Name: Immunocytochemia: Ludzkie neuronalne komórki macierzyste (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-24T00:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 41 s
Description: Poznaj metodę immunocytochemii do analizy ludzkich komórek macierzystych nerwowych. Ten protokół optymalizuje zużycie przeciwciał i zapewnia wyraźne wizualizowanie antygenów w mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr. Philipowi H. Schwartzowi z National Human Neural Stem Cell Resource w Children's Hospital, Orange County Research Institute za udostępnienie kultur hNSPC oraz dr. Gary'emu Bassellowi z Emory University za wstępne instruktaże w zakresie techniki barwienia z użyciem parafilmu.

Dzień 1: Przygotowanie niemieckich szkiełek nakrywkowych i wysiewanie komórek
Uwaga: Do hodowli pierwotnych komórek macierzystych neuronów i neuronów często preferowane są szkiełka nakrywkowe z niemieckiego szkła. W celu poprawy adhezji i rozprzestrzeniania się komórek stosujemy następujący protokół czyszczenia. Umieść szkiełka nakrywkowe w niewielkim statywie, który zapewni dostęp cieczy do obu stron szkiełka. Najpierw inkubuj szkiełka nakrywkowe w 1% Liquinox przez 10 minut, a następnie wykonaj 3 płukania wodą dejonizowaną. Upewnij się, że nie pozostały pęcherzyki mydła. Następnie inkubuj szkiełka w 1M HCl przez 30 minut, po czym wykonaj 3 płukania wodą dejonizowaną. Susz szkiełka nakrywkowe w temperaturze 65°C przez noc. Przenieś szkiełka nakrywkowe do szklanego naczynia i wysterylizuj w autoklawie.
<ol>
<li>W komorze do hodowli tkankowej umieścić sterylne szkiełka podstawowe w odpowiednio dobranej wielkością płytce wielodołkowej &nbsp;. </li>
<li>Pokryć szkiełka podstawowe lamininą w celu zapewnienia adhezji komórek. Inkubować szkiełka w roztworze 10 µg/ml poli-D-lizyny (PDL) w sterylnej wodzie przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć PDL i inkubować szkiełka w roztworze 20 µg/ml lamininy w EMEM przez 4 godziny lub przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37°C. <ol>
<li>Uwaga: W celu zapoznania się ze sposobem resuspensji i zliczania hNSPCs należy odwołać się do artykułu Passaging Human Neural Stem Cells (<a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a>) oraz artykułu Counting Human Neural Stem Cells (<a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262</a>). </li>
</ol></li>
<li>Przepłukać pokryte lamininą szkiełka podstawowe PBS i zasiać komórki do każdego dołka zawierającego szkiełko z określoną gęstością (w przypadku komórek przeznaczonych do immunobarwienia często stosujemy początkową gęstość wysiewu 100,000-300,000 komórek/ml). </li>
<li>Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37°C i pozwolić komórkom przytwierdzić się do szkiełek podstawowych (zazwyczaj wymagane jest minimum 4 godziny).</li>
</ol>
Dzień 2: Fixacja, permeabilizacja, blokowanie i dodawanie przeciwciała pierwszorzędowego do komórek
Uwaga: W celu zachowania morfologii komórek stosujemy następujący utrwalacz z 4% paraformaldehydu. Receptura obejmuje zmianę pH, która umożliwia przejście paraformaldehydu do roztworu. Preferujemy tę metodę zamiast ogrzewania w celu rozpuszczenia paraformaldehydu, ponieważ wyższe temperatury mogą prowadzić do powstania kwasu mrówkowego, co może zwiększyć tło podczas barwienia fluorescencyjnego. Niektóre składniki utrwalacza pomagają zachować strukturę cytoszkieletu (MgCl2 i EGTA), podczas gdy inne pomagają utrzymać ogólną morfologię (sukroza).
4% utrwalacz paraformaldehydowy do komórek
<table style="border-collapse: collapse; border: medium none" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
<tr>
<td>Odczynniki i etapy:</td>
