Name: Wysoka czułość wykrywania 5-hydroksymetylocytozyny w tkance mózgowej Balb / C (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-01T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj metodę wykrywania 5-hydroksymetylocytozyny w tkance mózgowej myszy Balb/C przy użyciu zestawu EpiMark. Technika oparta na reakcjach enzymatycznych umożliwia ilościową analizę modyfikacji epigenetycznych DNA z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sriharsa Pradhan, Shannon Morey Kinney, Hang Gyeong Chin, Jurate Bitinaite, Yu Zheng, Pierre Olivier Esteve, Romualdas Vaisvila, laboratorium Stevena E. Jacobsena, UCLA. Praca ta została częściowo sfinansowana przez NIH 1R44GM095209-01.

1. Glukozylacja DNA i reakcje kontrolne
<ol>
	<li>W probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml, w warunkach chłodzenia na lodzie, zmieszać 5-10 µg genomicznego DNA (do uzyskania stężenia końcowego 30 µg/ml), 12,4 µl UDP-glukozy (do uzyskania stężenia końcowego 80 µM), 31 µl NEBuffer 4 oraz uzupełnić wodą wolną od nukleaz do objętości końcowej 310 µl.</li>
	<li>Podzielić tę mieszaninę reakcyjną do dwóch probówek po 155 µl każda.</li>
	<li>Następnie do jednej z probówek dodać 30 jednostek (lub 3 µl) T4-β-glukozylotransferazy. Dokładnie wymieszać, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół. Druga probówka służy jako reakcja kontrolna, dlatego zamiast T4-BGT należy dodać 3 µl wody.</li>
	<li>Inkubować obie probówki w temperaturze 37 °C przez 12 do 18 godzin; w tym czasie T4-BGT przyłączy glukozę do grupy hydroksylowej grup 5-hydroksymetylocytozyny w próbce.</li>
</ol>
2. Trawienie enzymami restrykcyjnymi
<ol>
	<li>Oznakuj trzy probówki z pasków PCR o pojemności 0.2 ml numerami od 1 do 3. Do każdej z nich odmień 50 µl mieszaniny reakcyjnej.</li>
	<li>Oznakuj trzy probówki z pasków PCR o pojemności 0.2 ml numerami od 4 do 6. Do każdej z nich odmień 50 µl mieszaniny kontrolnej.</li>
	<li>Do probówek 1 i 4 dodaj 100 jednostek, czyli 1 µl, MspI. Wymieszaj dokładnie, delikatnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Do probówek 2 i 5 dodaj 50 jednostek, czyli 1 µl, HpaII. Wymieszaj dokładnie, delikatnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Do probówek 3 i 6 nie dodawaj niczego, ponieważ służą one jako kontrole.</li>
	<li>Inkubuj wszystkie 6 probówek w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 godziny.</li>
	<li>Do każdej probówki dodaj 1 µl Proteinazy K i inkubuj w temperaturze 40 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Znieczyń Proteinazę K poprzez inkubację w temperaturze 95 °C przez 10 minut.</li>
</ol>
3. Analiza DNA za pomocą PCR/qPCR
W niniejszym protokole wykorzystano polimerazę LongAmp Taq firmy NEB do końcowej reakcji PCR, która wykazała wysoką skuteczność. Można zastosować inne protokoły PCR.
<ol>
	<li>Do probówki PCR o pojemności 0,2 ml na lodzie dodać następujące składniki: 10 µL 5X LongAmp Taq Reaction Buffer, 1,5 µL 10 mM dNTPs, 1 µL 10 µM Forward Primer, 1 µL 10 µM Reverse Primer, 3 µL matrycowego DNA z poprzednich etapów, 1 µL LongAmp Taq DNA Polymerase oraz wodę wolną od nukleaz do objętości 50 µL. Objętości te mogą ulec zmianie w zależności od stosowanego protokołu PCR.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać reakcję. W razie potrzeby zebrać cały płyn na dnie probówki poprzez krótkie wirowanie.</li>
	<li>Przykryć próbkę olejem mineralnym, jeśli używany termocykler nie posiada grzanej pokrywy.</li>
	<li>Przenieść probówki PCR z lodu do termocyklera z blokiem wstępnie podgrzanym do 94 °C i uruchomić program cykli. W przypadku rutynowego 3-etapowego PCR należy zastosować jeden wstępny etap denaturacji w 94 °C przez 30 s, a następnie 30 cykli składających się z denaturacji w 94 °C przez 15 s, przyłączania w temperaturze od 55 do 65 °C przez 30 s oraz elongacji w 65 °C przez 20 s lub 50 s na kb. Następnie należy przeprowadzić jedną końcową elongację w 65 °C przez 5 min. W celu ilościowego oznaczenia zawartości 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny można również przeprowadzić PCR w czasie rzeczywistym. Szczegółowe informacje znajdują się w instrukcji produktu dostępnej na stronie neb.com.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2661/2661fig1.jpg" alt="Wyniki elektroforezy żelowej analizy metylacji i wykresy słupkowe porównujące liczbę kopii DNA w tkankach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1.Porównanie ilości 5-hydroksymetylocytozyny w locus 12 w różnych próbkach tkanek myszy Balb/C. (A), PCR punktowy. (B), PCR w czasie rzeczywistym.
Przeanalizowano DNA z czterech tkanek myszy. W celach porównawczych dane z PCR w czasie rzeczywistym znormalizowano względem niepociętego DNA. Do wyznaczenia liczby kopii wykorzystano krzywą wzorcową. Próbki można było znormalizować, dzieląc liczbę kopii w próbkach nr 1-6 przez liczbę kopii w kontroli niepoddanej trawieniu (nr 5). Obramowana ścieżka żelu pokazuje zmienność obecnego 5-hmC.

