Name: Wysokoprzepustowy pomiar i klasyfikacja fosforu organicznego w próbkach środowiskowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowej klasyfikacji fosforu organicznego w glebie i nawozach przy użyciu hydrolizy enzymatycznej. Technika ta umożliwia analizę form fosforu w standardowym laboratorium.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy USGS oraz Vermont Water Resources and Lake Studies Center za zapewnienie finansowania.

1. Ekstrakcja fosforu
<ol>
 <li>Przygotować 1L roztworu 0,25 M wodorotlenku sodu (NaOH, 40,00 g/mol) + 0,05 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, 292,24 g/mol).</li>
 <li>Dodać 30 mL roztworu NaOH + EDTA do 2 g mokrej lub wysuszonej gleby/próbki w probówce stożkowej o pojemności 50 mL.</li>
 <li>Inkubować z mieszaniem przez 16 h w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Wirować z prędkością 3000 xg przez 3 minuty.</li>
</ol>
2. Regulacja pH ekstraktu z próbki
<ol>
 <li>Przenieś 0,1 mL alykwootu do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.</li>
 <li>Dodaj 0,017 mL kwasu octowego 2,5 M, 0,144 mL buforu octanowego 0,4 M (70,5% octanu sodu [CH3COONa, 82,03 g/mol] i 29,5% kwasu octowego, pH 5,0) oraz 0,739 mL wody dejonizowanej.</li>
 <li>Końcowa objętość skorygowanego ekstraktu wyniesie 1 mL, a końcowe pH będzie wynosić 5,0.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworu zapasowego enzymu
<ol>
 <li>Przygotować 1 L 0,1 M roztworu octanu sodu (CH3COONa, 82,03 g/mol) o pH 5,0.</li>
 <li>Przygotować 2 x 10 mL roztworów zapasowych fosfatazy kwaśnej w buforze octanowym sodu przygotowanym w kroku 3.1, tak aby końcowe stężenia wynosiły odpowiednio 0,5 Units/mL. 
 Fosfataza kwaśna typu I z Triticum aestivum (zarodek pszenicy; GP, zazwyczaj 0,5 U mg-1 substancji stałej, EC 3.1.3.2) 
 Fosfataza kwaśna typu IV-S z Solanum tuberosum (ziemniak; PP, zazwyczaj 4,6 U mg-1 substancji stałej, EC 3.1.3.2) 
 * Jednostki aktywności są określone przez dostawcę, gdzie 1 Unit definiuje się jako uwolnienie 1 mikromola ortofosforanu do roztworu na godzinę w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Zrekonstytuować liofilizowaną nukleazę P1 (EC 3.1.30.1) z Penicillium citrinum (grzyby; NP1, zazwyczaj 500 U mg-1 substancji stałej) w jednym mL wody dejonizowanej – można ją teraz przechowywać w temperaturze 4°C do późniejszego użycia.</li>
 <li>Pipetować NP1 do jednej z probówek 10 mL przygotowanych w kroku 3.2, tak aby końcowe stężenie NP1 wynosiło 2,5 Units/mL; delikatnie wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę.</li>
 <li>Wirować oba 10 mL roztworów enzymów z prędkością 3000 xg przez 30 minut.</li>
</ol>
4. Krzywa kalibracyjna P i kontrole
<ol>
 <li>Przygotować 1 L roztworu stokowego 1 mM fosforanu potasu (K2HPO4, 174,18 g/mol).</li>
 <li>Do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL dodać 1 mL roztworu stokowego 1 mM fosforanu potasu i wykonać siedem seryjnych rozcieńczeń po 0,5 mL.</li>
 <li>Odrzucić pierwszą probówkę, aby uzyskać 7 rozcieńczeń w zakresie od 20 nmol do 0,625 nmol P.</li>
 <li>Przenieść 80 μL z każdej probówki w dwóch powtórzeniach do rzędów B - H standardowej płytki 96-dołkowej.</li>
 <li>Do rzędu A w kolumnach 11 i 12 dodać 80 μL buforu octanu sodu (sekcja 3.1) – jest to punkt kalibracyjny 0 nmol P.</li>
 <li>Każda z kolumn 11 i 12 zawiera obecnie 8 próbek referencyjnych od 0 nmol do 20 nmol fosforanu nieorganicznego.</li>
 <li>Kolumna 10 będzie zawierać następujące kontrole:
 <ol>
 <li>Do pierwszych trzech dołków w kolumnie 10 dodać 40 μL roztworu enzymu PP+GP + 40 μL buforu octanu sodu (sekcja 3.1).</li>
 <li>Do kolejnych trzech dołków dodać 40 μL roztworu enzymu PP+GP+NP1 + 40 μL buforu octanu sodu.</li>
 <li>Do jednego dołka dodać 40 μL roztworu octanu sodu zawierającego 10 nmol glukozo-6-fosforanu (C6H11Na2O9P 
 • xH2O, 304,1 g/mol) + 40 μL roztworu enzymu PP+GP, a do ostatniego dołka w kolumnie 10 dodać roztwór octanu sodu zamiast roztworu enzymu.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. Inkubacja próbki z enzymem
<ol>
 <li>Każda badana próbka zajmie pierwsze 9 dołków w jednym rzędzie standardowej płytki 96-dołkowej.</li>
 <li>Rozdziel 40 μL ekstraktów z próbek z skorygowanym pH z sekcji 2 do dołków 1-9 w maksymalnie 8 rzędach.</li>
 <li>Po rozdzieleniu wszystkich próbek* użyj pipety wielokanałowej, aby nanieść roztwór enzymu PP+GP do kolumn 1-3, PP+GP+NP1 do kolumn 4-6 oraz bufor octanu sodu (przygotowany w sekcji 3.1) do kolumn 7-9. 
