Name: Termodynamika fałdowania białek błonowych mierzona metodą spektroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Poznaj metodę pomiaru termodynamiki fałdowania białek błonowych przy użyciu spektroskopii fluorescencji tryptofanu z wykorzystaniem małych wesykul LAR. Technika ta pozwala wyznaczyć energię swobodną Gibbsa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Beijing Wu za udostępnienie jej danych. Praca ta była wspierana przez grant NSF CAREER przyznany J.E.K.

1. Przygotowanie małych jednowarstwowych pęcherzyków (SUV) o średnicy ok. 50 nm do fałdowania białek błonowych
<ol>
 <li>Roztwór lipidów 1,2-dimyristoylo-sn-glycero-3-fosfocholiny (DMPC) w chloroformie jest nabywany i rozdzielany na alikwoty po 20 mg na fiolkę w czystych szklanych fiolkach do przechowywania. Do każdej fiolki dodaje się warstwę azotu, aby zapobiec utlenianiu lipidów, a następnie fiolki zamyka się nakrętkami i uszczelnia parafinią. Fiolki przechowuje się w zamrażarce w temperaturze -20° C do czasu użycia.</li>
 <li>Do każdego eksperymentu wykorzystuje się jedną fiolkę zawierającą alikwot 20 mg lipidów w chloroformie. Zawartość fiolki jest suszona strumieniem azotu przez 1 godzinę, aż do całkowitego odparowania rozpuszczalnika.</li>
 <li>Wysuszone lipidy resuspenduje się w 1 mL 20 mM buforu fosforanowego potasu (pH = 7,3), używając sonikatora w kąpieli wodnej przez około 30 sekund. Roztwór zawiesiny lipidowej będzie mętny i zostaje przeniesiony do plastikowej probówki o pojemności 15 mL z stożkowym dnem. Kolejny alikwot 1 mL buforu fosforanowego dodaje się do pustej szklanej fiolki, w której pierwotnie znajdowały się lipidy, i powtarza sonikację; roztwór ten dodaje się następnie do tej samej probówki 15-mL. Proces ten powtarza się łącznie 4 razy, aż końcowa objętość w probówce wyniesie 4 mL, co daje stężenie lipidów 5 mg/mL w tym roztworze pęcherzyków zapasowym.</li>
 <li>Objętość 4 mL roztworu pęcherzyków lipidowych umieszcza się w ciepłej (~ 30° C) kąpieli wodnej i poddaje sonikacji za pomocą mikrokońcówki sonikatora ultradźwiękowego przez 1 godzinę przy 50% cyklu pracy. Kąpiel wodna pełni podwójną funkcję. Po pierwsze, zapobiega nadmiernemu nagrzaniu roztworu lipidów podczas procesu sonikacji. Po drugie, ciepła kąpiel zapewnia, że temperatura wodnego roztworu lipidów pozostaje powyżej temperatury przejścia fazowego dwuwarstwy podczas sonikacji; dla DMPC temperatura przejścia ta wynosi ~23° C.</li>
 <li>Sonikowany roztwór przepuszcza się przez filtr strzykawkowy 0,22 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń z końcówki sonikatora, a tak przefiltrowany roztwór inkubuje się przez noc w temperaturze 37° C do uzyskania stanu równowagi.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek do wstępnej krzywej rozwijania fluorescencji
<ol>
 <li>Przygotowuje się roztwór zapasowy 10 M mocznika w 20 mM buforze fosforanowym (pH 7.3). Niezbędne jest dodawanie wody do substancji stałej (a nie odwrotnie), ponieważ duża ilość mocznika zajmuje znaczną objętość w roztworze. Roztwór mocznika można przygotować poprzez wsypanie substancji rozpuszczalnych do czystej, pustej butelki i dolanie wody do pożądanego objętości końcowej. Roztwór ten może wymagać podgrzania w łaźni wodnej lub na płycie grzejnej z mieszaniem w celu rozpuszczenia substancji. Mocznik jest higroskopijny, dlatego rzeczywiste stężenie roztworu zapasowego mocznika należy wyznaczyć za pomocą współczynnika załamania światła.1</li>
 <li>Przygotowuje się zapasowy roztwór buforu fosforanowego 20 mM (pH 7.3).</li>
 <li>Przygotowuje się roztwór zapasowy rozfałdowanego białka. Ten zapasowy roztwór białka powinien mieć stężenie ~200 μM białka w 8 M mocznika i 20 mM buforze fosforanowym.</li>
 <li>Próbki do badań fluorescencji przygotowuje się w następujący sposób. Odpowiednie objętości zapasowego roztworu białka (sekcja 2.3), zapasowego roztworu lipidów (5 mg/mL lipidów, sekcja 1), zapasowego 10 M roztworu mocznika (sekcja 2.1) oraz zapasowego buforu fosforanowego (sekcja 2.2) łączy się tak, aby uzyskać próbki zawierające ~4 μM białka, 1 mg/mL lipidów oraz od 0 do 8 M mocznika w przyrostach 1 M. Objętość całkowita każdej próbki wynosi 200 μL. Dołączono przykładową tabelę (Tabela 1), w której wymieniono objętości wymagane przy użyciu 200 μM zapasowego roztworu białka.</li>
