Name: Wytwarzanie mikrowzorcowych hydrożeli do systemów hodowli neuronowych z wykorzystaniem dynamicznej fotolitografii projekcyjnej maski (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-11T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 6 s
Description: Poznaj technikę wytwarzania mikrowzorcowych hydrożeli do hodowli neuronowej z wykorzystaniem dynamicznej fotolitografii projekcyjnej maski. Metoda ta umożliwia badanie żywotności komórek nerwowych i wzrostu neuritów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować laboratorium prof. Anthony’ego Windebanka za podzielenie się wiedzą specjalistyczną w zakresie dysekcji i hodowli zwojów korzeni grzbietowych (DRG), a także prof. Shaochena Chena za pomocne dyskusje dotyczące konfiguracji DMD. Badania te były częściowo finansowane przez Tulane University oraz z grantów Louisiana Board of Regents (LEQSF[2009-10]-RD-A-18) i NIH (NS065374).

1. Konfiguracja DMD
<ol>
	<li>Płytka DMD, światłowód UV (z kolimatorem) oraz obiektyw 4x są zamontowane pionowo na stole wibroizolacyjnym.</li>
		<li>Światłowód UV należy ustawić tak, aby światło padało na macierz luster pod kątem 45° względem płaszczyzny luster oraz 24° poniżej płaszczyzny luster (Rysunek 1).</li>
		<li>Obiektyw jest zamontowany w taki sposób, aby odległość od DMD do obiektywu odpowiadała ogniskowej danej soczewki.</li>
		<li>Poniżej obiektywu umieszcza się mikroskop odwrócony, tak aby skupione światło odbite od DMD mogło być wizualizowane przez mikroskop. Odległość od obiektywu do powierzchni polimeryzacji powinna odpowiadać w przybliżeniu odległości roboczej soczewki. Stolik mikroskopu może być następnie wykorzystany do regulacji tej odległości w celu precyzyjnego ustawienia ostrości obrazu. Odległość ta może się różnić w zależności od wybranej powierzchni polimeryzacji.</li>
</ol>
2. Podwójne konstrukty hydrożelowe do hodowli eksplantów tkankowych
A. Adhezja eksplantów DRG
<ol>
<li>Pokryć ścianki wkładów do hodowli komórkowych z powłoką kolagenową w 6 dołkach (Corning) preparatem Rain-X, uważając, aby nie pokryć samej membrany. (Alternatywnie można zastosować hydrofobowy pisak do tworzenia barier).</li>
<li>Nawilżyć wkłady przez noc, stosując 1,5 mL medium adhezyjnego w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Medium adhezyjne to medium neurobasal z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny/streptomycyny, 0,5mM L-glutaminy oraz 20 μg/mL NGF.</li>
<li>Wyizolować embrionalne zwoje korzeni grzbietowych (DRG) z zarodków szczura w 15. dniu rozwoju (E-15). Zwoje DRG należy wysiać na wkładach 6-dołkowych z powłoką kolagenową, maksymalnie po cztery zwoje na wkład.</li>
<li>Inkubować wkłady przez 2 godziny, aby umożliwić adhezję DRG do membrany.</li>
</ol>
B. Fotopolimeryzacja z użyciem dynamicznej maski
Cyfrowe urządzenie mikrolustrzane (DMD) to matryca 1024 x 768 pojedynczych luster, podobna do tych stosowanych w telewizorach projekcyjnych, która selektywnie odbija światło w zależności od położenia luster. W naszych celach DMD jest wykorzystywane do naświetlania światłem ultrafioletowym (UV) fotousieciowalnych hydrożeli, co pozwala w prosty i szybki sposób tworzyć określone geometrie hydrożeli. Rysunek 1 przedstawia konfigurację DMD oraz drogę światła UV. Choć nasze DMD jest jednostką autonomiczną, urządzenie to może zostać również zintegrowane z wieloma istniejącymi mikroskopami.
<ol>
<li>Usuń cały nadmiar cieczy z wkładu i dodaj do jego wnętrza 500 μL medium do polimeryzacji. Medium do polimeryzacji zawiera 10% PEG (MW 1000) oraz 0,5% Irgacure 2959 rozpuszczone w medium neurobasal uzupełnionym o 20 μg/mL NGF oraz 1% Pen/Strep.</li>
<li>Umieść wkład pod urządzeniem DMD na szklanym podstawce potraktowanym preparatem Rain-X.</li>
<li>Za pomocą dołączonego podstawowego programu GUI ALP-3 załaduj odpowiedni czarno-biały obraz, który będzie służył jako „fotomaska” na DMD. Na potrzeby naszych badań wybrano kształt rozwidlający, aby umożliwić zastosowanie systemów kierowania wypustkami neurytów.</li>
<li>Używając mikroskopu odwróconego do wizualizacji, wyrównaj eksplanty tkankowe z odpowiednim miejscem na fotomasce, wykorzystując źródło światła widzialnego odbitego od DMD.</li>
<li>Zamień źródło światła widzialnego na źródło światła UV i naświetlaj roztwór PEG do momentu uzyskania wystarczającego stopnia sieciowania. (Dla podanych warunków i natężenia 5,0 Watts/cm2 padającego na DMD, sieciowanie może zostać ukończone w czasie tak krótkim jak 55 sekund). Powtórz procedurę dla wszystkich czterech DRG na wkładzie.</li>
<li>Przepłucz każdy wkład trzy razy sterylnym DPBS z 1% Pen-Strep.</li>
<li>Dodaj 1,5 mL medium wzrostowego pod wkłady do hodowli komórkowych i pozostaw do wyrównania w inkubatorze na 30 minut. Medium wzrostowe to medium neurobasal zawierające 2% B-27, 1% Pen/Strep, 0,5 mM L-glutaminy oraz 20 μg/mL NGF.</li>
</ol>
C. Wtórny hydrożel
Puramatrix
<ol>
<li>W zastosowaniach neuronalnych 1% Puramatrix rozcieńcza się zgodnie z instrukcjami producenta do stężenia 0,15% w sterylnym H2O i uzupełnia o rozpuszczalną lamininę w stężeniu 1 μg/mL.</li>
<li>Wszelkie nadmiary pożywki należy usunąć z pustych przestrzeni PEG zawierających eksplanty DRG, używając sterylnego aplikatora z patyczkiem bawełnianym, chusteczki Kimwipe lub mikropipety.</li>
<li>Do pustych przestrzeni PEG za pomocą mikropipety dodaje się Puramatrix, aby wypełnić wolną przestrzeń bez doprowadzenia do przelania. W zależności od objętości pustej przestrzeni, na jeden konstrukt zużywa się zazwyczaj ~ 1 μL.</li>