 *Krok ten należy wykonać szybko, aby zapewnić wszystkim próbkom równy czas inkubacji.</li>
 <li>Przykryj płytkę 96-dołkową pokrywką i inkubuj próbki z roztworami enzymów, kontrole oraz krzywą kalibracyjną przez dokładnie 1 hr w 37°C.</li>
</ol>
6. Kolorymetryczny pomiar uwolnionego i tła nieorganicznego P
<ol>
 <li>Przygotować po 50 mL każdego z następujących roztworów w wodzie dejonizowanej: 
 Roztwór A*: 0.1 M kwasu askorbinowego (C6H8O6, 176.12 g/mol) + 0.5M kwasu trójchlorooctowego (Cl3CCOOH, 163.39 g/mol) 
 Roztwór B: 0.01 M molibdenianu amonu ((NH4)2MoO4, 196.01 g/mol) 
 Roztwór C: 0.1 M cytrynianu sodu (HOC(COONa)(CH2COONa)2 2H2O, 294.10 g/mol) + 0.2 M arsenianu sodu (NaAsO2, 129.91 g/mol) + 5 % octanu lodowatego (CH3CO2H, 60.05 g/mol)
 * Roztwór A należy przygotowywać codziennie.</li>
 <li>Do wszystkich studzienek płytki 96-dołkowej dodać 25 μL roztworu SDS, 100 μL roztworu A, 20 μL roztworu B oraz 50 μL roztworu C. Czynność tę należy wykonać szybko, używając pipety wielokanałowej.</li>
 <li>Przykryć płytkę i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Zmierzyć absorbancję przy 850 nm w dowolnym mikroczytniku płytek z regulowaną długością fali.</li>
</ol>
7. Klasyfikacja związków P
<ol>
 <li>Zaimportuj surowe dane do aplikacji arkusza kalkulacyjnego (np. Microsoft Excel).</li>
 <li>Wykreśl krzywą kalibracyjną fosforu nieorganicznego: od 0 do 40 nmol P na osi x oraz średnią z powtórzonych pomiarów absorbancji na osi y.</li>
 <li>Wykonaj regresję liniową i wyznacz równanie linii trendu.</li>
 <li>Kolumny 1-3: Zastosuj bezpośrednio krzywą kalibracyjną – jest to tło fosforu nieorganicznego.</li>
 <li>Kolumny 4-6: Oblicz średnią wartości z trzech powtórzeń próbek i odjąć wartości kontrolne (roztwór enzymu + tło fosforu nieorganicznego) od absorbancji całkowitej – jest to P pochodzący z hydrolizowalnych monoestrów fosforanowych.</li>
 <li>Kolumny 7-9: Postępuj tak samo jak w punkcie 7.5, z wyjątkiem odjęcia wartości absorbancji z kolumn 4-6 – jest to P z hydrolizowalnych diestrów fosforanowych.</li>
 <li>Przelicz dane absorbancji na nmol uwolnionego P, stosując równanie kalibracyjne.</li>
 <li>Wartość nmol uwolnionego P można odnieść do mg P/kg pierwotnej gleby. Alternatywnie, przydatnym podejściem do analizy danych może być ocena proporcji poszczególnych klas P.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki:
Szybka inspekcja wizualna płytki 96-dołkowej po przeprowadzeniu reakcji kolorymetrycznych dostarczy informacji o tym, czy procedura została wykonana prawidłowo. W pierwszej kolejności należy sprawdzić poziom cieczy w każdym dołku, analizując profil boczny płytki. We wszystkich dołkach powinno znajdować się dokładnie 275 μL odczynników. Następnie należy wizualnie ocenić barwę dołków z próbkami w trzech powtórzeniach oraz dołków kalibracyjnych w dwóch powtórzeniach. Te powtórzenia techniczne powinny mieć ten sam odcień niebieskiego. Następnie należy zastosować krzywą kalibracyjną do dwóch dołków zawierających glukozo-6-fosforan i zweryfikować, czy uwolniły one wszystkie 10 nmol nieorganicznego P. Po pomiarze całkowitej ilości wyekstrahowanego P za pomocą ICP-OES lub alternatywnej metody, należy upewnić się, że wartości całkowitego P obliczone zgodnie z niniejszym protokołem nie przekraczają ilości P, która została wyekstrahowana. 
Uwaga: Staranne zarządzanie danymi w arkuszu kalkulacyjnym pomoże zapobiec błędom ilościowym. Ze względu na pracę z dużą liczbą danych jednocześnie, stworzenie szablonu będzie wartościowym rozwiązaniem.
<img src="/files/ftp_upload/2660/2660fig1.jpg" alt="Wyniki testu na płytce ELISA, detekcja kolorymetryczna, analiza aktywności enzymatycznej, oznaczanie ilości białka." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Płytka 96-dołkowa przedstawiająca wyniki dla 8 próbek (rzędy A-H) oraz krzywą kalibracyjną (kolumny 11 i 12). Kontrole znajdują się w kolumnie 10. 
Wzrost intensywności barwy między kolumnami 1-3 a 4-6 wynika z obecności zhydrolizowanych związków monoestru P, a między kolumnami 4-6 a 7-9 z obecności zhydrolizowanych związków diestru P.
<img src="/files/ftp_upload/2660/2660fig2.jpg" alt="Wykres słupkowy klas fosforu: ortofosforan, monoestrowe P, diesterowe P; stężenie w mg/kg SM." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Rozkład klas P w ekstrakcie z próbki gleby z Vermont w 0,25 M NaOH-0,05 M EDTA przy użyciu wysokoprzepustowej hydrolizy enzymatycznej. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe, n = 3.

