Mapowanie i zastosowanie ekspresji flippazy wzmacniająco-pułapkowej w ośrodkowym układzie nerwowym larw i dorosłych Drosophila

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest udoskonalenie ekspresji GAL 4 poprzez zastosowanie specyficznej tkankowo lipazy za pomocą narzędzi konwertujących GAL 80. Osiąga się to poprzez wygenerowanie kolekcji transgenicznych linii muchowych Philippe'a i określenie wzorca ekspresji lipazy w OUN w każdej linii. Korzystając z reportera GFP, raporty IMMUNOCHEMISTRY i GFP mogą odróżnić GL od ekspresji neuronalnej, aby przeciąć ekspresję GAL four w liniach zainteresowania Linie odwrócenia ET na muszkach zawierających narzędzie do przekształcania GAL 80 w potomstwie.

Analiza klonalna może być używana do analizy udoskonalenia wyrażenia GAL cztery, na przykład w oku. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że ulepszone linie oparte na odtwarzaniu ścieżek wraz z narzędziami do konwersji GAL 80 mogą być używane z szybką kolekcją GAL four alliance, która jest już dostępna w społeczności muchowej. Ponadto koncepcja ta może zostać rozszerzona na inne organizmy modelowe GALI four UAS, takie jak danio pręgowany.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące mapowania obwodów neuronowych leżących u podstaw zachowania. Chociaż protokół ten demonstruje zastosowanie zasady odwrócenia w podzbiorze komórek fotoreceptorowych, metoda intersekcjonalna może być stosowana do analizy innych tkanek, w tym tkanek nieneuronalnych. Jako bardziej wzmacniający scharakteryzowane są linie lipazy pułapkowej.

Podagra czwarta US jest ważną techniką szeroko stosowaną przez biologów much. Jednym z zastrzeżeń większości czterech linii GAL jest to, że jest ona wyrażona zbyt szeroko, aby można ją było wykorzystać do mapowania zachowań mózgu przy użyciu metod palcowych. Nie jest możliwe precyzyjne dostrojenie ekspresji GAL cztery w interesujących Cię koszulkach Przed użyciem transgenu ET w celu częściowego ograniczenia ekspresji czterech linii ekspresji GAL w tle.

Po pierwsze, pomocne jest poznanie wzorca ekspresji transgenu ET flip x two w późnym stadium rozwoju lawy, a u dorosłych wizualizacja ekspresji flip a w OUN ustaw krzyżówkę między samcami z ET t flip X dwoma transgenami będącymi przedmiotem zainteresowania i dziewiczymi samicami posiadającymi reportera GFP dla ekspresji et flip od potomstwa. Zbierz wędrujące larwy F1 w trzecim stadium rozwojowym do sekcji. Umieść je w czystym naczyniu S guard i usuń wszelkie zanieczyszczenia pędzlem, a następnie spłucz naczynie raz jednym PBS.

Teraz napełnij naczynie lodowatym zimnym raz PBS, aby znieczulić larwy, aby uzyskać dostęp do OUN lawy, przytrzymaj jej haczyk do ust za pomocą kleszczy. Chwyć naskórek w pobliżu rozszerzonej przedniej sfery i oderwij go z powrotem. OUN pozostaje przymocowany do haka ustnego wraz z kilkoma innymi strukturami.

Teraz za pomocą kleszczy usuń wszystkie te nadmiarowe struktury otaczające OUN podczas preparowania OUN. Przenieś je pojedynczo do naczynia Pyrex z trzema światami wypełnionego PBS. Po wypreparowaniu wszystkich OUN napraw je, całkowicie zanurzając je w 200 mikrolitrach 4% PFA na lodzie.

Jeśli OUN unosi się na wodzie, oznacza to, że nie został w pełni oczyszczony ze wszystkich otaczających tkanek. W takim przypadku użyj kleszczy, aby ponownie zanurzyć OUN w utrwalaczu po utrwaleniu na 15 minut, umyj tkankę lodowatym PB S3 razy, a następnie umyj tkankę jeszcze trzy razy w lodowatym PBT. Tkanka jest teraz gotowa do obrazowania lub znakowania za pomocą przeciwciał lub przechowywania w PBT w temperaturze czterech stopni Celsjusza na później.

Barwienie z tej samej krzyżówki, która służyła do zbierania przez larwy dorosłych F1 przed preparacją. Zanurzyłem od pięciu do 10 much i schłodziłem 95% etanol przez 30 sekund, aby usunąć wosk z powierzchni naskórka. Aby usunąć etanol, umyj dorosłe osoby trzy razy lodowatym raz PBS, a po trzecim umyciu przenieś jednego z nich do 35-milimetrowego naczynia sil guard wypełnionego lodowatym raz PBS, aby przygotować dorosłego do sekcji.

Umieść go brzuszną stroną do góry i włóż szpilkę sługusa w połowie brzucha. Rozpocznij preparację za pomocą kleszczy do usunięcia nóg. Następnie usuń naskórek głowy, przymocowując głowę do podpór i jednocześnie odrywając naskórek od spodu oka w kierunku czubka głowy.

Ostrożnie używając zaostrzonych kleszczy, usuń, śledź tkanki otaczające mózg, ponieważ śledź swoje tkanki mają silną autofluorescencję i sprawiają, że mózg unosi się podczas mocowania. Mózg jest tylko częścią dorosłego OUN. Druga część to brzuszny rdzeń nerwowy lub VNC w klatce piersiowej i należy ją również wypreparować.

