Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie mikrostrukturyzowanego, podwójnego systemu hodowli komórkowej w hydrożelu do badań neuronowych. Osiąga się to poprzez uprzednie wysianie implantów tkankowych, takich jak embrionalne zwoje korzeni grzbietowych, na przepuszczalnych insertach do hodowli komórkowej. Następnie, przy użyciu urządzenia cyfrowych mikroluster (DMD) jako dynamicznej maski światłoczułej, tworzony jest mikro wzór w hydrożelu sieciowanym fotochemicznie.

Następnie dodaje się samoorganizujący się hydrożel typu pure, który może zawierać zawiesinę zdysocjowanych komórek. Przed analizą komórkową niezbędny jest odpowiedni czas inkubacji. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące żywotność komórek neuronalnych oraz wzrost neurytów w określonych konfiguracjach geometrycznych zdefiniowanych przez DMD.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest możliwość szybkiego tworzenia, modyfikowania i rzutowania z dystansu dynamicznej maski świetlnej, co pozwala na dopasowanie do niemal każdego podłoża, takiego jak przepuszczalne wkładki do hodowli komórkowej. Choć metoda ta pozwala na badanie układów neuronalnych, może być również stosowana w innych układach, w których pożyteczne byłoby zastosowanie określonych ograniczeń geometrycznych, takich jak sygnalizacja komórkowa, migracja komórek, kontakt międzykomórkowy czy morfogeneza. Płyta DMD, światła UV, prowadnice oraz obiektyw z powiększeniem 4x są zamontowane pionowo na stole wibroizolacyjnym.

Mikroskop odwrócony jest umieszczony poniżej obiektywu w taki sposób, aby skupione światło odbite od DMD mogło być wizualizowane za pomocą mikroskopu. Dodatkowe szczegóły dotyczące konfiguracji DMD znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym. Najpierw przygotuj sześciostudniowe inserty do hodowli komórkowych powlekane kolagenem do hodowli eksplantatów X; pokryj ścianki insertów do hodowli komórkowych preparatem Rain-X, uważając, aby nie nakładać Rain-X na samą membranę.

Następnie do wkładów dodaj 1,5 mililitrów pożywki aian i inkubuj przez noc w temperaturze 37°C i przy 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia, po pobraniu zwojów korzeni grzbietowych embrionów z szczurów w 15. dniu embrionalnym (E15), przenieś do czterech zwojów DRG na każdy powlekany kolagenem wkład sześciodołkowy i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37°C i przy 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić przyleganie DRG do błony.

Po okresie inkubacji DRG będą gotowe do fotopolimeryzacji. Cyfrowe urządzenie mikro-lustrzane (DMD) to macierz 1024 na 768 pojedynczych luster, które selektywnie odbijają światło w zależności od położenia lustra. W tej procedurze DMD jest wykorzystywane do rzutowania wzorów światła ultrafioletowego na fotopolimeryzowalne hydrożele (photo CROs, linkable hydrogels), co pozwala na proste i szybkie tworzenie określonych geometrii hydrożeli.

Chociaż nasz DMD jest samodzielną jednostką, urządzenie to może być również zintegrowane z wieloma istniejącymi mikroskopami. Najpierw wyjmij rośliny DRGX z inkubatora i odessij cały nadmiar cieczy z insertu. Następnie dodaj 500 µL medium do polimeryzacji do wnętrza insertu.

Przenieś inserty z roślinami DRGX na szkiełko przedmiotowe i umieść szkiełko pod urządzeniem DMD. Użyj programu graficznego interfejsu użytkownika ALP three, aby wczytać na DMD czarno-biały obraz, który będzie służył jako maska fotograficzna. W tym przypadku wybrano kształt rozwidlony, aby umożliwić wdrożenie systemów naprowadzania neurytów przy użyciu mikroskopu odwróconego i widzialnego źródła światła DI.

