Name: Mapowanie i zastosowanie ekspresji flippazy wzmacniająco-pułapkowej w ośrodkowym układzie nerwowym larw i dorosłych Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę FINGR do precyzyjnej kontroli ekspresji genów w ośrodkowym układzie nerwowym larw i dorosłych Drosophila. Technika ta umożliwia szczegółową analizę klonalną i mapowanie obwodów nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy za wsparcie wewnętrznego funduszu University of Oklahoma (dla BZ) oraz grantu NSF (IOS-1025556, dla BZ i RAB), które umożliwiły finansowanie TRF, RAB, XP, AAO, MLW, CAS oraz niniejszych badań. Grant NIH (RO1 NS060878, dla BZ) częściowo wspierał RAB. RAB dziękuje za grant szkoleniowy NIH NRSA (T32 NS07292) przyznany Brandeis University oraz grant NIH (RO1 GM21473) przyznany Jeffreyowi Hallowi w Brandeis, które wsparły wczesne etapy tej pracy. Dziękujemy Jeffreyowi Hallowi za nieustanne wsparcie tego projektu. Dziękujemy dr Kristin Scott za udostępnienie szczepu tubP&gt;Gal80&gt;.

1. Szczepy Drosophila
<ol>
<li>Driver Gal4: 
GMR-Gal4, który wykazuje ekspresję Gal4 w komórkach fotoreceptorów.</li>
<li>Linie UAS 
UAS-MJD78Q (lub UAS-polyQ), która wywołuje degenerację neuronów w komórkach wykazujących ekspresję Gal4. 
UAS-GFP, która wykazuje ekspresję GFP w komórkach wykazujących ekspresję Gal4.</li>
<li>Linie FLP 
ey-FLP, która wykazuje ekspresję FLP w fotoreceptorach oraz w podzbiorach obszarów mózgu. 
Linie ET-FLPx2, będące liniami typu enhancer-trap zawierającymi dwie kopie FLP (FLP-IRES-FLP). Wygenerowano ok. 1 0 linii ET-FLP (Bohm et al., 2010), których wzorce ekspresji nie zostały jeszcze scharakteryzowane. W niniejszej pracy opisujemy charakterystykę wzorca ekspresji wybranych linii ET-FLPx2 w ośrodkowym układzie nerwowym (CNS) larwalnych i dorosłych much.</li>
<li>Reporter FLP 
yw, actinP&gt;CD2&gt;Gal4; UAS-GFP (Pignoni &amp; Zipursky, 1997), który raportuje wzorzec ekspresji ET-FLPx2 poprzez actinP&gt;Gal4; UAS-GFP po wycięciu sekwencji &gt;CD2 w wyniku rekombinacji zależnej od FLP.</li>
<li>Dwa komplementarne narzędzia konwertujące Gal80 
TubP&gt;Gal80&gt; (Gordon &amp; Scott, 209), konstrukt typu flip-out, który konstytutywnie wykazuje ekspresję Gal80 we wszystkich tkankach pod kontrolą silnego promotora tubuliny. Po rekombinacji zależnej od FLP sekwencja &gt;Gal80 zostaje usunięta (flipped out), a ekspresja Gal80 zostaje przerwana wyłącznie w tkankach wykazujących ekspresję ET-FLPx2. 
TubP&gt;stop&gt;Gal80 (Bohm et al., 2010), konstrukt typu flip-in, który w normalnych warunkach nie wykazuje ekspresji Gal80. Ekspresja Gal80 jest uruchamiana przez promotor tubuliny tylko w tkankach wykazujących ekspresję ET-FLPx2, w których FLP usuwa sekwencję &gt;stop i wprowadza (flips in) Gal80.</li>
<li>Muchy do badania aktywności FLP w oku złożonym 
GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;stop&gt;Gal80 (Bohm et al., 2010), które posiadają zdegenerowane i odbarwione oczy. W komórkach fotoreceptorów wykazujących ekspresję FLP ekspresja polyQ zostaje wyłączona po wprowadzeniu (flip-in) Gal80. 
GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;Gal80&gt; (Bohm et al., 2010), które posiadają prawidłowe oczy. W komórkach fotoreceptorów wykazujących ekspresję FLP ekspresja polyQ zostaje uruchomiona po usunięciu (flip-out) Gal80.</li>
</ol>

2. Odczynniki
Bufor fosforanowy (PBS, 1X), pH 7,4. 
4% paraformaldehyd (PFA), rozcieńczony w PBS z 16% PFA, stopień EM (Cat#15710, Electronic Microscopy Sciences, Hatfield, PA) 
PBT, 1XPBS zawierający 0,1% Triton-X 10 (Sigma) 
Przeciwciało anty-Elav (mAb, 9F8A9; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa), barwi wszystkie neurony u Drosophila. 
Przeciwciało anty-Repo (mAb 8D12; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa) barwi komórki glejowe u Drosophila. 
Wtórne przeciwciało anty-mysie z kurczaka Alexa 594 (Invitrogen)

