Badanie trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych wzorach receptorowych
13 lutego 2011
Opisujemy protokół obserwacji i analizy trajektorii toczenia się komórek na podłożach z asymetrycznymi wzorami receptorowymi. Otrzymane dane są użyteczne przy projektowaniu podłoży z wzorami receptorowymi do bezetykietowej separacji i analizy komórek.
Niniejszy protokół opisuje obserwację i analizę trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych wzorach receptorów, co ma na celu ułatwienie projektowania podłoży z wzorami receptorów do bezznaczeniowej separacji i analizy komórek. Procedurę rozpoczyna się od mikrokontaktowego drukowania cząsteczek PEG na złotym podłożu w celu utworzenia naprzemiennych wzorów samoorganizujących się monowarstw, a następnie wypełnienia pozostałych przestrzeni podłoża receptorami P-selektyny. Następnie podłoże zostaje zintegrowane z komorą przepływową. Do komory wprowadzane są komórki HL 60 w przepływie.
Należy zarejestrować sekwencję obrazów oddziaływania toczących się komórek HL 60 na wzorach P-selektyny, a następnie przeanalizować obrazy przekonwertowane z wideo. Trajektorie toczących się komórek, śledzenie krawędzi, długość, a także prędkości toczenia się na płaszczyźnie, w obszarze i na krawędzi mogą zostać wyznaczone przy użyciu programu MATLAB. Metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w sposób poruszania się komórek HL 60 na asymetrycznych wzorach receptorów w przepływie ścinającym.
Metodę tę można zastosować do ilościowego określania innych oddziaływań powierzchniowych komórek, bezpośredniej analizy komórek poprzez obserwację ich trajektorii na wzorach receptorowych oraz do projektowania urządzeń mikrostrukturalnych do separacji komórek. Mikrodośladownictwo (micro contact printing) jest wykorzystywane do tworzenia naprzemiennych wzorów samoorganizujących się monowarstw cząsteczek PEG na podłożu złotym.
Najpierw pokryj stempel z PDMS roztworem PEG o stężeniu 5 mM w etanolu. Susz powierzchnię przez 20 minut. Delikatnie przyłóż stempel do powierzchni złota na 40 sekund, upewniając się, że istnieje dobry kontakt między powierzchnią złota a stemplami.
Nie jest wymagane nadciśnienie. Przemyj powierzchnię etanolem i wysusz strumieniem azotu. Następnie, korzystając z komory perfuzyjnej, inkubuj podłoża w roztworze P selectin o stężeniu 15 µg/mL przez trzy godziny w temperaturze pokojowej, aby pokryć pozostałe obszary P selectin, przemyj komorę, a następnie wypełnij powierzchnie 1 mg/mL BSA przez jedną godzinę w celu zablokowania niespecyficznych oddziaływań.
Przed przeprowadzeniem eksperymentu z toczeniem się komórek należy wypłukać powierzchnię buforem DPBS. Złożyć komorę przepływową, a następnie przeprowadzić przepływ zawiesiny komórek HL 60 w stężeniu 10⁵ komórek/ml nad powierzchniami z wzorem w prostokątnej komorze przepływowej z kątem nachylenia wzoru receptorowego wynoszącym 10 stopni.
W temperaturze pokojowej 24,5 °C. Ustaw pompę strzykawkową tak, aby uzyskać przepływ rzędu 75 µL/min, co odpowiada laminarnemu naprężeniu ścinającemu wynoszącemu 0,5 dyn/cm². Następnie, używając mikroskopu odwróconego i zamontowanej kamery, zarejestruj toczenie się komórek HL 60.
Interakcje z adhezyjnymi p-selektynami i podłożami. Przy użyciu obiektywu 4x przy częstotliwości jednej klatki na sekundę przez czas 300 sekund. Przeprowadzić trzy niezależne eksperymenty.
Dane należy przedstawić jako średnią i odchylenie standardowe wartości średnich uzyskanych w każdym eksperymencie. Obrazy mikroskopowe przekonwertowane z filmu HL 60.Rolling. Interakcje z adhezyjnym p-selektyną i podłożami wykazują jasne i ciemne obszary odpowiadające odpowiednio receptorom p-selektyny i obszarom PEG.
Ślady zostały wyznaczone przy użyciu dostosowanego programu MATLAB. Kąt nachylenia krawędzi wynosił 10 stopni, a naprężenie ścinające 0,5 dyny na centymetr kwadratowy. Dalsze analizy oparto na rozkładzie długości śladów krawędziowych, średniej wartości długości śladu krawędziowego, a także na VE i VP, czyli prędkościach toczenia się na krawędzi i wewnątrz pasm.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu badania trajektorii komórkowych przy asymetrycznych wzorach receptorów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje obserwację i analizę trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych wzorach receptorowych, aby ułatwić projektowanie podłoży z wzorami receptorowymi do bezetykietowej separacji i analizy komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Biomateriały
- Mikroprzepływy
Wprowadzenie
- Turlanie komórek jest kluczowym procesem w wielu oddziaływaniach biologicznych.
- Asymetryczne wzory receptorowe mogą wpływać na zachowanie komórek.
- Techniki bezetykietowe są niezbędne do separacji i analizy komórek.