<li>Proces samoorganizacji Puramatrix rozpoczyna się natychmiast po kontakcie z fizjologicznym roztworem soli, tzn. napęczniałym PEG, jednak pod insert dodaje się 1,5 mL pożywki wzrostowej i umieszcza go w inkubatorze na jedną godzinę, aby zapewnić całkowitą żelowanie.</li>
<li>Początkowo Puramatrix ma lekko kwasowy odczyn, dlatego po godzinie należy wymienić pożywkę, aby umożliwić wyrównanie pH.</li>
<li>Wymiana pożywki jest wymagana mniej więcej co 48 godzin. Należy dbać o to, aby całą pożywkę dodawać pod insert, aby chronić integralność mechanicznie słabego Puramatrix.</li>
</ol>
Agaroza
<ol>
<li>W zastosowaniach neuronalnych agarozę rozcieńcza się do stężenia 1% w pożywce wzrostowej i umieszcza w kąpieli wodnej o temperaturze 60 °C aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy (~1 godz.). Następnie do roztworu dodaje się rozpuszczalną lamininę w stężeniu 1 μg/mL.</li>
<li>Należy usunąć całą nadmiarową pożywkę z pustych przestrzeni PEG.</li>
<li>Do pustych przestrzeni PEG dodaje się agarozę, aby wypełnić wolną przestrzeń, nie dopuszczając do przelania. W zależności od objętości pustej przestrzeni, zazwyczaj stosuje się ~ 1 μL na konstrukt.</li>
<li>W płytce 6-dołkowej schładza się wstępnie 1,5 mL pożywki wzrostowej (8 °C), a następnie wkłady zawierające agarozę przenosi się do schłodzonej pożywki i przechowuje w lodówce w temperaturze 8 °C przez co najmniej trzy minuty, aby umożliwić żelowanie agarozy.</li>
<li>Na koniec wkłady przenosi się do 1,5 mL wstępnie ogrzanej pożywki wzrostowej (37 °C) i inkubuje w temperaturze 37 °C, wymieniając pożywkę co 48 godzin.</li>
</ol>
3. Podwójna enkapsulacja komórek 3D w hydrożelu
Podwójna enkapsulacja w hydrożelu jest odpowiednia przy użyciu dowolnego żelu samowyciszającego. Żel fotousieciowalny, w tym przypadku PEG, służy jako wsparcie strukturalne dla geometrycznej prezentacji żelu samowyciszającego, na przykład Puramatrix lub agarozy. Niektóre z metod, a w szczególności rodzaj żelu i wybór fotomaski, będą zależeć od konkretnego zamierzonego zastosowania.
<ol>
<li>Wgraj odpowiednią maskę do DMD. W naszym zastosowaniu, jakim jest przeżywalność komórek, wybraliśmy prostą cylindryczną prezentację Puramatrix, aby ułatwić obrazowanie komórek. Badacze zajmujący się sygnalizacją komórkową mogą być zainteresowani geometrią przedziałową, aby umożliwić dyfuzję cząsteczek chemotaktycznych. Ponadto pokazano przybliżony model tętnicy, aby przedstawić możliwe zastosowanie w badaniach nad naczyniami krwionośnymi.</li>
<li>Potraktuj ścianki poliestrowego insertu do hodowli komórkowej preparatem Rain-X i umieść go pod DMD na szkiełku pokrytym Rain-X.</li>
<li>Dodaj do insertu 500 μL medium do polimeryzacji. Wywołaj sieciowanie PEG poprzez naświetlanie światłem UV przez 55 sekund.</li>
<li>Przemyj trzy razy sterylnym DPBS oraz 1% Pen-Strep.</li>
<li>Usuń całe nadmiarowe medium z pustych przestrzeni PEG.</li>
<li>Odwirowuj komórki przy pożądanej gęstości do postaci pelletu. Należy zadbać o usunięcie całego medium z pelletu komórkowego przed mieszaniem, ponieważ Puramatrix rozpoczyna samoorganizację natychmiast po kontakcie z roztworem soli. Zawieś komórki w 0,15% Puramatrix rozcieńczonym w sterylnym H2O z dodatkiem 10% sacharozy.</li>
<li>Wstrzyknij mieszaninę Puramatrix/komórki/sacharoza do pustych przestrzeni w PEG.</li>
<li>Dodaj 1,5 mL medium wzrostowego pod insert i pozostaw do żelowania w inkubatorze przez jedną godzinę.</li>
<li>Wymień medium po jednej godzinie, a następnie mniej więcej co 48 godzin.</li>
</ol>
4. Pojedyncza inkapsulacja komórek 3D w hydrożelu
Pojedyncza enkapsulacja w hydrożelu byłaby odpowiednia w każdej sytuacji, w której komórki mogą być badane wewnątrz fotousieciowalnego hydrożelu.
<ol>
<li>Wczytaj odpowiednią maskę do urządzenia DMD. W badaniach nad przeżywalnością komórek ponownie wybrano podstawową maskę okrągłą reprezentującą cylinder. W zależności od dziedziny badań można ponownie zastosować maski podobne do tych przedstawionych w metodzie 4.</li>
<li>Potraktuj poliestrowy insert do hodowli komórkowej preparatem Rain-X, a następnie umieść go pod urządzeniem DMD na szkiełku pokrytym Rain-X.</li>
<li>Komórki w dowolnym pożądanym stężeniu można dodać bezpośrednio do 10% roztworu PEG, dokładnie mieszając w celu zapewnienia homogennego rozkładu.</li>
<li>Dodaj 500 μL medium polimeryzacyjnego do insertu. Indukuj sieciowanie PEG poprzez naświetlanie światłem UV przez 55 sekund.</li>
<li>Przemyj trzy razy sterylnym DPBS z dodatkiem 1% Pen-Strep.</li>
<li>Wypełnij medium wzrostowym przestrzeń zarówno pod insertem, jak i nad nim, wymieniając medium mniej więcej co 2 dni.</li>
</ol>
5. Polimeryzacja cienkowarstwowego hydrożelu
<ol>
<li>Wczytaj odpowiednią maskę na DMD.</li>
<li>Potraktuj wkładkę do hodowli komórkowej z poliestru powleczonej kolagenem preparatem Rain-X, a następnie umieść ją na szkiełku powleczonym Rain-X.</li>
<li>Dodaj wystarczającą ilość medium polimeryzacyjnego, aby zakryć dno wkładki (~250-300 μL dla wkładek do płytek 6-dołkowych). Pozostaw medium, aby przeniknęło przez membranę wkładki przez 30-45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Usuń nadmiar medium polimeryzacyjnego z wkładki za pomocą mikropipety lub chusteczki Kimwipe. Dodaj wystarczającą ilość oleju przezroczystego dla UV, aby całkowicie zakryć dno wkładki. Pozostaw wkładkę na 15-30 minut w temperaturze pokojowej, aby olej utworzył wyraźną warstwę nad medium polimeryzacyjnym nasycającym membranę wkładki.</li>
<li>Umieść wkładkę i szkiełko pod DMD. Wywołaj sieciowanie PEG poprzez naświetlanie światłem UV. Ze względu na cienką warstwę PEG, sieciowanie może zostać zakończone w czasie nawet 15 sekund przy natężeniu 5.0 Watts/cm2 padającym na DMD.</li>
