Name: Elektrofizjologia Skorpiona Peg Sensilla (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Poznaj elektrofizjologiczną metodę rejestracji z pojedynczych sensilli skorpiona w oleju mineralnym. Technika ta pozwala izolować stymulację chemiczną i badać chemosensorykę u skorpionów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy funduszowi Life, Programowi Możliwości Badawczych dla Studentów Uniwersytetu w Oklahomie oraz Katedrze Zoologii za sfinansowanie tych prac. Dziękujemy również dr Mariëlle Hoefnagels za pomoc redakcyjną.

1. Przygotowanie żywego zwierzęcia przed nagrywaniem
<ol>
	<li>Wyjmij skorpiona ze słoika i umieść go w schłodzonym naczyniu szklanym; następnie włóż naczynie ze skorpionem do środowiska mroźnego (-5 °C) na minimum dwie minuty. Czas ten może się różnić w zależności od wieku, rozmiaru, gatunku itp. konkretnego badanego skorpiona. Zazwyczaj faza mrożenia kończy się, gdy zwierzę pozostanie nieruchome.</li>
	<li>Po dwóch minutach wyjmij unieruchomionego skorpiona ze schłodzonego naczynia szklanego i ułoż go stroną brzuszną do góry na szkiełku mikroskopowym. Unieruchom żądło, ogon, odnóża i pedipalpy za pomocą plastycznej gliny (na bazie olejów, Van Aken Plastalina).</li>
	<li>Przygotuj platformę, na której zostaną umieszczone grzebienie skorpiona. Dostosuj długość i szerokość platformy do rozmiaru grzebienia. Zazwyczaj nasze platformy są wykonane z nakrywki szkiełka mikroskopowego i mają wymiary około 10(L) X 18(W) mm.</li>
	<li>Przyklej dwustronną taśmę klejącą do platformy pod grzebień, przycinając taśmę (jeśli to konieczne), aby pasowała do wymiarów.</li>
	<li>Aby stworzyć komorę grzebieniową, zanurz trzy z czterech boków platformy w uprzednio roztopionym wosku (stosujemy 100% płatków wosku pszczelego) na głębokość 3-4 mm. Wosk roztapiamy, umieszczając płatki w szklanej płytce Petriego na płycie grzejnej. Po ochłodzeniu wosku na krawędziach komory grzebieniowej do temperatury pokojowej powinny powstać ścianki woskowe o wysokości około 1 mm.</li>
	<li>Zlokalizuj u zwierzęcia miejsce przyczepu grzebienia i umieść niepowleczoną woskiem krawędź platformy (stroną z taśmą do góry) bezpośrednio za nim. Następnie ustabilizuj platformę (tak, aby nie przesuwała się w późniejszym czasie), delikatnie dociskając jej prawe i lewe krawędzie peryferyjne do gliny użytej do unieruchomienia odnóży zwierzęcia.</li>
	<li>Za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami ostrożnie umieść grzebień lub grzebienie wewnątrz komory. Konkretnie, trzymając pęsetą grzebień wzdłuż kolca grzebieniowego, delikatnie wysuń grzebień spod nakrywki szklanej i opuść go na klejącą powierzchnię platformy. Utwórz połączenie grzebienia z taśmą, ostrożnie dociskając kolec grzebieniowy.</li>
	<li>Teraz nanieś roztopiony wosk (używamy podgrzanej metalowej szpatułki) na niepowleczoną woskiem krawędź platformy. Cel jest dwukrotny: zabezpieczyć grzebień oraz całkowicie zamknąć komorę w celu późniejszego wprowadzenia oleju mineralnego. Zachowaj ostrożność podczas nakładania wosku nad grzebieniem zwierzęcia, ponieważ zbyt gorący wosk może go uszkodzić.</li>
	<li>Konstrukcja komory grzebieniowej jest zakończona. Następnie wykonaj połączenie z elektrodą obojętną z hemolimfą zwierzęcia, wprowadzając srebrny drut pomiędzy dwa segmenty ogona.</li>
</ol>
2. Symultaniczne rejestrowanie zewnątrzkomórkowe i stymulacja chemiczna