 <li>Próbki ślepe przygotowuje się zgodnie z opisem w sekcji 2.4, z pominięciem dodania białka. Zamiast białka można dodać 4 μL roztworu 8 M mocznika, aby stężenia pozostałych składników były identyczne z tymi opisanymi w sekcji 2.4. Próbki ślepe te służą do odjęcia rozpraszania oraz innego sygnału tła, który pojawia się w widmach fluorescencji białek.</li>
 <li>Próbki z sekcji 2.4 i 2.5 inkubuje się w temperaturze 37° C przez co najmniej 2 godziny przed pomiarem widm fluorescencji, aby zapewnić całkowite sfałdowanie i równowagę.</li>
</ol>
3. Pomiar widm fluorescencji
Fluorescencję tryptofanu każdej próbki oraz próbki ślepej pomiaru wykonuje się za pomocą fluorometru w stanie stacjonarnym. Widma fluorescencji należy rejestrować przy długości fali wzbudzenia 290 nm, aby uniknąć wzbudzenia reszt tyrozyny, skanując zakres od 305 do 500 nm. Typowa szerokość szczeliny wejściowej i wyjściowej wynosi 3 nm. Przyrost długości fali oraz czas całkowania można zoptymalizować pod kątem stosunku sygnału do szumu. Typowe wartości przyrostu długości fali i czasu całkowania to odpowiednio 1 nm/step i 0,5 sec/step. Białka błonowe zazwyczaj fałdują się w syntetycznych lipidach tylko wtedy, gdy temperatura jest wyższa od temperatury przejścia fazowego dwuwarstwy. Dlatego w przypadku DMPC temperatura próbki jest utrzymywana na stałym poziomie 30 °C. W eksperymentach tych wykorzystuje się mikrowolumenową kuwetę z topionego kwarcu o pojemności 160 μL.
4. Generowanie wstępnej krzywej rozwijania oraz szacowanie energii swobodnej Gibbsa podczas rozwijania białka błonowego
<ol>
 <li>Widma fluorescencji w formie zestawu danych x-y są wczytywane do oprogramowania takiego jak Igor Pro, Matlab, Origin lub Excel.</li>
 <li>Sygnał z tła mocznika i pęcherzyków lipidowych musi zostać odjęty zgodnie z następującą procedurą: 
 Widmo A = surowe widmo fluorescencji białka w obecności pęcherzyków lipidowych i określonego stężenia mocznika. 
 Widmo B = surowe widmo fluorescencji odpowiadającej próbki ślepej, która zawiera pęcherzyki lipidowe i takie samo stężenie mocznika jak w widmie A; próbki ślepe nie zawierają białka. 
 Widmo skorygowane = Widmo A - C*widmo B. C jest skalarem zazwyczaj równym 1,0. W niektórych przypadkach C jest mniejsze lub większe od 1,0 ze względu na problemy z rozpraszaniem, które powodują nadmierne lub niedostateczne odjęcie w obszarze ~305-320 nm.</li>
 <li>Długość fali maksymalnej fluorescencji, λmax, jest zestawiana w tabeli na podstawie skorygowanych widm dla każdego stężenia mocznika. Typowa wartość dla całkowicie rozfałdowanego białka błonowego wynosi 350 nm, natomiast dla białka sfałdowanego ~330 nm. Zestawione długości fal są przeliczane na ułamek rozfałdowany poprzez konwersję zakresu wartości λmax (~330 do ~350 nm) na zakres od 0,0 do 1,0, aby powiązać wartość λmax z ułamkiem populacji rozfałdowanej. Na przykład wartość λmax wynosząca 330 nm odpowiada 0,0, 350 nm odpowiada 1,0, a 340 nm odpowiada 0,5 w odniesieniu do ułamka rozfałdowanego. Ten ułamek rozfałdowanego białka jest następnie nanoszony na wykres w zależności od stężenia mocznika. Jak wspomniano wcześniej, stężenie mocznika powinno zostać określone eksperymentalnie poprzez pomiar współczynnika załamania światła.</li>
 <li>Zakładamy, że białko może istnieć w jednym z dwóch stanów: sfałdowanym lub rozfałdowanym. Wykres ułamka rozfałdowanego, f, w funkcji stężenia mocznika, C, można dopasować do równania:2 
 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq2.jpg" alt="Wzór wiązania ligandu, \(f = \frac{e^{-m(\frac{C_m-C}{RT})}}{1+e^{-m(\frac{C_m-C}{RT})}}\), równanie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 2"> 
 Współczynnik m odpowiada szybkości zmiany energii swobodnej w odniesieniu do stężenia denaturanta, a Cm odpowiada środkowemu stężeniu mocznika, przy którym populacja sfałdowana jest równa populacji rozfałdowanej. Wartości te są zmiennymi dopasowania uzyskanymi metodą najmniejszych kwadratów przez oprogramowanie do analizy danych. R (0,001987 kcal/mol • K) to stała gazowa, a T to temperatura (303 K).</li>