<ol><li>Sadri, R. Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).</li>
<li>Mathur, E. J. Gene. 108, 1-6 (1991).</li>
<li>Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. Science. 324, 929-930 (2009).</li>
<li>Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).</li>
</ol>

Zarówno Ted, jak i Romas, autorzy tego artykułu, są pracownikami firmy NEB; Romas jest głównym opracowawcą zestawu, natomiast Ted pełni funkcję dyrektora działu aplikacji i rozwoju, który nadzorował opracowanie tego zestawu.

Podczas przygotowywania tego eksperymentu należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kwestii. Po pierwsze, ważne jest, aby glukozylacja genomowego DNA została przeprowadzona do końca. Specyficzność sekwencyjna T4-BGT nie jest znana i wydaje się, że enzym ten nie wykazuje preferencji co do sekwencji substratu. W związku z tym w niektórych przypadkach może być konieczne wydłużenie czasu inkubacji. Po drugie, trawienie za pomocą MspI i HpaII musi być całkowite, aby uniknąć sygnału tła. W przypadku tych enzymów restrykcyjnych zalecamy czas inkubacji wynoszący 4 godziny, jednak w razie zaobserwowania niepełnego cięcia można przeprowadzić dłuższą inkubację. Po trzecie, ilość wprowadzonego DNA można dostosować w zależności od dostępności, ponieważ do PCR końcowego można wykorzystać 20 ngs DNA. Na koniec zalecamy stosowanie dostarczonego kontrolnego DNA, które może być analizowane równolegle z genomowym DNA w celu ilościowego oznaczenia 5-mC i 5-hmC.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do analizy 5-hmC i 5-mC EpiMark&amp;#8482;</td><td>New England Biolabs</td><td>E3317</td><td></td></tr><tr><td>Primery specyficzne dla locus, flankujące interesującą sekwencję CCGG</td><td></td><td></td><td>Dostosowane do eksperymentu; dostarczone przez użytkownika</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA LongAmp&amp;#174; &lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0323</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>woda klasy biologii molekularnej</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny o wysokiej czułości w tkance mózgowej myszy balb/c