<ol>
	<li>Przygotowujemy zwierzę na 24 h przed przeprowadzeniem zewnątrzkomórkowych pomiarów metodą tip-recording, co – między innymi ze względu na aklimatyzację zwierzęcia do ustalonej pozycji – pozwala na wykonanie pipet stymulujących o specyficznej (zależnej od sensillum) średnicy końcówki. Do uzyskania takich parametrów wykorzystujemy wyciągacz mikrokapilar. Idealnie średnica pipet powinna być o ≈ 2 μm większa od średnicy poru sensillarnego. Parametry mikrokapilar dostosowujemy odpowiednio dla każdego zwierzęcia.</li>
	<li>Na 1 h przed rejestracją dodajemy 5 μl oleju mineralnego do komory grzebieniowej, zanurzając grzebień w oleju. Następnie umieszczamy zwierzę pod wysokiej klasy mikroskopem wyposażonym w obiektywy o dużej odległości roboczej i oświetlenie episkopowe.</li>
	<li>Aby chemicznie stymulować sensilla peg, wprowadzamy wodne substancje smakowe (np. kwas cytrynowy i sól) przez medium olejowe. Najpierw, za pomocą napełniacza mikrokapilar, wstrzykujemy stymulant do pipety stymulującej. Uwaga: wszystkie roztwory stymulujące powinny zawierać elektrolit w celu zapewnienia przewodnictwa elektrycznego.</li>
	<li>Następnie, po umieszczeniu pipety stymulującej w mikromanipulatorze (w układzie rejestracyjnym), wkładamy elektrodę pomiarową do tępego, otwartego końca pipety stymulującej. Ważne jest zapewnienie kontaktu między metalową elektrodą a elektrolitycznym roztworem stymulującym.</li>
	<li>Po uziemieniu elektrycznym preparatu (poprzez elektrodę obojętną), po prostu opuszczamy pipetę przez medium olejowe na por sensillarny. Czas trwania stymulacji chemicznej pojedynczego sensillum grzebieniowego może wynosić od trzydziestu minut do jednej sekundy. Zazwyczaj możemy pobrać próbki z wielu pegów (&gt; 30) przy użyciu jednej pipety. W przypadku zapchania pipety stymulującej drobnymi zanieczyszczeniami, należy wymienić zapchaną pipetę na nową, nieużywaną.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zwierzęcia do wielodniowych eksperymentów
<ol>
	<li>Jeśli zwierzę ma być wykorzystywane przez dłuższy czas, zalecamy ponowne użycie komory grzebieniowej i wymianę kropli oleju mineralnego przed każdą sesją rejestracyjną. Po zakończeniu danej sesji rejestracyjnej należy usunąć zwierzę z układu pomiarowego i przeprowadzić płukanie olejem mineralnym.</li>
	<li>W tym celu należy dodać do komory kolejną kroplę (5 μl) oleju mineralnego, a następnie usunąć cały olej. Pomaga to zminimalizować obecność pozostałości stymulatora, który mógł wycieknąć z pipety podczas sesji rejestracyjnej.</li>
	<li>Przed kolejną sesją należy dodać jedną kroplę oleju, zgodnie z wcześniejszym opisem.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
W zależności od zastosowanego sprzętu rejestrującego (np. konkretnego wzmacniacza, sprzętu do digitalizacji itp.), reprezentatywnym wynikiem jest rejestracja pozakomórkowa ze stosunkiem S:N wynoszącym co najmniej 3:1.
Prawidłowe przygotowanie komory z olejem mineralnym jest niezbędne do izolacji stymulacji chemicznej poszczególnych sensyli, ponieważ zapewnia ona medium do dostarczania polarnych (na bazie wody) substancji smakowych8. Jeśli oleju jest zbyt mało lub nie ma go wcale, roztwór stymulujący rozprzestrzeni się z rejestrowanego sensillum na sensyla sąsiednie, co prawdopodobnie spowoduje przedłużoną, niekontrolowaną stymulację chemiczną8.