 <li>Współczynniki uzyskane z dopasowania są wykorzystywane do wyznaczenia energii swobodnej Gibbsa (kcal/mol) rozfałdowania w obecności mocznika: <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq3.jpg" alt="Równanie termodynamiczne ΔG°H2O=mCm dla analizy stabilności białek w badaniu denaturacji chemicznej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 3">.</li>
</ol>
5. Zoptymalizowana krzywa rozfałdowania dla bardziej precyzyjnego pomiaru energii swobodnej Gibbsa rozfałdowania.
<ol>
 <li>Opisana powyżej krzywa rozwijania ujawnia zakres stężeń mocznika, które powodują największą zmianę λmax. Zakres ten jest zazwyczaj wąski, a większość procesu rozwijania zachodzi właśnie w tym przedziale. Aby precyzyjnie określić wolną energię rozwijania, w tym obszarze analizuje się dodatkowe próbki, aby uzyskać wykres zawierający wiele punktów danych, niezbędnych do zoptymalizowanego dopasowania metodą najmniejszych kwadratów. Na przykład, jeśli białko rozwija się w zakresie od 2 do 4 M mocznika, można przygotować próbki zawierające 2 - 4 M mocznika w odstępach 0,2 M, aby dokładniej określić kształt tego istotnego obszaru na krzywej rozwijania. Nie jest konieczne pomiar widm ślepych dla każdego stężenia mocznika; wystarczy zmierzyć widmo ślepe co około 0,5 M.</li>
 <li>Wolna energia rozwijania uzyskana z tego wykresu może nieznacznie różnić się od wartości otrzymanej z pierwotnej krzywej rozwijania, ale odzwierciedla wartość bardziej precyzyjną.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Próbka</td>
 <td>końcowe [mocznik], M</td>
 <td>białko zapasowe (μL)</td>
 <td>roztwór zapasowy lipidów (μL)</td>
 <td>roztwór zapasowy 10 M mocznika (μL)</td>
 <td>bufor treściwy (μL)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>~ 0.16</td>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>0</td>
 <td>156</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>1</td>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>20</td>
 <td>136</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>2</td>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>40</td>
 <td>116</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4</td>
 <td>3</td>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>60</td>
 <td>96</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5</td>
 <td>4</td>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>80</td>
 <td>76</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6</td>
 <td>5</td>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>100</td>
 <td>56</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>7</td>
 <td>6</td>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>120</td>
 <td>36</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8</td>
 <td>7</td>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>140</td>
 <td>16</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Tabela 1. Objętość roztworów zapasowych wymagana do przygotowania próbek fluorescencyjnych
<img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig1.jpg" alt="Wykres intensywności fluorescencji w funkcji długości fali; analiza emisji optycznej, wyniki spektroskopowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Widma fluorescencji tryptofanu reprezentatywnego białka błonowego o stężeniu ~ 5 μM, zawierającego jedną resztę tryptofanu. (A) Surowe widma fluorescencji białka (widmo A z pkt 4.2); (B) Surowe widma fluorescencji próbki ślepej (widmo B z pkt 4.2); (C) Skorygowane widmo z pkt 4.2.
<img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig2.jpg" alt="Wykres spektroskopii fluorescencyjnej, wpływ mocznika na stabilność białka, intensywność w funkcji długości fali." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Skorygowane widma fluorescencji tryptofanu białka błonowego z Ryciny 1 dla licznych stężeń mocznika.
<img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig3.jpg" alt="Denaturacja białka, krzywa sigmoidalna, [Mocznik] vs. Frakcyjna rozfałdowanie, ΔG=6.2 kcal/mol, wykres." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Krzywa rozfałdowania uzyskana z danych na Rysunku 2, z dopasowaniem do równania w sekcji 4.4. Energia swobodna Gibbsa została obliczona zgodnie z sekcją 4.5.