3. Mapowanie wzorca ekspresji linii FLPx2 z pułapką enhancera (* kroki krytyczne)
<ol>
<li>Zebrać dziewicze samice z linii yw, actinP&gt;CD2&gt;Gal4; UAS-GFP i skrzyżować je z samcami poszczególnych linii ET-FLPx2. Pierwsza z nich służy jako reporter GFP dla ekspresji tkankowej ET-FLP.</li>
<li>*Przeprowadzić mikrodissekcję larw F1 w 3rd stadium poczwarki (etap wędrowania), wyizolować OUN (t.j. mózg i brzuszny sznur nerwowy, VNC) oraz ścianę ciała, utrwalić przez 1 godzinę w 4% PFA w lodzie, przemyć 3X lodowatym PBS, a następnie 3X PBT. 
Mikrodissekcja
<ol>
<li>Wyjąć wędrujące larwy F1 w 3rd stadium poczwarki i umieścić je w czystym naczyniu z Sylgardem (szalka Petriego 35 mm x 10 mm wypełniona 2 gramami Sylgardu – zmieszanego zgodnie z instrukcją producenta).
<ol>
	<li>Usunąć resztki pożywki za pomocą pędzelka</li></ol></li>
<li>Wypełnić naczynie lodowatym 1XPBS i umieścić na lodzie, aby znieczulić larwy</li>
<li>Przytrzymać haki gębowe larwy jedną pęsetą, chwycić kutykulę w pobliżu wysuniętego przedniego przetchawika drugą pęsetą i oddzielić kutykulę w kierunku końca tylnego. OUN zostanie oddzielony wraz z hakami gębowymi, gruczołami ślinowymi, jelitem i krążkami wyobraźnymi.</li>
<li>Usunąć nadmiar tkanek i krążki wyobraźne otaczające OUN.</li>
<li>Przenieść OUN do 3-dołkowego naczynia Pyrex wypełnionego PBS.<ol>
		<li>Można użyć silikonizowanej końcówki pipety P200, aby zapobiec wysuszeniu tkanek.</li></ol></li> 
<li>Utrwalić przez 1 godzinę w 20 μl 4% PFA w lodzie.<ol>	
		<li>Upewnić się, że OUN jest całkowicie zanurzony w PFA.<ol>
				<li>Jeśli OUN pływa, zwykle sugeruje to, że nie został on prawidłowo oczyszczony z tkanek otaczających.</li></ol></li></ol></li> 
<li>Przemyć 3X lodowatym PBS, a następnie 3X PBT.</li>
</ol>
</li>
<li>*Przeprowadzić mikrodissekcję OUN dorosłych much F1.
<ol>
<li>Znieczulić muchy CO2 lub umieścić muchy w pustej fiolce na lodzie przez 10 minut.</li>
<li>Umieścić dorosłe muchy w szklanym naczyniu wypełnionym 95% EtOH na lodzie na 30 s.</li>
<li>Przenieść dorosłe muchy do szklanego naczynia wypełnionego 1XPBS na lodzie.<ol>
		<li>Przemyć 3X lodowatym 1X PBS, aby usunąć pozostałości EtOH</li></ol></li> 
<li>Umieścić muchę w 35-milimetrowym naczyniu z Sylgardem wypełnionym lodowatym 1X PBS</li>
<li>Ułożyć muchę stroną brzuszną do góry i wbić małą szpilkę entomologiczną (szpilki minutiens 0,1 mm) w połowie odwłoka.<ol>
		<li>Przytrzymać podstawy nóg jedną pęsetą i usunąć nogi drugą pęsetą.</li></ol></li>
<li>Usunąć kutykulę głowy<ol>
	<li>Chwytając trąbkę jedną pęsetą, umieścić drugą pod okiem i oddzielić kutykulę w kierunku grzbietowej linii środkowej głowy muchy.</li> 
	<li>Chwycić drugie oko i usunąć pozostałą kutykulę z drugiej strony.</li> 
	<li>Za pomocą ostrych pęset i/lub zaostrzonej igły wolframowej usunąć tkankę tchawkową otaczającą mózg<ol>
	<li>Niewłaściwe oczyszczenie tchawki spowoduje silną autofluorescencję, która przesłoni ekspresję GFP, oraz sprawi, że mózg będzie pływał podczas utrwalania</li></ol></li></ol></li>
<li>Mikrodissekcja VNC<ol>
		<li>Usunąć kutykulę klatki piersiowej<ol>
				<li>Zaczynając od tylnego końca klatki piersiowej, umieścić dwie pęsety po każdej stronie 3rd preepisternum (t.j. chwytając podstawy tylnych nóg).</li>
				<li>Delikatnie oddzielić kutykulę od brzusznej linii środkowej; powtarzać tę czynność, aż dotrzeć do podstawy szyi.</li> 
				<li>Delikatnie rozsunąć dwie połowy kutykuli klatki piersiowej, odsłaniając VNC</li></ol></li>
		<li>Następnie oddzielić odwłok od klatki piersiowej. Trzymając klatkę piersiową jedną pęsetą u podstawy drugiej pary nóg, użyć drugiej pęsety, aby chwycić odwłok w pobliżu 1. sternitu odwłoka i odciągnąć odwłok.</li>
		<li>Aby oddzielić VNC od otaczających tkanek klatki piersiowej, przytrzymać obszar humeralny jedną pęsetą, a drugą pęsetą delikatnie oderwać większość szkieletu klatki piersiowej.</li> 
		<li>Na tym etapie powinien pozostać pierścień tkanki łącznej otaczający połączenie szyjne (szyję). Za pomocą dwóch pęset rozerwać ten pierścień.</li> 
		<li>Usunąć wszelkie nadmiarowe tkanki klatki piersiowej otaczające VNC</li></ol></li> 
<li>Przenieść mózg i VNC do 9-dołkowego naczynia Pyrex zawierającego 1X PBS na lodzie<ol>
		<li>Można użyć silikonizowanej końcówki pipety P20, aby zapobiec wysuszeniu tkanek</li></ol></li>
</ol>
</li>
<li>*Utrwalić dorosły OUN przez 1 godzinę w 4% PFA na lodzie, a następnie przemyć 3X lodowatym PBS i 3X PBT.</li>
<li>Inkubować preparat dorosłego OUN lub larwalnego OUN i ściany ciała w temperaturze 4°C przez noc z przeciwciałami przeciwko neuronom (anti-Elav, 1:10) lub glii (anti-Repo, 1:10). Przemyć preparat 5X PBT.</li>
<li>Inkubować preparat dorosły lub larwalny z wtórnym przeciwciałem Alexa 594 przeciwko myszy produkowanym w kurach (1:10) w temperaturze pokojowej przez 2 h, a następnie przemyć preparat PBS.</li>