<ol><li>Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+a+Primary+Chemoreceptor+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Physiology of a Primary Chemoreceptor unit.</a> Science. 12, 417-418 (1955).</li>
<li>Newland, P. L. Taste processing in the insect nervous system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNewland%2C+PL+%22Methods+in+Insect+Sensory+Neuroscience%22">Methods in Insect Sensory Neuroscience</a>. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 289-318 (2005).</li>
<li>Foelix, R. F., Müller-Vorholt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+scorpion+sensory+organs+II.+Pecten+sensilla%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Br.+Arachnol.+Soc%22%5BJournal%5D)">The fine structure of scorpion sensory organs II. Pecten sensilla.</a> Bull. Br. Arachnol. Soc. 6, 68-74 (1983).</li>
<li>Carthy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structure+and+function+of+the+sensory+pegs+on+the+scorpion+pecten%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Fine structure and function of the sensory pegs on the scorpion pecten.</a> Experientia. 22, 89-91 (1966).</li>
<li>Gaffin, D. D., Brownell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+properties+of+chemosensory+peg+sensilla+on+the+pectines+of+scorpions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Response properties of chemosensory peg sensilla on the pectines of scorpions.</a> J. Comp. Physiol. A. 181, 291-300 (1997).</li>
<li>Wolf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pectine+organs+of+the+scorpion%2C+Vaejovis+spinigerus%3A+Structure+and+%28glomerular%29+central+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Struct.+Dev%22%5BJournal%5D)">The pectine organs of the scorpion, Vaejovis spinigerus: Structure and (glomerular) central projections.</a> Arthropod Struct. Dev. 37, 67-80 (2008).</li>
<li>Gaffin, D. D., Brownell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+evidence+of+synaptic+interactions+within+chemosensory+sensilla+of+scorpion+pectines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological evidence of synaptic interactions within chemosensory sensilla of scorpion pectines.</a> J. Comp. Physiol. A. 181, 301-307 (1997).</li>
<li>Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+examining+scorpion+peg+sensilla%3A+the+mineral+oil+flood+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Arachnol%22%5BJournal%5D)">A new approach to examining scorpion peg sensilla: the mineral oil flood technique.</a> J. Arachnol. 37, 379-382 (2009).</li>
<li>Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tip-recording+method+to+test+scorpion+pecten+chemoresponses+to+water-soluble+stimulants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new tip-recording method to test scorpion pecten chemoresponses to water-soluble stimulants.</a> J. Neurosci Methods. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Haupt, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antennal+sucrose+perception+in+the+honey+bee+%28Apis+mellifera+L.%29%3A+behaviour+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Antennal sucrose perception in the honey bee (Apis mellifera L.): behaviour and electrophysiology.</a> J. Comp. Physiol. A. 190, 735-745 (2004).</li>
<li>Bland, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensilla+on+the+antennae%2C+mouthparts%2C+and+body+of+the+larva+of+the+alfalfa+weevil%2C+hypera+postica+%28gyllenhal%29+%28Coleoptera+%3A+Curculionidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Insect+Morphol.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Sensilla on the antennae, mouthparts, and body of the larva of the alfalfa weevil, hypera postica (gyllenhal) (Coleoptera : Curculionidae).</a> Int. J. Insect Morphol. Embryol. 12, 261-272 (1983).</li>
<li>Cate, H. S., Derby, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooded+Sensilla+Homologues%3A+Structural+Variations+of+a+Widely+Distributed+Bimodal+Chemomechanosensillum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hooded Sensilla Homologues: Structural Variations of a Widely Distributed Bimodal Chemomechanosensillum.</a> J. Comp. Neurol. 444, 345-357 (2002).</li>
</ol>