Wyrównaj wycinek tkanki z odpowiednim miejscem na masce fotograficznej, wykorzystując światło odbite od DMD jako prowadnicę. Następnie zastąp widzialne źródło światła źródłem światła UV. Naświetl medium polimeryzacyjne wewnątrz hodowli komórkowej.

Wstawić do momentu, aż sieciowanie PEG zostanie zakończone. Powtórzyć dla każdego DRG na wkładce. Następnie przemyć każdą wkładkę trzy razy sterylnym roztworem soli fosforanowej w buforze (PBS) z dodatkiem 1% penicyliny i streptomycyny.

Na koniec dodać 1,5 mililitra pożywki pod wkłady do hodowli komórkowej i pozostawić do wyrównania w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut. W czasie inkubacji poddać czystą macierz sonikacji przez 30 minut. Aby rozpuścić peptydy, rozcieńczyć dostarczony 1% roztwór do stężenia 0,15% w sterylnej wodzie i uzupełnić o jeden mikrogram na mililitr rozpuszczalnej lamininy.

Po 30 minutach wyjmij kultury z inkubatora i odessaj cały nadmiar pożywki z insertu. Następnie, obserwując pustą przestrzeń pod mikroskopem, odessaj pożywkę z wnętrza obszaru pustki w konstrukcie PEG zawierającym eksplant DRGX i naciśnij pipetę, wprowadzając około 1 µL czystego roztworu macierzy do pustki wokół eksplantu X. Upewnij się, że czysta macierz nie przelewa się poza pustkę w słupku.

Następnie pipetujemy 1,5 ml pożywki wzrostowej pod wkładkę i umieszczamy w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C i przy 5% CO2 na jedną godzinę. Aby zapewnić pełną adaptację po tym czasie, należy wymienić pożywkę wzrostową, a następnie ponownie umieścić hodowle w inkubatorze. Pożywkę wzrostową wymienia się co 48 godzin hodowli.

Tutaj przedstawiono przykłady dwuskładnikowych konstrukcji hydrożelowych zawierających rośliny DRGX. Rośliny DRGX zostały znakowane markerami wzrostu i proliferacji. Zpolimeryzowana konstrukcja PEG ma kolor szary, neuryty DRG znakowane beta-tubuliną III mają kolor zielony, a barwienie DPI wybarwia jądra komórkowe na niebiesko.

Zwróć uwagę, że migracja komórek i rozszerzanie retikulów są ograniczone do obszaru konstrukcji z podwójnego hydrożelu przepuszczalnego dla komórek. Inkapsulacja w podwójnym hydrożelu jest odpowiednia przy zastosowaniu dowolnego żelu samomontującego się oraz żelu sieciowalnego fotochemicznie. W tym przypadku PEG służy jako wsparcie strukturalne dla geometrycznej prezentacji żelu samomontującego się.

Na przykład czysta macierz lub aris. Rodzaj żelu i wybór maski fotograficznej będą zależeć od konkretnego, zamierzonego zastosowania. Ścianki poliestrowego wkładu do hodowli komórkowych potraktować preparatem Rain-X, zgodnie z wcześniej zaprezentowaną procedurą.

Przenieś wkład na szkiełko pokryte Rain-X i umieść go pod DMD. Następnie dodaj do wkładu 500 µL medium polimeryzacyjnego. Wczytaj na DMD odpowiednią maskę dla tego eksperymentu przeżywalności.

Do obrazowania komórek wykorzystuje się cylindryczną prezentację czystej macierzy. W celu zaindukowania sieciowania PEG po procesie sieciowania, należy naświetlać wkładkę światłem UV przez 55 sekund. Nowo powstałą wolną przestrzeń należy przemyć sterylnym DPBS oraz 1% pen strep.