<ol><li>Shirley, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShirley%2C+BA+%22Protein+Folding+and+Stability%22">Protein Folding and Stability</a>. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+Analysis+of+Urea+and+Guanidine+Hydrochloride+Denaturation+Curves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves.</a> Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).</li>
<li>Lau, F. W., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Assessing+the+Stability+of+a+Membrane+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein.</a> Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).</li>
<li>Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Barrel+Proteins+that+Reside+in+the+Escherichia+coli+Outer+Membrane+in+Vivo+Demonstrate+Varied+Folding+Behavior+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro.</a> J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).</li>
<li>Booth, P. J., Curnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+scene+investigation%3A+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding scene investigation: membrane proteins.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).</li>
<li>Hong, H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+coupling+of+integral+membrane+protein+stability+to+lipid+bilayer+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).</li>
<li>Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Tryptophan+Microenvironment%2C+Soluble+Domain%2C+and+Vesicle+Size+on+the+Thermodynamics+of+Membrane+Protein+Folding%3A+Lessons+from+the+Transmembrane+Protein+OmpA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA.</a> Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Niniejszy protokół opisuje generowanie krzywych rozfałdowania białek i peptydów związanych z błoną, które zawierają reszty tryptofanu. Przyjęto tutaj, że fluorescencja tryptofanu odzwierciedla, czy białko jest sfałdowane i wbudowane w syntetyczne pęcherzyki lipidowe, czy też rozfałdowane w roztworze. W niniejszym raporcie przyjęto dodatkowe założenia, takie jak dwustanowe sfałdowanie i liniowa zależność energii swobodnej od stężenia denaturanta; zmiana tych założeń prowadzi do zastosowania innych równań.2 Prot...