<td>Ilość na 100 ml utrwalacza:</td>
</tr>
<tr>
<td>Woda MilliQ</td>
<td>75 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyd (odważyć w dygestorium)</td>
<td>4 g</td>
</tr>
<tr>
<td>10N NaOH, mieszać i dodawać kroplowo do momentu przejrzystości roztworu</td>
<td>według potrzeb</td>
</tr>
<tr>
<td>10X PBS</td>
<td>10 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>1M MgCl2</td>
<td>0,5 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>0,5 M EGTA</td>
<td>2 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Sacharoza</td>
<td>4 g</td>
</tr>
<tr>
<td>6N HCl, miareczkować do pH 7,4</td>
<td>według potrzeb</td>
</tr>
<tr>
<td>Woda MilliQ</td>
<td>dopełnić do 100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">Przechowywać w 4°C do 1 tygodnia. Przed użyciem ogrzać do 37°C</td>
</tr>
</tbody>
</table>
<ol>
<li>Na blacie roboczym usunąć medium i dodać uprzednio ogrzany utrwalacz. Inkubować przez 5-15 minut (zależnie od wykrywanego antygenu, zazwyczaj stosujemy 10 minut). Ten oraz kolejne kroki należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej. </li>
<li>Utrwalacz należy wylać do odpowiedniego pojemnika, ponieważ &nbsp;w wielu instytucjach paraformaldehyd jest traktowany jako odpad niebezpieczny. Przemyć komórki 3 razy PBS, po 5 minut za każdym razem. Podczas usuwania roztworów z komórek należy uważać, aby odsysanie nie doprowadziło do wyschnięcia komórek. Należy również zawsze mieć przygotowany kolejny roztwór do dodania do komórek przed usunięciem roztworu z nich, aby komórki nie wyschły. </li>
<li>Jeśli interesujący antygen znajduje się wewnątrz komórki, błona komórkowa musi zostać przepuszczczona, aby umożliwić wniknięcie przeciwciała. W celu permeabilizacji komórek należy użyć świeżego 0,3% roztworu Triton X-100 w PBS. Pipetować powoli, ponieważ Triton jest lepki, i upewnić się, że detergent jest całkowicie rozpuszczony w PBS przed dodaniem do komórek. Permeabilizować komórki przez 5 minut, a następnie przemyć komórki 3 razy PBS, po 5 minut za każdym razem. </li>
<li>Komórki muszą zostać poddane działaniu czynnika blokującego, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu przeciwciał. Jako czynnika blokującego stosujemy albuminę surowiczą bydlęcą (BSA). Roztwór blokujący przygotowuje się poprzez rozpuszczenie 5% BSA w PBS (na wytrząsacie lub rotatorze, ponieważ rozpuszczanie trwa) a następnie przefiltrowanie roztworu za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 µm. Blokować komórki w 5% roztworze BSA/PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (które powinno być specyficzne dla białka docelowego) do wcześniej określonego stężenia w 1% BSA/PBS (przygotowanym przez rozcieńczenie 5% BSA/PBS). Nanieść rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe (30 µl na szkiełko podstawowe 25 mm, 20 µl na szkiełko podstawowe 18 mm, 15 µl na szkiełko podstawowe 12 mm) na płytkę szklaną pokrytą parafilmem. Podnieść szkiełko podstawne z unieruchomionymi komórkami, odwrócić je tak, aby komórki znajdowały się na dole, i położyć na roztworze przeciwciał, tak aby komórki miały kontakt z przeciwciałami. Przykryć całą konstrukcję drugim paskiem parafilmu. Inkubować przez noc w temperaturze 4°C.
Dzień 3: Płukanie, inkubacja z przeciwciałem wtórnym, barwienie jąder i montaż preparatu
<ol>
<li>Ostrożnie usuń górny pasek parafilmu, podnieś szkiełko nakrywkowe, odwróć je i umieść z powrotem w płytce z PBS w każdym dołku do przemywania, tak aby komórki były skierowane do góry. </li>
<li>Przemyj komórki 3 razy PBS, po 5 minut za każdym razem. </li>