<li>Zamontować larwalny lub dorosły OUN na szkiełku. Aby zachować naturalny kształt OUN, użyć na szkiełku plastikowego pierścienia w kształcie litery O (Clear Reinforcement Label, Avery Dennison, Office Products, Brea, CA) jako mini-mostka do podtrzymania szkiełka nakrywki.</li>
<li>Zbadać preparat pod kątem wzorców ekspresji GFP i Elav (lub Repo) pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
4. Zastosowanie dwóch komplementarnych narzędzi konwertujących Gal80 w celu represji Gal4 w fotoreceptorach
<ol>
<li>Usunięcie Gal80 za pomocą tubP&gt;Gal80&gt; (Rysunek 5A).<ol>
		<li>Wyselekcjonuj samce z linii GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;Gal80&gt;. Zauważ, że oczy złożone u tych much są prawidłowe.</li>
		<li>Skrzyżuj je z dziewiczymi samicami ey-FLP.</li>
		<li>Wyselekcjonuj muchy F1 i zbadaj fenotyp oka.</li></ol></li>
<li>Wprowadzenie Gal80 za pomocą tubP&gt;stop&gt;Gal80 (Rysunek 5B).<ol>
 		<li>Wyselekcjonuj samce much GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;stop&gt;Gal80 i zbadaj fenotyp oka. Zwróć uwagę na zdegenerowane i odbarwione oczy u tych much w porównaniu do szczepów typu dzikiego (Canton-S).</li> 
	<li>Skrzyżuj je z dziewiczymi samicami ey-FLP;</li>
	<li>Wyselekcjonuj muchy F1 i zbadaj fenotyp oka.</li></ol></li> 
<li>Wybierz linie ET-FLPx2 z ekspresją w komórkach fotoreceptorowych
	</li> 
</ol>
Kroki 4.1 i 4.2 można powtórzyć, używając linii ET-FLPx2, które wykazują ekspresję FLP w podzbiorze komórek fotoreceptorowych. Alternatywnie, muchy GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;stop&gt;Gal80 lub GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;Gal80&gt; można krzyżować z poszczególnymi liniami ET-FLPx2 w celu przesiewania linii wykazujących ekspresję FLP w komórkach fotoreceptorowych. Wartościowe linie ET-FLPx2 to te, które wykazują ekspresję FLP jedynie w podzbiorze lub pojedynczych komórkach fotoreceptorowych (Rysunek 6).
5. Reprezentatywne wyniki
Wzorzec ekspresji konkretnej linii ET-FLPx2 można łatwo zbadać i udokumentować w larwach F1 lub dorosłych muchach pochodzących z krzyżowania dziewic yw, actinP&gt;CD2&gt;Gal4; UAS-GFP oraz samców ET-FLPx2 (Rysunek 1). Typowo przeprowadza się sekcję i badanie od trzech do pięciu powtórzeń zwierząt F1, aby określić powtarzalność wzorca ekspresji FLP (Bohm et al., 2010). Rysunek 2 przedstawia wzorzec ekspresji FLP w linii ET-FLPx2 173A w ośrodkowym układzie nerwowym (CNS) larw i dorosłych osobników. Wzorzec FLP można dalej analizować przy użyciu markera neuronalnego lub glialnego (Rysunek 3 i 4). 
Wyniki przedstawione na Rysunku 7 ilustrują skuteczność systemów Gal80 flip-in i flip-out w interseksjonalnej represji Gal4 po rekombinacji pośredniczonej przez FLP. Konstrukt tubP&gt;stop&gt;Gal80 nie wykazuje żadnej nieszczelnej ekspresji Gal80 (na podstawie jednorodnej degeneracji i depigmentacji fotoreceptorów), a mimo to jest w 100% skuteczny w procesie wstawiania (flip-in) Gal80 przy pomocy eyFLP w celu represji GMR-Gal4 i przywrócenia oczom normalnego wyglądu (Rys. 7A). Przeciwnie, tubP&gt;Gal80&gt; w pełni represuje GMR-Gal4 przed wprowadzeniem eyFLP. Po usunięciu Gal80 (flip-out), GMR-Gal4 napędza ekspresję UAS-polyQ, co prowadzi do degeneracji i depigmentacji oczu (Rys. 7B). W tym przykładzie użyliśmy pan-fotoreceptorowego FLP do mapowania „obwodów” fotoreceptorów, lecz nie badaliśmy konsekwencji behawioralnych. Stosując podobne podejścia z liniami Gal4 istotnymi behawioralnie, zmapowaliśmy część obwodu CCAP-Gal4 regulującego rozprostowanie skrzydeł u dorosłych much (Bohm et al., 2010). Wierzymy, że metoda FINGR będzie cenna w pogłębianiu naszego zrozumienia neuronalnych podstaw zachowania.
<img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig1.jpg" alt="Schemat krzyżówek genetycznych *Drosophila*; ekspresja ET-FLPx2; badanie markera UAS-GFP; dymorfizm płciowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Analiza wzorca ekspresji linii ET-FLPx2. Wzorzec ekspresji FLP (niebieskie owale) z linii ET-FLPx2 można wyznaczyć poprzez skrzyżowanie samca ET-FLPx2 (lewa góra) z aktynąP&gt;CD2&gt;dziewicze Gal4; UAS-GFP (prawy górny róg). Ubikwitynowa aktynaP&gt;Ekspresja Gal4 u samicy rodzicielskiej jest hamowana przez insercję sekwencji CD2 flankowanej przez miejsca FRT (szare trójkąty). W potomstwie F1 rekombinaza FLP wytnie sekwencję CD2, co umożliwi ekspresję aktynyP&gt;Gal4 do sterowania ekspresją UAS-GFP.
<img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig2.jpg" alt="Mikroskopia rozwoju Drosophila, larwa vs. osobnik dorosły ET-FLP 173A, porównanie analizy fluorescencyjnej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Wzór ekspresji linii ET-FLPx2 w centralnym układzie nerwowym larw i osobników dorosłychObrazy te przedstawiają ośrodkowy układ nerwowy (mózg i brzuszny sznur nerwowy, VNC) wypreparowany z potomstwa uzyskanego z krzyżowania yw, actinP&gt;CD2&gt;rodziców Gal4 oraz UAS-GFP do linii ET-FLPx2 173A. Poprzez rekombinacyjne usunięcie &gt;CD2&gt; kaseta, FLP aktywuje aktynęP&gt;ekspresja GAL4 (wtórna ekspresja UAS-GFP). Zatem wzór GFP wskazuje komórki wykazujące ekspresję FLP. Panel A przedstawia wzorzec ekspresji FLP w larwach, natomiast panel B przedstawia wzorzec ekspresji u osobników dorosłych w linii 173A.