<table><tbody><tr><td>DMPC</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>MP Biomedicals</td><td>04821527</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285</td><td></td></tr></tbody></table>

termodynamika fałdowania białek błonowych pomierzona za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Fałdowanie białek błonowych jest rozwijającym się tematem o znaczeniu zarówno fundamentalnym, jak i zdrowotnym. Duża liczba białek błonowych w komórkach uzasadnia potrzebę kompleksowych badań nad fałdowaniem tej powszechnie występującej rodziny białek. Ponadto postępy w możliwościach charakteryzowania chorób związanych z nieprawidłowo sfałdowanymi białkami stały się motywacją do znaczących wysiłków eksperymentalnych i teoretycznych w dziedzinie fałdowania białek. Szybki postęp w tej ważnej dziedzinie jest niestety utrudniony przez inherentne wyzwania związane z białkami błonowymi oraz złożoność mechanizmu fałdowania. W niniejszej pracy przedstawiamy procedurę eksperymentalną służącą do pomiaru właściwości termodynamicznej, jaką jest energia swobodna Gibbsa rozfałdowania w obecności wody (bez denaturanta), ΔG°H2O, dla reprezentatywnego integralnego białka błonowego z E. coli. Protokół ten koncentruje się na zastosowaniu spektroskopii fluorescencji w celu określenia populacji równowagowych stanów sfałdowanych i rozfałdowanych w funkcji stężenia denaturanta. Omówiono kwestie eksperymentalne dotyczące przygotowania syntetycznych pęcherzyków lipidowych oraz kluczowe etapy procedury analizy danych. Technika ta jest wszechstronna i może być stosowana z różnymi rodzajami denaturantów, w tym temperaturą i pH, a także w różnych środowiskach fałdowania, takich jak lipidy i micele. Przedstawiony protokół można uogólnić na dowolne białko błonowe lub rozpuszczalne, które spełnia zestaw kryteriów omówionych poniżej.

Niniejszy artykuł wideo szczegółowo opisuje procedurę eksperymentalną służącą do wyznaczenia energii swobodnej Gibbsa fałdowania białek błonowych za pomocą fluorescencji tryptofanu.

Termodynamika fałdowania białek błonowych pomierzona za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej

Fałdowanie białek błonowych to rozwijający się temat o znaczeniu zarówno fundamentalnym, jak i zdrowotnym. Obfitość białek błonowych w komórkach...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar parametrów termodynamicznych związanych z fałdowaniem białek błonowych. Cel ten osiąga się poprzez wstępne przygotowanie małych pęcherzyków LAR, które zapewniają środowisko fałdowania dla białka błonowego. Po ich utworzeniu pęcherzyki są wykorzystywane do przygotowania próbek zawierających białko oraz systematycznie zmienione stężenia mocznika.Następnie mierzy się widmo fluorescencji tryptofanu dla każdej próbki. W celu zgromadzenia danych niezbędnych do wygenerowania krzywej rozfałdowania białka błonowego uzyskuje się wyniki pokazujące, w jaki sposób można wyznaczyć energię swobodną Gibbsa rozfałdowania białka błonowego na podstawie krzywych rozfałdowania wygenerowanych z widm fluorescencji tryptofanu. Cześć, nazywam się Judy Kim. Jestem adiunktem na University of California w San Diego.Metoda, którą za chwilę zaprezentujemy, ujawnia istotną właściwość białek błonowych. W szczególności pokażemy, jak mierzyć stabilność białka, które jest sfałdowane i wstawione w lipidową dwuwarstwę. Nazywam się Diana Ottinger i jestem doktorantką w Departamencie Chemii na uc, San Diego.Dzisiaj zademonstrujemy tę metodę na reprezentatywnym białku błonowym. Technika ta jest jednak uniwersalna i może być stosowana w innych układach biologicznych, takich jak peptydy związane z błonami oraz białka rozpuszczalne. Przejdźmy zatem do pracy.Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu należy zakupić roztwór 1,2-dimyristoylglicero-3-fosfocholiny (DMPC) w chloroformie i przelać go do czystych szklanych fiolek. Przy ilościach 20 mg na fiolkę, do każdej z nich należy dodać warstwę azotu gazowego w celu zapobiegania utlenianiu lipidów, a następnie szczelnie zamknąć fiolki. Do każdego eksperymentu wykorzystuje się jedną fiolkę zawierającą 20 mg lipidów w chloroformie.Aby przygotować roztwór zapasowy pęcherzyków, należy rozpocząć od wysuszenia zawartości fiolki w strumieniu azotu przez jedną godzinę, używając teflonowej przegrody i igieł, aż do całkowitego odparowania rozpuszczalnika. Do wysuszonych lipidów należy dodać 1 mL 20 mM buforu fosforanowego potasu o pH 7,3, a następnie resuspender w łaźni wodnej przez około 30 sekund. Powstałą mętną zawiesinę należy przenieść za pomocą pipety do plastikowej probówki o objętości 15 mL z conical bottom.Do pustej szklanej fiolki, w której pierwotnie znajdował się lipid, należy dodać kolejny 1 ml buforu fosforanowego i powtórzyć sonikację. Uzyskaną zawiesinę przenieść do tej samej probówki o pojemności 15 ml. Powtórzyć ten proces łącznie cztery razy, aby uzyskać końcową objętość 4 ml i stężenie lipidów wynoszące 5 mg/mL.Umieść zawiesinę pęcherzyków lipidowych w ciepłej łaźni wodnej i poddaj sonikacji za pomocą mikrokońcówki sonikatora ultradźwiękowego przez jedną godzinę przy cyklu pracy 50%. Łaźnia wodna zapobiega nadmiernemu przegrzaniu roztworu lipidów i utrzymuje temperaturę wodnego roztworu lipidów powyżej temperatury przejścia fazowego dwuwarstwy podczas sonikacji.Przefiltruj SONIKOWANY roztwór przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,22 mikrona, aby usunąć zanieczyszczenia z końcówki ator, a następnie pozostaw przefiltrowany roztwór do równoważenia przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przygotować próbkę do wstępnego rozfałdowania fluorescencyjnego, przygotuj roztwór zapasowy 10 molarnego mocznika w 20 milimolarnym buforze fosforanowym oraz roztwór zapasowy buforu 20 milimolarny fosforanowy. Zgodnie z protokołem pisemnym, stężenie mocznika należy wyznaczyć doświadczalnie poprzez pomiar współczynnika załamania światła refraktometrem i porównanie go z wartościami znanymi.Następnie należy przygotować roztwór zapasowy rozfałdowanego białka o stężeniu około 200 µM białka w 8 M mocznika i 20 mM buforze fosforanowym. W niniejszym filmie do zaprezentowania protokołu wykorzystano białko błonowe OPA A. Próbki do badań fluorescencyjnych przygotowuje się poprzez połączenie odpowiednich objętości roztworu zapasowego białka, roztworu zapasowego lipidów, roztworu zapasowego 10 M mocznika oraz zapasowego buforu fosforanowego, aby uzyskać próbki zawierające około 4 µM białka, 1 mg/mL lipidów oraz od 0 do 8 M mocznika w przyrostach 1 M, przy całkowitej objętości 200 µL. Próbki ślepe przygotowuje się w ten sam sposób.Jednakże, zamiast białka stosuje się 4 µL 8 M roztworu mocznika. Próby ślepe przygotowuje się w celu odjęcia sygnałów rozproszenia i tła, które pojawiają się w widmach fluorescencji białek. Próbki białek oraz próby ślepe należy inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej dwie godziny przed pomiarem widm fluorescencji.Aby zapewnić całkowite zwinięcie białek, należy włączyć fluorymetr na godzinę przed rozpoczęciem pomiarów. Białka błonowe zazwyczaj zwijają się w syntetycznych lipidach tylko wtedy, gdy temperatura jest wyższa od temperatury przejścia fazowego dwuwarstwy. Dlatego w przypadku DMPC temperaturę uchwytu próbki we fluorymetrze ustawia się na 30 °C.Przygotuj eksperyment fluorescencyjny na fluorymetrze stanu