Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego na powierzchni pojedynczych komórek. Osiąga się to poprzez wstępne wprowadzenie pojedynczych mutacji reszt na styku domen pozakomórkowej i transbłonowej na cysteinę, co zasygnalizowano czerwonym C. Następnie należy określić, czy reszta ta może zostać oznakowana fluoroforem reagującym z cysteiną. Drugim krokiem procedury jest zbadanie, czy mutogeneza cysteinowa i/lub znakowanie fluoroforem wpływa na kinetykę i/lub stan konformacyjny białka.

Procedurę tę wykonuje się przy użyciu przedstawionego układu. Trzecim krokiem procedury jest porównanie i zestawienie zmian natężenia fluorescencji z parametrami kinetycznymi białka docelowego. Tutaj przedstawiono typowy zapis fluorescencji.

Ostatnim krokiem procedury jest znakowanie zmutowanych par cysteiny za pomocą donorowych Fluor fours lub par donor-akceptor Fluor fours w celu pomiaru szybkości fotodestrukcji równolegle z pomiarami metodą clampa napięciowego, aby określić ograniczenia dystansu. Na tej rycinie szybkość fotodestrukcji donora w obecności akceptora przedstawiono kolorem czarnym, a szybkość fotodestrukcji donora w obecności akceptora – kolorem czerwonym. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące, że zmiany intensywności fluorescencji, będące wynikiem zmian konformacyjnych białek, mogą być korelowane z funkcją białek błonowych za pomocą fluorometrii z clampem napięciowym.

Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu transportu jonów przez błony, takie jak wpływ zmian stanu konformacyjnego białka na ułatwienie transportu małych cząsteczek i jonów przez błonę komórkową. Procedurę należy rozpocząć od klonowania pompy sodowo-potasowej do wektora odpowiedniego dla ekspresji w oocytach Xenopus laevis. Następnym krokiem jest wprowadzenie mutacji cysteinowych w resztach zlokalizowanych na styku domen transbłonowej i zewnątrzkomórkowej, zgodnie z opisem w towarzyszącym artykule.

Po zakończeniu należy potwierdzić wstawienie mutacji za pomocą sekwencjonowania DNA po transkrypcji plazmidowego DNA do mRNA, zgodnie z opisem w towarzyszącym artykule, a następnie określić ilość uzyskanego mRNA za pomocą spektrofotometru przed operacją. Żaba powinna być głodzona przez 12 godzin, aby zapobiec wymiotom podczas zabiegu. Aby rozpocząć operację następnego dnia, należy zanurzyć żabę w roztworze anestetyka, aż przestanie ona reagować na uciśnięcie palca.

Wyjmij żabę z roztworu anestetycznego i połóż ją stroną grzbietową w dół na chłonnej stronie podkładu pieluchomajowego. Połóż na żabie mokry ręcznik papierowy, aby utrzymać jej wilgotność. Ponadto, jeśli oczy żaby są otwarte, nawilżaj je roztworem soli fizjologicznej.

Wykonaj niewielkie nacięcie wzdłuż linii środkowej żaby z jednej strony. Zlokalizuj jajnik i wyciągnij go na zewnątrz ciała żaby. Unikaj kontaktu jajnika ze skórą.

Usuń jajnik i umieść go w szalce Petriego zawierającej roztwór Ringera. Sprawdź, czy w pozostałej tkance występuje krwawienie, przed umieszczeniem jej z powrotem w jamie brzusznej. W przypadku wystąpienia krwawienia wywieraj ucisk za pomocą sterylnego patyczka higienicznego do czasu jego ustąpienia.

Zakończ operację, zaszywając nacięcie za pomocą szwów przerywanych. Przenieś żabę do terrarium, aby mogła dojść do siebie po znieczuleniu, używając nożyczek. Podziel wyizolowany płat jajnika na mniejsze części.

Przenieś grudki do roztworu Ringera z dodatkiem wapnia i kolagenazą. Następnie delikatnie wstrząsaj roztwór trawienny przez dwie godziny w temperaturze 18 °C. Gdy większość cytów zostanie oddzielona, przemyj oocyty roztworem Ringera bez wapnia.

