Termodynamika fałdowania białek błonowych pomierzona za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar parametrów termodynamicznych związanych z fałdowaniem białek błonowych. Cel ten osiąga się poprzez wstępne przygotowanie małych pęcherzyków LAR, które zapewniają środowisko fałdowania dla białka błonowego. Po ich utworzeniu pęcherzyki są wykorzystywane do przygotowania próbek zawierających białko oraz systematycznie zmienione stężenia mocznika.

Następnie mierzy się widmo fluorescencji tryptofanu dla każdej próbki. W celu zgromadzenia danych niezbędnych do wygenerowania krzywej rozfałdowania białka błonowego uzyskuje się wyniki pokazujące, w jaki sposób można wyznaczyć energię swobodną Gibbsa rozfałdowania białka błonowego na podstawie krzywych rozfałdowania wygenerowanych z widm fluorescencji tryptofanu. Cześć, nazywam się Judy Kim. Jestem adiunktem na University of California w San Diego.

Metoda, którą za chwilę zaprezentujemy, ujawnia istotną właściwość białek błonowych. W szczególności pokażemy, jak mierzyć stabilność białka, które jest sfałdowane i wstawione w lipidową dwuwarstwę. Nazywam się Diana Ottinger i jestem doktorantką w Departamencie Chemii na uc, San Diego.

Dzisiaj zademonstrujemy tę metodę na reprezentatywnym białku błonowym. Technika ta jest jednak uniwersalna i może być stosowana w innych układach biologicznych, takich jak peptydy związane z błonami oraz białka rozpuszczalne. Przejdźmy zatem do pracy.

Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu należy zakupić roztwór 1,2-dimyristoylglicero-3-fosfocholiny (DMPC) w chloroformie i przelać go do czystych szklanych fiolek. Przy ilościach 20 mg na fiolkę, do każdej z nich należy dodać warstwę azotu gazowego w celu zapobiegania utlenianiu lipidów, a następnie szczelnie zamknąć fiolki. Do każdego eksperymentu wykorzystuje się jedną fiolkę zawierającą 20 mg lipidów w chloroformie.

Aby przygotować roztwór zapasowy pęcherzyków, należy rozpocząć od wysuszenia zawartości fiolki w strumieniu azotu przez jedną godzinę, używając teflonowej przegrody i igieł, aż do całkowitego odparowania rozpuszczalnika. Do wysuszonych lipidów należy dodać 1 mL 20 mM buforu fosforanowego potasu o pH 7,3, a następnie resuspender w łaźni wodnej przez około 30 sekund. Powstałą mętną zawiesinę należy przenieść za pomocą pipety do plastikowej probówki o objętości 15 mL z conical bottom.

Do pustej szklanej fiolki, w której pierwotnie znajdował się lipid, należy dodać kolejny 1 ml buforu fosforanowego i powtórzyć sonikację. Uzyskaną zawiesinę przenieść do tej samej probówki o pojemności 15 ml. Powtórzyć ten proces łącznie cztery razy, aby uzyskać końcową objętość 4 ml i stężenie lipidów wynoszące 5 mg/mL.

Umieść zawiesinę pęcherzyków lipidowych w ciepłej łaźni wodnej i poddaj sonikacji za pomocą mikrokońcówki sonikatora ultradźwiękowego przez jedną godzinę przy cyklu pracy 50%. Łaźnia wodna zapobiega nadmiernemu przegrzaniu roztworu lipidów i utrzymuje temperaturę wodnego roztworu lipidów powyżej temperatury przejścia fazowego dwuwarstwy podczas sonikacji.

Przefiltruj SONIKOWANY roztwór przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,22 mikrona, aby usunąć zanieczyszczenia z końcówki ator, a następnie pozostaw przefiltrowany roztwór do równoważenia przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przygotować próbkę do wstępnego rozfałdowania fluorescencyjnego, przygotuj roztwór zapasowy 10 molarnego mocznika w 20 milimolarnym buforze fosforanowym oraz roztwór zapasowy buforu 20 milimolarny fosforanowy. Zgodnie z protokołem pisemnym, stężenie mocznika należy wyznaczyć doświadczalnie poprzez pomiar współczynnika załamania światła refraktometrem i porównanie go z wartościami znanymi.