<li>Wybierz przeciwciało wtórne, które wykryje przeciwciało pierwotne; na przykład, jeśli przeciwciało pierwotne zostało wytworzone u królika, przeciwciało wtórne powinno rozpoznawać królicze IgG. Należy zadbać o dopasowanie izotypu przeciwciała (IgG, IgM itp.). W przypadku stosowania wielu przeciwciał pierwotnych upewnij się, że pochodzą one od różnych gatunków lub mają różne izotypy, i zaplanuj detekcję za pomocą różnych markerów dołączonych do przeciwciał wtórnych. Na przykład można użyć przeciwciała wtórnego przeciwkróliczego sprzężonego z czerwonym fluorophorem oraz przeciwciała wtórnego przeciwmysiego sprzężonego z zielonym fluorophorem. Inkubuj komórki w roztworze przeciwciała wtórnego rozcieńczonym do odpowiedniego stężenia w 1% BSA przez 2 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej, stosując tę samą technikę co w przypadku przeciwciał pierwotnych (kroki niewykazane na filmie). Objętość przeciwciała wtórnego potrzebna do inkubacji może być nieco większa niż w przypadku przeciwciała pierwotnego, jeśli przeciwciało wtórne jest przechowywane jako roztwór glicerolu (40 µl na szkiełko nakrywkowe 25 mm, 30 µl na szkiełko nakrywkowe 18 mm, 25 µl na szkiełko nakrywkowe 12 mm). 
<ul>
<li>Uwaga: Jeśli do wizualizacji przeciwciała wtórnego używasz cząsteczek fluorescencyjnych, próbka musi być chroniona przed światłem po dodaniu przeciwciała wtórnego. Inkubuj w ciemności lub w płytce owiniętej folią. </li>
</ul>
</li>
<li>Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe z parafilmu, zgodnie z opisem dla przeciwciała pierwotnego. Przemyj komórki 2 razy PBS, po 5 minut za każdym razem, a następnie inkubuj przez 1 minutę w barwniku jądrowym Hoechst w stężeniu 2 µg/ml rozcieńczonym w PBS (jeśli preferowane jest przeciwbarwienie jąder). Jeśli barwnik Hoechst jest stary i sygnał jest zbyt słaby, można zwiększyć czas inkubacji i/lub stężenie. Po inkubacji z Hoechst przemyj 1 raz PBS przez 5 minut. </li>
<li>Szkiełka nakrywkowe należy zamontować na szkiełku przedmiotowym za pomocą medium montażowego w celu wizualizacji pod mikroskopem. W przypadkach, gdy do wizualizacji przeciwciała wtórnego użyto cząsteczki fluorescencyjnej, medium montażowe powinno zawierać substancje minimalizujące fotoblaknięcie. Jako medium montażowe do fluorescencji stosujemy Vectashield. Nanieś kroplę Vectashield o odpowiedniej wielkości na szkiełko przedmiotowe (12 µl na szkiełko nakrywkowe 25 mm, 6 µl na szkiełko nakrywkowe 18 mm, 3 µl na szkiełko nakrywkowe 12 mm). </li>
<li>Ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe i opłucz jego tył wodą dejonizowaną, aby usunąć sole (z PBS). Odchłoń nadmiar wody za pomocą chusteczki typu kimwipe lub ręcznika papierowego i połóż szkiełko na kropli Vectashield komórkami skierowanymi w dół. Połóż szkiełko nakrywkowe pod kątem i pozwól mu powoli opaść, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza. Opisz szkiełko przedmiotowe, podając datę i wszelkie informacje o próbce. </li>
<li>Pozostaw szkiełka z nakrywkami do wyschnięcia (w ciemności), a następnie odessać nadmiar Vectashield z krawędzi szkiełka nakrywkiego. Krawędzie szkiełka nakrywkiego można teraz uszczelnić lakierem do paznokci, jeśli jest to pożądane (szczególnie przydatne, jeśli szkiełka nakrywkowe będą obserwowane pod mikroskopem odwróconym). Zazwyczaj przechowujemy nasze szkiełka w zamrażarce w temperaturze -20°C.</li>
</ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamin+A%2C+the+Arp2%2F3+complex%2C+and+the+morphology+and+function+of+cortical+actin+filaments+in+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells.</a> J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).</li>
<li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of stem cells.</a> In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li>
</ol>