<li>Przemyj wkładkę trzy razy sterylnym DPBS z dodatkiem 1% Pen-Strep. (Jeśli problemem jest utrzymywanie się tłustych osadów, do buforu do płukania można dodać łagodny detergent, taki jak Tween 20 (1%).)</li>
<li>Przechowuj wkładkę w 6-dołkowej płytce do hodowli tkanek. Dodaj medium wzrostowe do zawiesiny komórek w pożądanym stężeniu, a następnie pipetuj wystarczającą objętość zawiesiny komórek do wkładki do hodowli komórkowej, aby uzyskać pożądaną gęstość komórek. Następnie dodaj pod wkładkę wystarczającą ilość medium wzrostowego, aby w pełni utrzymać żywotność komórek (~1.5 mL).</li>
<li>Po upływie 48 godzin przemyj wkładkę trzy razy sterylnym DPBS z dodatkiem 1% Pen-Strep, aby usunąć wszystkie nieprzytwierdzone komórki. Wymieniaj medium mniej więcej co 48 godzin.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Przykłady podwójnych konstrukcji hydrożelowych zawierających eksplanty zzęsłów korzeni grzbietowych (DRG) przedstawiono na rysunku 2. Zauważmy, że migracja komórek i wydłużanie neurytów są ograniczone do obszaru konstrukcji podwójnego hydrożelu dopuszczającego obecność komórek. Rysunek 3 przedstawia zdysocjowane komórki enkapsulowane w podobny sposób wewnątrz podwójnych konstrukcji hydrożelowych. Ze względu na dynamiczny charakter maski fotolitograficznej DMD, geometria dostępna do enkapsulacji jest ograniczona jedynie wymiarami i rozdzielczością optyki. Enkapsulacja komórek była możliwa również wewnątrz pojedynczego fotopolimeryzowalnego hydrożelu, PEG, a test żywotności (live/dead) został przeprowadzony, co wykazano na rysunku 4. Enkapsulacja w PEG służy jedynie jako przykład, ponieważ PEG nie stanowi idealnego środowiska dla komórek neuronalnych. W związku z tym żywotność komórek uzyskana w naszych konstrukcjach z PEG jest zrozumiałe niska. Na koniec, na rysunku 5 przedstawiono przykłady wykorzystania cienkich filmów PEG jako wzorowanej warstwy ograniczającej adhezję komórek na wkładkach do hodowli komórkowej. Ponadto na rysunku 6 zaprezentowano przykłady możliwych „nieprawidłowych” wyników.
Wyniki te stanowią jedynie niewielką część możliwych zastosowań metod opracowanych w naszym laboratorium. Mają one na celu zademonstrowanie łatwości, wszechstronności i wykonalności naszego podejścia i mogą zostać potraktowane jako „dowód koncepcji” dla badaczy chcących opracować własne adaptacje.
<img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="Schemat układu fotopolimeryzacji UV z DMD, obiektywem i rzutowaną fotomaską." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematyczny rysunek drogi światła wykorzystywanej w fotolitografii. Wstawka: Światło UV oświetla DMD pod kątem 45°, 24° poniżej płaszczyzny macierzy luster.
<img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="Wyniki urządzenia mikrofluidycznego; migracja komórek; mikroskopia fluorescencyjna; wiele kanałów; analiza biologiczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Oznakowany wzrost i proliferacja w konstrukcjach z podwójnego hydrożelu zawierających zwoje korzeni grzbietowych (DRG). A-D) Obrazy przedstawiające spolimeryzowane konstrukcje z PEG (szare) z neurytami oznakowanymi Beta III tubuliną (zielone) oraz jądrami komórkowymi barwionymi DAPI (niebieskie). Eksplanty DRG znajdują się w Puramatrix i są rozmieszczone w okrągłych obszarach wzoru, a neuryty rosną w kierunku rozgałęzienia (rozgałęzień).
<img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające mikrowzorowane hydrożele o różnych kształtach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Podwójne konstrukty hydrożelowe zawierające komórki znakowane calceiną AM, markerem żywych komórek, po 48 godzinach w pożywce wzrostowej. A-D) Różne kształty PEG, wypełnione Puramatrix zawierającym zdysocjowane neurony DRG (~5x103 komórek/mL).
<img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej, komponenty komórkowe, skala 200 µm, obrazowanie biologiczne, analiza komórkowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Pojedyncza konstrukcja hydrożelowa zawierająca żywe komórki znakowane Calcein AM (zielony) oraz martwe komórki znakowane etydinium homodimerem-1 (czerwony) po 24 godzinach w pożywce wzrostowej (5x103 cells/mL).
<img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej porównujące strukturę i rozmieszczenie komórek; powiększenie A) 500μm, B) 100μm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Restrykcyjny dla komórek PEG spolimeryzowany w postaci cienkiej warstwy z użyciem „wzorca testowego”, aby selektywnie przytwierdzić dysocjowane komórki do pokrytej kolagenem membrany w podkładkach przepuszczalnych. A, B) Żywe komórki zostały znakowane po 48 godzinach Calcein AM (zielony), natomiast martwe komórki znakowano etydium homodimerem-1 (czerwony). Minimalna adhezja komórek występuje w obszarze zawierającym cienką warstwę PEG.
<img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="Rozgałęziona struktura mikrofluidyczna; mikroskopia optyczna z markerami fluorescencyjnymi do analizy przepływu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Reprezentatywne obrazy niepożądanych wyników. A) Częściowa polimeryzacja PEG, prowadząca do powstania nieużytecznej konstrukcji z PEG. Nieprawidłowa polimeryzacja może wystąpić z powodu obecności menisku w medium pre-polimerowym, niewystarczającej ilości medium polimeryzacyjnego, niewystarczającej ekspozycji na UV lub niewłaściwego ustawienia ostrości optyki. B) Obraz przedstawiający spolimeryzowane konstrukcje z PEG (szary) z neurytami znakowanymi Beta III tubuliną (zielony) oraz jądrami komórkowymi barwionymi DAPI (niebieski). Neuryty były w stanie rosnąć poza wzorcowanymi kanałami z PEG. Często dzieje się tak w sytuacji, gdy Puramatrix przelewa się na górną część PEG podczas wtryskiwania.

<ol><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+biology%27s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li>
<li>Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+three+dimensions%3A+3D+nanostructured+environments+for+cell+culture+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Living in three dimensions: 3D nanostructured environments for cell culture and regenerative medicine.</a> Cell Biochem Biophys. 45, 215-227 (2006).</li>
<li>Maltman, D. J., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+three-dimensional+cell+culture+technology+aimed+at+improving+the+accuracy+of+in+vitro+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Developments in three-dimensional cell culture technology aimed at improving the accuracy of in vitro analyses.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1072-1075 (2010).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+isn%27t+flat%3A+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 8-9 (2006).</li>
<li>Irons, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+neural+constructs%3A+a+novel+platform+for+neurophysiological+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation.</a> Journal of Neural Engineering. 5, 333-341 (2008).</li>
<li>Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+in+rotating+bioreactors+promotes+maintenance+of+cardiac+myocyte+electrophysiology+and+molecular+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Cultivation in rotating bioreactors promotes maintenance of cardiac myocyte electrophysiology and molecular properties.</a> Tissue Eng. 9, 1243-1253 (2003).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li>
<li>Cushing, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+science.+Hydrogel+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Materials science. Hydrogel cell cultures.</a> Science. 316, 1133-1134 (2007).</li>
<li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324, 59-63 (2009).</li>
<li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine (Lond). 5, 469-484 (2010).</li>
<li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photolabile+hydrogel+for+guided+three-dimensional+cell+growth+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">A photolabile hydrogel for guided three-dimensional cell growth and migration.</a> Nature Materials. 3, 249-253 (2004).</li>
<li>Wylie, R. G., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+micropatterning+of+amines+within+an+agarose+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two-photon micropatterning of amines within an agarose hydrogel.</a> Journal of Materials Chemistry. 18, 2716-2721 (2008).</li>
<li>Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+three-dimensional+hyaluronic+acid+nanofibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospun three-dimensional hyaluronic acid nanofibrous scaffolds.</a> Biomaterials. 27, 3782-3792 (2006).</li>
<li>Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li>
<li>Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+electrophysiology+of+neural+cell+structures+generated+by+the+inkjet+printing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Viability and electrophysiology of neural cell structures generated by the inkjet printing method.</a> Biomaterials. 27, 3580-3588 (2006).</li>
<li>Liu Tsang, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+hepatic+tissues+by+additive+photopatterning+of+cellular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels.</a> FASEB J. 21, 790-801 (2007).</li>
<li>Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+tectonics%3A+A+comprehensive+construction+platform+for+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13488-13493 (2000).</li>
<li>Lu, Y., Mapili, G., Suhali, G., Chen, S. C., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+micro-mirror+device-based+system+for+the+microfabrication+of+complex%2C+spatially+patterned+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">A digital micro-mirror device-based system for the microfabrication of complex, spatially patterned tissue engineering scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 77, 396-405 (2006).</li>
<li>Naiser, T., Mai, T., Michel, W., Ott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+maskless+microscope+projection+photolithography+system+and+its+application+in+light-directed+fabrication+of+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Versatile maskless microscope projection photolithography system and its application in light-directed fabrication of DNA microarrays.</a> Review of Scientific Instruments. 77, 063711-063711 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisana tutaj metoda może być wykorzystana przez każdego badacza poszukującego prostych i powtarzalnych systemów hodowli komórkowych. Teoretycznie, dzięki szerokiej gamie dostępnych fotopolimeryzowalnych hydrożeli, środowisko można dostosować do każdego typu komórek, w tym do całych eksplantów tkankowych. Dodatkowo, podwójny system hydrożeli pozwala na lepszą kontrolę przestrzenną w prezentacji hydrożeli samopolimeryzujących, które mają tendencję do przyjmowania amorficznych kształtów. Powstałe „2,5D” mikrostrukturalne konstrukty hydrożelowe zapewniają macierz 3D dla wzrostu neuronów w konfiguracji 2D, co umożliwia wygodną ocenę mikroskopową. Można również zmieniać podłoże, na którym polimeryzowane są żele, co pozwala na większą kontrolę w projektowaniu eksperymentów. Nasze metody są zoptymalizowane pod kątem zastosowania z przepuszczalnymi podłożami do hodowli komórkowych, ponieważ zaobserwowaliśmy poprawę przeżywalności (Rysunek 4) w porównaniu z polimeryzacją na szkiełkach przedmiotowych (dane niepokazane). Jednak inne powierzchnie polimeryzacji mogą być bardziej odpowiednie dla różnych zastosowań, na przykład do wytwarzania na szkiełkach przedmiotowych wykorzystywanych w eksperymentach mikroprzepływowych lub do formowania agregatów komórkowych.
Nasze doświadczenia z tymi systemami hodowli pozwoliły na zidentyfikowanie potencjalnych obszarów problematycznych. Po pierwsze, wymagane są staranne techniki w celu zachowania sterylności konstruktów. Ze względu na masywną budowę zestawu DMD, trudno jest przeprowadzać etapy polimeryzacji w warunkach sterylnych. Aby zapobiec temu problemowi, pomocny jest opisany w metodach etap płukania, a we wszystkich pożywkach należy stosować antybiotyki. Dodatkowo, końcowa grubość i kształt spolimeryzowanego konstruktu są w dużym stopniu zależne od właściwości płynnych mieszaniny prepolimeru, a obecność menisku może prowadzić do powstania konstruktów żelowych, które są zbyt cienkie lub niecałkowicie spolimeryzowane (Rysunek 6). Można podjąć dwa kroki w celu zminimalizowania tworzenia się menisku wewnątrz insertów do hodowli komórkowych. W przypadku grubych hydrożeli (&gt;200 μm) wystarczająca jest prosta powłoka z Rain-X na wewnętrznej ściance insertu. Jednakże, jak krótko opisano powyżej, dla cienkich konstruktów (&lt;200 μm) wymagana jest warstwa oleju, aby zarówno zminimalizować menisk, jak i zapobiec wygaszaniu polimeryzacji wolnorodnikowej przez tlen. Stwierdzono, że rozdzielczość zależy od grubości, przy czym rozmiar detali zmniejszał się wraz ze zwiększaniem grubości żelu. Rozdzielczość różniła się również w zależności od tego, czy detal stanowił wypukłość czy wklęsłość w hydrożelu. Niemniej jednak, osiągnęliśmy wystarczającą rozdzielczość dla konstruktów z minimalnymi rozmiarami detali rzędu ~100 μm, używając wyłącznie obiektywów mikroskopowych jako optyki skupiającej.
Nasze eksperymenty wykazały, że opisane tutaj podwójne konstrukty hydrożelowe stanowią doskonałą podstawę do tworzenia podstawowych modeli in-vitro wzrostu i prowadzenia neurytów. Zastosowana technika mikrowzorowania jest adaptacją istniejących metod18,19, jednak nasz układ kładzie nacisk na prosty w implementacji projekt i został zoptymalizowany pod kątem produkcji podwójnych konstruktów hydrożelowych na insertach do hodowli komórkowych; inserty te były kluczowe dla poprawy żywotności komórek, a także dla sieciowania wokół wcześniej przytwierdzonych eksplantów tkankowych. Zakres przedstawionych wyników jest ograniczony obszarami zainteresowań naszego laboratorium; wierzymy jednak, że metody opisane w niniejszej publikacji okażą się przydatne dla badaczy poszukujących stosunkowo taniej, szybkiej i łatwej w użyciu metody wytwarzania trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych.