<ol><li>Turner, B. L., Frossard, E., Baldwin, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurner%2C+BL+%22Organic+phosphorus+in+the+environment%22">Organic phosphorus in the environment</a>. , Cabi Publishing. Wallingford. (2005).</li>
<li>Murphy, J., Riley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+single+solution+method+for+determination+of+phosphate+in+natural+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A modified single solution method for determination of phosphate in natural waters.</a> Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).</li>
<li>Dick, W. A., Tabatabai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+orthophosphate+in+aqueous+solutions+containing+labile+organic+and+inorganic+phosphorus+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Qual%22%5BJournal%5D)">Determination of orthophosphate in aqueous solutions containing labile organic and inorganic phosphorus compounds.</a> J. Environ. Qual. 6, 82-85 (1977).</li>
<li>He, Z., Toor, G. S., Honeycutt, C. W., Sims, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+hydrolysis+approach+for+characterizing+labile+phosphorus+forms+in+dairy+manure+under+mild+assay+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">An enzymatic hydrolysis approach for characterizing labile phosphorus forms in dairy manure under mild assay conditions.</a> Bioresour. Technol. 97, 1660-1668 (2006).</li>
<li>He, Z., Honeycutt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+molybdenum+blue+method+for+orthophosphate+determination+suitable+for+investigating+enzymatic+hydrolysis+of+organic+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Soil+Sci.+Plant+Anal%22%5BJournal%5D)">A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates.</a> Commun. Soil Sci. Plant Anal. 36, 1373-1383 (2005).</li>
<li>Cade-Menun, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+phosphorus+in+environmental+and+agricultural+samples+by+31P+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Characterizing phosphorus in environmental and agricultural samples by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Talanta. 66, 359-371 (2005).</li>
<li>Johnson, N. R., Hill, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorus+species+composition+of+poultry+manure-amended+soil+using+high-throughput+enzymatic+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Sci.+Soc.+Am.+J%22%5BJournal%5D)">Phosphorus species composition of poultry manure-amended soil using high-throughput enzymatic hydrolysis.</a> Soil Sci. Soc. Am. J. 74, 1786-1791 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Z natury szybka metoda wykorzystująca małe objętości wymaga ogromnej staranności. Dlatego najbardziej krytyczne są etapy związane z pipetowaniem roztworów na płytkę. Precyzyjna, a przede wszystkim spójna technika pipetowania jest niezbędna dla powodzenia tego testu.
Ekstrakcja NaOH-EDTA pozwoli na podzielenie większości fosforu (P) w wielu próbkach na trzy klasy: ortofosforany, monoestry P i diestry P. Metoda ta może być zastosowana do gleb, nawozów organicznych, osadów lub jakichkolwiek innych próbek środowiskowych zawierających P wyekstrahowalny za pomocą NaOH-EDTA. Formy P w próbkach środowiskowych niekoniecznie są stabilne, a technika ta zapewni ich charakterystykę przed ewentualną degradacją próbek, bez konieczności angażowania licznych zespołów badawczych.
Analiza ta jest szczególnie odpowiednia w przypadku konieczności przetworzenia dużej liczby próbek. Zapotrzebowanie na odczynniki oraz wymagania przestrzenne zostały zredukowane do poziomu łatwiejszego w obsłudze (np. probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL zamiast szklanych kolb o pojemności 50 mL). Adaptacja ta ogranicza również powstawanie odpadów.