Metody te opublikowaliśmy wcześniej w dwóch czasopismach: Knowlton i Gaffin (2009) oraz Knowlton i Gaffin (w druku).

Powyższy protokół opisuje sposób przygotowania skorpiona z preri pustynnych (Paruroctonus utahensis) do badań elektrofizjologicznych. W szczególności pokazujemy, jak zbudować komorę do kontrolowanych zewnątrzkomórkowych rejestracji z końcówki elektrody z neuronów chemosensorycznych grzebieni pod warstwą oleju. Ponieważ olej i woda nie mieszają się, możliwe jest ograniczenie stymulacji chemicznej (za pomocą stymulantów na bazie wody) do pojedynczych sensyli. Należy podkreślić, że P. utahensis jest stosunkowo małym zwierzęciem (≈ 2,5-5 cm) i zastosowanie tego protokołu u większych zwierząt może wymagać wielu korekt rozmiarowych, takich jak wymiary platformy dla zwierzęcia, komory oraz ilość zastosowanego oleju. Zalecamy przeprowadzenie badań pilotażowych w celu ustalenia minimalnej ilości oleju niezbędnej do kontrolowanego podawania wodnych stymulantów chemicznych.
Ponadto nie stwierdzono wpływu oleju na podstawową aktywność neuronalną w sensylach grzebieniowych8. Należy to potwierdzić również w przypadku innych systemów modelowych przed oceną chemoodpowiedzi.
Tę metodę można stosować w połączeniu z inną metodą w celu zbadania efektów interakcji odpowiedzi chemicznej pomiędzy sensillami w polu sensorycznym. Na przykład możliwe jest rejestrowanie sygnału z wierzchołka (pod warstwą oleju) jednej sensilli, podczas gdy rejestrujemy sygnał z podstawy (za pomocą elektrody wolframowej) sąsiedniej sensilli9. Taka konfiguracja rejestracji może być wykorzystana do oceny, czy stymulacja chemiczna jednej sensilli wpływa na aktywność neuronalną sensilli rejestrowanej u podstawy. Do tej pory nikt nie badał tego zjawiska w przypadku sensilli grzebieniowych skorpionów, a kwestia ta pozostaje otwarta również dla innych systemów chemosensorycznych.
Podsumowując, uważamy, że metoda rejestracji końcówką elektrody w środowisku olejowym poszerza zakres badań elektrofizjologicznych nad neuronalnymi podstawami smaku u stawonogów. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół przygotowania zwierząt do tej metody i mamy nadzieję, że stanowić on będzie solidną podstawę dla dalszych badań nad obwodowymi układami nerwowymi zmysłów.

<table><tbody><tr><td>Karta Lift-N-Press</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16082</td><td>Dwustronna taśma klejąca</td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF34G</td><td>Wypełniacz do mikropipet</td></tr><tr><td>Standardowe kapilary szklane</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-6</td><td>Pipety szklane</td></tr><tr><td>Uchwyt mikro&amp;#8211;elektrody</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MEH3SBW10</td><td></td></tr></tbody></table>

elektrofizjologia sensilli typu peg u skorpionów

Electrophysiology of Scorpion Peg Sensilla

Opisujemy modyfikację istniejącej techniki rejestracji końcówkowej (tip-recording)1,2 służącą do elektrofizycznych badań krótkich, przypominających kołki sensilli sensorycznych3,4. Na środkowej powierzchni brzusznej wszystkich skorpionów znajdują się dwie wyrostki zwane grzebieniami (pectines), które posiadają gęste pola mechanoreceptywnych i chemoreceptywnych sensilli w formie kołków5,6. Jedna z metod oceny chemoreaktywności tych sensilli wykorzystuje elektrodę wolframową do pozakomórkowej rejestracji aktywności neuronalnej wewnątrz sensillum podczas wprowadzania lotnego substancji zapachowej do pola sensorycznego5,7. Ograniczenia tej metody obejmują powolny zbiór danych oraz brak kontroli nad wprowadzaniem i usuwaniem stymulanta z pola kołków. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy nową technikę rejestracji końcówkowej, w której wykorzystuje się niepolarny olej mineralny jako medium do dostarczania substancji smakowych na bazie wody do pojedynczych sensilli w formie kołków8,9. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę w celu uzyskania chemoreakcji sensillarnych na kwas cytrynowy, etanol i sól. W niniejszym pracy opisujemy protokół eksperymentalny dla takiego badania9. Uważamy, że ta nowa metoda może być użyteczna w badaniu właściwości odpowiedzi innych chemoreceptywnych systemów stawonogów, w tym owadów10, 11 i skorupiaków12.

W niniejszym artykule opisano metodę elektrofizjologiczną służącą do izolowanej stymulacji chemicznej poszczególnych sensilli poprzez zewnątrzkomórkowe rejestracje końcówkowe w oleju mineralnym.

Elektrofizjologia sensilli typu peg u skorpionów

Opisujemy modyfikację istniejącej techniki rejestracji za pomocą mikroelektrody (tip-recording)1,2, służącą do badań elektrofizjologicznych krótkich, przypominających kołki sensilli sensorycznych3,4. Na...

