Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny o wysokiej czułości w tkance mózgowej myszy Balb/C

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest analiza i ilościowe oznaczenie 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksyetylocytozyny w obrębie specyficznego locus DNA genomicznego. Cel ten osiąga się poprzez blokowanie grupy hydroksylowej 5-hydroksyetylocytozyny, co przekształca miejsce cięcia enzymu MSP1 w miejsce niepodatne na cięcie. W drugim kroku DNA genomiczne jest trawione enzymami restrykcyjnymi MSP1 i HPA2, które wykorzystują swoją różnicową wrażliwość na metylację do identyfikacji miejsc 5-hydroksyetylocytozyny związanych z glukozą.

Następnie przeprowadzono reakcję PCR w celu analizy locus. Wyniki wykazały obecność 5-hydroksyetylocytozyny w konkretnym locus. Metodą qPCR można określić ilościowo zawartość 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksyetylocytozyny.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak sekwencjonowanie z użyciem pirosiarczynu, jest możliwość rozróżnienia 5-metylocytozyny od 5-hydroksyetylocytozyny. Dzisiejsze eksperymenty zostaną przeprowadzone przez Romasa Vice Villę; Romas był głównym twórcą tego zestawu w New England Biolabs. Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu oczyszczono genomowe DNA z tkanki mózgowej B Sea, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej. W probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml zmieszaj genomowe DNA, UDP-glukozę, bufor NEB 4 oraz wystarczającą ilość wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość 310 µl.

Podziel tę mieszaninę reakcyjną do dwóch probówek, po 155 µL każda. Następnie do jednej z probówek dodaj 30 jednostek lub 3 µL T4 beta-glukozylotransferazy. Wymieszaj dokładnie, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół.

Do nie dodawaj T4 BGT do drugiej probówki, ponieważ jest to reakcja kontrolna, ale pamiętaj o dodaniu 3 µL wody. Inkubuj obie probówki w temperaturze 37 °C przez 12 do 18 godzin; w tym czasie BGT przyłączy glukozę do grupy hydroksylowej grup 5-hydroksyetylocytozyny w próbce. Aby rozpocząć trawienie enzymem restrykcyjnym, przenieś 50 µL mieszaniny reakcyjnej do każdej z trzech probówek PCR w pasku o pojemności 0,2 ml, oznakowanych numerami od 1 do 3.

Następnie odnieś aliquoty po 50 µL mieszaniny kontrolnej do każdej z trzech probówek paskowych do PCR oznaczonych numerami od czterech do sześciu. Do probówek jeden i cztery dodaj po 100 units msp. Następnie do probówek dwa i pięć dodaj po 50 units HPA two i wymieszaj dokładnie, delikatnie pipetując w górę i w dół.

Do probówek trzeciej i szóstej nie dodawać niczego, ponieważ służą one jako kontrole. Wszystkie sześć probówek inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej cztery godziny. Następnie do każdej probówki dodać 1 µL proteinazy K i inkubować w temperaturze 40 °C przez 30 minut.

Na koniec należy dezaktywować proteinazę K poprzez inkubację w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Procedura ta została zaprezentowana z użyciem zestawu NEB LongAmp Taq dla endpoint PCR. Można jednak zastosować inne odczynniki i procedury PCR w probówce do reakcji PCR o pojemności 0,2 ml na lodzie.

Dodać 5x bufor reakcyjny long amp TAC, dNTP, primery forward i reverse, wcześniej otrzymaną matrycę DNA, polimerazę long AMP TDNA oraz odpowiednią ilość wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać objętość końcową 50 µL. Delikatnie wymieszać odczynnik i w razie potrzeby zebrać cały płyn na dnie probówki poprzez krótkie wirowanie. Przenieść probówki PCR z lodu do termocyklera z blokiem wstępnie podgrzanym do 94 °C i uruchomić program cykli dla rutynowego trójetapowego PCR.

Należy przeprowadzić jeden wstępny etap denaturacji w temperaturze 94°C przez 30 s, a następnie 30 cykli obejmujących denaturację w 94°C przez 15 s, przyłączanie starterów w temperaturze od 55 do 65°C przez 30 s oraz elongację w 65°C przez 20 s lub 50 s na kb. Cały proces należy zakończyć jedną końcową elongacją w 65°C przez pięć minut. Można również przeprowadzić PCR w czasie rzeczywistym w celu ilościowego oznaczenia zawartości 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksymetylocytozyny.

Szczegółowe informacje znajdują się w instrukcji produktu dostępnej na stronie nb. com. Porównanie ilości pięciu hydroxyethyl aine w locus 12 przeprowadzono przy użyciu końcowej PCR oraz PCR w czasie rzeczywistym; przeanalizowano cztery różne próbki tkanek mysich BSY, w tym mózg, wątrobę, serce i śledzionę.

Zmienność poziomu 5-hydroksyetylocytozyny jest widoczna w obramowanej ścieżce żelu z próbkami końcowego PCR w celu porównania. Dane z PCR w czasie rzeczywistym zostały znormalizowane względem nieciętego DNA, a do wyznaczenia liczby kopii wykorzystano krzywą wzorcową. Próbki znormalizowano poprzez podzielenie liczby kopii w próbkach przez liczbę kopii w kontroli niepoddanej trawieniu.

Tutaj zmienność poziomu 5-hydroksyetylocytozyny można zaobserwować, porównując żółte słupki. Kilka uwag dotyczących przeprowadzania tej techniki. Kluczowe jest, aby wszystkie reakcje enzymatyczne zostały doprowadzone do końca. W przypadku BGT ważne jest, aby inkubację prowadzić przez noc, aby móc całkowicie wyizolować wszystkie miejsca DNA dla Ms.P one i HEPA two; w przypadku tych reakcji ważne jest, aby trwały one co najmniej cztery godziny, aby mieć pewność, że osiągnięto pełny stopień przereagowania.

I na koniec zapewniamy kontrole DNA oraz kontrole starterów, aby umożliwić przeprowadzenie reakcji kontrolnych równolegle.