Dokładny i prosty pomiar cytokiny prozapalnej IL-1β z wykorzystaniem testu stymulacji krwi pełnej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar cytokin prozapalnych produkowanych w teście stymulacji krwi pełnej. W pierwszej kolejności składniki komórkowe krwi pełnej są izolowane z osocza poprzez wirowanie, a następnie liczba białych krwinek jest wyznaczana przy użyciu barwienia acydyną pomarańczową. Następnie komórki są wysiewane i stymulowane LPS w celu wywołania produkcji cytokin przez komórki posiadające receptory rozpoznające wzorce mikrobiologiczne. Nadnadiny z hodowli są następnie zbierane w określonych punktach czasowych po rozpoczęciu stymulacji.

Na koniec stężenia cytokin w supernatantach mierzy się za pomocą testu multipleksowego na płytce 96-dołkowej. Dzięki tej prostej metodzie można szybko ocenić zmienność stężeń cytokin prozapalnych produkowanych przez stymulowane komórki pochodzące od różnych dawców. Metoda ta jest szczególnie użyteczna w identyfikacji chorób zapalnych o podłożu cytokinowym u pacjentów wykazujących patologiczne objawy przeciwzapalne, zwłaszcza w sytuacjach, gdy dostępna objętość krwi jest ograniczona.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami pomiaru stężeń cytokin jest to, że technologia oparta na systemie Luminex umożliwia jednoczesny pomiar wielu cytokin przy użyciu niewielkiej objętości próbki. Należy pobrać próbki zawierające 10 ml lub więcej krwi żylnej od osób chorych, a także od zdrowych osób kontrolnych dobranych pod względem wieku i płci; należy upewnić się, że próbki są pobierane do probówek Vacutainer z heparyną sodową i że nie dodano EDTA ani innych przeciwkrzepliwości, ponieważ mogą one zakłócić przebieg analizy. Próbki należy przetworzyć tak szybko, jak to możliwe po pobraniu. W razie potrzeby próbki mogą być przechowywane do 24 godzin w temperaturze pokojowej w warunkach słabego oświetlenia.

Odwiruj próbki krwi przy 3000 RPM przez 10 minut w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamowaniem. Po odwirowaniu próbek pobierz osocze z górnej części probówek, uważając, aby nie naruszyć warstwy „buffy coat” zawierającej monocyty i limfocyty. Resuspenduj warstwę „buffy coat” oraz znajdujący się pod nią osad erytrocytów w bezsurowiczym medium RPMI w temperaturze pokojowej, aby wypłukać komórki, delikatnie pipetując mieszaninę.

Następnie przenieść komórki z probówki do zbierania do 50 ml probówki stożkowej. Uzupełnić objętość do 50 ml za pomocą medium RPMI i delikatnie odwrócić każdą probówkę, aby wymieszać zawartość. Ponownie odwirować komórki przy 3000 RPM przez 10 minut.

Następnie odessij supernatant, uważając, aby nie zaburzyć pelletu komórkowego. Powtórz ten etap płukania od dwóch do czterech razy, aby usunąć zanieczyszczenia i wyeliminować cytokiny związane z komórkami. Po wypłukaniu komórek resuspenduj je w medium RPMI bez surowicy do uzyskania całkowitej objętości 20 milliliters. Aby policzyć komórki, nanieś 20 microliters mieszaniny próbki i barwnika acridine orange w stosunku jeden do jednego do jednorazowej komory zliczeniowej Soterascope. Acridine orange stosowany w końcowym stężeniu 1 microgram per milliliter barwi wyłącznie jądrowe białe krwinki, co pozwala na ich odróżnienie od czerwonych krwinek.

Po uzyskaniu całkowitej liczby komórek, należy policzyć wyłącznie komórki D-dodatnie. Przesuspenduj próbki w medium RPMI bez surowicy, aby uzyskać końcowe stężenie 2 milionów komórek na mililitr. Dla każdej próbki opisz podwójne studzienki płytki 24-dołkowej, zgodnie z warunkami eksperymentalnymi przeznaczonymi do przetestowania.

W tym przypadku warunki obejmują: brak stymulacji, sam LPS, sam a TP oraz LPS wraz z a TP. Do każdej studni dodaj jeden mililitr rozcieńczonych komórek, a do odpowiednich studni dodaj LPS do końcowej strefy stężenia 1 µg/mL. Próbki inkubuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez dwie godziny i 40 minut. Po tym wstępnym okresie inkubacji dodaj a TP do końcowego stężenia 2 mM w studniach z samym a TP oraz LPS wraz z a TP. Następnie inkubuj płytki przez kolejne 20 minut w temperaturze 37 °C.

Po zakończeniu drugiej inkubacji przenieś komórki z każdej studzienki do oddzielnej, wcześniej oznakowanej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra, odwiruj próbki przy 10 000 RRP M przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie przenieś nadsącz z każdej probówki do nowej, wcześniej oznakowanej probówki EOR. Nadsącz można poddać analizie pod kątem cytokin niezwłocznie lub przechowywać w zamrożeniu w celu oceny stężeń IL one beta lub innych cytokin. W próbkach stosujemy Bio-Plex Pro Human Cytokine X-plex z systemem Bio-Plex 200.

Zgodnie z instrukcjami producenta. Na tym schemacie analiza produkcji IL-1β po stymulacji prawidłowych komórek krwi pełnej za pomocą LPS, ATP lub obu tych czynników jednocześnie wykazuje odpowiedź na LPS plus ATP, której skala zależy od liczby stymulowanych komórek. W przeciwieństwie do zdrowych kontroli, testy krwi pełnej pobranej od pacjentów z patologiami autozapalnymi wykazują zwiększoną produkcję IL-1β po stymulacji LPS w przypadku braku egzogennego dodatku ATP. Należy pamiętać, że praca z płynami ustrojowymi człowieka, takimi jak krew, może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać uniwersalnych środków ostrożności.