Ogólnym celem tej procedury jest badanie fizjologii chemosensorycznej poszczególnych włosków (pegilla) w grzebieniu skorpiona. Osiąga się to poprzez unieruchomienie znieczulonego skorpiona na szkiełku podstawowym stroną brzuszną do góry. Wykorzystanie plasteliny do stabilizacji wymaga zanurzenia grzebieni w specjalnie wykonanej komorze wypełnionej olejem oraz przygotowania elektrod wypełnionych stymulantem chemicznym.Reakcje chemosensoryczne są rejestrowane w poszczególnych illach na grzebieniu, które ostatecznie wykazują podobne profile odpowiedzi na wodne chemostymulanty. Rejestrowaliśmy sygnały u podstawy ill, podczas gdy nad porami przedmuchiwano lotne stymulanty. Główną zaletą techniki rejestracji z wierzchołka jest to, że pozwala ona na izolację stymulacji do jednego segmentu, bez wpływu na aktywność sąsiednich struktur.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii chemosensorycznej, na przykład: dlaczego zwierzęta wykorzystują tak wiele powtarzających się rzęsek w procesie detekcji i percepcji chemicznej? Skorpiony mogą nie wydawać się najbezpieczniejszymi zwierzętami do badań, jednak nie wszystkie gatunki są niebezpieczne lub trudne w hodowli. Na przykład skorpiony stepowe z terenów pustynnych osiągają długość zaledwie czterech do pięciu centymetrów, są łatwe w utrzymaniu w warunkach laboratoryjnych i rzadko żądlą, jeśli są odpowiednio obchodzeni.W przypadku użądlenia jad sztucznie pobudza neurony sensoryczne, z których niektóre przekazują informacje o bólu. Uczucie to zazwyczaj ustępuje po około 15 minutach. Skorpiony są wytrzymałymi obiektami badawczymi i mogą znosić wielodniowe eksperymenty, po których często są zwracane do swoich siedlisk.Po zakończeniu eksperymentu, aby unieruchomić skorpiona, umieść go w schłodzonym wcześniej szklanym pojemniku. Następnie włóż słoik ze skorpionem do zamrażarki na minimum dwie minuty i wyjmij go, gdy zwierzę przestanie się poruszać. Teraz umieść unieruchomionego skorpiona stroną brzuszną do góry na szkiełku przedmiotowym.Unieruchom odnóża ogona z żądłem oraz odnóża chodne za pomocą modeliny. Grzebienie skorpiona to sparowane struktury przypominające grzebienie, znajdujące się w pobliżu narządów płciowych, charakterystyczne wyłącznie dla tych zwierząt. Należy przygotować komorę, która pomieści pojedynczy grzebień, bez konieczności usuwania go z organizmu zwierzęcia.Najpierw należy przygotować platformę dla pektyny, wykorzystując szkiełko nakrywkowe docięte do wymiarów około 5 mm na 18 mm, co zazwyczaj jest wystarczające. Następnie należy przykleić do platformy dwustronną taśmę klejącą i w razie potrzeby przyciąć ją do odpowiedniego rozmiaru.Po trzecie, rozpuść niewielką ilość płatków 100% wosku pszczelego w szklanym naczyniu za pomocą płyty grzejnej. Następnie zanurz trzy z czterech krawędzi platformy w roztopionym wosku pszczelim na głębokość od trzech do czterech milimetrów. Schłodzony wosk służy jako ścianka do utworzenia komory.Następnie umieść niewymieszaną krawędź platformy tuż za punktem przyczepu grzebienia u zwierzęcia. Stabilizuj platformę, delikatnie dociskając jej prawe i lewe krawędzie peryferyjne do gliny użytej do unieruchomienia nóg zwierzęcia za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami. Ostrożnie chwyć jeden z grzebieni wzdłuż kolca grzebieniowego, delikatnie wysuń go spod szkiełka nakrywki i opuść na klejące dno platformy.Przymocuj pektynę, ostrożnie naciskając kolce pektalne. Zamknij komorę, używając rozgrzanej metalowej szpatułki do naniesienia roztopionego wosku na niepołączoną krawędź platformy. Zwierzę jest teraz niemal gotowe do przeprowadzenia pomiarów elektrofizjologicznych.Teraz jest odpowiedni moment na wykonanie