Najpierw usuń naskórek klatki piersiowej, zabezpieczając rozporek u podstawy tylnej nogi i delikatnie ściągając naskórek klatki piersiowej aż do podstawy szyi. Po drugie, aby odsłonić VNC, delikatnie rozprowadź dwie połówki naskórka klatki piersiowej. Po trzecie, usuń brzuch z klatki piersiowej, zabezpieczając u podstawy drugiej nogi i odciągając brzuch w pobliżu pierwszej nocy z mieszaniem w jamie brzusznej.

Po czwarte, oczyść VNC, zabezpieczając w okolicy kości ramiennej i delikatnie odrywając tkankę otaczającą VNC. Rozerwij pierścień tkanki łącznej otaczający tkankę łączną szyjki macicy i kontynuuj usuwanie nadmiaru tkanki podczas zbierania mózgu. A VNC przenosi je jako gruszki do dziewięcioświatowego naczynia z Pyrexu wypełnionego schłodzonym kiedyś PBS trzymanym na lodzie.

Aby utrwalić dorosłe tkanki, zanurz je w 4% PFA na lodzie na 15 minut. Po kąpieli wykonaj trzy lodowate płukanki PBS i trzy myjki PBT. Tkanka jest teraz gotowa do obrazowania lub znakowania za pomocą przeciwciał w celu dokładnej analizy ekspresji transgenu.

Przydatne jest oznaczenie OUN markerami neuronalnymi lub glejowymi, aby zapewnić układ odniesienia, zacznij od inkubacji tkanki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc z przeciwciałami przeciwko neuronom lub glejowi następnego dnia. Przemyć preparat pięciokrotnie PBT i inkubować z fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Owinąć płytkę i folię, aby zapobiec fotowybielaniu przeciwciała po zakończeniu inkubacji.

Umyć preparat PBS i w całości zamontować preparat na szkiełku. Użyj plastikowego pierścienia OSHA, aby zapobiec zgnieceniu tkanki przez szkiełko nakrywkowe. Układ nerwowy jest teraz gotowy do zbadania pod kątem wzorców ekspresji GFP i LL pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Zazwyczaj bada się od trzech do pięciu powtórzeń w celu określenia odtwarzalności wzorca wyrażenia odwrócenia. Wzorzec ekspresji odwrócenia w odwróceniu, linia może być używana wraz z innymi transgenami, aby zmienić sposób wyrażania represora GAL cztery GAL 80. Zmiana wyrażenia represora GAL 80 jest skuteczną metodą wprowadzania zmian.

W ekspresji GAL four jedną z metod jest odwrócenie ekspresji GAL 80 za pomocą transgenu GAL 80, który dezaktywuje GAL 4, co w przeciwnym razie prowadzi do zwyrodnienia oka w całym oku. Skrót ET flip line 6 88 A jest tutaj używany do oceny skuteczności narzędzia konwertującego GAL 80 w podzbiorze fotoreceptorów w potomstwie F1, porównania fenotypu oka z fenotypem oka szczepów rodzicielskich. Każde pojawienie się deformacji lub depigmentacji oka potwierdza, że wzorzec ekspresji odwróconej jest obecny w fotoreceptorach i GAL 80 flipout zakończył się sukcesem.

Komplementarną, nienadmiarową strategią jest przerzucanie wyrażenia GAL 80 przy użyciu tej samej interesującej linii przerzucania. Ta strategia jest bardzo podobna do drugiej, ale teraz pigmentacja ID i degeneracja u potomstwa F1 są tłumione. W klapce X dwa.

Ekspresja fotoreceptorów Po opanowaniu rozbioru OUN można go przeprowadzić w ciągu około pięciu minut u dorosłych i jednej minuty u larw, jeśli zostanie przeprowadzony prawidłowo. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby użyć ostrych kleszczy do usunięcia tchawicy i tkanki otaczającej zarówno osobę dorosłą, jak i Libre C, a Ss.It ważne jest, aby do sekcji użyć naczynia wolnego od utrwalacza. Odwrócenie szoku cieplnego jest obecnie używane do generowania losowych klonów.

W przeciwieństwie do tego, odwrócenie pułapki wzmacniającej pozwala na generowanie powtarzalnych klonów, co ułatwia analizę morfologiczną i behawioralną. Kolejną mocną stroną metody palcowej jest to, że można jeszcze bardziej ograniczyć wzorce ekspresji GAL four, używając dodatkowych linii opartych na odwróceniu pułapki anan i innych linii gal. Słabością konfiguracji tubuliny GAL 80 jest to, że niektóre kombinacje efektorów GA four i UAS, takie jak LAG four i U-A-S-K-I-R, nie są kompatybilne, ponieważ zabijają muchy.

Problem ten można łatwo rozwiązać, stosując warunkowy efektor UAS, taki jak UAS Shiri Ts, który pozwala na zbadanie zachowania w restrykcyjnych temperaturach Zgodnie z oczekiwaniami. Nie wszystkie linie lipazy pułapki wzmacniającej wyrażają wystarczająco wysoki poziom lipazy, aby były użyteczne. Niemniej jednak, opisana tutaj technika palcowa zapewnia nowe podejście dla badaczy drosophila do udoskonalenia analizy mozaiki zarówno dla obwodów rozwojowych, jak i zachowania.