Name: Chromatografia powinowactwa za pośrednictwem pęcherzyków lipidowych z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (LIMACS): nowa metoda analizy interakcji białko-lipid (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj nową metodę LIMACS do analizy interakcji białko-lipid w środowisku przypominającym błonę komórkową. Technika wykorzystuje sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie do izolacji kompleksów białkowo-lipidowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez granty NIH R01NS046835 i R01AG034389 oraz grant March of Dimes 6FY08-322. Szczególne podziękowania kieruję do pani Eleanor Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), która ogromnie pomogła dzięki swojej wiedzy na temat technologii MACS. Firma Miltenyi nieodpłatnie i hojnie dostarczyła materiały wykorzystane do demonstracji eksperymentów. Jestem również wdzięczny dr. Guanghu Wangowi (Medical College of Georgia/Georgia Health Sciences University, Augusta, GA), który stworzył linie komórkowe ekspresyjące PKCζ. Podziękowania kieruję również do Instytutu Medycyny Molekularnej w Medical College of Georgia/Georgia Health Sciences University (pod kierownictwem dr. Lin Mei) za udzielone wsparcie.

1. Wstęp
Technika chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem pęcherzyków lipidowych i magnetycznego sortowania komórek (LIMACS) została opracowana w naszym laboratorium w celu izolacji kompleksów białkowych związanych z ceramidami 1-3. Pierwotnie pęcherzyki lipidowe składały się z ceramidu i fosfatydyloseryny, co umożliwiało zastosowanie MACS z użyciem Annexiny V sprzężonej z cząsteczkami magnetycznymi (wykazującej wysokie powinowactwo do fosfatydyloseryny) w celu izolacji pęcherzyków oraz związanych z nimi białek. Technikę LIMACS wykorzystaliśmy do rekonstytucji in vitro kompleksu polarności związanego z ceramidami oraz do izolacji białek wiążących ceramid z lizatów komórkowych 3. Metodę LIMACS można modyfikować, stosując inne partnerzy interakcji do izolacji pęcherzyków (np. lektyny specyficzne dla glikolipidów lub przeciwciała przeciwlipidowe).
2. Procedury eksperymentalne
Przygotowanie pęcherzyków lipidowych i testy wiązania aPKC
<ol>
	<li>Pęcherzyki lipidowe uzyskuje się z wysuszonych mieszanin ekvimolarnych ilości fosfatydyloseryny (105 μg) i ceramidu C16 (85 μg) zgodnie z zmodyfikowanymi procedurami przygotowania dużych liposomów 1,4-7.</li>
	<li>Mieszaniny lipidowe są następnie resuspenderowane i poddawane sonikacji przez 1 h w 100 μl buforu do pęcherzyków składającego się z 50 mM Tris/HCl (pH 7.5) i 150 mM NaCl.</li>
	<li>Po dodaniu 300 μl buforu do pęcherzyków uzupełnionego o 0.1 mM MnCl2, próbki są wirowane przy 12,000 μg przez 20 min w 4 °C.</li>
	<li>Osad (duże pęcherzyki lipidowe) jest resuspenderowany w 100 μl buforu do pęcherzyków i inkubowany z 1 nmol Vybrant CM-diI przez 1 h w 37 °C w celu wizualizacji frakcji pęcherzyków po separacji MACS. Vybrant CM-diI jest czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym, który wbudowuje się specyficznie w błony lipidowe.</li>
	<li>Lizat komórkowy wolny od detergentów przygotowuje się poprzez sonikację/homogenizację komórek w 300 μl buforu hipotonicznego (10 mM Tris/HCl (pH 7.0) z inhibitorami proteaz i fosfataz), a następnie usuwa się zanieczyszczenia błonowe poprzez wirowanie. Należy dodać etap wirowania przy 100,000xg przez 1 h, aby uniknąć zanieczyszczenia lizatu komórkowego endogennymi błonami zawierającymi fosfatydyloserynę.</li>
	<li>Oczyszczony lizat dodaje się do zawiesiny pęcherzyków lipidowych, a mieszaninę inkubuje przez 2 h w 4 °C.</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną uzupełnia się o 20 μl 20x buforu wiążącego Anneksynę V oraz 50 μl roztworu zawierającego kulki magnetyczne sprzężone z Anneksyną V, a następnie inkubuje przez 1 h w 4 °C.</li>
	<li>Separację MACS przeprowadza się zgodnie z protokołem producenta (Miltenyi Biotec, Inc.). Obecność i ilość pęcherzyków lipidowych określa się poprzez monitorowanie fluorescencji Vybrant CM-diI w frakcjach przepływowych i elucyjnych przy użyciu mikro płytkowego czytnika fluorescencji.</li>
	<li>Liniową korelację między ilością lipidów pęcherzykowych a intensywnością fluorescencji Vybrant CM-diI związanego z pęcherzykami weryfikuje się za pomocą ilościowej cienkowarstwowej chromatografii wysokosprawnej (HPTLC) mieszaniny lipidowej zastosowanej w MACS opartej na Anneksynie V.</li>
	<li>Specyficzność reakcji wiązania aPKC lub innych białek z pęcherzykami ceramid/fosfatydyloseryna weryfikuje się testem konkurencji przeciwciał, inkubując lizat komórkowy z 1 μg króliczego poliklonalnego przeciwciała przeciwko PKCζ przez 1 h w 4 °C przed inkubacją z pęcherzykami lipidowymi.</li>
	<li>Wiązanie białek do pęcherzyków ceramid/fosfatydyloseryna w elucie MACS analizuje się za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu.</li>
</ol>
In vitro kompleks polarności lipidowo-białkowej
<ol>
	<li>Rekonstytucja in vitro kompleksu polarności lipidowo-białkowego jest przeprowadzana zgodnie z procedurą LIMACS opisaną w poprzedniej sekcji. W skrócie, fosfatydyloserynę (420 μg) i ceramid C16 (107 μg) wysusza się z rozpuszczalnika organicznego.</li>
	<li>Wysuszone lipidy resuspendsuje się podczas sonikacji w 500 μl buforu do pęcherzyków (50 mM Tris/HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl).</li>
	<li>Dodaje się pięć μl 10 mM MnCl2, 1 μl Vybrant CM-diI oraz 500 ng PKCζ (rekombinowane ludzkie) i inkubuje mieszaninę reakcyjną przy delikatnym mieszaniu przez 60 min w 4 °C.</li>
	<li>Barwione Vybrant CM-diI pęcherzyki fosfatydyloseryny/ceramidu odzyskuje się poprzez wirowanie przy 12,000xg przez 60 min w 4 °C.</li>
	<li>Osad (różowy) resuspendsuje się w 100 μl buforu Tris i uzupełnia o γS-GTP (100 μM), GDP (1 mM), GST-Par6 (100 ng) lub GST-Cdc42 (500 ng), a następnie inkubuje przez 3 h w 4 °C (można tutaj zastosować każdą inną kombinację wybranych białek rekombinowanych).</li>
	<li>Dodaje się bufor do Annexiny V (5 μl z 20-krotnego roztworu zapasowego) oraz kuleczki magnetyczne sprzężone z Annexiną V (50 μl) i inkubuje mieszaninę reakcyjną przy delikatnym mieszaniu przez kolejne 30 min w 4 °C.</li>
	<li>Procedurę Annexin V-MACS przeprowadza się zgodnie z protokołem dostawcy opisanym wcześniej.</li>
	<li>Frakcję elucyjną (1 ml) uzupełnia się o 10 μg czystej owalbuminy jako pomocnika wytrącania. Białko koncentruje się metodą wytrącania Wessel-Flugge i analizuje za pomocą SDS-PAGE/immunoblottingu zgodnie z wcześniejszym opisem 8.</li>
	<li>Ilość eluowanych pęcherzyków lipidowych określa się poprzez detekcję Vybrant CM-diI (różowy) w fazie organicznej (chloroform/metanol) reakcji wytrącania Wessel-Flugge. Ilość analizowanego białka normalizuje się względem równych ilości pęcherzyków lipidowych.</li>
</ol>
3. Wyniki
Oczyszczanie PKCζ-EGFP oraz domeny wiążącej ceramid C20ζ-EGFP metodą LIMACS
Lizat komórek MDCK, pozyskano bez użycia detergentów, w których eksprymowano pełnowymiarową PKCζ z C-końcowym połączeniem z zielonym białkiem fluorescencyjnym (FLζ-EGFP) lub domenę wiążącą ceramid na C-końcu PKCζ (C20ζ-EGFP), inkubowano z pęcherzykami fosfatydyloseryny/ceramidu zgodnie z opisem w Procedurach Eksperymentalnych. Po elucji z kolumny MACS białko analizowano za pomocą immunoblottingu, stosując przeciwciała przeciwko PKCζ i EGFP w celu wykrycia eluowanego białka 2.
<img src="/files/ftp_upload/2657/2657fig1.jpg" alt="Schemat western blot; analiza ekspresji białek; EGFP, FLζ-EGFP, C20ζ-EGFP; marker kDa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. LIMACS PKCζ znakowanego EGFP oraz jego fragmentu C-końcowego C20ζ z wykorzystaniem pęcherzyków fosfatydyloseryny/ceramidu.
Lizaty komórek MDCK nie zawierające detergentów, wykazujące ekspresję EGFP (jako kontrola niewiążąca), pełnowymiarowego białka PKCζ-EGFP lub wiążącego ceramid fragmentu C-końcowego C20ζ-EGFP, inkubowano z pęcherzykami fosfatydyloseryny/ceramidu zgodnie z opisem w sekcji Procedury eksperymentalne. Po zastosowaniu techniki LIMACS białko eluowano buforem do próbek SDS i analizowano za pomocą SDS-PAGE oraz immunoblottingu. Lewy panel pokazuje, że EGFP nie wiązało się z pęcherzykami zatrzymanymi przez magnetyczne kulki sprzężone z Aneksyną V. Środkowy i prawy panel wykazują, że pełnowymiarowe PKCζ-EGFP oraz C20ζ-EGFP zostały zatrzymane w wyniku wiązania z ceramidem.

<ol><li>Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+to+ceramide+activates+protein+kinase+Czeta+before+the+formation+of+a+pro-apoptotic+complex+with+PAR-4+in+differentiating+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells.</a> J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).</li>
<li>Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carboxyl-terminal+domain+of+atypical+protein+kinase+Czeta+binds+to+ceramide+and+regulates+junction+formation+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells.</a> J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).</li>
<li>Chalfant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+ceramide+regulates+the+alternative+splicing+of+caspase+9+and+Bcl-x+in+A549+lung+adenocarcinoma+cells.+Dependence+on+protein+phosphatase-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1.</a> J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).</li>
<li>Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+of+C%2816%29-ceramide+between+phospholipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles.</a> Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).</li>
<li>Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+%28and+sociology%29+of+ceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Symp%22%5BJournal%5D)">Biophysics (and sociology) of ceramides.</a> Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).</li>
<li>Kumagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CERT+mediates+intermembrane+transfer+of+various+molecular+species+of+ceramides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides.</a> J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).</li>
<li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Badanie specyficznej interakcji między lipidem a jego białkiem wiążącym jest utrudnione przez osadzenie lipidów w błonie komórkowej. Błona komórkowa składa się z mieszaniny kilku lipidów i białek i jest zorganizowana w lipidowe mikrodomeny lub tratwy. W związku z tym wspólne oczyszczanie mikrodomen i białek nie pozwala jednoznacznie rozstrzygnąć, czy białko wiąże się bezpośrednio z lipidem, czy jest jedynie wzbogacone w strukturze mikrodomeny. Inne metody z wykorzystaniem określonych lipidów naniesionych na powierzchnie,...

<table><tbody><tr><td>Kuleczki magnetyczne sprzężone z Anneksyną V oraz mikrokolumny i minikolumny MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipidy (o najwyższej czystości)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (limacs): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Analiza oddziaływań między lipidami a białkami jest trudna, ponieważ lipidy są osadzone w błonach komórkowych, co czyni je niedostępnymi dla większości procedur oczyszczania. Jako alternatywę można zastosować powlekanie płaskich powierzchni lipidami, co wykorzystuje się w testach lipid ELISA oraz spektroskopii rezonansu plazmonowego. Jednak lipidy powlekające powierzchnię nie tworzą struktur mikrodomen, które mogą mieć istotne znaczenie dla właściwości wiązania lipidów. Ponadto metody te nie pozwalają na oczyszczenie większych ilości białek wiążących się z ich docelowymi lipidami.
 Aby przezwyciężyć ograniczenia w badaniu oddziaływań białek z lipidami oraz w celu oczyszczania białek wiążących lipidy, opracowaliśmy nową metodę nazwaną chromatografią powinowactwa wspomaganą pęcherzykami lipidowymi z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS). W tej metodzie pęcherzyki lipidowe przygotowuje się z lipidem docelowym oraz fosfatydyloseryną, która służy jako lipid kotwiczący dla MACS z użyciem Annexiny V. Fosfatydyloseryna jest powszechnie występującym fosfolipidem błon komórkowych, który wykazuje wysokie powinowactwo do białka Annexina V. Dzięki zastosowaniu kulek magnetycznych sprzężonych z Annexiną V pęcherzyki lipidowe zawierające fosfatydyloserynę wiążą się z tymi kulkami. Podczas inkubacji pęcherzyków lipidowych z lizatem komórkowym białko wiążące lipid docelowy zostanie również przywiązane do kulek i może zostać współoczyszczone przy użyciu MACS. Metoda ta może być również wykorzystana do sprawdzenia, czy białka rekombinowane odtwarzają kompleks białkowy wiążący lipid docelowy. 
 Metodę tę wykorzystaliśmy do wykazania interakcji atypowej PKC (aPKC) ze sphingolipidem ceramidą oraz do współoczyszczania białka prostate apoptosis response 4 (PAR-4), które wiąże się z aPKC związaną z ceramidą. Zastosowaliśmy również tę metodę do rekonstrukcji kompleksu rekombinowanej aPKC związanej z ceramidą z białkami Par6 i Cdc42, które biorą udział w regulacji polarności komórkowej. Ponieważ pęcherzyki lipidowe można przygotować z różnymi sfingolipidami lub fosfolipidami, LIMACS stanowi wszechstronne narzędzie do badania interakcji białko-lipid w środowisku lipidowym, które ściśle przypomina błonę komórkową. Dodatkowe kompleksy białkowo-lipidowe można zidentyfikować za pomocą analizy proteomicznej białek wiążących lipidy, współoczyszczonych z pęcherzykami lipidowymi.

Aby przetestować interakcję białka z jego docelowym lipidem, zastosowano system MACS oraz kule magnetyczne skoniugowane z Aneksyną V oraz pęcherzyki lipidowe zsyntetyzowane z lipidu docelowego i fosfatydyloseryny wiążącej Aneksynę V. Białka związane z lipidem docelowym są współoczyszczane i analizowane po elucji z kulek.

Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Analiza oddziaływań białek z lipidami jest trudna, ponieważ lipidy są wbudowane w błony komórkowe, przez co są niedostępne dla większości metod oczyszczania...

Niniejszy eksperyment został zaprojektowany w celu identyfikacji białek wiążących lipidy oraz analizy oddziaływań białko-lipid w zdefiniowanym środowisku błonowym z liposomów. Białka z homogenatu komórkowego inkubuje się ze świeżo przygotowanymi pęcherzykami lipidowymi z fosfatydyloseryny i ceramidu. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się magnetyczne kulki sprzężone z przeciwciałem anty-V w celu zakotwiczenia białek związanych z pęcherzykami lipidowymi na kulkach magnetycznych. Następnie pęcherzyki lipidowe z białkami są oczyszczane za pomocą magnetycznego sortowania komórek (MACS).Aby zidentyfikować białka wiążące lipidy wykazane w wynikach, należy zastosować elektroforezę SDS-PAGE i Western blotting w celu wykazania oczyszczania endogennej i rekombinowanej atypowej PKC oraz specyficznej domeny wiążącej ceramidy wykazującej ekspresję w komórkach MDCK. Główną zaletą tej nowej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak ELISA czy spektroskopia rezonansu plazmonowego w badaniu wiązań powierzchniowych, jest fakt, że oddziaływanie białko-lipid zachodzi w środowisku przypominającym błonę komórkową, a wiążące białka mogą zostać oczyszczone i poddane analizie. Zastosowania tej techniki obejmują terapię i diagnostykę chorób związanych z lipidami, ponieważ w tych schorzeniach fizjologiczne oddziaływanie białko-lipid jest zaburzone.W przypadku niektórych z tych chorób białkowe cele nie są nawet znane i muszą zostać zidentyfikowane. Aby zaprojektować terapię opartą na lipidach, należy rozpocząć od przygotowania SLs lipidowych z wysuszonej mieszaniny równomolowych ilości fosfatydyloseryny i ceramidu C16 w 100 µL buforu sical. Po dodaniu 300 µL buforu sical, uzupełnionego o 0,1 mM chlorku manganu, poddać próbki sonikacji przez jedną godzinę. Następnie odwiruj próbki przy 12 000 ×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, a następnie resuspenduj osad dużych pęcherzyków lipidowych w 100 µL buforu sical. Dodaj 1 nM fluorescencyjnego barwnika vibrant cm DII i inkubuj w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę, aby ułatwić wizualizację frakcji SLE po separacji magnetycznej. Odzyskaj różowy osad fosfatydyloseryny i ceramidu C16 w postaci SLs zabarwionych barwnikiem vibrant cm dai poprzez wirowanie, a następnie resuspenduj w 100 µL buforu TRIS.Następnie, aby przygotować lizat komórkowy wolny od detergentów, poddaj komórki sonikacji w 300 µL hipertonicznego buforu 10 mM Tris-HCl zawierającego inhibitory proteaz i fosfataz, a następnie odwiruj próbkę. Aby usunąć szczątki błonowe, dodaj teraz klarowny lizat komórkowy do zawiesiny fizycznej lipidów i inkubuj mieszaninę przez dwie godziny w temperaturze 4 °C. Ponieważ lizaty komórkowe mogą zawierać endogenne błony z fosfoerytryną, zaleca się oczyszczenie lizatu z tych błon poprzez dodatkowe etapy wirowania.Uzupełnić mieszaninę reakcyjną o 20 µL buforu wiążącego XNV oraz 50 µL roztworu zawierającego kule magnetyczne sprzężone z XNV, inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C, a następnie przeprowadzić magnetyczną separację komórek (MACS) zgodnie z protokołem producenta. Następnie monitorować fluorescencję vibrant CM DII w frakcjach przepływowych i elowanych przy użyciu mikroplatejkowego czytnika fluorescencji, aby określić obecność i ilość lipidów w teście konkurencji przeciwciał. Aby zweryfikować swoistość reakcji wiązania A PKC z pęcherzykami ceramidofosforyno-serynowymi, inkubować 1 µg przeciwciała królika poliklonalnego anty-P KC Zeta z lizatem komórkowym przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C, a następnie inkubować z pęcherzykami lipidowymi.Kontynuuj analizę za pomocą elektroforezy SDS-PAGE oraz immunoblottingu w celu zbadania wiązania białek do fosfoserynozyny ceramidowej w eluatach maksymalnych podczas in vitro rekonstrukcji kompleksu polarności białek lipidowych; rozpocznij od przygotowania różowego osadu barwionych vibrant cm DII pęcherzyków fosfoserynozyny ceramidowej, zgodnie z wcześniejszym opisem, i resuspender pęcherzyki w 100 µL buforu tri, uzupełnionego o 100 µM gamma S GT P, 1 mM GDP oraz kombinację rekombinowanych białek zainteresowania. Następnie inkubuj reakcję w temperaturze 4 °C przez trzy godziny. Kolejnie dodaj 5 µL 20-krotnego roztworu zapasowego buforu X in V oraz 50 µL kulek magnetycznych sprzężonych z X in V.Inkubować mieszaninę przy łagodnym mieszaniu przez kolejne 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusa. Kontynuować magnetyczną aktywację sortowania komórek NX NV zgodnie z protokołem producenta, aby ułatwić wytrącanie. Uzupełnić frakcję elucyjną o 10 µg czystej albuminy e.Skoncentruj białka poprzez wytrącanie metodą weyl flue. Faza dolna składa się z chloroformu i metanolu z wzbogaconym vibrant cm dii. Brązowa interfaza zawiera kulki magnetyczne i wytrącone białko.Ilościowo oznacz pęcherzyki lipidowe poprzez detekcję intensywnie różowego barwnika cm dii w organicznej fazie chloroformowo-metanolowej w reakcji weyl flu. Użyj równych ilości pęcherzyków lipidowych, aby znormalizować ilość białka pomiędzy próbkami, a następnie przeprowadź analizę metodą SDS-PAGE oraz immunoblotting.Lizat komórek MDCK pozbawiony detergentów, wykazujący ekspresję pełnowymiarowego białka PKC Zetta z końcem C połączonym z zielonym białkiem fluorescencyjnym lub domeną wiążącą ceramid. Koniec C białka PKC Zetta inkubowano z fosfoseryną.Po elucji z kolumny max, pęcherzyki ceramidowe oraz białka przeanalizowano za pomocą immunoblottingu. Fragment wiążący ceramid C 20 Zeta, EGFP oraz pełna długość P KC Zeta zostały odzyskane z eluatu kolumny max, co jest zgodne ze specyficznością i skutecznością procedury lyx. Negatywna kontrola EGFP, która nie wiązała się z fosforanowymi pęcherzykami ceramidowymi z Syrii, nie była wykrywalna w eluacie.Gdy metodę Linx uzupełni się o inne techniki, takie jak SDS-PAGE, western blotting lub analizę proteomiczną, można uzyskać odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład o to, które białka wchodzą w skład kompleksu białek wiążących lipidy. Po opracowaniu metody LabX otworzyła badaczom z dziedziny badań nad pojedynczymi lipidami drogę do eksploracji apoptozy indukowanej ceramidami oraz polarności komórek w komórkach macierzystych neuronów i komórkach nabłonkowych.

lipid-vesicle-mediated-affinity-chromatography-using-magnetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Chromatografia powinnościowa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznej selekcji komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy interakcji białko-lipid

Przepuszczalny przez błony komórkowe czynnik sieciujący DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizuje przejściowe i nietrwałe oddziaływania in vivo, co umożliwia ich izolację przy użyciu rygorystycznych technik oczyszczania kompleksów białkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy technikę sieciowania komórek hodowlanych, a następnie izolacji kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji.

Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

W tym filmie pokazujemy interakcję między białkami a sztucznymi pęcherzykami fosfolipidowymi za pomocą ilościowej cytometrii przepływowej. Wiązanie białek znakowanych fluorescencyjnie z pęcherzykami fosfolipidowymi znakowanymi fluorescencyjnie zwiększa średnią intensywność fluorescencji, a wzrost ten jest wykrywany przez cytometr przepływowy.

Ilościowa cytometria przepływowa do badania znakowanych interakcji pęcherzyków białko-fosfolipid

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Tutaj prezentujemy protokół techniki trawienia na błonie do przygotowania próbek do spektrometrii mas. Technika ta ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko.

Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Termoforeza w mikroskali szybko uzyskuje stałe wiązania przy niskich kosztach materiałowych. Na rynku dostępna jest termoforeza w mikroskali znakowana lub bezetykietowa; Jednak termoforeza bezznacznikowa nie jest w stanie zapewnić różnorodności pomiarów interakcji, które można wykonać przy użyciu etykiet fluorescencyjnych. Udostępniamy protokół dla znakowanych pomiarów termoforezy.

Zastosowanie termoforezy w mikroskali do pomiaru interakcji białko-lipid

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Opisujemy metodę użycia cyklodekstryny do pośredniczenia w wymianie między lipidami błony komórkowej a lipidami egzogennymi. Technikę tę można połączyć z eksperymentami badającymi białka transbłonowe, które zachowują się inaczej w środowiskach podobnych do tratw lipidowych niż w środowiskach niepodobnych do tratwy.

Test wymiany lipidów w żywych komórkach

Przedstawiamy opłacalną metodę oceny przepuszczalności błony liposomalnej, z wyższą czułością i rozdzielczością w porównaniu do tradycyjnych technik. Stosując nowatorską reakcję podstawiania ligandów w kapsule, technika ta wykrywa zmiany w błonach modelowych wywołane fosfolipaząA2. Łatwo zintegrowane ze standardowymi analizami, to dostępne podejście zwiększa rozdzielczość w badaniu biofizyki błon i interakcji toksyn.

Badanie przepuszczalności błony liposomowej do badania wpływu grup fosforanu fosfatydylinozytolu na działanie membranotropowe jadu PLA2

Poznaj nową metodę LIMACS do analizy interakcji białko-lipid w środowisku przypominającym błonę komórkową. Technika wykorzystuje sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie do izolacji kompleksów białkowo-lipidowych.

Chromatografia powinowactwa za pośrednictwem pęcherzyków lipidowych z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (LIMACS): nowa metoda analizy interakcji białko-lipid (Wideo) | JoVE Journal

Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Przeglądaj więcej filmów