<img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig3.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna tkanki nerwowej, markery GFP wskazujące ekspresję genów, skala 200 μm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Charakterystyka typów komórek wykazujących ekspresję flippazy w linii ET-FLPx2 nr 688A. A, obraz kompozytowy utrwalonej F1 3rd larwa w stadium poczwarki zabarwiona przeciwciałem anty-REPO, pochodząca z krzyżówki linii ET-FLPx2 nr 68A i linii raportującej GFP Flippase. B-D, widok przy dużym powiększeniu (Zeiss Plan-Apochromat 63x oil) wykonany z tylnego końca VNC z 3Badania i rozwój stadia larwalne.
<img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig4.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające wzorce ekspresji genów; markery GFP i REPO w komórkach nerwowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4. Charakterystyka typów komórek w obrębie ciała grzybowego linii ET-FLPx2 nr 150. A-C, zdjęcie przy dużym powiększeniu (63x, imersja olejowa) ciał grzybowatych utrwalonej larwy F1 w trzecim stadium rozwojowym, barwionej przeciwciałem anty-REPO. 
<img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig5.jpg" alt="Schemat genetycznych strategii flip-in i flip-out; szlaki GMR-Gal4, polyQ+GFP, działanie flippazy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5. Ilustracja strategii Gal80 Flip-in i Flip-out. A. W strategii flip-out Gal80 pod promotorem tubuliny (TubP&gt;Gal80&gt;) wykazuje aktywność konstytutywną, co prowadzi do represji GMR-Gal4 i fenotypu oka typu dzikiego (czerwone oko). Represja ta jest zniesiona poprzez wprowadzenie FLP (fioletowy), który powoduje odwrócenie orientacji Gal80 (środek, czerwony), umożliwiając GMR-Gal4 stymulację ekspresji UAS-polyQ. Skutkuje to degeneracją komórek fotoreceptorowych (zilustrowaną białymi kropkami w oku). BW odwrotności do poprzedniej strategii, ekspresja Gal80 sterowana promotorem tubuliny jest przerywana przez kodon „stop” flankowany sekwencjami FRT (szary trójkąt). Wobec braku Gal80, GMR-Gal4 wiąże się z UAS-polyQ, co powoduje degenerację neuronalną w fotoreceptorach (zilustrowaną białymi kropkami w oku). Poprzez krzyżowanie GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;stop&gt;Samce GAL80 z dziewiczymi samicami wykazującymi ekspresję FLP w komórkach fotoreceptorów; FLP (fioletowy) katalizuje rekombinację w miejscach FRT, wycinając kodon „stop” (środek, czerwony), co umożliwia ekspresję Gal80 i represję GMR-Gal4. Zapobiega to neurodegeneracji w komórkach fotoreceptorów (zilustrowane brakiem białych kropek w oku).
<img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig6.jpg" alt="fenotyp złożonego oka Drosophila; wynik krzyżowania genetycznego; obraz mikroskopowy; UAS-GFP, GMR-Gal4." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rycina 6. Zastosowanie metody FINGR do wyciszenia Gal80 przy użyciu linii ET-FLPx2 nr 68A. Potomstwo F1 z krzyżówki linii ET-FLPx2 nr 68A (dziewice) z GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;Samce GAL80. Brak pigmentu w środkowej części ommatidiów oka reprezentuje ekspresję FLP w linii #68A. W tym obszarze zniesiono supresję GMR-Gal4 przez Gal80, co pozwoliło Gal4 na napędzanie UAS-polyQ.
<img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig7.jpg" alt="Porównanie mutacji oka Drosophila, GMR-Gal4, UAS-polyQ; tub&gt;P&gt;stop&gt;Gal80, wyniki eksperymentu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rycina 7. Zastosowanie metody FINGR w celu wprowadzenia lub usunięcia Gal80 w celu przecięcia się z Gal4 w fotoreceptorach. A. KuwetaP&gt;zatrzymaj&gt;System flip-in Gal80 ogranicza ekspresję GAL4 w sposób zależny od FLP. W GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;stop&gt;W przypadku much GAL80 komórki fotoreceptorowe są zdegenerowane i odbarwione (mucha po lewej). Po wprowadzeniu eyFLP białko Gal80 ulega ekspresji w komórkach fotoreceptorowych, co prowadzi do pełnej represji GMR-Gal4, co z kolei wyłącza ekspresję polyQ i daje muchy z prawidłowo rozwiniętymi oczami (mucha po prawej). B. KuwetaP&gt;Gal80&gt; system odchylny działa w sposób przeciwny do wannyP&gt;zatrzymaj&gt;System flip-in Gal80. TubP&gt;Gal80&gt; konstytutywnie represuje GAL4 i tłumi ekspresję polyQ (muszka po lewej, z normalnymi oczami). Po wprowadzeniu eyFLP Gal80 zostaje usunięte z komórek fotoreceptorów, co znosi supresję GMR-Gal4 i uruchamia ekspresję polyQ. Prowadzi to do powstania muszek zdegenerowanymi i odbarwionymi oczami (muszka po prawej).