połączenia z elektrodą obojętną. Wprowadź srebrny drut między dwa segmenty ogona do hemolimfy skorpiona. Wciśnij część drutu wystającą z ciała zwierzęcia w glinę, aby go unieruchomić, pozostawiając wystarczającą długość, by dosięgnąć wzmacniacza.Następnie odstaw preparat na co najmniej godzinę przed wykonaniem pomiarów, aby mógł on osiąść. Użyj wyciągarki do mikro pipet, aby przygotować pipety o średnicy wewnętrznej o około dwa mikrony większej od średnicy otworu sensora, która różni się w zależności od zwierzęcia. Na godzinę przed pomiarem wypełnij komorę pektynową pięcioma mikrolitrami oleju mineralnego.Następnie umieść zwierzę pod mikroskopem o dużym powiększeniu, wyposażonym w obiektywy z dużą odległością roboczą oraz oświetlenie epistyczne, aby chemicznie stymulować włoski peg. Napełnij pipetę stymulującą roztworami smakowymi w roztworze elektrolitycznym. Używając mikropipetyzatora, przymocuj napełnioną pipetę stymulującą do mikromanipulatora.Następnie włóż elektrodę rejestrującą do otwartego końca pipety stymulującej. Ważne jest, aby zapewnić kontakt między metalową elektrodą a elektrolitycznym roztworem stymulującym. Podłącz przewody elektrod rejestrującej i obojętnej do wzmacniacza różnicowego.Wzmacniacz jest podłączony do oscyloskopu w celu wizualizacji aktywności elektrycznej oraz do głośnika, aby umożliwić słuchowe wykrywanie zmian elektrycznych. Układ jest teraz gotowy do rejestracji danych. Używając mikromanipulatora, ostrożnie opuść pipetę na por sensora.Zmiana na wyższe częstotliwości będzie słyszalna w momencie nawiązania kontaktu elektrycznego między elektrolitem pipety a płynem wewnątrz sensa peg. W tym czasie można również usłyszeć charakterystyczne trzaski potencjałów czynnościowych neuronów. Czas trwania stymulacji chemicznej dla każdego sensa może wynosić od 30 minut do zaledwie jednej sekundy.Zazwyczaj jedna pipeta pozwala na pobranie próbek z ponad 30 pinów. Pipety zapchane należy zastąpić czystymi. Przygotowanie pipet jest proste, a ich zatykanie zdarza się często, dlatego należy zawsze mieć w pogotowiu zapasowe pipety.Możliwe jest rejestrowanie sygnałów z jednego zwierzęcia przez kilka godzin w ramach jednej sesji pomiarowej przed koniecznością wymiany oleju mineralnego. Pojedyncze zwierzę może pozostawać w uchwycie pomiarowym podczas wielu sesji rejestracyjnych przeprowadzanych w ciągu kilku kolejnych dni. W przypadku kolejnych sesji należy ponownie wykorzystać komorę piersiową, ale wymienić olej mineralny.Należy po prostu usunąć cały zużyty olej za pomocą pipety i dodać świeżą kroplę. Pomaga to zminimalizować obecność pozostałości stymulanta, który mógł wycieknąć z pipety ze stymulantem podczas sesji rejestracji. Poniżej przedstawiono reprezentatywne rejestracje z końcówek dla różnych stymulantów.Ten zapis pokazuje stosunkowo spójną odpowiedź na 0,01 molarny chlorek potasu. Odpowiedź tego pinu na 0,1 molarny kwas cytrynowy rozpoczyna się znacznie intensywniej, a następnie jej intensywność maleje w ułamku sekundy, po czym następuje spadek częstotliwości. W typowej odpowiedzi na 30% ethanol zapis wykazuje serie z wieloma skokami przed krótkimi przerwami w aktywności podczas porównywania pomiarów z końcówki dla różnych odpowiedzi sensorycznych na ten sam stymulant, taki jak 0,1 molarny kwas cytrynowy.Reakcje są bardzo podobne. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o napełnieniu pipety stymulantem na bazie wody, który nie miesza się z ośrodkiem olejowym, co pozwala na chemiczną stymulację jednego lumy na raz. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak w sposób kontrolowany stymulować poszczególne CIN w grzebieniu skorpiona, wykorzystując olej mineralny jako ośrodek.