Niniejszy protokół opisuje procedurę immunobarwienia dla hNSPCs, która minimalizuje objętość niezbędnych przeciwciał i zapewnia wiarygodne barwienie komórek. Opisana procedura jest optymalna dla antygenów wewnątrzkomórkowych, ale może zostać zmodyfikowana w celu barwienia cząsteczek powierzchniowych komórek lub wzmocnienia barwienia cytoszkieletu.

<table><tbody><tr><td>Kryszalki z niemieckiego szkła (Deutsche Spiegelglas)</td><td>Narzędzie</td><td>Carolina Biological</td><td>WW-63-3029</td><td>dostępne kryszalki o średnicach 12, 15, 18, 22, 25 mm</td></tr><tr><td>Detergent bezfosforowy Liquinox</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273279</td><td>bardzo lepki</td></tr><tr><td>Hydrobromek poli-D-lizyny</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Laminina, naturalna mysia</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>Odczynnik</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>Dystrybuowane przez Fisher pod wskazanym numerem katalogowym</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>bardzo lepki</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>potencjalny kancerogen, zachować ostrożność podczas stosowania w formie proszku i roztworu</td></tr><tr><td>Seryjna albumina wołowa, wolna od IgG</td><td>Odczynnik</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-161</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>H-1399</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Odczynnik</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>lepki</td></tr></tbody></table>

immunocytochemia: ludzkie neuralne komórki macierzyste

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemia jest bardzo potężną i stosunkowo prostą metodą określania obecności, lokalizacji wewnątrzkomórkowej oraz względnej liczebności badanego antygenu, najczęściej białka, w hodowlach komórkowych. Niniejszy protokół przedstawia łatwą do naśladowania serię kroków, która pozwoli badaczom ograniczyć zużycie przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, zapewniając jednocześnie wysoką jakość oraz powtarzalność uzyskanych danych jakościowych i ilościowych z barwienia. Protokół ten zawiera dwa aspekty pomagające zminimalizować objętość przeciwciał niezbędną do barwienia. Po pierwsze, komórki są hodowane na małych, okrągłych szkiełkach nakrywek umieszczonych w dołkach płytki do hodowli tkanek. Po fiksacji komórki na szkiełkach nakrywek mogą zostać usunięte z dołków płytki. W celu barwienia przeciwciałami, szkiełko nakrywka z komórkami jest odwrócone na małą kroplę roztworu przeciwciał na parafilmie i przykryte drugim kawałkiem parafilmu, aby zapobiec wysychaniu. Stosując tę metodę, do każdego szkiełka nakrywki (lub próbki) przeznaczonego do barwienia potrzeba jedynie ~25 μl roztworu przeciwciał. Protokół ten opisuje immunobarwienie ludzkich komórek macierzystych/prekursorowych układu nerwowego (hNSPCs), jednak może być stosowany w przypadku wielu innych typów komórek.

Immunocytochemia jest potężną metodą pozwalającą określić obecność, lokalizację subkomórkową oraz względną obfitość interesującego antygenu w hodowlach komórkowych. Niniejszy protokół przedstawia łatwą do naśladowania serię kroków, które umożliwią oszczędność przeciwciał i zoptymalizują proces barwienia.

Immunocytochemia: ludzkie neuralne komórki macierzyste

Immunocytochemia jest bardzo skuteczną i stosunkowo prostą metodą określania obecności, lokalizacji wewnątrzkomórkowej oraz względnej zawartości...

Cześć, jestem Steve. Pracuję w laboratorium doktora Flanagana na Wydziale Patologii Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine. A dzisiaj pokażę wam, jak przeprowadzić immunochemię ludzkich nerwowych komórek prekursorowych.Protokół ten obejmuje umieszczanie komórek na powlekanych szkiełkach nakrywkowych oraz blokowanie i inkubację komórek w pierwotnym przeciwciałie przez noc, a następnie wykonanie kilku testów i nałożenie przeciwciała drugorzędowego w temperaturze pokojowej. I wreszcie, montaż pokrywy wsuwa się na loty mikroskopów. Zacznijmy.Więc najpierw zamierzam umieścić trzy sterylne niemieckie szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 milimetrów w 24-dołkowej płytce, aby pokryć je laminatem. Więc teraz mam moje szkiełka nakrywkowe na płytce i najpierw dodam roztwór polilizyny PDL, a następnie zamierzam inkubować suby okładki w PDL przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Więc teraz, po pięciu minutach, zamierzam usunąć PDL i nałożyć lamininę, a następnie zamierzam inkubować szkiełka nakrywkowe w laminacie przez co najmniej cztery godziny lub lepiej przez noc.Tak więc inkubowałem płytkę przez noc w laminacie, a teraz zamierzam przepłukać szkiełka nakrywkowe PBS i płytką ludzkich nerwowyc

immunocytochemistry-human-neural-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Immunocytochemia: Ludzkie neuronalne komórki macierzyste

Immunocytochemiczne barwienie w zawiesinie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs) pod kątem markerów powierzchniowych komórek (SSEA-3/SSEA-4) zostało przeprowadzone z wykorzystaniem własnego urządzenia do cytocentryfugacji w celu stworzenia monowarstwy komórek do obserwacji i kwantyfikacji.

