Name: Przygotowanie i stosowanie pierwotnych limfocytów T CD4 + zakażonych HIV-1 jako komórek docelowych w testach cytotoksycznych komórek NK (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Poznaj metodę izolacji zakażonych HIV-1 limfocytów T CD4+ jako komórek docelowych w testach cytotoksyczności komórek NK. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej i interakcji receptor-ligand.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Ruscetti, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+effector+mechanisms+against+HTLV-I-+and+HTLV-III%2FLAV-infected+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells.</a> J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).</li>
<li>Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparent+ineffectiveness+of+natural+killer+cells+vis-a-vis+retrovirus-infected+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets.</a> J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).</li>
<li>Ferrari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clade+B-based+HIV-1+vaccines+elicit+cross-clade+cytotoxic+T+lymphocyte+reactivities+in+uninfected+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).</li>
<li>Shankar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+function+of+circulating+HIV-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+chronic+human+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection.</a> Blood. 96, 3094-3101 (2000).</li>
<li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Vpr+triggers+natural+killer+cell-mediated+lysis+of+infected+cells+through+activation+of+the+ATR-mediated+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response.</a> PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).</li>
<li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+modulates+the+expression+of+ligands+important+in+triggering+natural+killer+cell+cytotoxic+responses+on+infected+primary+T-cell+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts.</a> Blood. 110, 1207-1214 (2007).</li>
<li>Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+human+immunodeficiency+virus-infected+primary+T-cell+blasts+by+autologous+natural+killer+cells+is+dependent+on+the+ability+of+the+virus+to+alter+the+expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules.</a> Blood. 104, 2087-2094 (2004).</li>
<li>Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+mechanisms+in+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).</li>
<li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> J Virol. 74, 10074-10080 (2000).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Fogli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysis+of+endogenously+infected+CD4%2B+T+cell+blasts+by+rIL-2+activated+autologous+natural+killer+cells+from+HIV-infected+viremic+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals.</a> PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).</li>
<li>Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cell+lysis+of+HIV-1-infected+autologous+CD4+primary+T+cells%3A+requirement+for+IFN-mediated+NK+activation+by+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells.</a> J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).</li>
<li>Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-C+and+HLA-E+reduce+antibody-dependent+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+of+HIV-infected+primary+T+cell+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts.</a> Aids. 18, 1769-1779 (2004).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Przy prawidłowym wykonaniu testy opisane w niniejszym protokole powinny dostarczyć reprezentatywnego obrazu zdolności komórek NK do degranulacji i lizy komórek zakażonych HIV-1 (patrz Rycina 5). Degranulacja komórek NK w odpowiedzi na komórki zakażone HIV oraz lizy komórek zakażonych HIV przez komórki NK powinny być bezpośrednio proporcjonalne10. Wiarygodne wyniki dwóch funkcjonalnych testów komórek NK służących do pomiaru odpowiedzi cytotoksycznej na komórki zakażone HIV zależą od izolacji wysoko oczyszczonych komórek NK, jak i wysoko oczyszczonej populacji komórek zakażonych. Posiadanie oczyszczonych komórek NK i komórek zakażonych HIV-1 jest kluczowe dla uzyskania dość dokładnego stosunku komórek efektorowych do docelowych. Podobnie, usunięcie martwych i apoptotycznych komórek z populacji komórek docelowych jest istotne przed znakowaniem 51Cr lub inkubacją z komórkami efektorowymi. 51Cr może być internalizowany przez komórki przechodzące apoptozę, a obecność martwych lub apoptotycznych komórek podczas etapu znakowania izotopowego spowoduje wysokie uwalnianie spontaniczne i zniekształci obliczony % specyficznej lizy. Co więcej, obecność martwych lub apoptotycznych komórek może wyzwolić degranulację komórek NK, prowadząc do nienaturalnie wysokich poziomów ekspresji CD107a. Precyzyjne pipetowanie jest niezbędne podczas usuwania bezkomórkowych supernatantów po inkubacji komórek NK i komórek docelowych w testach uwalniania 51Cr, ponieważ różnice w objętości supernatantu usuniętego z każdej powtórzonej serii w studzienkach spowodują wysokie odchylenia standardowe. Protokoły te można modyfikować w celu oceny roli specyficznych receptorów NK w wyzwalaniu lizy komórek zakażonych HIV przez komórki NK poprzez inkubację efektorów lub celów przed kokulturą z przeciwciałami antagonistycznymi do specyficznych receptorów lub ligandów 6,11. Do oceny funkcjonalności stymulowanych komórek NK można użyć komórek NK traktowanych cytokinami (np. IL-2, IL-15) 12. Podobnie, zgodnie z tymi protokołami można przeprowadzić testy cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał. Przeciwciała anty-HIV (np. anty-gp120) można dodać do komórek docelowych w celu rozpoznania przez receptor CD16 o niskim powinowactwie do Fc komórek NK 13. Testy te, choć zaprojektowane do pomiaru odpowiedzi cytotoksycznej komórek NK na komórki zakażone HIV, mogą być również modyfikowane w celu pomiaru zdolności komórek NK do produkcji cytokin po rozpoznaniu komórek zakażonych HIV. Chociaż w niniejszym protokole opisaliśmy zastosowanie komórek zakażonych in vitro jako komórek docelowych, ostatnio opisaliśmy generowanie komórek docelowych od pacjentów zakażonych HIV. Wymaga to izolacji limfocytów T CD4+ i ich następującej ekspansji przez okres dwóch tygodni po stymulacji mitogenami w obecności interleukiny-2 11. Po dwutygodniowym okresie ekspansji stosuje się protokoły opisane w tym artykule w celu izolacji komórek docelowych.

