Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z znakowaniem fluorescencyjnym skierowanym w miejsce

Opiszemy metodę, która mierzy kinetykę transportu jonów białek błonowych wraz z analizą zmian konformacyjnych specyficznych dla miejsca za pomocą fluorescencji na pojedynczych komórkach. Technika ta można dostosować do kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych i można ją wykorzystać do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białka.

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie dynamiki konfirmacyjnej białek błonowych z wykorzystaniem znakowania fluorescencyjnego skierowanego na miejsce na powierzchni pojedynczych komórek. Osiąga się to najpierw poprzez indywidualne mutowanie reszt na granicy domen zewnątrzkomórkowych i transbłonowych z cystyną, jak pokazano na czerwonym C.It jest następnie konieczne do określenia, czy ta reszta może być znakowana cystyną reagującą z fluorem czterema. Drugim krokiem procedury jest zbadanie, czy cystyna, mutageneza i/lub znakowanie fluorem czwartym wpływają na kinetykę i/lub stan potwierdzenia białka.

Odbywa się to za pomocą pokazanej konfiguracji. Trzecim krokiem procedury jest porównanie i zestawienie zmian intensywności fluorescencji z parametrami kinetycznymi białka docelowego. Pokazany jest tutaj typowy ślad fluorescencyjny

Ostatnim krokiem procedury jest znakowanie zmutowanych par cysteiny czwórkami fluoru donora lub czwórkami fluoru akceptora dawcy w celu zmierzenia szybkości fotoniszczenia w połączeniu z pomiarami cęgów napięcia w celu określenia ograniczeń odległości. Ten rysunek przedstawia wskaźniki niszczenia zdjęć dawcy w przypadku braku akceptora w kolorze czarnym, zniszczenie zdjęcia dawcy w obecności akceptora jest zaznaczone na czerwono. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują, że zmiany intensywności fluorescencji, które są wynikiem zmian potwierdzających białka, mogą być skorelowane z funkcją białka błonowego poprzez fluorometrię cęgów napięciowych.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie błonowego transportu jonów, takie jak to, w jaki sposób zmiany stanu potwierdzenia białka ułatwiają transport małych cząsteczek i jonów przez błonę plazmatyczną. Rozpocznij procedurę od sklonowania pompy sodowo-potasowej do wektora odpowiedniego dla postów xop, ekspresji oocytów Lavisa. Następnym krokiem jest wywołanie mutacji cysteiny w resztach znajdujących się na granicy między domenami transbłonowymi i zewnątrzkomórkowymi, jak opisano w towarzyszącym artykule.

Po zakończeniu sprawdź wprowadzenie mutacji przez sekwencjonowanie DNA po transkrypcji DNA osocza do mRNA, jak opisano w załączonym artykule, określ ilościowo wydajność mRNA za pomocą spektrofotometru przed operacją. Żaba powinna być na czczo przez 12 godzin, aby zapobiec wymiotom podczas operacji. Aby rozpocząć operację następnego dnia, zanurz żabę w roztworze znieczulającym, aż żaba przestanie reagować na uszczypnięcie palca u nogi.

Wyjmij żabę z roztworu znieczulającego i połóż ją grzbietem do dołu na chłonnej stronie wkładu do pieluchy. Połóż mokry ręcznik papierowy na żabie, aby żaba była wilgotna. Ponadto, jeśli oczy żaby są otwarte, utrzymuj je wilgotne roztworem soli fizjologicznej.

Wykonaj małe mimiczne nacięcie po jednej stronie linii środkowej żaby. Zlokalizuj jajnik i przynieś go na zewnątrz żaby. Unikaj dotykania jajnika do skóry.

Usunąć jajnik i umieścić go na szalce Petriego zawierającej roztwór Dzwonka. Sprawdź, czy pozostała tkanka nie ma krwawienia przed umieszczeniem jej z powrotem w jamie smic. Jeśli wystąpi krwawienie, uciskaj sterylną patyczkiem higienicznym, aż do ustania.

Zakończ operację, zszywając nacięcie za pomocą przerwanego wzoru szwów. Przywróć żabę do jej obudowy, aby wyzdrowiała ze znieczulenia za pomocą nożyczek. Podziel izolowany płat jajnika na mniejsze części.