Następnie należy przygotować roztwór zapasowy rozfałdowanego białka o stężeniu około 200 µM białka w 8 M mocznika i 20 mM buforze fosforanowym. W niniejszym filmie do zaprezentowania protokołu wykorzystano białko błonowe OPA A. Próbki do badań fluorescencyjnych przygotowuje się poprzez połączenie odpowiednich objętości roztworu zapasowego białka, roztworu zapasowego lipidów, roztworu zapasowego 10 M mocznika oraz zapasowego buforu fosforanowego, aby uzyskać próbki zawierające około 4 µM białka, 1 mg/mL lipidów oraz od 0 do 8 M mocznika w przyrostach 1 M, przy całkowitej objętości 200 µL. Próbki ślepe przygotowuje się w ten sam sposób.

Jednakże, zamiast białka stosuje się 4 µL 8 M roztworu mocznika. Próby ślepe przygotowuje się w celu odjęcia sygnałów rozproszenia i tła, które pojawiają się w widmach fluorescencji białek. Próbki białek oraz próby ślepe należy inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej dwie godziny przed pomiarem widm fluorescencji.

Aby zapewnić całkowite zwinięcie białek, należy włączyć fluorymetr na godzinę przed rozpoczęciem pomiarów. Białka błonowe zazwyczaj zwijają się w syntetycznych lipidach tylko wtedy, gdy temperatura jest wyższa od temperatury przejścia fazowego dwuwarstwy. Dlatego w przypadku DMPC temperaturę uchwytu próbki we fluorymetrze ustawia się na 30 °C.

Przygotuj eksperyment fluorescencyjny na fluorymetrze stanu stacjonarnego i zmierz fluorescencję tryptofanu dla każdej próbki oraz dla próbki ślepej. Długość fali wzbudzenia powinna zostać ustawiona na 290 nanometrów, aby uniknąć wzbudzenia reszt tyrozyny, a emisja powinna być zbierana w zakresie od 305 do 500 nanometrów. Użyj szerokości pasma przepustowego wejścia i wyjścia wynoszącej trzy nanometry.

Przyrost długości fali oraz czas całkowania można zoptymalizować w celu uzyskania odpowiedniego stosunku sygnału do szumu. Typowe wartości przyrostu długości fali i czasu całkowania to odpowiednio 1 nm na krok oraz 0,5 s na krok. Należy pipetować 200 µL próbki do mikrokubety z topionego kwarcu Q Vet o pojemności 160 µL, a następnie umieścić kubetę w uchwycie Q Vet urządzenia.

Na koniec można przystąpić do pomiarów fluorescencji, ładując arkusz danych XY widm fluorescencji do oprogramowania takiego jak Igor Pro, MATLAB, Origin lub Excel. W tej demonstracji program Igor Pro zostanie wykorzystany do usunięcia tła mocznika i pęcherzyków lipidowych, pomnożenia widma fluorescencji próbki ślepej przez skaler S oraz odjęcia go od surowego widma fluorescencji roztworu białkowo-lipidowego. Dla odpowiadającego stężenia mocznika należy wyznaczyć z poprawionego widma długość fali maksymalnej fluorescencji, czyli lambda max.

Dla każdego stężenia mocznika. Typowa wartość dla całkowicie rozfałdowanego białka błonowego wynosi 350 nanometrów. Podczas gdy wartość dla białka sfałdowanego wynosi około 330 nanometrów, należy przeliczyć zestawione w tabeli długości fal na ułamek rozfałdowania poprzez konwersję zakresu wartości lambda max na zakres od zera do jeden, korelując wartość lambda max z ułamkiem rozfałdowanej populacji.