<table><tbody><tr><td>Probówki Vacutainer (z heparyną sodową)</td><td>BD Biosciences</td><td>367874</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji limfocytów T CD4+ RosetteSep</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>CMF PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>płytki surowicy bydlęcej (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Medium do separacji limfocytów</td><td>Cellgro</td><td>25-072-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Cellgro</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekspansji limfocytów T</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-441</td><td></td></tr><tr><td>CMF HBSS (1x)</td><td>Hyclone</td><td>SH30588.01</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td></td><td>46-034-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do negatywnej izolacji komórek NK</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-657</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12440-046</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji komórek CD4+</td><td>Invitrogen</td><td>113,31 D</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do usuwania martwych komórek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PacificBlue</td><td>BD Biosciences</td><td>558117</td><td></td></tr><tr><td>CD14 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>325616</td><td></td></tr><tr><td>CD20 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>302328</td><td></td></tr><tr><td>CD56 APC</td><td>BioLegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD69 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555531</td><td></td></tr><tr><td>CD107a FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;51&lt;/sup&gt;Chrom</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEZ030002MC</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do licznika gamma</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1270-401</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik gamma 2470</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>2470-0050</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td>643629</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FJ-9-1YR</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i zastosowanie pierwotnych limfocytów t cd4+ zainfekowanych hiv-1 jako komórek docelowych w testach cytotoksyczności komórek nk