Użyj mikropipety lub sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby usunąć cały nadmiar cieczy z wolnej przestrzeni. Przygotuj czysty Matrixx poprzez sonikację przez 30 minut, rozcieńczając go do stężenia 0,15% w sterylnej wodzie z dodatkiem 1 µg/ml rozpuszczalnej lamininy oraz 10% sacharozy. Następnie, poprzez wirowanie, wytrącaj w formie pelletu komórki przeznaczone do hodowli.

Dokładnie odessaj pożywkę z osadu komórkowego, a następnie zawieś osad w 0,15% roztworze pure matrix do stężenia około 5 × 10³ komórek/ml. Kluczowe jest całkowite odessanie pożywki z osadu komórkowego, ponieważ pure matrix rozpoczyna proces samoorganizacji w kontakcie z roztworem soli. Następnie pipetuj około 1 µL uzupełnionej mieszaniny komórek w pure matrix do otworu w pegu.

Taka objętość jest zazwyczaj wystarczająca, aby wypełnić pustą przestrzeń bez przepełnienia; pipetujemy 1,5 milliliters pożywki wzrostowej pod wkładkę. Następnie umieszcza się czysty hydrożel macierzy wtórnej w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 degrees Celsius i 5% carbon dioxide na jedną godzinę, aby zapewnić całkowitą żelację. Po tym czasie odsysamy pożywkę i dodajemy świeżą pożywkę pod wkładkę, uważając, aby nie uszkodzić mechanicznie słabej czystej macierzy.

Przenieś hodowle z powrotem do inkubatora do hodowli tkanek i wymieniaj pożywkę co 48 godzin hodowli. Oto przykłady żywych neuronów DRG zamkniętych w różnych konstrukcjach z hydrożelu podwójnego. Po 48 godzinach w pożywce wzrostowej komórki zostały znakowane wskaźnikiem calcium am, który jest markerem żywych komórek i wykazuje zieloną fluorescencję.

W tym przypadku, ze względu na dynamiczny charakter maski fotograficznej DMD, geometria dostępna do enkapsulacji jest ograniczona jedynie wymiarami i rozdzielczością układu optycznego. Pojedyncza enkapsulacja w hydrożelu jest odpowiednia w sytuacjach, gdy komórki mogą być badane wewnątrz sieciującego światłem hydrożelu, co odpowiada hodowli komórkowej w poliestrze. Wprowadzić przy użyciu Rain-X i umieścić pod DMD na szkiełku pokrytym Rain-X.

Podobnie jak poprzednio, pipetuj komórki przeznaczone do hodowli bezpośrednio do medium polimeryzacyjnego w pożądanym stężeniu i wymieszaj dokładnie, aby zapewnić jednorodny rozkład. Następnie pipetuj 500 µL mieszaniny komórek w medium polimeryzacyjnym do insertu. Wybierz odpowiednią maskę i załaduj ją na DMD, a następnie zindukuj sieciowanie PEG poprzez ekspozycję na światło UV przez 55 sekund.

W badaniach przeżywalności komórek stosuje się podstawową maskę kołową w celu odwzorowania cylindra; należy przemyć insert trzy razy sterylnym DPBS oraz 1% pen strep, a następnie pipetować 1,5 milliliters medium wzrostowego pod insert oraz wystarczającą ilość medium wzrostowego na górze, aby w pełni zanurzyć insert; inkubować w 37 degrees Celsius i 5% carbon dioxide z wymianą medium co 48 godzin. Oto przykład żywych, dysocjowanych neuronów korowych enkapsulowanych w PEG. Żywe komórki są znakowane calcium am i wykazują kolor zielony, natomiast martwe komórki są znakowane ahy homodimer one i wykazują kolor czerwony.

Enkapsulacja w PEG ma charakter wyłącznie przykładowy, ponieważ PEG nie stanowi optymalnego środowiska dla komórek neuronalnych. Wybrana geometria reprezentuje prosty sposób badania żywotności komórek, lecz może zostać dostosowana do szerokiego zakresu struktur. Cienkowarstwowe hydrożele mogą być wykorzystywane do generowania specyficznych wzorów ograniczonego rozmieszczenia komórek.