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

Hydroksymetylacja DNA jest znaną od dawna modyfikacją DNA, która jednak w ostatnim czasie stała się przedmiotem intensywnych badań epigenetycznych. DNA ssaków jest enzymatycznie modyfikowane na pozycji 5ego węgla reszt cytozyny (C) do 5-mC, głównie w obrębie dinukleotydów CpG. 5-mC ulega enzymatycznemu utlenieniu do 5-hmC przez enzymy z rodziny Tet, które uważa się za zaangażowane w procesy rozwojowe oraz patogenezę chorób. Obecnie biologiczna rola 5-hmC nie jest w pełni poznana, jednak budzi duże zainteresowanie ze względu na swój potencjał jako biomarkera. Wynika to z kilku przełomowych badań, w których zidentyfikowano 5-hydroksymetylocytozynę w embrionalnych komórkach macierzystych (ES) oraz komórkach neuronalnych myszy. Techniki badawcze, w tym metody sekwencjonowania z konwersją bisyfitową, nie pozwalają na łatwe rozróżnienie między 5-mC a 5-hmC. Istnieje kilka protokołów umożliwiających pomiar globalnej ilości 5-hydroksymetylocytozyny w genomie, w tym chromatografia cieczowa sprzężona z analizą spektrometrii mas lub chromatografia cienkowarstwowa pojedynczych nukleozydów uzyskanych z trawienia DNA genomowego. Dostępne są również przeciwciała skierowane przeciwko 5-hydroksymetylocytozynie, które mogą być wykorzystane w analizie dot blot, immunofluorescencji lub wytrącaniu hydroksymetylowanego DNA, jednak przeciwciała te nie zapewniają rozdzielczości na poziomie pojedynczej zasady. Ponadto rozdzielczość zależy od wielkości immunoprecypitowanego DNA, a w przypadku eksperymentów z mikromacierzami – od projektu sondy. Ponieważ nie jest dokładnie znane, w których miejscach genomu występuje 5-hydroksymetylocytozyna ani jaka jest jej rola w regulacji epigenetycznej, konieczne są nowe techniki umożliwiające identyfikację hydroksymetylacji specyficznej dla konkretnych locusów. Zestaw EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit stanowi rozwiązanie pozwalające na rozróżnienie tych dwóch modyfikacji w określonych locusach. Zestaw do analizy EpiMark 5-hmC i 5-mC to prosta i niezawodna metoda identyfikacji i oznaczania ilościowego 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksymetylocytozyny w konkretnym locus DNA. To podejście enzymatyczne wykorzystuje różną wrażliwość na metylację izoschizomerów MspI i HpaII w prostym, 3-stopniowym protokole. Badane DNA genomiczne poddaje się działaniu T4-BGT, co prowadzi do przyłączenia reszty glukozy do 5-hydroksymetylocytozyny. Reakcja ta jest niezależna od sekwencji, zatem wszystkie 5-hmC zostaną glukozylowane; DNA niemodyfikowane lub zawierające 5-mC nie ulegnie zmianom. Następnie po glukozylacji przeprowadza się trawienie endonukleazą restrykcyjną. MspI i HpaII rozpoznają tę samą sekwencję (CCGG), lecz wykazują różną wrażliwość na stan metylacji. HpaII przecina tylko całkowicie niemodyfikowane miejsce: każda modyfikacja (5-mC, 5-hmC lub 5-ghmC) przy którejkolwiek z cytozyn blokuje cięcie. MspI rozpoznaje i przecina 5-mC oraz 5-hmC, ale nie 5-ghmC. Trzecią częścią protokołu jest analiza locus za pomocą PCR. Można wykorzystać ilość DNA wejściowego wynoszącą zaledwie 20 ng. Przeprowadzana jest amplifikacja eksperymentalnego (glukozylowanego i trawionego) oraz kontrolnego (pozornie glukozylowanego i trawionego) docelowego DNA za pomocą starterów flankujących interesującą sekwencję CCGG (100-200 bp). Jeśli miejsce CpG zawiera 5-hydroksymetylocytozynę, po glukozylacji i trawieniu zostanie wykryty prążek, który nie pojawi się w kontrolnej reakcji bez glukozylacji. PCR w czasie rzeczywistym pozwoli na przybliżone określenie ilości hydroksymetylocytozyny w tym konkretnym miejscu. W tym eksperymentie przeanalizujemy zawartość 5-hydroksymetylocytozyny w próbce mózgu myszy Babl/C za pomocą końcowej PCR.