<table><tbody><tr><td>cyfrowe urządzenie mikrolustrzane (DMD)</td><td>Texas Instruments</td><td>DLPD4X00KIT</td><td></td></tr><tr><td>przepuszczalne podłoże Transwell powlekane kolagenem</td><td>Corning</td><td>3491</td><td>W manuskrypcie określany również jako wkład do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>przepuszczalne podłoże Transwell poliestrowe</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>W manuskrypcie określany również jako wkład do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>pożywka Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>czynnik wzrostu nerwów (NGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>suplement B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Puramatrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1000</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15178</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td>0298913AB</td><td></td></tr><tr><td>olej</td><td>stosowano zarówno olej rzepakowy, jak i olej silikonowy</td><td></td><td>musi być przezroczysty dla promieni UV i minimalizować powstawanie menisku</td></tr><tr><td>OmniCure Series 1000</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Coraz częściej środowiska hodowli komórkowych o określonym wzorze stają się istotną techniką badania charakterystyki komórkowej, a wielu badaczy uznaje za niezbędne stosowanie środowisk 3D w eksperymentach in vitro, aby lepiej odwzorować właściwości in vivo 1-3. Badania w takich dziedzinach jak onkologia 4, inżynieria neuronalna 5, fizjologia serca 6 oraz oddziaływania komórka-macierz 7,8 wykazały, że zachowanie komórek różni się znacząco pomiędzy tradycyjnymi hodowlami monolayerowymi a konstrukcjami 3D.
Hydrożele są wykorzystywane jako środowiska 3D ze względu na swoją różnorodność, wszechstronność oraz możliwość dostosowania składu molekularnego poprzez funkcjonalizację 9-12. Istnieje wiele technik tworzenia konstrukcji służących jako macierze wspierające komórki, w tym elektroprzędzenie13, stempelki elastomerowe14, druk atramentowy15, addytywne fotopatternowanie16, statyczna litografia projekcyjna z maską fotolitograficzną17 oraz dynamiczna mikrostereolitografia z maską18. Niestety metody te wiążą się z wieloma etapami produkcji i/lub wymagają sprzętu, który nie jest łatwo dostosowalny do konwencjonalnych metod hodowli komórek i tkanek. Technika zastosowana w niniejszym protokole adaptuje dwie ostatnie metody, wykorzystując urządzenie cyfrowych mikroluster (DMD) do tworzenia dynamicznych masek fotolitograficznych w celu sieciowania geometrycznie specyficznych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG), indukowanego poprzez polimeryzację rodnikową inicjowaną promieniami UV. Powstałe struktury „2.5D” zapewniają ograniczone środowisko 3D dla wzrostu neuronów. Stosujemy podejście z podwójnym hydrożelem, w którym PEG służy jako region ograniczający komórki, nadając strukturę inaczej bezkształtnemu, ale dopuszczającemu komórki żelowi samofunkcjonalnemu wykonanemu z Puramatrix lub agarozy. Proces ten jest szybką i prostą jednoczynnościową metodą wytwarzania, która jest wysoce powtarzalna i łatwo dostosowalna do stosowania z konwencjonalnymi metodami i podłożami do hodowli komórkowych.
Całe eksplanty tkanek, takie jak embrionalne zwoje korzeni grzbietowych (DRG), mogą być włączone do dwuskładnikowych konstrukcji hydrożelowych w celu przeprowadzenia testów eksperymentalnych, takich jak pomiar wzrostu neurytów. Dodatkowo, dysocjowane komórki mogą zostać zamknięte w hydrożelu fotopolimeryzowalnym lub samopolimeryzującym, bądź selektywnie przytwierdzone do przepuszczalnej membrany wspierającej przy użyciu fotowzorowania ograniczającego rozmieszczenie komórek. Wykorzystując DMD, stworzyliśmy konstrukcje hydrożelowe o grubości do ~1mm, jednak struktury z PEG w formie cienkich warstw (&lt;200 μm) były ograniczone przez wygaszanie tlenowe reakcji polimeryzacji rodnikowej. Następnie opracowaliśmy technikę wykorzystującą warstwę oleju nad cieczą polimeryzacyjną, co umożliwiło polimeryzację cienkich struktur z PEG.
W niniejszym protokole opisujemy szybkie tworzenie trójwymiarowych (3D) systemów hydrożelowych do produkcji mikrofabrykowanych kultur komórek i tkanek neuronalnych. Przedstawione tutaj podwójne konstrukty hydrożelowe stanowią wszechstronne modele in vitro, które mogą okazać się użyteczne w badaniach z zakresu neuronauki dotyczących przeżywalności komórek, ich migracji i/lub wzrostu oraz prowadzenia neurytów. Co więcej, ponieważ protokół ten można zastosować do wielu rodzajów hydrożeli i komórek, potencjalne zastosowania są różnorodne i szerokie.