stacjonarnego i zmierz fluorescencję tryptofanu dla każdej próbki oraz dla próbki ślepej. Długość fali wzbudzenia powinna zostać ustawiona na 290 nanometrów, aby uniknąć wzbudzenia reszt tyrozyny, a emisja powinna być zbierana w zakresie od 305 do 500 nanometrów. Użyj szerokości pasma przepustowego wejścia i wyjścia wynoszącej trzy nanometry.Przyrost długości fali oraz czas całkowania można zoptymalizować w celu uzyskania odpowiedniego stosunku sygnału do szumu. Typowe wartości przyrostu długości fali i czasu całkowania to odpowiednio 1 nm na krok oraz 0,5 s na krok. Należy pipetować 200 µL próbki do mikrokubety z topionego kwarcu Q Vet o pojemności 160 µL, a następnie umieścić kubetę w uchwycie Q Vet urządzenia.Na koniec można przystąpić do pomiarów fluorescencji, ładując arkusz danych XY widm fluorescencji do oprogramowania takiego jak Igor Pro, MATLAB, Origin lub Excel. W tej demonstracji program Igor Pro zostanie wykorzystany do usunięcia tła mocznika i pęcherzyków lipidowych, pomnożenia widma fluorescencji próbki ślepej przez skaler S oraz odjęcia go od surowego widma fluorescencji roztworu białkowo-lipidowego. Dla odpowiadającego stężenia mocznika należy wyznaczyć z poprawionego widma długość fali maksymalnej fluorescencji, czyli lambda max.Dla każdego stężenia mocznika. Typowa wartość dla całkowicie rozfałdowanego białka błonowego wynosi 350 nanometrów. Podczas gdy wartość dla białka sfałdowanego wynosi około 330 nanometrów, należy przeliczyć zestawione w tabeli długości fal na ułamek rozfałdowania poprzez konwersję zakresu wartości lambda max na zakres od zera do jeden, korelując wartość lambda max z ułamkiem rozfałdowanej populacji.Następnie należy wykreślić zależność frakcji rozfałdowanego białka od stężenia mocznika. Wykres frakcji rozfałdowania F w funkcji stężenia mocznika C można dopasować do równania zakładającego, że białko może występować w stanie sfałdowanym lub rozfałdowanym. Współczynnik M odpowiada szybkości zmiany energii swobodnej w stosunku do stężenia denaturatora, a CM odpowiada średniemu stężeniu mocznika, przy którym populacja białek sfałdowanych jest równa populacji białek rozfałdowanych.R to stała gazowa, a T to temperatura wyrażona w kelwinach. Procedura dopasowania pozwala wyznaczyć wartości współczynników m i cm.Współczynniki te mnoży się w celu wyznaczenia delta G, czyli energii swobodnej Gibbsa unfoldingu w obecności mocznika. Opisana krzywa unfoldingu ujawnia zakres stężeń mocznika, który powoduje największą zmianę lambda max. Zakres ten jest zazwyczaj niewielki, a większość procesu unfoldingu zachodzi właśnie w tym wąskim przedziale, co pozwala na precyzyjne wyznaczenie energii swobodnej unfoldingu.W tym obszarze należy przeanalizować dodatkowe próbki, aby uzyskać wykres zawierający wystarczającą liczbę punktów danych, niezbędnych do optymalnego dopasowania metodą najmniejszych kwadratów. Na przykład, jeśli białko ulega rozfałdowaniu w zakresie od dwóch do czterech molarnych stężeń mocznika, próbki można przygotować w tym przedziale w odstępach 0,2 M, aby dokładniej określić kształt tego istotnego fragmentu krzywej rozfałdowania. Dla uzyskania najlepszych wyników, próbę ślepą należy uwzględnić co najmniej w każdym kroku 0,5 M oraz w każdym kroku 0,2 M.Energia swobodna rozfałdowania uzyskana z tego wykresu może nieznacznie różnić się od tej otrzymanej z pierwotnej krzywej rozfałdowania, lecz odzwierciedla przedstawioną, bardziej precyzyjną wartość. Poniżej znajdują się widma fluorescencji tryptofanu reprezentatywnego białka błonowego om a, które zawiera jedną resztę tryptofanu. Surowe widmo fluorescencji próbki ślepej zostaje odjęte od surowych widm fluorescencji białka zgodnie z opisem w protokole, co pozwala na uzyskanie widma skorygowanego.Przedstawiono tutaj skorygowane widma fluorescencji tryptofanu białka błonowego dla licznych stężeń mocznika, uzyskane zgodnie z opisanymi metodami. W niniejszej demonstracji wygenerowano krzywą rozfałdowania przy założeniu, że białko jest albo sfałdowane, albo rozfałdowane i że nie istnieje stan stabilny. Parametr M odzwierciedla ilość polipeptydu eksponowaną na rozpuszczalnik podczas rozfałdowania, natomiast CM jest istotną wartością opisującą stężenie denaturanta wymaganego do uzyskania równej liczby populacji sfałdowanych i rozfałdowanych.Wysokie wartości CM i M wskazują na stabilne białko. Przy zastosowaniu tej procedury obliczono, że energia swobodna Gibbsa rozfałdowania dla OPA a wynosi 6,2 kcal/mol. W celu uzyskania analogicznych informacji na temat termodynamiki fałdowania białek można zastosować inne metody rozfałdowania, takie jak temperatura, pH oraz inne denaturatory chemiczne.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak mierzyć stabilność białka w oparciu o różne właściwości fluorescencyjne stanu sfałdowanego i rozfałdowanego. Alternatywnie można wygenerować krzywą rozfałdowania, stosując inne metody, takie jak dichroizm kołowy, o ile wybrana metoda pozwala na określenie konformacji białka, niezależnie od zastosowanego narzędzia analitycznego. Metoda krzywych rozfałdowania jest wszechstronna i może być stosowana w odniesieniu do szerokiego zakresu białek błonowych i rozpuszczalnych.