Ponownie potraktuj poliestrowy wkład do hodowli komórkowych preparatem Rain X, tak jak wcześniej, i umieść go na szkiełku potraktowanym Rain X. Następnie pipetuj od 250 do 300 µL medium do polimeryzacji na dno przygotowanego wkładu do hodowli komórkowej. Taka objętość jest wystarczająca, aby tylko przykryć dno wkładu; inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 do 45 minut, aby medium przeniknęło przez membranę wkładu, a następnie odessaj nadmiar medium z wkładu za pomocą mikropipety.

Następnie pipetuj odpowiednią ilość oleju transparentnego w zakresie UV na dno wkładki, aby całkowicie pokryć ten obszar. Inkubuj wkładkę w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut, co pozwoli olejowi na utworzenie wyraźnej warstwy nad medium polimeryzacyjnym. Po nasyceniu membrany wkładki załaduj odpowiednią maskę na DMD.

Po umieszczeniu wkładki i szkiełka pod DMD zaindukuj sieciowanie pegu poprzez naświetlanie światłem UV. Przemyj wkładkę trzy razy sterylnym DPBS oraz 1% pen strap, a następnie przenieś wkładkę do sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej, aby zebrać i scentryfugować komórki przeznaczone do hodowli. Odsącz medium i resuspenduj pellet komórkowy w medium wzrostowym do pożądanego stężenia w zakresie od 10⁴ do 10⁶ komórek na ml.

Następnie do insertu do hodowli komórkowej pipetujemy odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej, aby uzyskać pożądaną gęstość komórek. Pod insert dodajemy wystarczającą ilość pożywki wzrostowej, aby w pełni utrzymać żywotność komórek. Inkubujemy w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przez 48 godzin.

Przemyj wkładkę trzykrotnie sterylnym DPBS z 1% pen strep, aby usunąć niezwiązane komórki. Następnie dodaj do dołków świeżą pożywkę wzrostową. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkanek i wymieniaj pożywkę co 48 godzin.

W tym przypadku ograniczający komórki PEG został spolimeryzowany w postaci cienkiej warstwy z wykorzystaniem wzoru testowego, aby selektywnie przytwierdzić dysocjowane komórki do pokrytej kolagenem membrany podpór przepuszczalnych. Komórki znakowano po 48 godzinach inkubacji. Żywe komórki znakowane Calcein AM barwią się na zielono, natomiast martwe komórki znakowane Ethidium Homodimer-1 barwią się na czerwono.

Można zauważyć, że minimalne przyleganie komórek występuje w obszarze zawierającym cienką warstwę PEG. Jest to przykład niepożądanego wyniku. Częściowa polimeryzacja PEG doprowadziła do powstania bezużytecznej konstrukcji z PEG.

Nieprawidłowa polimeryzacja może wystąpić z powodu obecności menisku w medium prepolimerycznym, niewystarczającej ilości medium polimeryzacyjnego, niewystarczającej ekspozycji na promieniowanie UV lub niewłaściwej ostrości optyki. Jest to przykład nieudanej trójwymiarowej enkapsulacji kultury roślinnej A-D-R-G-X w dwuskładnikowym hydrożelu. Na tym obrazie widać, że neuryty zaznaczone na zielono były w stanie wzrastać poza ukształtowanymi kanałami typu peg.

Dzieje się to często, jeśli podczas wstrzykiwania czysta macierz przeleje się na część PEG. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne standardowe metody, takie jak patch-clamping lub immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące m.in. elektrofizjologii lub ekspresji fenotypowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania fotolitografii z dynamiczną projekcją maski do określania prezentacji geometrycznej pojedynczych lub podwójnych systemów hydrożelowych w badaniach kultur komórek neuronalnych.