Opisano proste techniki szybkiego wytwarzania mikrofabrykowanych systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem cyfrowego urządzenia z mikrolustrami do litografii z dynamiczną projekcją maski na standardowych podłożach do hodowli komórkowej. Systemy hodowlane te mogą lepiej odzwierciedlać naturalną architekturę biologiczną, a opisane techniki można dostosować do licznych zastosowań.

Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

Coraz częściej środowiska hodowli komórkowych z nadanym wzorem stają się istotną techniką badania charakterystyki komórkowej, a wielu badaczy wierzy w...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie mikrostrukturyzowanego, podwójnego systemu hodowli komórkowej w hydrożelu do badań neuronowych. Osiąga się to poprzez uprzednie wysianie implantów tkankowych, takich jak embrionalne zwoje korzeni grzbietowych, na przepuszczalnych insertach do hodowli komórkowej. Następnie, przy użyciu urządzenia cyfrowych mikroluster (DMD) jako dynamicznej maski światłoczułej, tworzony jest mikro wzór w hydrożelu sieciowanym fotochemicznie.Następnie dodaje się samoorganizujący się hydrożel typu pure, który może zawierać zawiesinę zdysocjowanych komórek. Przed analizą komórkową niezbędny jest odpowiedni czas inkubacji. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące żywotność komórek neuronalnych oraz wzrost neurytów w określonych konfiguracjach geometrycznych zdefiniowanych przez DMD.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest możliwość szybkiego tworzenia, modyfikowania i rzutowania z dystansu dynamicznej maski świetlnej, co pozwala na dopasowanie do niemal każdego podłoża, takiego jak przepuszczalne wkładki do hodowli komórkowej. Choć metoda ta pozwala na badanie układów neuronalnych, może być również stosowana w innych układach, w których pożyteczne byłoby zastosowanie określonych ograniczeń geometrycznych, takich jak sygnalizacja komórkowa, migracja komórek, kontakt międzykomórkowy czy morfogeneza. Płyta DMD, światła UV, prowadnice oraz obiektyw z powiększeniem 4x są zamontowane pionowo na stole wibroizolacyjnym.Mikroskop odwrócony jest umieszczony poniżej obiektywu w taki sposób, aby skupione światło odbite od DMD mogło być wizualizowane za pomocą mikroskopu. Dodatkowe szczegóły dotyczące konfiguracji DMD znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym. Najpierw przygotuj sześciostudniowe inserty do hodowli komórkowych powlekane kolagenem do hodowli eksplantatów X; pokryj ścianki insertów do hodowli komórkowych preparatem Rain-X, uważając, aby nie nakładać Rain-X na samą membranę.Następnie do wkładów dodaj 1,5 mililitrów pożywki aian i inkubuj przez noc w temperaturze 37°C i przy 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia, po pobraniu zwojów korzeni grzbietowych embrionów z szczurów w 15. dniu embrionalnym (E15), przenieś do czterech zwojów DRG na każdy powlekany kolagenem wkład sześciodołkowy i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37°C i przy 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić przyleganie DRG do błony.Po okresie inkubacji DRG będą gotowe do fotopolimeryzacji. Cyfrowe urządzenie mikro-lustrzane (DMD) to macierz 1024 na 768 pojedynczych luster, które selektywnie odbijają światło w zależności od położenia lustra. W tej procedurze DMD jest wykorzystywane do rzutowania wzorów światła ultrafioletowego na fotopolimeryzowalne hydrożele (photo CROs, linkable hydrogels), co pozwala na proste i szybkie tworzenie określonych geometrii hydrożeli.Chociaż nasz DMD jest samodzielną jednostką, urządzenie to może być również zintegrowane z wieloma istniejącymi mikroskopami. Najpierw wyjmij rośliny DRGX z inkubatora i odessij cały nadmiar cieczy z insertu. Następnie dodaj 500 µL medium do polimeryzacji do wnętrza insertu.Przenieś inserty z roślinami DRGX na szkiełko przedmiotowe i umieść szkiełko pod urządzeniem DMD. Użyj programu graficznego interfejsu użytkownika ALP three, aby wczytać na DMD czarno-biały obraz, który będzie służył jako maska fotograficzna. W tym przypadku wybrano kształt rozwidlony, aby umożliwić wdrożenie systemów naprowadzania neurytów przy użyciu mikroskopu odwróconego i widzialnego źródła światła DI.Wyrównaj wycinek tkanki z odpowiednim miejscem na masce fotograficznej, wykorzystując światło odbite od DMD jako prowadnicę. Następnie zastąp widzialne źródło światła źródłem światła UV. Naświetl medium polimeryzacyjne wewnątrz hodowli komórkowej.Wstawić do momentu, aż sieciowanie PEG zostanie zakończone. Powtórzyć dla każdego DRG na wkładce. Następnie przemyć każdą wkładkę trzy razy sterylnym roztworem soli fosforanowej w buforze (PBS) z dodatkiem 1% penicyliny i streptomycyny.Na koniec dodać 1,5 mililitra pożywki pod wkłady do hodowli komórkowej i pozostawić do wyrównania w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut. W czasie inkubacji poddać czystą macierz sonikacji przez 30 minut. Aby rozpuścić peptydy, rozcieńczyć dostarczony 1% roztwór do stężenia 0,15% w sterylnej wodzie i uzupełnić o jeden mikrogram na mililitr rozpuszczalnej lamininy.Po 30 minutach wyjmij kultury z inkubatora i odessaj cały nadmiar pożywki z insertu. Następnie, obserwując pustą przestrzeń pod mikroskopem, odessaj pożywkę z wnętrza obszaru pustki w konstrukcie PEG zawierającym eksplant DRGX i naciśnij pipetę, wprowadzając około 1 µL czystego roztworu macierzy do pustki wokół eksplantu X. Upewnij się, że czysta macierz nie przelewa się poza pustkę w słupku.Następnie pipetujemy 1,5 ml pożywki wzrostowej pod wkładkę i umieszczamy w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C i przy 5% CO2 na jedną godzinę. Aby zapewnić pełną adaptację po tym czasie, należy wymienić pożywkę wzrostową, a następnie ponownie umieścić hodowle w inkubatorze. Pożywkę wzrostową wymienia się co 48 godzin hodowli.Tutaj przedstawiono przykłady dwuskładnikowych konstrukcji hydrożelowych zawierających rośliny DRGX. Rośliny DRGX zostały znakowane markerami wzrostu i proliferacji. Zpolimeryzowana konstrukcja PEG ma kolor szary, neuryty DRG znakowane beta-tubuliną III mają kolor zielony, a barwienie DPI wybarwia jądra komórkowe na niebiesko.Zwróć uwagę, że migracja komórek i rozszerzanie retikulów są ograniczone do obszaru konstrukcji z podwójnego hydrożelu przepuszczalnego dla komórek. Inkapsulacja w podwójnym hydrożelu jest odpowiednia przy zastosowaniu dowolnego żelu samomontującego się oraz żelu sieciowalnego fotochemicznie. W tym przypadku PEG służy jako wsparcie strukturalne dla geometrycznej prezentacji żelu samomontującego się.Na przykład czysta macierz lub aris. Rodzaj żelu i wybór maski fotograficznej będą zależeć od konkretnego, zamierzonego zastosowania. Ścianki poliestrowego wkładu do hodowli komórkowych potraktować preparatem Rain-X, zgodnie z wcześniej zaprezentowaną procedurą.Przenieś wkład na szkiełko pokryte Rain-X i umieść go pod DMD. Następnie dodaj do wkładu 500 µL medium polimeryzacyjnego. Wczytaj na DMD odpowiednią maskę dla tego eksperymentu przeżywalności.Do obrazowania komórek wykorzystuje się cylindryczną prezentację czystej macierzy. W celu zaindukowania sieciowania