Przenieś grudki do roztworu Ringera plus wapń z kolagenazą. Następnie delikatnie wstrząsaj roztworem trawiącym przez dwie godziny w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Gdy większość cytów zostanie oddzielona, przemyj oocyty roztworem Ringera minus wapń.

Następnie inkubuj oocyty przez 10 minut w roztworze dzwonka minus wapń w temperaturze pokojowej. W tym momencie dokładnie umyj cyty w obrączkach i roztworze wapnia. Następnie przenieś oocyty do roztworu Ringera wraz z wapniem w celu przechowywania przed wstrzyknięciem.

W następnym kroku pobierz zsyntetyzowane mRNA z zamrażarki o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Dodaj 25 nanogramów mRNA do końcowej objętości 50 nanolitrów. Następnie wstrzyknij mRNA do cytów po wstrzyknięciu.

Umieść oocyty w roztworze Ringera i jednym miligramie na mililitr gentamycyny i inkubuj je w temperaturze 18 stopni Celsjusza w ciemności przez trzy do siedmiu dni. Pozwala to na ekspresję pompy sodowo-potasowej w błonie plazmatycznej oocytów. W dniu doświadczenia należy wyjąć oocyty z inkubatora i umieścić je w buforze ładującym na 45 minut, a następnie w buforze po załadowaniu na 45 minut.

Zwiększa to wewnątrzkomórkowe stężenie sodu, aby ułatwić pomiar pompy sodowo-potasowej. W przypadku pomiarów fluorescencji inkubuj cyty w buforze po załadowaniu, który zawiera pięć mikromolów pożądanego fluoroforu, takiego jak TMRM lub FM, przez pięć do 10 minut w ciemności. Po znakowaniu flory czwartej, dokładnie umyj oocyty bezbarwnikowym buforem pocztowym.

Utrzymuj oocyty w ciemności, aby zapobiec wybielaniu zdjęć. Aby przygotować się do pomiaru napięcia cęgowego dwóch elektrod, należy rozpocząć od napełnienia mikroelektrod trzema molowymi roztworami chlorku potasu i sprawdzenia rezystancji. Rezystancja powinna wynosić od 0,5 do 1,5 mega oma.

W przypadku eksperymentów skaningowych z cysteiną należy wyposażyć mikroskop fluorescencyjny w filtr wzbudzenia 5 35 DF 50, filtr emisyjny 5 65 EFLP i zwierciadło diowe 5 70 DRLP. Następnie umieść oktę w komorze RC 10 na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Następnie delikatnie włóż obie mikroelektrody do okta za pomocą wzmacniacza, aby utrzymać potencjał membrany na stałym poziomie.

Zmierz strumień jonów przez błonę, aktywując białko za pomocą odpowiedniej techniki, takiej jak wymiana roztworu lub zmiana potencjału błony. Do jednoczesnych pomiarów fluorescencji użyj 100-watowego wolframowego źródła światła, aby wzbudzić fluorofor dawcy i przypiąć 0 2 2, zdjęcie DDE w celu wykrycia zmian intensywności fluorescencji do znakowania fluorescencyjnego. Po skanowaniu cysteiny.

Zmierz zmianę natężenia fluorescencji przy prądzie stacjonarnym za pomocą kroków napięcia, które są kontrolowane przez oprogramowanie P clamp 10. Druga część protokołu obejmuje wykonywanie pomiarów atropii anany wraz z pomiarami odległości. Aby obliczyć zakres wartości kappa do kwadratu, attropia mierzy względną ruchliwość fluoro four spowodowaną rotacją.

Szczegółowe informacje na temat obliczeń można znaleźć w załączonym artykule. Aby zmierzyć ograniczenia odległości, użyj enzymu holologicznego, który ma dwie dostępne zewnątrzkomórkowe reszty cysteiny, które można oznaczyć fluorowymi czwórkami. Dodać bufor po załadowaniu zawierający jeden mikromolowy FM i cztery mikromolowe TMRM.

To jest dawca i akceptor. Fluoro fours do jednej partii oocytów dodaje tylko jeden mikromolowy FM. To jest tylko dawca fluoro.