- Mikrodruk kontaktowy jest użyteczną metodą tworzenia podłoży wzorzystych.
Cel badania
- Opracowanie protokołu obserwacji toczenia się komórek na podłożach z wzorem receptorowym.
- Analiza trajektorii toczących się komórek w celu usprawnienia inżynierii podłoży.
- Zapewnienie wglądu w dynamikę ruchu komórek w warunkach przepływu.
Zastosowane metody
- Mikrodruk kontaktowy cząsteczek PEG na złotym podłożu.
- Tworzenie naprzemiennych wzorów samozorganizujących się monowarstw.
- Wypełnianie pozostałych wolnych przestrzeni podłoża P-selektyną oraz receptorami.
- Implementacja w komorze przepływowej i obrazowanie komórek HL-60 toczących się po wzorach.
Główne wyniki
- Nagrano sekwencje obrazów oddziaływań komórek HL-60.
- Trajektorie toczących się komórek przeanalizowano za pomocą programu MATLAB.
- Uzyskano dane dotyczące długości śledzenia krawędzi oraz prędkości toczenia się komórek.
- Przedstawiono wnioski dotyczące ruchu komórek na asymetrycznych wzorach receptorów.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia szczegółową analizę dynamiki toczenia się komórek.
- W celu skutecznej separacji komórek można zaprojektować asymetryczne wzory receptorów.
- Metoda ta przyczynia się do zrozumienia zachowania komórek w przepływie ścinającym.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie trajektorii toczenia się komórek po asymetrycznych wzorach receptorów umożliwia racjonalne projektowanie bezetykietowych mikrofluidycznych urządzeń separacyjnych. Niniejszy protokół dostarcza ilościowych danych na temat długości śledzenia krawędzi oraz prędkości toczenia się w określonym naprężeniu ścinającym, co wspiera modelowanie predykcyjne zachowania komórek w przepływie. Takie spostrzeżenia ograniczają liczbę empirycznych iteracji w inżynierii urządzeń przeznaczonych do oczyszczania komórek oraz analizy fenotypowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie kinetyki wiązania ligand-receptor w warunkach fizjologicznego ścinania, co dostarcza informacji niezbędnych do walidacji celów w obrębie szlaków zależnych od adhezji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia metodę bezznacznika do oceny funkcjonalnej aktywności receptorów bez konieczności stosowania znaczników fluorescencyjnych lub reporterów genetycznych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych wyników prędkości toczenia się komórek oraz długości śledzenia krawędzi w celu analizy porównawczej dla różnych gęstości receptorów lub geometrii wzorów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie podłoża za pomocą mikrostemplowania oraz integracji z komorą przepływową, co umożliwia powtarzalne testy adhezji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka strategii separacji opartych na adhezji poprzez powiązanie projektu wzorca receptorów z obserwowalnymi wynikami trajektorii komórek.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przesiewanie fenotypów komórkowych na podstawie zachowania tocznego, co jest użyteczne przy wzbogacaniu subpopulacji w modelach przedklinicznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w początkową fazę odkrywania leków, służąc jako podstawa do opracowania analiz i tworzenia narzędzi przedklinicznych, szczególnie w przypadku celów molekularnych, w których adhezja w przepływie stanowi funkcjonalny odczyt.
- Biologia odkryć: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących oddziaływań receptor-ligand w przepływie ścinającym, wyjaśniając mechanistyczny wkład w proces toczenia się komórek.
- Screening: Dostarcza standaryzowanych, ilościowych mierników adhezji, umożliwiających porównywanie linii komórkowych lub modulatorów receptorowych.
- Analityka: Generuje rozkłady długości śledzenia krawędzi oraz prędkości toczenia, zapewniając statystyczną podstawę do porównania warunków.
- Badania translacyjne: Łączy dynamikę toczenia in vitro z potencjalną użytecznością w urządzeniach do bezmarkerowej separacji komórek w przedklinicznym przetwarzaniu próbek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do oceny zachowania komórek zależnego od adhezji dla wielu celów i typów komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do mechanizmów separacji opartych na adhezji poprzez ilościowe określanie parametrów trajektorii w kontrolowanym ścinaniu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji druku mikrokontaktowego, wypełnianiu receptorów (backfilling) oraz konfiguracji komory przepływowej.
- Wartość strategiczna: Redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach opracowywania urządzeń, umożliwiając wczesną walidację funkcjonalną wzorów receptorowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje typu go/no-go dla technologii separacji mikrofluidalnych poprzez dostarczenie empirycznych danych na temat wydajności wzorów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie druku mikrokontaktowego, chemii powierzchni oraz mikrofluidycznej kontroli przepływu.
- Zależne od dostępu do odwróconej mikroskopii w polu jasnym, kamery wysokich prędkości oraz narzędzi do śledzenia cząstek opartych na programie MATLAB.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji wytwarzania podłoży oraz raportowania warunków przepływu w celu zapewnienia powtarzalności w wielu ośrodkach.
- Adaptacja do alternatywnych typów komórek wymaga walidacji par ligand-receptor oraz optymalizacji parametrów naprężenia ścinającego.
- Ograniczone przez przejściowy charakter oddziaływań na krawędziach komórek, co utrudnia pełną rekonstrukcję trajektorii i wymaga analizy segmentowej.