PEG po procesie sieciowania, należy naświetlać wkładkę światłem UV przez 55 sekund. Nowo powstałą wolną przestrzeń należy przemyć sterylnym DPBS oraz 1% pen strep.Użyj mikropipety lub sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby usunąć cały nadmiar cieczy z wolnej przestrzeni. Przygotuj czysty Matrixx poprzez sonikację przez 30 minut, rozcieńczając go do stężenia 0,15% w sterylnej wodzie z dodatkiem 1 µg/ml rozpuszczalnej lamininy oraz 10% sacharozy. Następnie, poprzez wirowanie, wytrącaj w formie pelletu komórki przeznaczone do hodowli.Dokładnie odessaj pożywkę z osadu komórkowego, a następnie zawieś osad w 0,15% roztworze pure matrix do stężenia około 5 × 10³ komórek/ml. Kluczowe jest całkowite odessanie pożywki z osadu komórkowego, ponieważ pure matrix rozpoczyna proces samoorganizacji w kontakcie z roztworem soli. Następnie pipetuj około 1 µL uzupełnionej mieszaniny komórek w pure matrix do otworu w pegu.Taka objętość jest zazwyczaj wystarczająca, aby wypełnić pustą przestrzeń bez przepełnienia; pipetujemy 1,5 milliliters pożywki wzrostowej pod wkładkę. Następnie umieszcza się czysty hydrożel macierzy wtórnej w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 degrees Celsius i 5% carbon dioxide na jedną godzinę, aby zapewnić całkowitą żelację. Po tym czasie odsysamy pożywkę i dodajemy świeżą pożywkę pod wkładkę, uważając, aby nie uszkodzić mechanicznie słabej czystej macierzy.Przenieś hodowle z powrotem do inkubatora do hodowli tkanek i wymieniaj pożywkę co 48 godzin hodowli. Oto przykłady żywych neuronów DRG zamkniętych w różnych konstrukcjach z hydrożelu podwójnego. Po 48 godzinach w pożywce wzrostowej komórki zostały znakowane wskaźnikiem calcium am, który jest markerem żywych komórek i wykazuje zieloną fluorescencję.W tym przypadku, ze względu na dynamiczny charakter maski fotograficznej DMD, geometria dostępna do enkapsulacji jest ograniczona jedynie wymiarami i rozdzielczością układu optycznego. Pojedyncza enkapsulacja w hydrożelu jest odpowiednia w sytuacjach, gdy komórki mogą być badane wewnątrz sieciującego światłem hydrożelu, co odpowiada hodowli komórkowej w poliestrze. Wprowadzić przy użyciu Rain-X i umieścić pod DMD na szkiełku pokrytym Rain-X.Podobnie jak poprzednio, pipetuj komórki przeznaczone do hodowli bezpośrednio do medium polimeryzacyjnego w pożądanym stężeniu i wymieszaj dokładnie, aby zapewnić jednorodny rozkład. Następnie pipetuj 500 µL mieszaniny komórek w medium polimeryzacyjnym do insertu. Wybierz odpowiednią maskę i załaduj ją na DMD, a następnie zindukuj sieciowanie PEG poprzez ekspozycję na światło UV przez 55 sekund.W badaniach przeżywalności komórek stosuje się podstawową maskę kołową w celu odwzorowania cylindra; należy przemyć insert trzy razy sterylnym DPBS oraz 1% pen strep, a następnie pipetować 1,5 milliliters medium wzrostowego pod insert oraz wystarczającą ilość medium wzrostowego na górze, aby w pełni zanurzyć insert; inkubować w 37 degrees Celsius i 5% carbon dioxide z wymianą medium co 48 godzin. Oto przykład żywych, dysocjowanych neuronów korowych enkapsulowanych w PEG. Żywe komórki są znakowane calcium am i wykazują kolor zielony, natomiast martwe komórki są znakowane ahy homodimer one i wykazują kolor czerwony.Enkapsulacja w PEG ma charakter wyłącznie przykładowy, ponieważ PEG nie stanowi optymalnego środowiska dla komórek neuronalnych. Wybrana geometria reprezentuje prosty sposób badania żywotności komórek, lecz może zostać dostosowana do szerokiego zakresu struktur. Cienkowarstwowe hydrożele mogą być wykorzystywane do generowania specyficznych wzorów ograniczonego rozmieszczenia komórek.Ponownie potraktuj poliestrowy wkład do hodowli komórkowych preparatem Rain X, tak jak wcześniej, i umieść go na szkiełku potraktowanym Rain X. Następnie pipetuj od 250 do 300 µL medium do polimeryzacji na dno przygotowanego wkładu do hodowli komórkowej. Taka objętość jest wystarczająca, aby tylko przykryć dno wkładu; inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 do 45 minut, aby medium przeniknęło przez membranę wkładu, a następnie odessaj nadmiar medium z wkładu za pomocą mikropipety.Następnie pipetuj odpowiednią ilość oleju transparentnego w zakresie UV na dno wkładki, aby całkowicie pokryć ten obszar. Inkubuj wkładkę w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut, co pozwoli olejowi na utworzenie wyraźnej warstwy nad medium polimeryzacyjnym. Po nasyceniu membrany wkładki załaduj odpowiednią maskę na DMD.Po umieszczeniu wkładki i szkiełka pod DMD zaindukuj sieciowanie pegu poprzez naświetlanie światłem UV. Przemyj wkładkę trzy razy sterylnym DPBS oraz 1% pen strap, a następnie przenieś wkładkę do sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej, aby zebrać i scentryfugować komórki przeznaczone do hodowli. Odsącz medium i resuspenduj pellet komórkowy w medium wzrostowym do pożądanego stężenia w zakresie od 10⁴ do 10⁶ komórek na ml.Następnie do insertu do hodowli komórkowej pipetujemy odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej, aby uzyskać pożądaną gęstość komórek. Pod insert dodajemy wystarczającą ilość pożywki wzrostowej, aby w pełni utrzymać żywotność komórek. Inkubujemy w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przez 48 godzin.Przemyj wkładkę trzykrotnie sterylnym DPBS z 1% pen strep, aby usunąć niezwiązane komórki. Następnie dodaj do dołków świeżą pożywkę wzrostową. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkanek i wymieniaj pożywkę co 48 godzin.W tym przypadku ograniczający komórki PEG został spolimeryzowany w postaci cienkiej warstwy z wykorzystaniem wzoru testowego, aby selektywnie przytwierdzić dysocjowane komórki do pokrytej kolagenem membrany podpór przepuszczalnych. Komórki znakowano po 48 godzinach inkubacji. Żywe komórki znakowane Calcein AM barwią się na zielono, natomiast martwe komórki znakowane Ethidium Homodimer-1 barwią się na czerwono.Można zauważyć, że minimalne przyleganie komórek występuje w obszarze zawierającym cienką warstwę PEG. Jest to przykład niepożądanego wyniku. Częściowa polimeryzacja PEG doprowadziła do powstania bezużytecznej konstrukcji z PEG.Nieprawidłowa polimeryzacja może wystąpić z powodu obecności menisku w medium prepolimerycznym, niewystarczającej ilości medium polimeryzacyjnego, niewystarczającej ekspozycji na promieniowanie UV lub niewłaściwej ostrości optyki. Jest to przykład nieudanej trójwymiarowej enkapsulacji kultury roślinnej A-D-R-G-X w dwuskładnikowym hydrożelu. Na tym obrazie widać, że neuryty zaznaczone na zielono były w stanie wzrastać poza ukształtowanymi kanałami typu peg.Dzieje się to często, jeśli podczas wstrzykiwania czysta macierz przeleje się na część PEG. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne standardowe metody, takie jak patch-clamping lub immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące m.in. elektrofizjologii lub ekspresji fenotypowej.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania fotolitografii z dynamiczną projekcją maski do określania prezentacji geometrycznej pojedynczych lub podwójnych systemów hydrożelowych w badaniach kultur komórek neuronalnych.