Analiza immunocytochemiczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem własnoręcznie wykonanego urządzenia do cytocentryfugacji

Niniejszy protokół wideo demonstruje sposób rozróżniania i zliczania rzeczywistych komórek macierzystych układu nerwowego w mieszanej populacji komórek prekursorowych układu nerwowego z wykorzystaniem testu tworzenia kolonii neuronalnych.

Test tworzenia kolonii neuronalnych: metoda różnicowania rzeczywistych komórek macierzystych układu nerwowego od komórek progenitorowych układu nerwowego

Ten film demonstruje procedurę barwienia nowo rozmnożonych nerwowych komórek macierzystych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą inkorporacji EdU, a następnie immunofluorescencji w celu wizualizacji określonych białek, zwiększając zrozumienie dynamiki i proliferacji komórek.

Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji rozproszyłych nerwowych komórek macierzystych w wycinkach mózgu myszy

Źródło: Becker-Kojić, Z. A.,  i inni. al., Wolne od GMO pokolenie komórek neuronalnych pochodzących z krwi. J. Vis. Exp. (2021)Film przedstawia protokół przygotowania komórek nerwowych pochodzących z przeprogramowanych komórek krwi obwodowej do mikroskopii fluorescencyjnej, prezentując różne typy komórek i etapy rozwoju za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego.

Mikroskopia immunofluorescencyjna komórek nerwowych zróżnicowanych z obwodowych komórek krwiopochodnych 

Neuronalne komórki macierzyste pobrane z dorosłego mózgu są coraz częściej wykorzystywane w różnych zastosowaniach, począwszy od podstawowych badań nad rozwojem układu nerwowego, a skończywszy na odkrywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych w medycynie regeneracyjnej. To sprawia, że rygorystyczna kontrola warunków izolacji i hodowli stosowanych do hodowli tych komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania solidnych wyników eksperymentalnych.

Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Dostarczamy szczegółowy opis protokołu analizy cytometrycznej powierzchni i/lub antygenów wewnątrzkomórkowych w typach komórek nerwowych. Wyjaśniono kluczowe aspekty planowania eksperymentalnego, procedury metodologiczne krok po kroku i podstawowe zasady cytometrii przepływowej, aby umożliwić neurobiologom wykorzystanie tej potężnej technologii.

Protokoły cytometrii przepływowej do powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych analiz antygenowych typów komórek nerwowych

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) odnoszą się do komórek, które mogą samoodnawiać się i różnicować w trzy linie nerwowe. W tym miejscu opisujemy protokół określania częstości NSC w danej populacji komórek za pomocą tworzenia i różnicowania neurosfery w warunkach klonalnych.

Liczenie nerwowych komórek macierzystych za pomocą testów klonalnych

Ten protokół demonstruje metodologie dla mysiego modelu urazowego mózgu z otwartą czaszką i przeszczepu hodowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do miejsca urazu. W skrócie opisano również testy behawioralne i histologiczne wyników tych procedur.

Kontrolowany model wpływu kory mózgowej uszkodzenia mózgu myszy z terapeutycznym przeszczepem ludzkich pluripotencjalnych komórek nerwowych pochodzących z komórek macierzystych

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje strategie identyfikacji i wzbogacania stanu komórki w pierwotnych hodowlach dorosłych mysich nerwowych komórek macierzystych za pomocą obrazowania autofluorescencyjnego przy użyciu i) mikroskopu konfokalnego, ii) aktywowanego fluorescencyjnie sortera komórek do wykonywania obrazowania intensywności, lub iii) mikroskopu wielofotonowego do wykonywania obrazowania czasu życia fluorescencji.

Klasyfikacja stanu aktywacji neuronalnych komórek macierzystych in vitro za pomocą autofluorescencji

Poznaj metodę immunocytochemii do analizy ludzkich komórek macierzystych nerwowych. Ten protokół optymalizuje zużycie przeciwciał i zapewnia wyraźne wizualizowanie antygenów w mikroskopii fluorescencyjnej.

Immunocytochemia: ludzkie neuralne komórki macierzyste

Przeglądaj więcej filmów