<table><tbody><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>lodowaty kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td></td></tr><tr><td>octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>fosfataza kwaśna z pszenicy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3627</td><td></td></tr><tr><td>fosfataza kwaśna z ziemniaka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1146</td><td></td></tr><tr><td>nukleaza P1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8630</td><td></td></tr><tr><td>fosforan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>glukozo-6-fosforan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7250</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td></td></tr><tr><td>kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>TCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>molibdan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1343</td><td></td></tr><tr><td>cytrynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>arsenian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9663</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy pomiar i klasyfikacja fosforu organicznego w próbkach środowiskowych

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

W próbkach środowiskowych występuje wiele rodzajów organicznych cząsteczek fosforu (P)1. Tradycyjne pomiary P nie wykrywają tych organicznych związków fosforu, ponieważ nie reagują one z odczynnikami kolorymetrycznymi2,3. Hydroliza enzymatyczna (EH) jest nową metodą dokładnej charakterystyki form organicznego P w próbkach środowiskowych4,5. Metoda ta ustępuje dokładnością jedynie spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego fosforu-31 (31P-NMR) – metodzie kosztownej i wymagającej specjalistycznego przeszkolenia technicznego6. Zaadaptowaliśmy metodę hydrolizy enzymatycznej umożliwiającą pomiar trzech klas fosforu (P monoestrowego, P diestrowego i P nieorganicznego) do systemu czytnika mikropłytek7. Metoda ta zapewnia badaczom szybki, dokładny, niedrogi i łatwy w obsłudze sposób pomiaru form P w glebach, osadach, nawozach organicznych oraz, po zagęszczeniu, w próbkach wodnych. Jest to jedyna wysokoprzepustowa metoda pomiaru form i podatności enzymatycznej organicznego P, którą można przeprowadzić w standardowym laboratorium. Uzyskane dane dostarczają cennych informacji naukowcom badającym zawartość składników odżywczych w systemie oraz potencjał eutrofizacji.

Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustową metodę hydrolizy enzymatycznej, w której wykorzystuje się czytnik mikropłytek do pomiaru i klasyfikacji fosforu glebowego jako monoestrów P, diestrów P oraz fosforu nieorganicznego. W standardowych warunkach laboratoryjnych jednorazowo można zmierzyć do 96 próbek.

Wysokoprzepustowy pomiar i klasyfikacja fosforu organicznego w próbkach środowiskowych

W próbkach środowiskowych występuje wiele rodzajów organicznych cząsteczek fosforu (P)1. Tradycyjne metody pomiaru zawartości P nie wykrywają tych organicznych związków fosforu, ponieważ ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest klasyfikacja enzymatycznie hydrolizowanego fosforu organicznego w ekstraktach z próbek gleby lub obornika. Osiąga się to poprzez uprzednią ekstrakcję próbek roztworem wodorotlenku sodu i EDTA oraz regulację pH ekstraktów. Następnie regulowane ekstrakty inkubuje się z dwoma różnymi roztworami enzymów.Ostatnim krokiem na płytce 96-dołkowej jest pomiar ortofosforanu uwalnianego przez enzym przy użyciu kolorymetrii błękitu molibdenowego. W rezultacie większość rodzimych form fosforu w postaci monoestrów i diestrów ortofosforanu w próbkach gleby lub obornika może zostać sklasyfikowana na podstawie różnicowego uwalniania ortofosforanu metodą hydrolizy enzymatycznej. Metodę tę można tanio przeprowadzić w każdym standardowym laboratorium.Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego fosforu 31, jest możliwość pomiaru potencjału natywnych enzymów glebowych do uwalniania ortofosforanu z organicznych związków grochu w przyszłości. W związku z tym dane uzyskane tą metodą mogą pomóc w prognozowaniu żyzności gleby lub potencjału gleby do uwalniania szkodliwych ilości ortofosforanu dostępnego dla alg. Do 2 g mokrej lub wysuszonej próbki w 50 ml probówce stożkowej należy dodać 30 ml 0,25 M roztworu wodorotlenku sodu.Inkubować z wytrząsaniem przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Próbki wirować przy 3000 ×g przez 30 minut, a następnie przenieść 100 µL do probówki do mikrowirowania o pojemności 1,5 mL zawierającej wcześniej bufor octanowy. Skorygowana próbka ma całkowitą objętość 1 mL i pH 5,0.Przygotuj dwa roztwory zapasowe zawierające 0,5 jednostki na mililitr fosfatazy kwaśnej w 10 mililitrach świeżo przygotowanego 0,1 molowego octanu sodu o pH 5. Następnie dodaj zrekonstytuowaną liofilizowaną nukleazę NP1 z Penicillium Citrin do jednej z probówek z 10 mililitrami zapasu fosfatazy kwaśnej do końcowego stężenia 2,5 jednostki NP1 na mililitr; wymieszaj delikatnie, odwracając kilka razy probówkę, a następnie odwiruj oba roztwory enzymów przy 3000 ×g przez 30 minut. Aby sporządzić krzywą kalibracyjną, zacznij od dodania 1 mililitra 1 milimolarnego roztworu zapasowego fosforanu potasu do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i wykonaj siedem seryjnych rozcieńczeń po 0,5 mililitra; odrzuć pierwszą probówkę, tak aby końcowy zakres rozcieńczeń wynosił od 20 µl do 0,625 nM fosforu.Następnie przenieś standardy ORTOFOSFORANÓW do dwóch ostatnich kolumn na płytce, zaczynając od 0 nM ortofosforanu w rzędzie A i kończąc na 20 nM ortofosforanu w rzędzie H w trzech pierwszych studzienkach kolumny 10. Do kolejnych trzech studzienek kolumny 10 dodaj 40 µL roztworu enzymów PP oraz GP. Dodaj 40 µL roztworu jednego enzymu PP oraz GP oraz NP.Na koniec do wszystkich sześciu studzienek dodaj 40 µL buforu octanowego o stężeniu 100 mM. Obecnie każda z pierwszych sześciu studzienek w kolumnie 10 powinna zawierać 80 µL roztworu. Do kolejnych dwóch studzienek dodaj 40 µL roztworu octanu sodu zawierającego 10 M glukozy i fosforanu oraz 40 µL roztworu enzymów PP i GP.Dla każdej badanej próbki, po rozdzieleniu wszystkich próbek, nanieś 40 µL ekstraktów z próbek