Cztery do drugiej partii oocytów inkubują obie partie oocytów na lodzie przez 30 minut w ciemności. Pozwala to na wykonywanie pomiarów enzymów hollo znakowanych akceptorem fluoro czwórki i bez niego. Następnie wyposaż mikroskop w filtr wzbudzenia 4 75 DF 40, filtr emisyjny 5 0 DF 30 i zwierciadło dichroiczne 5 0 5 DRLP.

Następnie umieść oocyt w komorze na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Utrzymując ciągły przepływ roztworu, zmierz zależność czasową bielenia dawcy w obecności i braku flory akceptorowej. Cztery. Wyniki te można wykorzystać do obliczenia odległości między dwiema pozostałościami na pompie sodowo-potasowej za pomocą leśniczego.

Równanie dwa pomiary napięcia cęgowego elektrody powinny być wykonywane jednocześnie, aby upewnić się, że białko jest funkcjonalne. Korzystając z funkcji zacisku X w zacisku P 10, uśrednij wyniki fotograficznego zniszczenia dawcy fluoro cztery dla co najmniej czterech nagrań miejsca oh. Aby zmierzyć względny ruch podjednostek białkowych, użyj podwójnych konstruktów cysteiny, które zawierają akceptorowe i donorowe czwórki fluorowe.

Intensywność fluorescencji w tych pozostałościach jest niewrażliwa na stan potwierdzenia białka i będzie funkcją odległości między dwiema czwórkami. Następnie zmień zestaw filtrów w mikroskopie na filtr wzbudzenia 4 75 a F 40, filtr emisyjny 5 95 a F 60 i zwierciadło dichroiczne 5 0 5 DRLP. Następnie umieść OI w komorze na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego.

Następnie dawca jest wzbudzany za pomocą 100-watowego wolframowego źródła światła i intensywności fluorescencji akceptora. Fluoro four mierzy się za pomocą odpowiedniej metody, takiej jak wymiana liganda napięciowego lub roztworu, aktywuje białko błonowe i jednocześnie mierzy zmianę intensywności fluorescencji. Rysunek ten pokazuje korelację transportu jonów przez błonę komórkową a zmianami intensywności fluorescencji.

Górna ścieżka pokazuje pomiary cęgów prądu w obecności roztworu testowego sodu i roztworu testowego potasu w obecności 10 mikromolowych i 10 milimolowych. Dolna ścieżka pokazuje zmiany intensywności fluorescencji mierzone w połączeniu z obecnymi pomiarami cęgowymi. Ten rysunek przedstawia dwa oocyty znakowane TMRM, akceptorem fluoru cztery.

Oocyt po lewej stronie wyraża atpa sodowo-potasowy typu dzikiego, podczas gdy oocyt po prawej stronie wyraża APA sodowo-potasowe z jedną dostępną resztą cysteiny. Górne ślady tego rysunku pokazują dane o prądzie przejściowym po impulsie napięcia. Dolne ślady pokazują zapisy w czasie rzeczywistym zmian intensywności fluorescencji pod wpływem impulsu napięcia.

Rysunek ten pokazuje zależność czasową fotowybielania od niszczenia zdjęć dawcy przy braku i obecności akceptora fluoro czterech; fotowybielanie następuje szybciej bez akceptora fluoro cztery. Każdy ślad jest średnią z czterech nagrań z jednego miejsca. Rysunek ten przedstawia względny ruch podjednostek po potwierdzeniu zmian.

Zmiany fluorescencji są pokazane na czerwonych ścieżkach, a przepływ prądu jest pokazany na czarnych ścieżkach. Wzrost intensywności fluorescencji pokazany po lewej stronie wskazuje, że podłogi roślinne zbliżają się do siebie. Brak zmiany intensywności fluorescencji pokazanej pośrodku wskazuje, że odległość Fluor Four pozostaje statyczna.

Spadek intensywności fluorescencji pokazany po prawej stronie wskazuje, że czwórki Fluor oddalają się od siebie podczas próby wykonania tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać o skorelowaniu zmian intensywności fluorescencji w stanie kinetycznym i stacjonarnym ze zmianami potwierdzającymi w białku.