Następnie inkubuj oocyty przez 10 minut w roztworze Ringera bez wapnia w temperaturze pokojowej. Na tym etapie dokładnie przemyj komórki w roztworze Ringera z dodatkiem wapnia. Następnie przenieś oocyty do roztworu Ringera z wapniem w celu ich przechowywania przed iniekcją.

W następnym kroku wyjmij zsyntetyzowane mRNA z zamrażarki ustawionej na -20°C. Dodaj 25 ng mRNA do objętości końcowej 50 nl. Następnie wstrzyknij mRNA do cytoplazmy komórek.

Umieścić oocyty w roztworze Ringera z dodatkiem 1 mg/mL gentamycyny i inkubować je w temperaturze 18 °C w ciemności przez okres od trzech do siedmiu dni. Pozwala to na ekspresję pompy sodowo-potasowej w błonie plazmatycznej oocytu. W dniu eksperymentu wyjąć oocyty z inkubatora, umieścić je w buforze ładującym na 45 minut, a następnie w buforze poladowym na 45 minut.

Zwiększa to wewnątrzkomórkowe stężenie sodu, aby ułatwić pomiar pracy pompy sodowo-potasowej. W przypadku pomiarów fluorescencyjnych inkubuj oocyty w buforze po ładowaniu zawierającym 5 µM wybranego fluoroforu, takiego jak TMRM lub FM, przez 5 do 10 minut w ciemności. Po znakowaniu fluoroforem dokładnie przemyj oocyty buforem po ładowaniu niezawierającym barwnika.

Przechowywać oocyty w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu. W celu przygotowania do pomiarów metodą clampy napięciowej z użyciem dwóch elektrod, należy najpierw napełnić mikroelektrody roztworem KCl o stężeniu 3 M i sprawdzić ich oporność. Oporność powinna mieścić się w zakresie od 0,5 do 1,5 MΩ.

W przypadku eksperymentów z mapowaniem cystein (cysteine scanning), wyposażyć mikroskop fluorescencyjny w filtr wzbudzenia 5 35 DF 50, filtr emisyjny 5 65 EFLP oraz lustro dichroiczne pięć 70 DRLP. Następnie umieścić oocyt w komorze RC 10 na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Następnie delikatnie wprowadzić obie mikroelektrody do oocytu, używając wzmacniacza do utrzymania potencjału błonowego na stałym poziomie.

Zmierz strumień jonowy przez błonę, aktywując białko za pomocą odpowiedniej techniki, takiej jak wymiana roztworu lub zmiana potencjału błonowego. W przypadku jednoczesnych pomiarów fluorescencji użyj wolframowego źródła światła o mocy 100 W do wzbudzenia fluoroforu donora oraz 0 2 2, A photo DDE do wykrywania zmian natężenia fluorescencji w przypadku znakowania fluorescencyjnego. Następnie przeprowadź skanowanie cysteinowe.

Zmierz zmianę intensywności fluorescencji przy prądzie stacjonarnym, stosując skoki napięcia kontrolowane przez oprogramowanie P clamp 10. Druga część protokołu obejmuje wykonywanie pomiarów anizotropii wraz z pomiarami odległości. Aby obliczyć zakres wartości kappa kwadrat, pomiar anizotropii określa względną mobilność fluoroforu wynikającą z rotacji.

Szczegóły obliczeń znajdują się w towarzyszącym artykule. Do pomiaru ograniczeń odległości należy użyć holoenzymu, który posiada dwie dostępne pozakomórkowe reszty cysteiny, które można znakować fluoroforami. Dodać bufor do ładowania zawierający 1 µM FM i 4 µM TMRM.

To jest donor i akceptor. Do jednej partii oocytów dodajemy tylko 1 µM FM. Jest to wyłącznie donor fluorescencyjny.