o dostosowanym pH do studni od pierwszej do dziewiątej w maksymalnie ośmiu rzędach. Używając pipety wielokanałowej, nanieś roztwór enzymu PP plus GP do kolumn od pierwszej do trzeciej, PP plus GP plus NP 1 do kolumn od czwartej do szóstej oraz 0,1 M bufor octanu sodu do kolumn od siódmej do dziewiątej. Wykonaj ten krok szybko, aby zapewnić wszystkim próbkom równoczesny czas inkubacji.Przykryj płytkę 96-dołkową pokrywką i inkubuj próbki, roztwory enzymów, kontrole oraz krzywą kalibracyjną dokładnie przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C w wodzie dejonizowanej. Przygotuj po 50 mL z każdego z czterech roztworów zapasowych. Roztwór A musi być przygotowywany codziennie, szybko, przy użyciu pipety wielokanałowej.Do wszystkich dołków płytki 96-dołkowej dodaj 25 µL SDS, 100 µL roztworu A, 20 µL roztworu B oraz 50 µL roztworu C. Przykryj płytkę i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec zmierz absorbancję przy 850 nm w dowolnym programowalnym czytniku płytek mikrodołkowych, wykorzystując aplikację arkusza kalkulacyjnego.W pierwszej kolejności należy wykreślić krzywą kalibracyjną dla fosforu nieorganicznego, nanosząc na oś X wartości od 0 do 20 nanomoli fosforu, a na oś Y średnią z pomiarów absorbancji wykonanych w dubletach, następnie przeprowadzić regresję liniową i wyznaczyć równanie linii trendu. Następnie należy obliczyć poziom tła fosforu nieorganicznego poprzez wyciągnięcie średniej z wartości w kolumnach od pierwszej do trzeciej, a następnie zastosowanie krzywej kalibracyjnej do zestawu danych. Aby określić ilość fosforu pochodzącego z hydrolizy monoestrów fosforanowych, należy obliczyć średnią z wartości próbek wykonanych w triplikatach w kolumnach od czwartej do szóstej, a następnie odjąć od nich wartość dla roztworu enzymu kontrolnego oraz poziom tła fosforu nieorganicznego.Następnie, aby obliczyć zawartość fosforu z fosforu zhydrolizowanego, DERs obliczają średnią z wartości próbek wykonanych w trzech powtórzeniach z kolumn od siedem do dziewięć i odejmują od niej wartość roztworu enzymu kontrolnego oraz tło nieorganicznego fosforu i fosforu z zhydrolizowanego monoestru z kolumn od czterech do sześciu. Typowa płytka 96-dołkowa przedstawia wyniki dla ośmiu próbek oraz krzywą kalibracyjną. Kontrole znajdują się w kolumnie 10.Wzrost intensywności koloru między kolumnami pierwszą a trzecią wynika z obecności zhydrolizowanych związków fosforu z grupy monoestrów, natomiast między kolumnami czwartą a szóstą oraz siódmą a dziewiątą wynika on z obecności zhydrolizowanych związków fosforu z grupy diaestrów. W niniejszej pracy zastosowano metodę wysokoprzepustowej hydrolizy enzymatycznej w celu pomyślnej analizy rozkładu klas fosforu w ekstraktach z próbki gleby z Vermont, przygotowanych w 0,25 molarnym wodorotlenku sodu i 0,05 molarnym EDTA. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat pomiaru natywnych ortofosforanów oraz związków monoestrów i diaestrów fosforu w ekstraktach z gleby lub obornika przy użyciu hydrolizy enzymatycznej.Ta technika może pomóc utorować drogę badaczom z dziedziny chemii środowiska i gospodarki składnikami odżywczymi w badaniu zachowania organicznego P w systemach glebowych lub nawozowych.

high-throughput-measurement-classification-organic-p-environmental

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wysokowydajne pomiaru i klasyfikacji organicznego P w próbkach środowiskowych

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Test bioreporterowy całej komórki z Burkholderia sartisoli RP037-mChe został opracowany do wykrywania frakcji zanieczyszczenia organicznego (tj. fluoru) dostępnego do degradacji bakteryjnej po aktywnym transporcie przez grzybnię wypełniającą pory wypełnione powietrzem w systemie modelowym nienasyconym wodą.