<ol><li>Bohm, R. A., Welch, W. P., Goodnight, L. K., Cox, L. W., Henry, L. G., Gunter, T. C., Bao, H., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+mosaic+approach+for+neural+circuit+mapping+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A genetic mosaic approach for neural circuit mapping in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 16378-16383 (2010).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Bruno, B., Holbro, N., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+group+genes+are+required+for+neural+stem+cell+survival+in+postembryonic+neurogenesis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Polycomb group genes are required for neural stem cell survival in postembryonic neurogenesis of Drosophila.</a> Development. 134, 1091-1099 (2007).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. , 34-341 (2002).</li>
<li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302, 1765-1768 (2003).</li>
<li>Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+tissue+specific+transgene+expression+system+using+inducible+GAL4%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A conditional tissue specific transgene expression system using inducible GAL4.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).</li>
<li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Drosophila+eye+development+by+decapentaplegic%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of Drosophila eye development by decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li>
<li>Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%5BSwitch%5D%2C+a+system+for+spatial+and+temporal+control+of+gene+expression+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 12602-12607 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

System Gal4/UAS jest szeroko i z sukcesem wykorzystywany przez badaczy Drosophila w różnych studiach biologicznych (Brand &amp; Perrimon, 1993; Duffy, 2002). Do tej pory środowisko badawcze stworzyło tysiące linii Gal4 sterowanych przez promotory oraz linie typu enhancer-trap. Główną zaletą metody FINGR jest jej kompatybilność z systemem Gal4/UAS, co pozwala na znaczne zwiększenie możliwości wykorzystania Gal4 w badaniach nad Drosophila. 
Jednym z istotnych zastosowań metody FINGR jest precyzyjne dostrajanie obwodów neuronalnych leżących u podstaw zachowań poprzez przecięcie Gal4/Gal80. Zachowania te mogą obejmować, między innymi, uczenie się i pamięć, zaloty, sen oraz rytm okołodobowy. Metoda FINGR może być również wykorzystana do mapowania kluczowych neuronów podatnych na neurodegenerację w modelowaniu ludzkich chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, stwardnienie zanikowe boczniszne (ALS) oraz choroba Parkinsona. Podobnie, za pomocą metody FINGR można mapować skupiska neuronów lub obwodów neuronalnych kluczowych dla mediowania uzależnienia od kokainy, alkoholu i innych substancji. Należy zauważyć, że z metodą FINGR można stosować warunkowe Gal4 (Osterwalder et al., 2001; Roman et al., 2001), aby uzyskać kontrolę czasową nad obwodami neuronalnymi i zachowaniami. Modyfikacja narzędzi konwertujących Gal80 poprzez zastosowanie temperaturo-czułego Gal80 (Gal80ts, McGuire et al., 2003) może prowadzić do wytworzenia tubP&gt;stop&gt;Gal80ts lub tubP&gt;Gal80ts&gt;, co zapewnia dodatkową elastyczność czasową w manipulacji obwodami. Poza układem nerwowym metoda FINGR jest równie przydatna do ograniczania ekspresji Gal4 w podzbiorach komórek, niezależnie od tego, czy chodzi o skrzydło, czy odnogę. 
Linie ET-FLPx2 będą cennym zasobem dla wszystkich biologów badających Drosophila, zainteresowanych analizą klonalną opartą na systemie FRT/FLP (Xu &amp; Rubin, 1993), w tym metodą MARCM (Lee &amp; Luo, 1999). Przewiduje się również, że niektóre linie ET-FLPx2 mogą zastąpić heatshock-FLP w celu generowania powtarzalnych klonów oraz do wielokrotnych analiz morfologicznych i behawioralnych. Podobnie jak w przypadku linii Gal4 z pułapką enhancerową, większość linii ET-FLPx2 prawdopodobnie nie będzie wykaziwać ekspresji specyficznie w komórkach będących przedmiotem zainteresowania. Większość linii będzie exprimować FLP w komórkach docelowych ORAZ w innych komórkach lub tkankach. Jednak brak „specyficzności tkankowej” zarówno Gal4, jak i ET-FLPx2 nie będzie stanowił istotnego problemu dla metody FINGR, dopóki obszar ich nakładania się jest pożądany w konkretnym eksperymencie. Metoda FINGR została zaprojektowana tak, aby przekształcić dwa „szerokie” systemy w jeden precyzyjny.
Metody przedstawione w tych protokołach są dość standardowe i powinny być powtarzalne. Główne kroki wymagające szczególnej uwagi dotyczą wyboru i zastosowania utrwalacza. Należy unikać utrwalaczy innych niż PFA, ponieważ mogą one wygasić sygnał GFP. Zauważyliśmy również, że do utrwalania za pomocą PFA nie należy używać szalki do sekcji, aby uniknąć możliwości, w których ekspresja FLP nie będzie wiarygodnie raportowana przez GFP.