Zestaw do analizy EpiMark 5-hmC i 5-mC może być stosowany do analizy i oznaczania ilościowego 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksymetylocytozyny w obrębie konkretnego locus. Zestaw odróżnia 5-mC od 5-hmC poprzez dodanie glukozy do grupy hydroksylowej 5-hmC w reakcji enzymatycznej z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (T4-BGT). Gdy 5-hmC występuje w kontekście CCGG, modyfikacja ta przekształca podatną na cięcie sekwencję rozpoznawaną przez MspI w sekwencję niepodatną na cięcie.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny o wysokiej czułości w tkance mózgowej myszy Balb/C

Hydroksymetylacja DNA jest znaną od dawna modyfikacją DNA, która jednak w ostatnim czasie stała się przedmiotem intensywnych badań nad epigenetyką. DNA ssaków jest enzymatycznie...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest analiza i ilościowe oznaczenie 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksyetylocytozyny w obrębie specyficznego locus DNA genomicznego. Cel ten osiąga się poprzez blokowanie grupy hydroksylowej 5-hydroksyetylocytozyny, co przekształca miejsce cięcia enzymu MSP1 w miejsce niepodatne na cięcie. W drugim kroku DNA genomiczne jest trawione enzymami restrykcyjnymi MSP1 i HPA2, które wykorzystują swoją różnicową wrażliwość na metylację do identyfikacji miejsc 5-hydroksyetylocytozyny związanych z glukozą.Następnie przeprowadzono reakcję PCR w celu analizy locus. Wyniki wykazały obecność 5-hydroksyetylocytozyny w konkretnym locus. Metodą qPCR można określić ilościowo zawartość 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksyetylocytozyny.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak sekwencjonowanie z użyciem pirosiarczynu, jest możliwość rozróżnienia 5-metylocytozyny od 5-hydroksyetylocytozyny. Dzisiejsze eksperymenty zostaną przeprowadzone przez Romasa Vice Villę; Romas był głównym twórcą tego zestawu w New England Biolabs. Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu oczyszczono genomowe DNA z tkanki mózgowej B Sea, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej. W probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml zmieszaj genomowe DNA, UDP-glukozę, bufor NEB 4 oraz wystarczającą ilość wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość 310 µl.Podziel tę mieszaninę reakcyjną do dwóch probówek, po 155 µL każda. Następnie do jednej z probówek dodaj 30 jednostek lub 3 µL T4 beta-glukozylotransferazy. Wymieszaj dokładnie, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół.Do nie dodawaj T4 BGT do drugiej probówki, ponieważ jest to reakcja kontrolna, ale pamiętaj o dodaniu 3 µL wody. Inkubuj obie probówki w temperaturze 37 °C przez 12 do 18 godzin; w tym czasie BGT przyłączy glukozę do grupy hydroksylowej grup 5-hydroksyetylocytozyny w próbce. Aby rozpocząć trawienie enzymem restrykcyjnym, przenieś 50 µL mieszaniny reakcyjnej do każdej z trzech probówek PCR w pasku o pojemności 0,2 ml, oznakowanych numerami od 1 do 3.Następnie odnieś aliquoty po 50 µL mieszaniny kontrolnej do każdej z trzech probówek paskowych do PCR oznaczonych numerami od czterech do sześciu. Do probówek jeden i cztery dodaj po 100 units msp. Następnie do probówek dwa i pięć dodaj po 50 units HPA two i wymieszaj dokładnie, delikatnie pipetując w górę i w dół.Do probówek trzeciej i szóstej nie dodawać niczego, ponieważ służą one jako kontrole. Wszystkie sześć probówek inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej cztery godziny. Następnie do każdej probówki dodać 1 µL proteinazy K i inkubować w temperaturze 40 °C przez 30 minut.Na koniec należy dezaktywować proteinazę K poprzez inkubację w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Procedura ta została zaprezentowana z użyciem zestawu NEB LongAmp Taq dla endpoint PCR. Można jednak zastosować inne odczynniki i procedury PCR w probówce do reakcji PCR o pojemności 0,2 ml na lodzie.Dodać 5x bufor reakcyjny long amp TAC, dNTP, primery forward i reverse, wcześniej otrzymaną matrycę DNA, polimerazę long AMP TDNA oraz odpowiednią ilość wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać objętość końcową 50 µL. Delikatnie wymieszać odczynnik i w razie potrzeby zebrać cały płyn na dnie probówki poprzez krótkie wirowanie. Przenieść probówki PCR z lodu do termocyklera z blokiem wstępnie podgrzanym do 94 °C i uruchomić program cykli dla rutynowego trójetapowego PCR.Należy przeprowadzić jeden wstępny etap denaturacji w temperaturze 94°C przez 30 s, a następnie 30 cykli obejmujących denaturację w 94°C przez 15 s, przyłączanie starterów w temperaturze od 55 do 65°C przez 30 s oraz elongację w 65°C przez 20 s lub 50 s na kb. Cały proces należy zakończyć jedną końcową elongacją w 65°C przez pięć minut. Można również przeprowadzić PCR w czasie rzeczywistym w celu ilościowego oznaczenia zawartości 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksymetylocytozyny.Szczegółowe informacje znajdują się w instrukcji produktu dostępnej na stronie nb. com. Porównanie ilości pięciu hydroxyethyl aine w locus 12 przeprowadzono przy użyciu końcowej PCR oraz PCR w czasie rzeczywistym; przeanalizowano cztery różne próbki tkanek mysich BSY, w tym mózg, wątrobę, serce i śledzionę.Zmienność poziomu 5-hydroksyetylocytozyny jest widoczna w obramowanej ścieżce żelu z próbkami końcowego PCR w celu porównania. Dane z PCR w czasie rzeczywistym zostały znormalizowane względem nieciętego DNA, a do wyznaczenia liczby kopii wykorzystano krzywą wzorcową. Próbki znormalizowano poprzez podzielenie liczby kopii w próbkach przez liczbę kopii w kontroli niepoddanej trawieniu.Tutaj zmienność poziomu 5-hydroksyetylocytozyny można zaobserwować, porównując żółte słupki. Kilka uwag dotyczących przeprowadzania tej techniki. Kluczowe jest, aby wszystkie reakcje enzymatyczne zostały doprowadzone do końca. W przypadku BGT ważne jest, aby inkubację prowadzić przez noc, aby móc całkowicie wyizolować wszystkie miejsca DNA dla Ms.P one i HEPA two; w przypadku tych reakcji ważne jest, aby trwały one co najmniej cztery godziny, aby mieć pewność, że osiągnięto pełny stopień przereagowania.I na koniec zapewniamy kontrole DNA oraz kontrole starterów, aby umożliwić przeprowadzenie reakcji kontrolnych równolegle.

high-sensitivity-5-hydroxymethylcytosine-detection-balbc-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wysoka Czułość Wykrywania 5-hydroksymetylocytozyny w Tkankach Mózgu Balb/C

Opisano dwuetapowy proces znakowania z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (β-GT) w celu przeniesienia azydoglućkozy na 5-hmC, a następnie zastosowanie chemii klik w celu przeniesienia łącznika biotynowego dla łatwego i niezależnego od gęstości wzbogacenia. Ta wydajna i specyficzna metoda znakowania umożliwia wzbogacenie 5-hmC przy niezwykle niskim poziomie tła oraz wysokoprzepustowe mapowanie epigenomiczne za pomocą sekwencjonowania następnej generacji.

