10, należy wyciągnąć średnią z wyników fotodestrukcji fluoroforu donora dla minimum czterech zapisów z jednego miejsca wiązania. Aby zmierzyć wzglóźny ruch podjednostek białka, należy zastosować konstrukty z podwójną cysteiną zawierające fluorofory akceptora i donora.Intensywność fluorescencji w tych resztach jest niewrażliwa na stan konformacyjny białka i będzie funkcją odległości między dwiema fluoroforami. Następnie zmień zestaw filtrów w mikroskopie na filtr wzbudzenia 475 a F 40, filtr emisyjny 595 a F 60 oraz lustro dichroniczne 505 DRLP. Następnie umieść OI w komorze na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego.Następnie donor jest pobudzany za pomocą wolframowego źródła światła o mocy 100 watt, a następnie mierzy się intensywność fluorescencji akceptora. Fluoro four jest mierzone przy użyciu odpowiedniej metody, takiej jak ligand napięciowy lub wymiana roztworu, aktywując białko błonowe i jednocześnie mierząc zmianę intensywności fluorescencji. Rycina ta przedstawia korelację transportu jonów przez błonę komórkową oraz zmian intensywności fluorescencji.Górny ślad przedstawia pomiary w trybie clampy prądowej w obecności testowego roztworu sodu oraz testowego roztworu potasu w obecności 10 micromolar i 10 millimolar ing. Dolny ślad pokazuje zmiany intensywności fluorescencji mierzonej równolegle z pomiarami w trybie clampy prądowej. Rysunek przedstawia dwa oocyty oznakowane TMRM, akceptorem fluoroforu cztery.Oocyt po lewej stronie wykazuje ekspresję dzikiego typu pompy sodowo-potasowej ATPazy, podczas gdy oocyt po prawej stronie wykazuje ekspresję ATPazy sodowo-potasowej z jedną dostępną resztą cysteiny. Górne ślady na tym rysunku przedstawiają dane dotyczące prądu przejściowego po impulsie napięcia. Dolne ślady przedstawiają zapisy zmian intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym po impulsie napięcia.Rysunek ten przedstawia zależność czasową fotobleachingu; fotodestrukcję donora mierzy się w obecności oraz w nieobecności akceptora fluoro four. Fotobleaching zachodzi szybciej w przypadku braku akceptora fluoro four. Każdy ślad jest średnią z czterech pomiarów w obrębie miejsca oh. Rysunek ten przedstawia względny ruch podjednostek podczas zmian konformacyjnych.Zmiany fluorescencji przedstawiono na czerwonych liniach, a przepływ prądu na czarnych liniach. Wzrost intensywności fluorescencji widoczny po lewej stronie wskazuje na to, że podłogi fluorowe zbliżają się do siebie. Brak zmian intensywności fluorescencji widoczny w środku wskazuje, że odległość między podłogami fluorowymi pozostaje stała.Spadek intensywności fluorescencji pokazany po prawej stronie wskazuje, że fluorofory oddalają się od siebie. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o powiązaniu zmian w kinetycznej i stacjonarnej intensywności fluorescencji ze zmianami konformacyjnymi białka.

examining-conformational-dynamics-membrane-proteins-situ-with-site

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem skierowanego na miejsce znaczników fluorescencyjnych

Niniejszy artykuł wideo szczegółowo opisuje procedurę eksperymentalną służącą do wyznaczenia energii swobodnej Gibbsa fałdowania białek błonowych za pomocą fluorescencji tryptofanu.

Termodynamika fałdowania białek błonowych pomierzona za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Opisujemy tutaj ulepszoną metodę transferu energii rezonansu luminescencji (LRET), w której wprowadzamy miejsce rozszczepienia proteazy między miejscem fluoroforu dawcy i akceptora. Modyfikacja ta pozwala na uzyskanie specyficznych sygnałów LRET pochodzących z interesujących nas białek błonowych, co pozwala na badanie białek błonowych bez oczyszczania białek.

Transfer energii rezonansu luminescencyjnego w celu zbadania zmian konformacyjnych w białkach błonowych ulegających ekspresji w komórkach ssaków

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Tutaj prezentujemy protokół do określenia orientacji i topologii integralnych białek błonowych w żywych komórkach. Ten prosty protokół opiera się na selektywnej wrażliwości chimer na proteazę między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a GFP.

Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP)

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj metodę badania dynamiki konformacyjnej białek błonowych z znakowaniem fluorescencyjnym skierowanym w miejsce na powierzchni pojedynczych komórek. Technika ta pozwala korelować zmiany intensywności fluorescencji z kinetyką transportu jonów.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Przeglądaj więcej filmów