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Komórki natural killer (NK) stanowią kluczowy element wrodzonej odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom zainfekowanym wirusami. Zrozumienie zdolności komórek NK do rozpoznawania i lizowania komórek zainfekowanych HIV-1 jest istotne, ponieważ zidentyfikowanie wszelkich nieprawidłowości w funkcji komórek NK wobec komórek zainfekowanych HIV mogłoby potencjalnie doprowadzić do opracowania terapii zwiększających ich aktywność cytolityczną. W testach cytotoksyczności konieczne jest zastosowanie zainfekowanych HIV pierwotnych blastów limfocytów T jako komórek docelowych, zamiast zainfekowanych linii komórkowych limfocytów T. Linie limfocytów T, nawet bez infekcji, są dość podatne na lizę przez komórki NK. Ponadto niezbędne jest użycie autologicznych komórek pierwotnych, aby zapobiec niezgodności głównego kompleksu histocompatybilności klasy I między komórką docelową a efektorową, co skutkowałoby lizą. Wczesne badania oceniające odpowiedzi cytolityczne komórek NK na pierwotne komórki zainfekowane HIV nie wykazały istotnego niszczenia zainfekowanych komórek 1,2. Jednakże wykorzystanie zainfekowanych HIV-1 pierwotnych limfocytów T jako komórek docelowych w testach funkcjonalnych komórek NK było utrudnione ze względu na obecność zanieczyszczających niezinfekowanych komórek 3. Taki niespójny stosunek komórek zainfekowanych do niezinfekowanych prowadzi do zmienności w niszczeniu przez komórki NK między próbkami, co może nie wynikać ze zmienności funkcji komórek NK dawcy. W związku z tym korzystne byłoby zastosowanie oczyszczonej populacji komórek zainfekowanych w celu standaryzacji stosunku komórek efektorowych do docelowych pomiędzy eksperymentami 3,4. W niniejszej pracy demonstrujemy izolację wysoce oczyszczonej populacji komórek zainfekowanych HIV-1, wykorzystując zdolność HIV-1 do modulacji w dół CD4 na zainfekowanych komórkach oraz dostępność komercyjnych zestawów do usuwania komórek martwych lub obumierających 3-6. Oczyszczone zainfekowane pierwotne blasty limfocytów T mogą być następnie wykorzystane jako cele w teście degranulacji lub teście cytotoksyczności z oczyszczonymi komórkami NK jako populacją efektorową 5-7. Wykorzystanie komórek NK jako efektorów w teście degranulacji pozwala ocenić zdolność komórki NK do uwalniania treści litycznej ze specjalistycznych lizosomów 8, nazywanych „granulami cytolitycznymi”. Poprzez barwienie przeciwciałem sprzężonym z fluorochromem przeciwko CD107a — białku błony lizosomalnej, które pojawia się na powierzchni komórki NK podczas łączenia się granul cytolitycznych z błoną plazmatyczną — możemy określić, jaki procent komórek NK ulega degranulacji w odpowiedzi na rozpoznanie komórki docelowej. Alternatywnie, aktywność lityczną komórek NK można ocenić w teście cytotoksyczności, który umożliwia wyznaczenie procentu komórek docelowych poddanych lizie poprzez uwalnianie 51Cr z wnętrza komórki docelowej w obecności komórek NK.

Testy cytotoksyczności służące do pomiaru odpowiedzi litycznej komórek natural killer na komórki zakażone HIV są ograniczone przez czystość komórek docelowych. Prezentujemy tutaj izolację wysoce oczyszczonej populacji zakażonych HIV-1 pierwotnych blastów limfocytów T, wykorzystując zdolność HIV-1 do down-modulacji CD4.

Przygotowanie i zastosowanie pierwotnych limfocytów T CD4+ zainfekowanych HIV-1 jako komórek docelowych w testach cytotoksyczności komórek NK