fabrication-micropatterned-hydrogels-for-neural-culture-systems-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wytwarzanie mikrofasonowanych hydrożeli dla systemów hodowli neuronów z wykorzystaniem dynamicznej projekcji maski w fotolitografii

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Opisane są protokoły dla układu mikroprzepływowego pojedynczego neuronu i maskowania wody dla wbudowanego w układ plazmowy wzór powłok biomateriałowych. Wysoce powiązane ze sobą kokultury można przygotować przy użyciu minimalnego wkładu komórek.

Przygotowanie kokultur neuronalnych z precyzją pojedynczej komórki

Opisujemy wytwarzanie arkuszy hydrożelowych z mikrowzorzystymi elementami za pomocą prostego procesu, który może być składany i manipulowany w formie wolnostojącej. Korzystając z tych modułowych arkuszy hydrożelowych, można wygenerować prosty system hodowli komórkowych 3D w skali makro z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym.

Budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3D w skali makro

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Opisujemy sekwencyjny proces tworzenia za pośrednictwem światła i późniejszego biochemicznego wzorcowania syntetycznych matryc hydrożelowych do zastosowań w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Przedstawiono budowę i modyfikację hydrożeli za pomocą cytokompatybilnej chemii photoclick. Ponadto przedstawiono łatwe techniki ilościowego określania i obserwacji wzorców oraz określania żywotności komórek w tych hydrożelach.

Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Opisane są protokoły wytwarzania degradowalnych termoresponsywnych hydrożeli opartych na sieciowaniu hydrazonów polimerowych oligomerów na skalę masową, mikroskalową i nanoskalę, przy czym ta ostatnia służy do przygotowania zarówno nanocząstek żelowych, jak i nanowłókien.

Wytwarzanie degradowalnych termoczułych hydrożeli w różnych skalach długości za pomocą wytłaczania reaktywnego, mikrofluidyki, samoorganizacji i elektroprzędzenia

Ten protokół wprowadza metodę mikrowzorowania bez litografii, która jest prosta i dostępna dla osób z ograniczonym doświadczeniem w bioinżynierii. Metoda ta wykorzystuje spersonalizowane, wycinane laserowo szablony do mikromodelowania białek macierzy zewnątrzkomórkowej w kształcie interesującym do modulowania morfologii komórek. Procedura mikrowzorcowania została zademonstrowana przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Proste, wolne od litografii mikromodelowanie pojedynczych komórek przy użyciu szablonów wycinanych laserowo

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia zautomatyzowane wytwarzanie mikrowzorów, które standaryzują kształt komórki, do badania struktur cytoszkieletu w komórkach ssaków. Ta przyjazna dla użytkownika technika może być skonfigurowana z dostępnymi na rynku systemami obrazowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu niedostępnego dla standardowych laboratoriów biologii komórki.

Kontrola geometrii komórki za pomocą mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Druk 3D w skali mikrometrycznej umożliwia szybkie prototypowanie urządzeń polimerowych do hodowli komórek neuronalnych. Jako dowód słuszności zasady, połączenia strukturalne między neuronami były ograniczane przez tworzenie barier i kanałów wpływających na rozrost neurytów, podczas gdy funkcjonalne konsekwencje takiej manipulacji zaobserwowano za pomocą elektrofizjologii zewnątrzkomórkowej.

Polimeryzacja dwufotonowa: druk 3D urządzeń do hodowli komórek neuronalnych w mikroskali

Poznaj technikę wytwarzania mikrowzorcowych hydrożeli do hodowli neuronowej z wykorzystaniem dynamicznej fotolitografii projekcyjnej maski. Metoda ta umożliwia badanie żywotności komórek nerwowych i wzrostu neuritów.

Wytwarzanie mikrowzorcowych hydrożeli do systemów hodowli neuronowych z wykorzystaniem dynamicznej fotolitografii projekcyjnej maski (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

Przeglądaj więcej filmów