electrophysiology-of-scorpion-peg-sensilla

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Elektrofizjologia czułek Peg skorpiona

Reakcje elektrofizjologiczne neuronów sensorycznych węchu na odoranty u owadów można mierzyć za pomocą rejestracji z pojedynczych sensyli. W tym artykule wideo zademonstrujemy, jak przeprowadzić rejestrację z pojedynczych sensyli w czułkach muszki owocowej (Drosophila melanogaster) oraz w palpach szczękowych komara malarycznego (Anopheles gambiae).

Rejestracja z pojedynczych sensyli u owadów Drosophila melanogaster oraz Anopheles gambiae

Układy węchowe owadów zapewniają wyjątkowe możliwości rejestrowania odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w formie elektroantenogramów (EAG) oraz rejestracji z pojedynczych sensyli (SSR), które stanowią odpowiednio sumaryczne odpowiedzi wszystkich neuronów receptorowych zapachowych (ORNs) zlokalizowanych na antenie oraz tych znajdujących się w poszczególnych sensylach.

Pomiary elektrofizjologiczne z systemu węchowego ćmy

Opisujemy sekcję układu nerwowego zająca morskiego Aplysia po znieczuleniu, izolację neuronów do krótkotrwałej hodowli tkanek oraz zapisy prądów jonowych pojedynczej komórki za pomocą techniki patch clamp.

Izolacja neuronów czuciowych Aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych

Ten artykuł opisuje sekcję brzusznego rdzenia nerwowego karalucha oraz pozakomórkowe nagrania z nerwu szyjnego i łączników. Reakcje wywołane są generowane przez elektryczną stymulację nerwu szyjnego lub bezpośrednią mechaniczną stymulację szyjki macicy.

Zapis obwodu neuronalnego z nienaruszonego układu nerwowego karalucha

Ten artykuł opisuje trzy preparaty układu nerwowego za pomocą pijawek: wewnątrzkomórkowy zapis z neuronów w brzusznych zwojach, hodowlę neuronów z brzusznych zwojów oraz zapis z plamy unerwionej skóry do mapowania pól czuciowych.

Zapis wewnątrzkomórkowy, mapowanie pola sensorycznego i hodowla zidentyfikowanych neuronów w pijawce, Hirudo medicinalis

Ten protokół opisuje zewnątrzkomórkowy zapis odpowiedzi potencjału czynnościowego wyzwalanych przez neurony smaku etykietowego u Drosophila.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila labellar Taste Sensilla

Wykres penetracji elektrycznej (EPG) jest dobrze znaną techniką badania zachowań żywieniowych owadów noszących stylet. W tym artykule przedstawiamy nowe zastosowanie EPG jako nieinwazyjnego narzędzia do pozyskiwania wewnątrzkomórkowych zapisów elektrofizjologii elementów sitowych (SE), komórek tworzących naczynia krwionośne łyka u roślin.

Nowe zastosowanie wykresu penetracji elektrycznej (EPG) do akwizycji i pomiaru sygnałów elektrycznych w elementach sitowych łyka

Pluskwy polegają na neuronach receptorów węchowych umieszczonych w ich czułkach węchowych do wykrywania substancji semiochemicznych w środowisku. Wykorzystując rejestrację pojedynczego czujnika, demonstrujemy metodę oceny reakcji pluskiew na substancje semiochemiczne i badamy związany z tym proces kodowania.

Wykorzystanie pojedynczego zapisu sensillum do wykrywania reakcji neuronów węchowych pluskiew na substancje semiochemiczne

Ten artykuł opisuje szczegółowy i wysoce skuteczny protokół dla pojedynczych nagrań sensillum z sensilla basiconica na palpach aparatów gębowych owadów.

Single Sensillum Recordings dla Locust Palp Sensilla Basiconica

Aby zaobserwować ultrastrukturę wrażliwości owadów, w badaniu przedstawiono protokół przygotowania próbki za pomocą skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (odpowiednio SEM i TEM). Tween 20 został dodany do utrwalacza, aby uniknąć deformacji próbki w SEM. Mikroskopia fluorescencyjna była pomocna w poprawie dokładności krojenia w TEM.

Metoda przygotowania próbki skaningowego i transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla przydatków chrząszcza leśnego

To badanie przedstawia chirurgiczną manipulację polegającą na uwidocznieniu T-DRG u znieczulonych myszy do obrazowania wapnia in vivo, wraz z synchronicznymi zapisami EKG. Metoda ta stanowi najnowocześniejsze narzędzie do badania obwodowej stymulacji nerwów elektrycznych i danych wejściowych narządów trzewnych klatki piersiowej, a także ich interakcji na podstawowym poziomie sensorycznym.

Obrazowanie in vivo wapnia zwojów korzenia grzbietowego klatki piersiowej (DRG) i zapis EKG w celu badania stymulacji nerwów obwodowych

Poznaj elektrofizjologiczną metodę rejestracji z pojedynczych sensilli skorpiona w oleju mineralnym. Technika ta pozwala izolować stymulację chemiczną i badać chemosensorykę u skorpionów.

Elektrofizjologia sensilli typu peg u skorpionów

Przeglądaj więcej filmów