Komórki NK (natural killer) stanowią kluczowy element wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na komórki zainfekowane wirusem. Ważne jest zrozumienie zdolności komórek NK ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena odpowiedzi cytotoksycznej komórek NK na komórki zakażone HIV-1. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację i zakażenie komórek T CD4+ pochodzących z krwi żylnej. Następnie z krwi tego samego dawcy izoluje się komórki natural killer.Następnie niezinfekowane limfocyty T CD4+ są izolowane od komórek zakażonych. W końcowym etapie komórki zakażone oraz komórki NK są wykorzystywane odpowiednio jako cele i efektory w jednym z dwóch testów służących do oceny cytotoksyczności komórek NK. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące, że komórki NK reagują na komórki zakażone HIV-1 poprzez upregulację ekspresji CD107a, określoną za pomocą analizy cytometrycznej, lub poprzez uwalnianie ⁵¹Cr, wykrywane za pomocą licznika gamma.Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie HIV-1, takie jak: czy komórki NK reagują na komórki zakażone HIV-1, jakie interakcje receptor-ligand są istotne w interakcjach komórek NK z limfocytami T oraz czy białka wirusowe HIV-1 modulują odpowiedź komórek NK na komórki zakażone HIV-1. Po stymulowaniu limfocytów T CD4+, wyizolowanych z ludzkiej krwi obwodowej i stymulowanych przez 72 h za pomocą kuleczek sprzężonych z przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, należy policzyć powstałą populację limfocytów T za pomocą hemocytometru. Następnie kulturę należy podzielić na dwie grupy: około 2×10⁶ limfocytów T przenieść do 15 ml probówki stożkowej do wykorzystania jako niezakażona grupa kontrolna, a pozostałą zawiesinę limfocytów T CD4+ umieścić w 50 ml probówce stożkowej dla grupy zakażonej.Wirować obie grupy z prędkością 300 G w temperaturze 22°C przez 10 minut, a następnie odessać nadsącz. Resuspender komórki T CD4+ z probówki 50 ml bezpośrednio w pożywce hodowlanej zawierającej wiriony i dodać polybrene do stężenia końcowego 10 mg/ml. Następnie przeprowadzić wirowanie z infekcją komórek przy 1200 ×g przez dwie godziny w temperaturze od 20 do 25°C.W tym etapie komórki są zakażane wirusem DHIV three z multiplicity of infection wynoszącą pięć. Po zakończeniu wirowania podczas infekcji należy usunąć nadsącz i resuspender zakażone komórki w gęstości 3 × 10⁶ na ml w pełnym medium RPMI uzupełnionym o 100 units/ml IL two.Następnie hoduj komórki niezakażone oraz nowo zakażone przez 72 godziny w płytce sześciodołkowej, jeśli do zakażenia komórek użyto wirusa niezdolnego do replikacji, lub przez pięć do siedmiu dni, jeśli użyto wirusa zdolnego do replikacji. Zbierz nadsącz zawierający hodowle zakażonych limfocytów T CD4+ i odwiruj komórki z prędkością 300 G przez 10 minut w temperaturze 22 °C z włączonym hamowaniem. Odessaj nadsącz i ponownie zawiesić osad w 2 mL PBS z 2% FBS i 2 mM EDTA, a następnie policz komórki za pomocą hematocytometru, stosując zestaw do izolacji komórek CD4+.Wyizoluj niezakażone limfocyty T CD4+. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi izolacji limfocytów T CD4+, z wyjątkiem zastosowania stosunku 1 przeciwciała anty-CD4 na jedną komórkę. Następnie usuń martwe komórki z oczyszczonej populacji komórek zawierających wirusa, używając zestawu do usuwania martwych komórek.Zgodnie z instrukcjami producenta, należy zebrać populację żywych limfocytów T i odwirować oczyszczone komórki przy 300 G przez 10 minut. Po zatrzymaniu wirówki należy usunąć nadsącz i zawiesić osad w 1 ml kompletnego medium RPMI, a następnie policzyć komórki. Komórki NK z krwi obwodowej są izolowane od tego samego dawcy, od którego pobrano limfocyty T CD4+.Po nocnej hodowli należy policzyć komórki NK za pomocą hemocytometru, odwirować je przy 300 G przez 10 minut z włączonym hamulcem, a następnie resuspendować