Podejście bioreporterowe oparte na całej komórce do oceny transportu i biodostępności zanieczyszczeń organicznych w systemach nienasyconych wodą

Struktura ściany komórkowej roślin i cechy chemiczne są oceniane w celu zidentyfikowania idealnych surowców do produkcji biopaliw i biomateriałów. Standardowe metody mają ograniczenia, gdy są stosowane do dużych zestawów danych. Te wysokoprzepustowe metody obróbki wstępnej, scukrzania enzymatycznego i pirolizy ze spektrometrią mas wiązki molekularnej porównują dużą liczbę próbek biomasy przy skróconym czasie i kosztach eksperymentu.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe zmian oporności biomasy lignocelulozowej: lignina całkowita, monomery ligniny i enzymatyczne uwalnianie cukru

Przedstawiono protokół dotyczący charakterystyki i zastosowania pięciu różnych pasywnych urządzeń do próbkowania.

Charakterystyka i zastosowanie próbników pasywnych do monitorowania pestycydów w wodzie

Czas reakcji transferu protonów w locie Spektrometria mas umożliwia bardzo czułą, szybką i nieinwazyjną analizę lotnych związków organicznych. Aby pokazać jej potencjał, podajemy trzy przykłady: fermentację mlekową jogurtu (monitorowanie bioprocesów on-line), różne genotypy jabłek (badania przesiewowe na dużą skalę) oraz przestrzeń zanosową po wypiciu kawy (analiza przestrzeni nosowej).

PTR-ToF-MS w połączeniu ze zautomatyzowanym systemem pobierania próbek i dostosowaną analizą danych do badań żywności: monitorowanie bioprocesów, badania przesiewowe i analiza przestrzeni nosowej

Ten artykuł opisuje procedury operacyjne dla Harvard Environmental Chamber (HEC) i powiązanych przyrządów do pomiaru gatunków gazowych i cząstek. Komora środowiskowa służy do produkcji i badania wtórnych gatunków organicznych wytwarzanych z prekursorów organicznych, zwłaszcza związanych z atmosferycznym pyłem organicznym.

Produkcja i pomiar organicznego pyłu zawieszonego w Harvard Environmental Chamber

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Przedstawiamy protokół szybkiego badania próbek środowiskowych pod kątem potencjału sideroforu, przyczyniającego się do biodostępności i obrotu mikroelementów w systemach lądowych.

Wysokoprzepustowe przesiewanie sideroforów z próbek środowiskowych: tkanek roślinnych, gleb masowych i gleb ryzosferowych

Obecny protokół opisuje prostą i efektywną metodę transportu kwasów perfluoroalkilowych w pszenicy na duże odległości.

Badanie transportu kwasów perfluoroalkilowych na duże odległości w pszenicy za pomocą techniki ekspozycji z rozszczepionymi korzeniami

Obecny protokół opisuje wykorzystanie mrówczanu amonu do podziału faz w QuEChERS, wraz z chromatografią gazową i spektrometrią mas, do skutecznego określania pozostałości pestycydów chloroorganicznych w próbce gleby.

Analiza pestycydów chloroorganicznych w próbce gleby za pomocą zmodyfikowanego podejścia QuEChERS z wykorzystaniem mrówczanu amonu

Poznaj metodę wysokoprzepustowej klasyfikacji fosforu organicznego w glebie i nawozach przy użyciu hydrolizy enzymatycznej. Technika ta umożliwia analizę form fosforu w standardowym laboratorium.

Wysokoprzepustowy pomiar i klasyfikacja fosforu organicznego w próbkach środowiskowych

Przeglądaj więcej filmów