Selektywne wychwytywanie 5-hydroksymetylocytozyny z DNA genomowego

Ten film opisuje technikę dot-blot do określania poziomu metylacji DNA w ludzkich chondrocytach in vitro poprzez plamienie próbek DNA na nylonowej membranie i późniejszą wizualizację za pomocą przeciwciał monoklonalnych. Pomaga to określić fenotyp chondrocytów na różnych etapach hodowli.

5-metylocytozyna Dot Blot w celu określenia stopnia metylacji DNA

Ten protokół opisuje wykrywanie wirusa cytomegalii metodą qPCR w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie, co jest szybkie, czułe, specyficzne i przydatne do interpretacji niejednoznacznych wzorców barwienia hematoksyliną i eozyną lub immunohistochemicznych.

qPCR jest czułą i szybką metodą wykrywania DNA wirusa cytomegalii w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie

Hybrydyzacja in situ (ISH) RNA umożliwia wizualizację RNA w komórkach i tkankach. Tutaj pokazujemy, jak połączenie RNAscope ISH z immunohistochemią lub barwnikami histologicznymi może być z powodzeniem wykorzystane do wykrywania mRNA zlokalizowanych na aksonach w odcinkach mózgu myszy i człowieka.

Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w skrawkach mózgu za pomocą hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości

Tutaj opisujemy czułą immunochemiczną metodę mapowania przestrzennego rozkładu pochodnych utleniania 5mC opartą na użyciu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą i amplifikacji sygnału tyramidowego.

Wykrywanie zmodyfikowanych form cytozyny za pomocą czułej immunohistochemii

Nowo odkryte utlenione formy 5-metylocytozyny (oksy-mC), 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC) mogą reprezentować odrębne modyfikacje DNA o unikalnych rolach funkcjonalnych. W tym miejscu opisano półilościowy przepływ pracy do wizualizacji rozkładu przestrzennego oksy-mC, profilowania intensywności sygnału i kolokalizacji.

Barwienie immunologiczne w modyfikacjach DNA: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych

Przedstawiono szczegółowe protokoły wprowadzania zmodyfikowanego enzymu rozszczepionego TET2 (CiDER) do komórek ssaków w celu indukowania chemicznie indukowanego DNA hydroksymetylacji i epigenetycznej przebudowy.

Zmodyfikowany enzym split-TET2 do chemicznie indukowanej hydroksymetylacji DNA i przebudowy epigenetycznej

Celem tego raportu jest opisanie protokołu do solidnego immunohistochemicznego wykrywania markerów epigenetycznych, 5-metylocytozyny (5mC) i 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC) w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy.

Immunohistochemiczne wykrywanie 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania 5-hydroksymetylocytozyny w komórkach i tkankach mózgu, wykorzystujący barwienie immunofluorescencyjne i metody dot-blot DNA.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny w nerwowych komórkach macierzystych i mózgach myszy

Odwracalne dodawanie palmitynianu do białek jest ważnym regulatorem wewnątrzkomórkowego transportu białek. Jest to szczególnie interesujące w neuronach, w których wiele białek synaptycznych jest palmitoilowanych. Wykorzystujemy prostą metodę biochemiczną do wykrywania białek palmitoilowanych w hodowanych neuronach, które można dostosować do wielu typów komórek i tkanek.

Wykrywanie palmitoylacji białek w hodowanych neuronach hipokampa poprzez immunoprecypitację i wymianę acylo-biotyny (ABE)

Poznaj metodę wykrywania 5-hydroksymetylocytozyny w tkance mózgowej myszy Balb/C przy użyciu zestawu EpiMark. Technika oparta na reakcjach enzymatycznych umożliwia ilościową analizę modyfikacji epigenetycznych DNA z wysoką czułością.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny o wysokiej czułości w tkance mózgowej myszy Balb/C

Przeglądaj więcej filmów