komórki w pełnym medium RPMI, dostosowując końcowe stężenie do 10⁶ komórek na ml. Następnie należy zebrać i odwirować oczyszczone zawiesiny zainfekowanych oraz kontrolnych niezinfekowanych limfocytów T przy 300 G przez 10 minut. Przy włączonym hamulcu należy usunąć nadsącz i resuspendować osady.W pełnej pożywce RPMI przy stężeniu 2 × 10⁶ komórek/ml, jako kontrolę pozytywną, w niniejszym filmie wykorzystano około 2 × 10⁶ komórek K 5 62 podatnych na lizę przez komórki NK. Wirować komórki K 5 62 przy 300 G przez 10 minut z wyłączonym hamowaniem, następnie usunąć nadosad i resuspendować osad w pełnej pożywce RPMI do stężenia 2 × 10⁶ komórek/ml.Po przemyciu wszystkich populacji komórek i ich ponownym zawieszeniu w stężeniach eksperymentalnych, należy połączyć komórki NK z komórkami K 5 62, niezakażonymi limfocytami T lub limfocytami T zakażonymi HIV. W poszczególnych studzienkach płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V, w celu pomiaru nieswoistej degranulacji komórek NK, zostanie użyta tylko jedna powtórka dla każdego typu komórek docelowych. Do jednej z nich należy dodać 100 µL efektorowych komórek NK oraz 100 µL samego medium.Do każdej studni dodaje się 10 µL przeciwciała anty-CD107a sprzężonego z fluorochromem, a następnie wiruje płytkę z prędkością 20 G przez dwie minuty z włączonym hamulcem w temperaturze 22 °C. Następnie płytkę inkubuje się w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez cztery godziny. Po inkubacji płytkę wiruje się z prędkością 400 G przez pięć minut z włączonym hamulcem w temperaturze 22 °C, a następnie usuwa nadsącz za pomocą pipety aspiracyjnej o pojemności 2 ml z założonym końcem P 200.Następnie do każdej dołki należy dodać 100 µL buforu do cytometrii przepływowej, a następnie barwić komórki przeciwciałami anty-CD 3 14 20 Pacific blue oraz przeciwciałem anty-CD 56 APC w temperaturze 0°C przez 20 minut. Po zabarwieniu komórek do każdej dołki należy dodać 200 µL buforu do cytometrii przepływowej i wirować płytkę z prędkością 400 ×g przez pięć minut. Przy włączonym hamowaniu, w temperaturze 22°C, należy ostrożnie odessać bufor do cytometrii przepływowej z każdej dołki.Używając pipety aspirującej o pojemności 2 ml z końcówką 200 µL, uważając, aby nie naruszyć osadu, ponownie przemyć komórki, a następnie resuspender osady w 200 µL 1% paraformaldehydu w PBS pozbawionym wapnia i magnezu. Następnie przenieść zawiesiny komórkowe do probówek przepływowych i uzupełnić całkowitą objętość w probówkach do 300 µL, dodając do każdej z nich około 100 µL 1% paraformaldehydu w PBS pozbawionym wapnia i magnezu. Następnie odczytać 2 × 10⁴ zdarzeń komórek NK za pomocą cytometrii przepływowej, korzystając z oprogramowania FACSDiva, i przeanalizować dane za pomocą oprogramowania FlowJo. Oznaczyć oczyszczone zainfekowane HIV-1 oraz niezainfekowane komórki T docelowe za pomocą 125 µCi chromu 51 w soli fizjologicznej na 10⁶ komórek przez dwie godziny w 37 °C i 5% CO2 w 15 ml probówce stożkowej jako kontrolę dodatnią; analogicznie oznaczyć 10⁶ komórek K562 za pomocą 100 µCi chromu 51 przez dwie godziny.W tych samych warunkach hodowli. Należy użyć pełnej pożywki RPMI, aby doprowadzić końcową objętość roztworu barwiącego dla każdej populacji komórek do 500 µl. Objętość dodawanego do komórek docelowych chromu 51 oblicza się za pomocą uniwersalnego kalkulatora rozpadu promieniotwórczego dostępnego na stronie internetowej firmy PerkinElmer podczas etykietowania komórek docelowych.Usunąć wcześniej wyizolowane komórki NK z hodowli i policzyć je, a następnie odwirować przy 300 G przez 10 minut z włączoną funkcją hamowania i zawiesić osady w pełnej pożywce RPMI. Rozdzielić otrzymane zawiesiny komórkowe do trzech 15 ml probówek stożkowych. Dostosować gęstość komórek do 10⁵/ml w pierwszej probówce, 2,5 × 10⁵/ml w drugiej probówce oraz 5 × 10⁵/ml w trzeciej probówce. Komórki NK zostaną