Wysokoprzepustowy pomiar i klasyfikacja fosforu organicznego w próbkach środowiskowych

Ogólnym celem tej procedury jest klasyfikacja enzymatycznego hydrolizowanego fosforu organicznego w ekstraktach z gleby lub próbkach obornika. Osiąga się to poprzez pierwszą ekstrakcję próbek roztworem EDTA wodorotlenku sodu i dostosowanie pH ekstraktów. Następnie inkubuj te dostosowane ekstrakty z dwoma różnymi roztworami enzymatycznymi.

Na 96-dołkowej płytce ostatnim krokiem jest pomiar ortofosforanu uwalnianego przez enzym za pomocą kolorymetrii błękitu molibdenowego. Ostatecznie większość natywnych form fosforu monoestrowego ortofosforanu i fosforu diastrowego można sklasyfikować w próbkach gleby lub obornika na podstawie zróżnicowanego uwalniania ortofosforanu metodą hydrolizy enzymatycznej. Tę metodę można niedrogo wykonać w każdym standardowym laboratorium.

Główną przewagą nad istniejącymi metodami, takimi jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego fosforu 31, jest to, że może mierzyć potencjał rodzimych enzymów glebowych do uwalniania ortofosforanu z organicznych związków grochu w przyszłości. W związku z tym dane uzyskane tą metodą mogą pomóc w prognozowaniu żyzności gleby lub potencjału gleby do uwalniania szkodliwych ilości ortofosforanu dostępnego dla glonów. Dodać 30 mililitrów 0,25 molowego roztworu wodorotlenku sodu do dwóch gramów mokrej lub wysuszonej próbki w 50-mililitrowej stożkowej probówce.

Inkubować z mieszaniem przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Odwirować próbki 3000 razy G przez 30 minut, a następnie przenieść 100 mikrolitrów do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej, która zawiera już bufor octanowy. Skorygowana próbka ma całkowitą objętość jednego mililitra i pH 5,0.

Przygotować dwa roztwory podstawowe zawierające 0,5 jednostki na mililitr kwaśnej fosfatazy w 10 mililitrach świeżo przygotowanego 0,1 molowego octanu sodu o pH pięć. Teraz dodaj odtworzoną liofilizowaną nukleazę NP jeden z Penicillium Citron do jednej z 10-mililitrowych probówek z kwaśnymi zapasami fosfatazy do końcowego stężenia 2,5 jednostki NP jeden na mililitr delikatnie wymieszany przez kilkakrotne odwrócenie, odwirować dwa roztwory enzymów w temperaturze 3000 razy G przez 30 minut. Aby skonstruować krzywą kalibracyjną, należy rozpocząć od dodania jednego mililitra jednego milimolowego roztworu podstawowego fosforanu potasu do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej i wykonać siedem 0,5 mililitrowych rozcieńczeń zbóż wyrzucić pierwszą probówkę, tak aby końcowe rozcieńczenie mieściło się w zakresie od 20 al do 0,625 nm fosforu.

Teraz przenieś wzorce ortofosforanu do dwóch ostatnich kolumn na płytce, zaczynając od zerowego ortofosforanu NM w rzędzie A i kończąc na ortofosforanie 20 nm w rzędzie H do pierwszych trzech studzienek kolumny 10. Dodaj 40 mikrolitrów roztworu enzymatycznego PP plus GP do następnych trzech dołków kolumny 10. Dodaj 40 mikrolitrów PP plus GP plus NP jeden roztwór enzymu.

Na koniec dodaj 40 mikrolitrów 100-milimolowego buforu octanowego do wszystkich sześciu studzienek. Teraz każda z pierwszych sześciu studzienek w kolumnie 10 powinna zawierać 80 mikrolitrów roztworu do następnych dwóch studzienek. Dodaj 40 mikrolitrów roztworu octanu sodu zawierającego 10 M glukozy, sześć fosforanów i 40 mikrolitrów roztworu enzymatycznego PP plus GP.

Dla każdej badanej próbki rozprowadzić 40 mikrolitrów ekstraktów próbek o dostosowanym pH do studzienek od jednego do dziewięciu w maksymalnie ośmiu rzędach po rozprowadzeniu wszystkich próbek. Za pomocą pipety wielokanałowej rozprowadź roztwór enzymu PP plus GP w kolumnach od pierwszej do trzeciej, PP plus GP plus NP od jednej do kolumn od czwartej do szóstej i 0,1 molowego buforu octanu sodu do kolumny od siódmej do dziewiątej. Wykonaj ten krok szybko, aby upewnić się, że wszystkie próbki mają równoważny czas inkubacji.

Przykryj 96-dołkową płytkę pokrywką i inkubuj próbki, roztwory enzymów, kontrole i krzywą kalibracyjną dokładnie jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wodzie dejonizowanej. Przygotować 50 mililitrów każdego z czterech roztworów podstawowych. A musi być przygotowywany codziennie za pomocą pipety wielokanałowej szybko.

Dodaj 25 mikrolitrów SDS, 100 mikrolitrów roztworu, 20 mikrolitrów roztworu B i 50 mikrolitrów roztworu C do wszystkich studzienek w 96. Dobrze przykryć płytkę i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec zmierz absorbancję przy 850 nanometrach w dowolnym czytniku mikropłytek z możliwością dostrajania T za pomocą aplikacji arkusza kalkulacyjnego.

Najpierw wykreśl krzywą kalibracji fosforu nieorganicznego z zerem do 20 nanomoli fosforu na osi x i średnią z pomiarów podwójnej absorbancji na osi Y, wykonaj regresję liniową i znajdź równanie linii najlepszego dopasowania. Następnie oblicz fosfor nieorganiczny w tle, uśredniając wartości w kolumnach od pierwszej do trzeciej, a następnie stosując krzywą kalibracyjną do zestawu danych. Następnie, aby oznaczyć fosfor pochodzący z hydrolizowanych monoestrów fosforu, uśrednić wartości potrójnej próbki z kolumn od czwartej do szóstej i odjąć roztwór enzymu kontrolnego oraz nieorganiczny fosfor tła.

Następnie, aby obliczyć zawartość fosforu w hydrolizowanym fosforze, DER uśredniają wartości próbki trzykrotnej z kolumny od siódmej do dziewiątej i odejmują roztwór enzymu kontrolnego plus nieorganiczny fosfor tła plus hydrolizowany fosfor monoestrowy z kolumn od czwartego do szóstego. Typowa płytka 96-dołkowa pokazuje wyniki dla ośmiu próbek i krzywej kalibracyjnej. Elementy sterujące znajdują się w kolumnie 10.

Wzrost intensywności koloru między kolumnami od pierwszej do trzeciej i od czwartej do szóstej jest spowodowany hydrolizowanymi monoestrowymi związkami fosforu między kolumnami od czwartej do szóstej i od siedmiu do dziewięciu za sprawą zhydrolizowanych związków fosforu o średnicy wewnętrznej. W tym przypadku zastosowano metodę wysokoprzepustowej hydrolizy enzymatycznej do pomyślnej analizy rozkładu klas fosforu w 0,25-molowych ekstraktach wodorotlenku sodu o stężeniu 0,05 molowym EDTA w próbce gleby w stanie Vermont. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć natywne związki ortofosforanu, monoestru i grochu diastrowego w ekstraktach glebowych lub obornikowych za pomocą hydrolizy enzymatycznej.

Technika ta może pomóc utorować drogę naukowcom zajmującym się chemią środowiska i zarządzaniem składnikami odżywczymi w celu zbadania zachowania organicznego fosforu w glebie lub systemach obornika.