mapowanie i zastosowanie ekspresji flippazy w pułapkach enhancerów w oun larw i dorosłych osobników drosophila

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Metoda binarna Gal4/UAS jest potężnym narzędziem do manipulacji genami i obwodami neuronalnymi u Drosophila. W większości badań neurobiologicznych ekspresja Gal4 jest jednak rzadko na tyle specyficzna tkankowo, aby umożliwić precyzyjną korelację obwodu z odczytami behawioralnymi. Aby pokonać tę główną przeszkodę, opracowaliśmy niedawno metodę FINGR, pozwalającą na uzyskanie bardziej restrykcyjnej ekspresji Gal4 w interesującej nas tkance. Metoda FINGR składa się z trzech komponentów: 1) tradycyjnego systemu Gal4/UAS; 2) zestawu narzędzi do konwersji Gal80 opartych na systemie FLP/FRT; oraz 3) pułapki enhancerowej FLP (ET-FLP). Gal4 służy do zdefiniowania głównego, badanego obwodu neuronalnego. Parowanie Gal4 z efektorem UAS, takim jak UAS-MJD78Q lub UAS-Shits, reguluje aktywność neuronalną, co z kolei przejawia się zmianami w zachowaniu muchy. Dzięki zastosowaniu dodatkowego reportera UAS, takiego jak UAS-GFP, obwód neuronalny zaangażowany w konkretne zachowanie może być jednocześnie mapowany do analizy morfologicznej. W przypadku linii Gal4 o szerokiej ekspresji, można ją ograniczyć, stosując dwa komplementarne narzędzia konwersji Gal80: tubP&gt;Gal80&gt; („flip out”) oraz tubP&gt;stop&gt;Gal80 („flip in”). Wreszcie badacze mogą odpowiednio włączać lub wyłączać Gal80 przy pomocy tkankowo specyficznego ET-FLP. W trybie flip-in Gal80 będzie tłumić ekspresję Gal4 wszędzie tam, gdzie Gal4 i ET-FLP się przecinają. W trybie flip-out Gal80 zniesie represję Gal4 w komórkach, w których Gal4 i FLP nakładają się na siebie. Oba podejścia umożliwiają ograniczenie liczby komórek w obwodzie zdefiniowanym przez Gal4, ale w odwrotnych schematach. Metoda FINGR jest kompatybilna z ogromną kolekcją linii Gal4 dostępnych w społeczności badaczy much i jest niezwykle wszechstronna w tradycyjnej analizie klonalnej oraz w mapowaniu obwodów neuronalnych. W niniejszym protokole demonstrujemy mapowanie wzorców ekspresji FLP w wybranych liniach ET-FLPx2 oraz skuteczność metody FINGR w komórkach fotoreceptorów. Zasada metody FINGR powinna być również możliwa do zastosowania u innych organizmów modelowych, w których wykorzystuje się systemy Gal4/UAS, Gal80 oraz FLP/FRT.

Opisujemy metodę Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR), która pozwala wykorzystać tkankowo specyficzną FLP do określania wzorców ekspresji Gal80. W każdym miejscu, w którym Gal4 i FLP nakładają się na siebie, ekspresja Gal4 zostaje włączona (Gal80 zostaje usunięte – „flipped out”) lub wyłączona (Gal80 zostaje wstawione – „flipped in”). Metoda FINGR jest wszechstronnym narzędziem do analizy klonalnej i mapowania obwodów neuronalnych.

Mapowanie i zastosowanie ekspresji flippazy w pułapkach enhancerów w OUN larw i dorosłych osobników Drosophila