Następnie należy wykreślić zależność frakcji rozfałdowanego białka od stężenia mocznika. Wykres frakcji rozfałdowania F w funkcji stężenia mocznika C można dopasować do równania zakładającego, że białko może występować w stanie sfałdowanym lub rozfałdowanym. Współczynnik M odpowiada szybkości zmiany energii swobodnej w stosunku do stężenia denaturatora, a CM odpowiada średniemu stężeniu mocznika, przy którym populacja białek sfałdowanych jest równa populacji białek rozfałdowanych.

R to stała gazowa, a T to temperatura wyrażona w kelwinach. Procedura dopasowania pozwala wyznaczyć wartości współczynników m i cm.

Współczynniki te mnoży się w celu wyznaczenia delta G, czyli energii swobodnej Gibbsa unfoldingu w obecności mocznika. Opisana krzywa unfoldingu ujawnia zakres stężeń mocznika, który powoduje największą zmianę lambda max. Zakres ten jest zazwyczaj niewielki, a większość procesu unfoldingu zachodzi właśnie w tym wąskim przedziale, co pozwala na precyzyjne wyznaczenie energii swobodnej unfoldingu.

W tym obszarze należy przeanalizować dodatkowe próbki, aby uzyskać wykres zawierający wystarczającą liczbę punktów danych, niezbędnych do optymalnego dopasowania metodą najmniejszych kwadratów. Na przykład, jeśli białko ulega rozfałdowaniu w zakresie od dwóch do czterech molarnych stężeń mocznika, próbki można przygotować w tym przedziale w odstępach 0,2 M, aby dokładniej określić kształt tego istotnego fragmentu krzywej rozfałdowania. Dla uzyskania najlepszych wyników, próbę ślepą należy uwzględnić co najmniej w każdym kroku 0,5 M oraz w każdym kroku 0,2 M.

Energia swobodna rozfałdowania uzyskana z tego wykresu może nieznacznie różnić się od tej otrzymanej z pierwotnej krzywej rozfałdowania, lecz odzwierciedla przedstawioną, bardziej precyzyjną wartość. Poniżej znajdują się widma fluorescencji tryptofanu reprezentatywnego białka błonowego om a, które zawiera jedną resztę tryptofanu. Surowe widmo fluorescencji próbki ślepej zostaje odjęte od surowych widm fluorescencji białka zgodnie z opisem w protokole, co pozwala na uzyskanie widma skorygowanego.

Przedstawiono tutaj skorygowane widma fluorescencji tryptofanu białka błonowego dla licznych stężeń mocznika, uzyskane zgodnie z opisanymi metodami. W niniejszej demonstracji wygenerowano krzywą rozfałdowania przy założeniu, że białko jest albo sfałdowane, albo rozfałdowane i że nie istnieje stan stabilny. Parametr M odzwierciedla ilość polipeptydu eksponowaną na rozpuszczalnik podczas rozfałdowania, natomiast CM jest istotną wartością opisującą stężenie denaturanta wymaganego do uzyskania równej liczby populacji sfałdowanych i rozfałdowanych.

Wysokie wartości CM i M wskazują na stabilne białko. Przy zastosowaniu tej procedury obliczono, że energia swobodna Gibbsa rozfałdowania dla OPA a wynosi 6,2 kcal/mol. W celu uzyskania analogicznych informacji na temat termodynamiki fałdowania białek można zastosować inne metody rozfałdowania, takie jak temperatura, pH oraz inne denaturatory chemiczne.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak mierzyć stabilność białka w oparciu o różne właściwości fluorescencyjne stanu sfałdowanego i rozfałdowanego. Alternatywnie można wygenerować krzywą rozfałdowania, stosując inne metody, takie jak dichroizm kołowy, o ile wybrana metoda pozwala na określenie konformacji białka, niezależnie od zastosowanego narzędzia analitycznego. Metoda krzywych rozfałdowania jest wszechstronna i może być stosowana w odniesieniu do szerokiego zakresu białek błonowych i rozpuszczalnych.