wykorzystane jako komórki efektorowe w teście uwalniania chromu 51 w stosunkach odpowiednio 1:1, 2,5:1 oraz 5:1.Wyjmij odpowiednio oznakowane komórki docelowe z inkubatora i dodaj 4,5 milliliters pełnej pożywki RPMI do każdej probówki. Wirowarkuj probówki przy 300 G przez 10 minutes. Następnie ostrożnie przelej nadsącz do pojemnika na radioaktywne odpady ciekłe, uważając, aby nie naruszyć osadu.Przemyj komórki docelowe jeszcze dwa razy, aby usunąć cały niezaabsorbowany chrom 51. Nadsącz z trzeciego płukania można zutylizować w pojemniku na niepromieniotwórcze odpady ciekłe. Następnie ponownie zawieś komórki docelowe w pełnej pożywce RPMI do końcowej gęstości komórek 10⁵ na mililitr, co stanowi przykład typowego przygotowania do testu uwalniania chromu 51.Należy pamiętać, że każdą grupę wykonuje się w trzech powtórzeniach. Do wskazanych studzienek płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem należy nanieść 100 µL znakowanych komórek docelowych, aby uzyskać końcową liczbę 10⁴ komórek docelowych na studzienkę. Następnie do komórek docelowych dodaje się 100 µL zawiesiny komórek NK w odpowiednio wskazanych stosunkach efektorowych do docelowych. Do odpowiednich studzienek, w których brakuje komórek efektorowych, dodaje się 100 µL komórek docelowych dla grup uwalniania maksymalnego i spontanicznego.Uzupełnij grupę uwalniania spontanicznego dodatkowymi 100 µL pełnej pożywki RPMI, odwiruj płytkę z prędkością 20 G przez dwie minuty z włączonym hamulcem, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez cztery godziny. Po czterogodzinnej inkubacji do każdego dołka, z wyjątkiem dołków uwalniania maksymalnego, dodaj 5 µL rozcieńczenia 1:10 ludzkich erytrocytów w pełnej pożywce RPMI, a następnie do dołków uwalniania maksymalnego dodaj 100 µL 10% siarczanu sodu i odwiruj płytkę z prędkością 400 G przez pięć minut. Aby spalić komórki, opisz probówkę do licznika gamma dla każdego z dołków eksperymentalnych i kontrolnych.Z płytki 96-dołkowej pobierz 100 µL naddenutka wolnego od komórek z każdego dołka i przelej go do wcześniej oznakowanych probówek. Zmierz ilość chromu 51 w każdej probówce przy użyciu automatycznego licznika gamma PerkinElmer 24 70. Poniższe wykresy rozrzutu przedstawiają typową strategię bramkowania w cytometrii przepływowej służącą do analizy wyników CD 1 0 7.Analiza degranulacji. Najpierw wyznaczana jest bramka dla pojedynczych komórek, wykluczając agregaty lub dublety na wykresie FSCA względem FSCH. Następnie, w ramach bramki pojedynczych komórek, na wykresie FSCA względem SSC wyznaczana jest bramka dla populacji limfocytów, wskazanej ponownie różową obwódką.Bramka limfocytów jest następnie przedstawiona jako CD 3 14 20 względem CD 56, z uwzględnieniem populacji CD 56 dodatniej i CD 3 14 20 ujemnej, co zaznaczono pionowym różowym owalem. Tutaj NK GA jest przedstawione jako CD 1 0 7 A względem CD 56 w celu wizualizacji degranulujących komórek NK; na kolejnych dwóch rysunkach pokazano reprezentatywne wyniki oceny odpowiedzi cytotoksycznej komórek natural killer przeciwko komórkom zainfekowanym HIV 1. Zdolność komórek NK do degranulacji oceniano w warunkach bez komórek docelowych oraz w odpowiedzi na komórki K 5 62, pierwotne komórki T CD 4 dodatnie i pierwotne komórki T zainfekowane HIV, co określono jako procent komórek NK wykazujących ekspresję powierzchniową CD 1 0 7 A. Liczby w każdym kwadrancie reprezentują procent całkowitej liczby komórek NK na tym rysunku.Zdolność komórek NK do lizy komórek K 5 62, niezakażonych limfocytów T CD4+ oraz limfocytów T zakażonych HIV-1 oceniono za pomocą testu uwalniania acromium 51 przy stosunkach liczby komórek efektorowych do docelowych wynoszących 2,5:1, 5:1 oraz 7,5:1. Po opracowaniu, technika ta pomogła badaczom w dziedzinie biologii HIV-1 zgłębić sposób, w jaki komórki NK reagują na komórki zakażone HIV-1 u pacjentów zakażonych HIV.