Metoda binarna Gal4/UAS jest potężnym narzędziem do manipulacji genami i obwodami neuronalnymi u Drosophila. Jednak w większości badań neurobiologicznych Gal4...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest doprecyzowanie ekspresji GAL4 poprzez zastosowanie specyficznej tkankowo lipazy wraz z narzędziami konwertującymi GAL80. Osiąga się to poprzez wygenerowanie kolekcji transgenicznych linii much Philippe z pułapką enhancerową oraz określenie wzorca ekspresji lipazy w obrębie OUN w każdej z linii. Wykorzystując reporter GFP, immunochemia i raporty GFP pozwalają odróżnić ekspresję gliaльную od neuronalnej, aby przeciąć ekspresję GAL4 w interesujących liniach ET flip w potomstwie much zawierających narzędzie konwertujące GAL80.Analiza klonalna może być wykorzystana do badania precyzji ekspresji GAL4, na przykład w oku. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość wykorzystania linii opartych na śledzeniu enhancerów wraz z narzędziami konwertującymi GAL80, co pozwala na szybkie korzystanie z szerokiej kolekcji linii GAL4 dostępnej już w społeczności badaczy muchy owocówki. Ponadto koncepcja ta może zostać rozszerzona na inne organizmy modelowe wykorzystujące system UAS/GAL4, takie jak zebrafish.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące mapowania obwodów neuronalnych leżących u podstaw zachowań. Chociaż niniejszy protokół demonstruje zastosowanie flip base w podgrupie komórek fotoreceptorów, metoda intersekcyjna może zostać zastosowana do analizy innych tkanek, w tym tkanek pozaneuronalnych, w miarę charakteryzacji kolejnych linii enhancer trap lipase.System GAL4/UAS jest istotną techniką powszechnie stosowaną przez biologów badających muchy. Jednym z ograniczeń większości linii GAL4 jest zbyt szeroka ekspresja, która uniemożliwia mapowanie zachowań w mózgu z wykorzystaniem metod funkcjonalnych. Przed zastosowaniem transgenu FLP-out w celu częściowego ograniczenia ekspresji linii GAL4, nie jest możliwe precyzyjne dostrojenie ekspresji GAL4 w interesujących badacza tkankach.W pierwszej kolejności warto poznać wzorzec ekspresji transgenu ET flip x two w późnych stadiach rozwoju larw oraz u osobników dorosłych, aby zwizualizować ekspresję flip a w OUN. Przeprowadź krzyżówkę między samcami z interesującym transgenem ET t flip X two a dziewiczymi samicami posiadającymi reporter GFP dla ekspresji et flip. Z potomstwa wybierz wędrujące larwy trzeciego stadium F1 do sekcji. Umieść je w czystej szalce S guard, usuń wszelkie zanieczyszczenia pędzelkiem i wypłucz szalkę raz roztworem 1x PBS.Następnie napełnij naczynie lodowatym 1x PBS, aby znieczulić larwy. Aby uzyskać dostęp do OUN larwy, przytrzymaj haczyk gębowy za pomocą pęsety. Chwyć kutykulę w pobliżu wysuniętej przedniej sfery i odchyl ją do tyłu. OUN pozostaje przytwierdzony do haczyka gębowego wraz z niektórymi innymi strukturami.Następnie za pomocą pęsety usuń wszystkie nadmiarowe struktury otaczające OUN podczas jego preparowania. Przenoś je pojedynczo do naczynia Pyrex wypełnionego PBS. Po wypreparowaniu wszystkich OUN utrwal je, całkowicie zanurzając w 200 µL 4% PFA w temperaturze 0°C.Jeśli OUN pływa, oznacza to, że nie został całkowicie oczyszczony z otaczających go tkanek. W takim przypadku należy użyć pincety, aby ponownie zanurzyć OUN w utrwalaczu na 15 minut, przemyć tkankę lodowatym PBS 3 razy, a następnie trzykrotnie przemyć tkankę lodowatym PBT. Tkanka jest teraz gotowa do obrazowania, znakowania przeciwciałami lub przechowywania w PBT w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego użycia.Barwienie z tego samego krzyżowania, które służyło do pozyskania larw, w celu zebrania dorosłych osobników F1 przed sekcją. Zanurzono od pięciu do 10 much w schłodzonym 95% etanolu na 30 sekund, aby usunąć wosk z powierzchni kutykuli. Aby usunąć etanol, przemyto dorosłe osobniki trzykrotnie lodowatym 1x PBS, a po trzecim przemyciu przeniesiono jednego z nich do 35-milimetrowej szalki typu sil guard wypełnionej lodowatym 1x PBS, aby przygotować osobnika do sekcji.Umieść go stroną brzuszną do góry i wetknij szpilkę entomologiczną w połowie długości odwłoka. Rozpocznij sekcję, używając pęsety do usunięcia nóg. Następnie usuń kutykulę głowy, unieruchamiając głowę w podpórkach i jednocześnie odrywając kutykulę od spodu oka w kierunku czubka głowy.Używając ostrożnie zaostrzonych pęsety, usuń i odsuń tkanki otaczające mózg, ponieważ tkanki te wykazują silną autofluorescencję, co powoduje unoszenie się mózgu podczas utrwalania. Mózg jest tylko częścią dorosłego OUN. Pozostałą częścią jest brzuszny sznur nerwowy (VNC) w klatce piersiowej, który również musi zostać wypreparowany.Po pierwsze, usuń kutykulę klatki piersiowej, unieruchamiając muchę u nasady tylnej nogi i delikatnie odciągając kutykulę klatki piersiowej aż do podstawy szyi. Po drugie, aby odsłonić VNC, delikatnie rozsuń dwie połowy kutykuli klatki piersiowej. Po trzecie, oddziel odwłok od klatki piersiowej, unieruchamiając muchę u nasady drugiej nogi i odciągając odwłok w okolicy pierwszego segmentu odwłoka.Po czwarte, oczyść VNC, chwytając go w okolicy ramiennej i delikatnie odrywając tkankę otaczającą VNC. Rozdziel pierścień tkanki łącznej otaczający połączenia szyjne i kontynuuj usuwanie nadmiaru tkanki podczas pobierania mózgu. Przenieś mózg i VNC w parach do płytki Pyrex o średnicy 9 cm wypełnionej schłodzonym 1x PBS i utrzymywanej w lodzie.Aby utrwalić tkanki dorosłych osobników, należy zanurzyć je w 4% PFA w temperaturze 0°C na 15 minut. Następnie przeprowadzić trzy płukania w lodowatym PBS oraz trzy płukania w PBT. Tkanka jest teraz gotowa do obrazowania lub znakowania przeciwciałami w celu dokładnej analizy ekspresji transgenu.W celu stworzenia układu odniesienia warto znakować OUN markerami neuronalnymi lub glejowymi; należy rozpocząć od inkubacji tkanki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc z przeciwciałami przeciwko neuronom lub glejowi. Następnego dnia preparat należy przemyć pięciokrotnie w PBT i inkubować z fluorescencyjnym przeciwciałem wtórnym w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Po zakończeniu inkubacji płytkę należy owinąć folią, aby zapobiec fotoblakaniu przeciwciał.Przemyj preparat PBS i zamocuj go w całości na szkiełku. Użyj plastikowego pierścienia OSHA, aby zapobiec zgniataniu tkanki przez szkiełko nakrywkę. Układ nerwowy jest teraz gotowy do badania wzorców ekspresji GFP i LL pod mikroskopem fluorescencyjnym.Zazwyczaj bada się od trzech do pięciu powtórzeń, aby określić powtarzalność wzorca ekspresji flip. Wzorzec ekspresji flip w linii flip może być wykorzystywany wraz z innymi transgenami do zmiany sposobu ekspresji represora GAL 80 z GAL4. Zmiana ekspresji represora GAL 80 jest skuteczną metodą wprowadzania modyfikacji.W przypadku ekspresji GAL4 jedną z metod jest usunięcie (flip-out) ekspresji GAL80 za pomocą transgenu; ekspresja GAL80 inaktywuje GAL4, który w przeciwnym razie powoduje degenerację oka w całej jego strukturze. Linia ET flip hash 6 88 A została tutaj wykorzystana do oceny skuteczności narzędzia konwertującego GAL80 w podzbiorze fotoreceptorów w potomstwie F1, poprzez porównanie fenotypu oka z fenotypem oka szczepów rodzicielskich. Wszelka obecność deformacji oka lub depigmentacji potwierdza, że wzór ekspresji flip występuje w fotoreceptorach, a usunięcie (flip-out) GAL80 przebiegło pomyślnie.Uzupełniającą, nieredundantną strategią jest wprowadzenie ekspresji GAL 80 przy użyciu tej samej linii flip, która jest przedmiotem zainteresowania. Strategia ta jest bardzo podobna do poprzedniej, jednak w tym przypadku pigmentacja ID oraz degeneracja w potomstwie F1 są zahamowane. W flip X dwa.Ekspresja fotoreceptorów. Po opanowaniu techniki, sekcja OUN może zostać przeprowadzona w około pięć minut w przypadku osobników dorosłych i jedną minutę w przypadku larw, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest użycie ostrych pincet do usunięcia tchawic oraz tkanek otaczających zarówno dorosłe osobniki, jak i Libre C i Ss. Do sekcji należy używać naczynia wolnego od utrwalacza. W celu generowania losowych klonów obecnie stosuje się metodę szoku termicznego (heat shock flip).W przeciwieństwie do tego, metoda enhancer trap flip pozwala na generowanie powtarzalnych klonów, co ułatwia analizę morfologiczną i behawioralną. Inną zaletą metody finger jest możliwość dalszego ograniczania wzorców ekspresji GAL4 poprzez wykorzystanie dodatkowych linii opartych na anan trap flip oraz innych linii gal. Słabością konfiguracji tubulin stop GAL80 jest fakt, że niektóre kombinacje efektorów GAL4 i UAS, takich jak LAG4 i U-A-S-K-I-R, są niekompatybilne, ponieważ prowadzą do śmierci much.Problem ten można łatwo rozwiązać, stosując warunkowy efektor UAS, taki jak UAS Shiri Ts, który pozwala na badanie zachowania w temperaturach restrykcyjnych. Zgodnie z przewidywaniami, nie wszystkie linie lipazy z pułapką wzmacniacza będą wykazywać wystarczająco wysoki poziom ekspresji lipazy, aby były użyteczne. Niemniej jednak, opisana tutaj technika palca stanowi nowe podejście dla badaczy Drosophila w celu doprecyzowania analizy mozaikowej, zarówno w odniesieniu do obwodów rozwojowych, jak i zachowania.

mapping-application-enhancer-trap-flippase-expression-larval-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Odwzorowanie i zastosowanie ekspresji Enhancer-trap Flippase w ośrodkowym układzie nerwowym larw i dorosłych Drosophila

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Rozdzielczość czasowa i przestrzenna manipulacji genetycznych determinuje spektrum zjawisk biologicznych, na które mogą one oddziaływać. W niniejszej pracy wykorzystujemy dyskretną czasowo i przestrzennie elektroporację in vivo, w połączeniu z transgenicznymi liniami danio pręgowanego, aby indukować ekspresję transgenu GFP specyficznie w neuronach rozwijającej się opolśnij węchowej.

Targetowanie neuronów opłaty węchowej z wykorzystaniem połączonej elektroporacji in vivo oraz linii ryb danio-ostroskrzelnych typu enhancer trap opartych na Gal4

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić specyficzną dla typu komórki translację mRNA. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony izolacji mRNA w rzadkich populacjach komórek zarodków Drosophila.

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Komórki mają różne morfologie i nawiązują różnorodne interakcje ze swoimi sąsiadami. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ujawnić morfologię pojedynczych komórek i zbadać interakcję komórka-komórka przy użyciu dobrze znanego systemu ekspresji Gal4 / UAS.

Zastosowanie techniki MultiColor FlpOut do badania wysokorozdzielczych morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych gleju u Drosophila

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Ten protokół opisuje kroki wymagane do przeprowadzenia hybrydyzacji łańcucha reakcji fluorescencyjnej in situ (HCR-FISH) w narządach wzrokowych larw Drosophila melanogaster. Szczegółowo opisano procedury projektowania sond, hybrydyzacji, amplifikacji oraz montażu tkanki, aby ułatwić wizualizację rozwijającego się narządu wzrokowego.

Reakcja łańcuchowa hybrydyzacji FISH w rozwijającym się Drosophila płacie wzrokowym

Poznaj metodę FINGR do precyzyjnej kontroli ekspresji genów w ośrodkowym układzie nerwowym larw i dorosłych Drosophila. Technika ta umożliwia szczegółową analizę klonalną i mapowanie obwodów nerwowych.

Mapowanie i zastosowanie ekspresji flippazy w pułapkach enhancerów w OUN larw i dorosłych osobników Drosophila

Przeglądaj więcej filmów