thermodynamics-membrane-protein-folding-measured-fluorescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Termodynamika fałdowania białek błonowych mierzona spektroskopią fluorescencyjną

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Ten film demonstruje technikę spektroskopii fluktuacji fluorescencji (FFS) do badania homooligomeryzacji białek. Białka znakowane fluorescencyjnie w próbce są dimeryzowane przy użyciu środka podczas badania oligomeryzacji białek za pomocą FFS. Za pomocą mikroskopu konfokalnego, gdy białka wchodzą i wychodzą z małej objętości obserwacyjnej, przeprowadza się analizę wahań jasności cząsteczek fluorescencyjnych w celu określenia stanu oligomerycznego białek.

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania homooligomeryzacji białek

Kluczowe etapy funkcjonowania białka, w szczególności zmiany konformacyjne szkieletu i reakcje transferu protonów, często odbywają się w skali od mikrosekund do milisekund. Te dynamiczne procesy można badać za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowo-rozdzielczym, w szczególności w przypadku białek, których funkcja jest wyzwalana przez światło.

Transfer protonów i dynamika konformacji białek w białkach światłoczułych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowym i transformacją Fouriera

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Przedstawiamy protokół do szybkiej charakterystyki biomolekularnych oddziaływań fałdowania i wiązania z termolabilnymi ligandami za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej.

Pomiar biomolekularnych profili DSC za pomocą termolabilnych ligandów w celu szybkiego scharakteryzowania interakcji fałdowania i wiązania

Wiele białek w sensie komórkowym i indukuje krzywiznę błony. Opisujemy metodę wyciągania nanorurek błonowych z pęcherzyków lipidowych w celu zbadania interakcji białek lub dowolnej cząsteczki aktywnej pod kątem krzywizny z zakrzywionymi błonami in vitro.

Wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Czasowo-rozdzielcze wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki jest użytecznym czujnikiem zbliżeniowym spektroskopowym fluorescencji, wrażliwym na lokalne zmiany strukturalne w białkach. Tutaj pokazujemy, że można go użyć do odkrycia stabilnych lokalnych konformacji w α-synukleinie, która jest inaczej znana jako kulisto nieustrukturyzowana i niestabilna, gdy jest mierzona za pomocą linijki FRET o większym zasięgu.

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Niniejszy protokół opisuje procedurę przeprowadzenia chromatografii wykluczenia rozmiaru fluorescencyjnego (FSEC) białek błonowych w celu oceny ich jakości na potrzeby dalszej analizy funkcjonalnej i strukturalnej. Przedstawiono reprezentatywne wyniki FSEC zebrane dla kilku receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR) w warunkach rozpuszczalnych w detergentach i bezdetergentowych.

Szybka ocena jakości białka błonowego za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiaru fluorescencyjnego

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalnej elastyczności i dynamiki biomolekuł za pomocą czasowo-rozdzielczej anizotropii fluorescencji na poziomie pojedynczej cząsteczki w trybie mikroskopii konfokalnej.

Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach

Poznaj metodę pomiaru termodynamiki fałdowania białek błonowych przy użyciu spektroskopii fluorescencji tryptofanu z wykorzystaniem małych wesykul LAR. Technika ta pozwala wyznaczyć energię swobodną Gibbsa.

Termodynamika fałdowania białek błonowych pomierzona za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów