Chromatografia powinowactwa za pośrednictwem pęcherzyków lipidowych z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (LIMACS): nowa metoda analizy interakcji białko-lipid

Eksperyment ten ma na celu identyfikację białek wiążących lipidy oraz analizę interakcji białek lipidowych w określonym środowisku błonowym lipidów, białek homogenatu komórkowego inkubuje się ze świeżo przygotowanymi pęcherzykami lipidowymi z niewodu fosforanowego i ceramidu. Mieszanina reakcyjna jest następnie uzupełniana sprzężonymi kulkami magnetycznymi Xin V w celu zakotwiczenia białka związanego z pęcherzykami lipidowymi w kulkach magnetycznych. Następnie białkowe pęcherzyki lipidowe są oczyszczane przez magnetyczne sortowanie komórek.

Aby zidentyfikować wyniki wykazane w białku związanym z lipidami, użyj strony SDS Western blot, aby pokazać oczyszczanie lyx z endogennego i rekombinowanego atypowego PKC oraz specyficznej domeny wiążącej ceramid ulegającej ekspresji w komórkach MDCK. Główną zaletą tej nowatorskiej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak Eliza lub spektroskopia rezonansu plazmowego, taka jak wiązanie powierzchniowe, jest to, że interakcja z białkami lipidowymi odbywa się w środowisku podobnym do błony, a białka wiążące można oczyszczać i analizować. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię i diagnostykę chorób związanych z lipidami, ponieważ w tych chorobach fizjologiczna interakcja z białkami lipidowymi jest upośledzona.

W przypadku niektórych z tych chorób docelowe białka nie są nawet znane i muszą zostać zidentyfikowane Aby zaprojektować terapię opartą na lipidach, Zacznij od lipidów przygotowanych z wysuszonej mieszaniny równomolowej, ilości fosfatydylu seine i ceramidu C 16 w 100 mikrolitrach buforu sical. Sonikować przez godzinę po dodaniu 300 mikrolitrów buforu iCal, uzupełnionego 0,1 milimolowym chlorkiem manganu, odwirować próbki w temperaturze 12 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie ponownie zawiesić osad dużych pęcherzyków lipidowych w 100 mikrolitrach buforu sical. Dodaj jeden nanomolar żywego barwnika fluorescencyjnego cm DII i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby ułatwić wizualizację frakcji SLE po maksymalnej separacji, odzyskaj różową granulkę żywego fosforanu barwionego cm dai, syryjski ceramid sles przez wirowanie i Resus spędz w 100 mikrolitrach buforu tris.

Następnie, aby przygotować lizat komórkowy bez detergentu, należy poddać je sonikacji komórek w 300 mikrolitrach hipertonicznego buforu 10 milimolowych trisów, chlorowodoru zawierającego inhibitory proteazy i fosfatazy oraz wirówki. Aby usunąć błoniaste resztki, dodaj teraz klarowny lizat komórkowy do fizycznej zawiesiny lipidów i inkubuj mieszaninę przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponieważ lizaty komórkowe mogą zawierać endogenne błony z aeryną fosforanową, zaleca się usunięcie lizatu z tych błon poprzez dodatkowe etapy wirowania.

Uzupełnić mieszaninę reakcyjną 20 mikrolitrami buforu wiążącego XNV i 50 mikrolitrami roztworu zawierającego kulki magnetyczne sprzężone z inkubatem XNV przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przeprowadzić magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych zgodnie z zaleceniami protokołu producenta. Następnie monitoruj żywą fluorescencję CM DII we frakcjach przepływowych i elucyjnych za pomocą czytnika fluorescencji mikropłytki, aby określić obecność i ilość lipidów w teście konkurencji przeciwciał. W celu sprawdzenia swoistości reakcji wiązania A PKC dla pęcherzyków ceramidu fosfo Seine należy inkubować jeden mikrogram poliklonalnego przeciwciała poliklonalnego anty P KC Zeta z lizatem komórkowym przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie inkubować z pęcherzykami lipidowymi.

Kontynuuj ze stroną SDS i analizą immuno blotting wiązania białka z ceramidowym fosforanem seryny sles w maksymalnym eluacie do rekonstytucji in vitro kompleksu polarności białek lipidowych rozpocznij od przygotowania różowej granulki żywych pęcherzyków ceramidowych fosforanowych barwionych cm DII, jak pokazano wcześniej, ponownie zawiesić pęcherzyki w 100 mikrolitrach buforu tri, uzupełniony o 100 mikromolowych gamma S GT P, jeden milimol, GDP i kombinację rekombinowanych białek będących przedmiotem zainteresowania. Następnie inkubuj reakcję w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny. Następnie dodaj pięć mikrolitrów 20 x roztworu podstawowego buforu X w V i 50 mikrolitrów sprzężonych kulek magnetycznych X w V.

Inkubować mieszaninę pod delikatnym mieszaniem przez kolejne 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Kontynuuj sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie NX NV zgodnie z zaleceniami protokołu producenta, aby ułatwić wytrącanie. Uzupełnienie frakcji elucyjnej 10 mikrogramami czystej albuminy e.

Zagęścić białka przez wytrącanie spalin weylowych. Dolna faza składa się z chloroformu metanolu o wzbogaconym żywym cm dii. Brązowawa interfaza zawiera kulki magnetyczne i wytrącone białko.

Określ ilościowo pęcherzyki lipidowe ellu, wykrywając różowe, żywe cm dii w fazie organicznego chloroformu metanolowego reakcji grypy weylowej. Użyj równych ilości pęcherzyków lipidowych, aby znormalizować ilość białka między próbkami i przeanalizować za pomocą strony SDS. Blotting immunologiczny.

Wolny od detergentów lizat komórek MDCK wykazujący ekspresję PKC Zetta C na całej długości, ostatecznie połączony z zielonym białkiem fluorescencyjnym lub domeną wiążącą ceramidy. Na końcu C pkc. Zetta inkubowano z niewodem fosfonowym.

Pęcherzyki ceramidowe po wyjaśnieniu kolumny max, białka analizowano metodą immuno blotingu. Fragment wiążący ceramidy C 20 Zeta, EGFP i P KC Zeta o pełnej długości odzyskano z EIT kolumny max, co jest zgodne ze specyficznością i skutecznością procedury lyx. Kontrola negatywna EGFP, która nie wiązała się z fosforanem, nasze syryjskie pęcherzyki ceramidowe nie była wykrywalna w eit.

Gdy Linx jest uzupełniany innymi metodami, takimi jak strona SDS i western blotting lub analiza proteomiczna, można uzyskać odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, które białka znajdują się w kompleksie białek wiążących lipidy. Po jego opracowaniu, LabX utorował drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad pojedynczymi lipidami S do zbadania apoptozy indukowanej ceramidami i polaryzacji komórek w komórkach macierzystych i nabłonkowych układu nerwowego.