preparation-use-hiv-1-infected-primary-cd4-t-cells-as-target-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przygotowanie i stosowanie pierwotnych komórek CD4+ zakażonych HIV-1 jako komórek docełowych w badaniach cytotoksycznych komórek NK

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Kilka aptamerów 2’-Fluoro RNA przeciwko HIV-1Ba-L gp120 o powinowactwie nanomolowym zostało wyizolowanych z biblioteki RNA za pomocą procedury in vitro SELEX. Stworzono nową chimerę aptamer-siRNA o podwójnej funkcji hamującej przeciwko gp120, która wykazuje znaczny potencjał w systemowej terapii przeciw HIV.

Opracowanie specyficznych dla typu komórek aptamerów przeciwko gp120 HIV do dostarczania siRNA

Ten film demonstruje przeprowadzenie testu uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu określenia cytotoksyczności komórek NK (natural killer) w stosunku do docelowych komórek nowotworowych. Test określa ilościowo uwalnianie enzymu cytoplazmatycznej dehydrogenazy mleczanowej z komórek rakowych, mierząc absorbancję powstałego produktu o czerwonym zabarwieniu.

Test in vitro do oceny cytotoksyczności komórek NK wobec komórek rakowych

Limfocyty T regulatorowe CD4+ są silnymi modulatorami immunologicznymi i pełnią ważne funkcje w homeostazie immunologicznej. Niedobór tych komórek we krwi obwodowej sprawia, że badania funkcjonalne są trudne, szczególnie w kontekście zakażenia HIV-1. Opisujemy tutaj metodę izolowania i namnażania funkcjonalnych limfocytów Treg CD4 + z krwi obwodowej od osób zakażonych wirusem HIV-1.

Nowe narzędzia do ekspansji limfocytów T regulatorowych od osób zakażonych wirusem HIV-1

Opracowaliśmy test in vitro, aby zbadać rolę szlaków immunoregulacyjnych w regulacji wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV.

In vitro Test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV

W przeciwieństwie do bezkomórkowych cząsteczek HIV-1, zakażone limfocyty T CD4+ są skutecznie wykrywane przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC). Niniejszy manuskrypt opisuje metodę, w której jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) lub izolowane pDC są hodowane wspólnie z limfocytami T zakażonymi wirusem HIV-1 w celu oceny wrodzonego wykrywania przez pDC, oceniane przez uwalnianie IFN typu I.

Ocena wrodzonego wyczuwania limfocytów T CD4 + zakażonych wirusem HIV-1 przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne przy użyciu systemu kohodowli ex vivo.

Celem tego badania było sformułowanie technologii, które pozwalają na skuteczną transdukcję genów w pierwotnych komórkach NK (natural killer). Transdukcja lentiwirusowa ludzkich lub mysich pierwotnych komórek NK za pośrednictwem dekstranu skutkuje wyższą wydajnością ekspresji genów. Ta metoda transdukcji genów znacznie poprawi manipulację genetyczną komórkami NK.

Dekstran zwiększa efektywność transdukcji lentiwirusowej mysich i ludzkich pierwotnych komórek NK

Metoda oparta na cytometrii przepływowej do ilościowego określania aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK jest pokazana tutaj.

Test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK

Prosta metoda pozyskiwania klonów komórek NK i T od pacjentów z CAEBV została opracowana z wysoką wydajnością, niewielką ilością krwi obwodowej i niską dawką IL-2.

Skuteczna i prosta metoda tworzenia linii komórkowych NK i T od pacjentów z przewlekłym aktywnym zakażeniem wirusem Epsteina-Barr

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Tutaj opisujemy kilka sprawdzonych metod określania stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) i aktywacji odpowiedzi na nieswojone białko (UPR), ze szczególnym naciskiem na zakażenie HIV-1. W artykule opisano również zestaw protokołów do badania wpływu stresu ER/UPR na replikację HIV-1 i zakaźność wirionu.

Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1

Poznaj metodę izolacji zakażonych HIV-1 limfocytów T CD4+ jako komórek docelowych w testach cytotoksyczności komórek NK. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej i interakcji receptor-ligand.

Przygotowanie i stosowanie pierwotnych limfocytów T CD4 + zakażonych HIV-1 jako komórek docelowych w testach cytotoksycznych komórek NK (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie i zastosowanie pierwotnych limfocytów T CD4+ zainfekowanych HIV-1 jako komórek docelowych w testach cytotoksyczności komórek NK

Przeglądaj więcej filmów