Przygotuj kolejną partię oocytów. Inkubuj obie partie oocytów na lodzie przez 30 minut w ciemności. Pozwala to na przeprowadzenie pomiarów enzymów holo znakowanych z akceptorem fluoroforu i bez niego. Następnie wyposaż mikroskop w filtr wzbudzenia 475 DF 40, filtr emisyjny 530 DF 30 oraz lustro dichroiczne 505 DRLP.

Następnie umieść oocyt w komorze na stole mikroskopu fluorescencyjnego. Przy zachowaniu ciągłego przepływu roztworu zmierz zależność czasu od wygaszania donora w obecności i w nieobecności flory akceptora. Wyniki te można wykorzystać do obliczenia odległości między dwoma resztami w pompie sodowo-potasowej, wykorzystując metodę Förstera.

Pomiary metodą clampowania napięcia za pomocą dwóch elektrod powinny być wykonywane równolegle, aby upewnić się, że białko jest funkcjonalne. Wykorzystując funkcję clamp X w programie P clamp 10, należy wyciągnąć średnią z wyników fotodestrukcji fluoroforu donora dla minimum czterech zapisów z jednego miejsca wiązania. Aby zmierzyć wzglóźny ruch podjednostek białka, należy zastosować konstrukty z podwójną cysteiną zawierające fluorofory akceptora i donora.

Intensywność fluorescencji w tych resztach jest niewrażliwa na stan konformacyjny białka i będzie funkcją odległości między dwiema fluoroforami. Następnie zmień zestaw filtrów w mikroskopie na filtr wzbudzenia 475 a F 40, filtr emisyjny 595 a F 60 oraz lustro dichroniczne 505 DRLP. Następnie umieść OI w komorze na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego.

Następnie donor jest pobudzany za pomocą wolframowego źródła światła o mocy 100 watt, a następnie mierzy się intensywność fluorescencji akceptora. Fluoro four jest mierzone przy użyciu odpowiedniej metody, takiej jak ligand napięciowy lub wymiana roztworu, aktywując białko błonowe i jednocześnie mierząc zmianę intensywności fluorescencji. Rycina ta przedstawia korelację transportu jonów przez błonę komórkową oraz zmian intensywności fluorescencji.

Górny ślad przedstawia pomiary w trybie clampy prądowej w obecności testowego roztworu sodu oraz testowego roztworu potasu w obecności 10 micromolar i 10 millimolar ing. Dolny ślad pokazuje zmiany intensywności fluorescencji mierzonej równolegle z pomiarami w trybie clampy prądowej. Rysunek przedstawia dwa oocyty oznakowane TMRM, akceptorem fluoroforu cztery.

Oocyt po lewej stronie wykazuje ekspresję dzikiego typu pompy sodowo-potasowej ATPazy, podczas gdy oocyt po prawej stronie wykazuje ekspresję ATPazy sodowo-potasowej z jedną dostępną resztą cysteiny. Górne ślady na tym rysunku przedstawiają dane dotyczące prądu przejściowego po impulsie napięcia. Dolne ślady przedstawiają zapisy zmian intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym po impulsie napięcia.

Rysunek ten przedstawia zależność czasową fotobleachingu; fotodestrukcję donora mierzy się w obecności oraz w nieobecności akceptora fluoro four. Fotobleaching zachodzi szybciej w przypadku braku akceptora fluoro four. Każdy ślad jest średnią z czterech pomiarów w obrębie miejsca oh. Rysunek ten przedstawia względny ruch podjednostek podczas zmian konformacyjnych.

Zmiany fluorescencji przedstawiono na czerwonych liniach, a przepływ prądu na czarnych liniach. Wzrost intensywności fluorescencji widoczny po lewej stronie wskazuje na to, że podłogi fluorowe zbliżają się do siebie. Brak zmian intensywności fluorescencji widoczny w środku wskazuje, że odległość między podłogami fluorowymi pozostaje stała.

Spadek intensywności fluorescencji pokazany po prawej stronie wskazuje, że fluorofory oddalają się od siebie. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o powiązaniu zmian w kinetycznej i stacjonarnej intensywności fluorescencji ze zmianami konformacyjnymi białka.