Name: Immunocytochemia: Ludzkie neuronalne komórki macierzyste (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-24T00:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 41 s
Description: Poznaj metodę immunocytochemii do analizy ludzkich komórek macierzystych nerwowych. Ten protokół optymalizuje zużycie przeciwciał i zapewnia wyraźne wizualizowanie antygenów w mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr. Philipowi H. Schwartzowi z National Human Neural Stem Cell Resource w Children's Hospital, Orange County Research Institute za udostępnienie kultur hNSPC oraz dr. Gary'emu Bassellowi z Emory University za wstępne instruktaże w zakresie techniki barwienia z użyciem parafilmu.

Dzień 1: Przygotowanie niemieckich szkiełek nakrywkowych i wysiewanie komórek
Uwaga: Do hodowli pierwotnych komórek macierzystych neuronów i neuronów często preferowane są szkiełka nakrywkowe z niemieckiego szkła. W celu poprawy adhezji i rozprzestrzeniania się komórek stosujemy następujący protokół czyszczenia. Umieść szkiełka nakrywkowe w niewielkim statywie, który zapewni dostęp cieczy do obu stron szkiełka. Najpierw inkubuj szkiełka nakrywkowe w 1% Liquinox przez 10 minut, a następnie wykonaj 3 płukania wodą dejonizowaną. Upewnij się, że nie pozostały pęcherzyki mydła. Następnie inkubuj szkiełka w 1M HCl przez 30 minut, po czym wykonaj 3 płukania wodą dejonizowaną. Susz szkiełka nakrywkowe w temperaturze 65°C przez noc. Przenieś szkiełka nakrywkowe do szklanego naczynia i wysterylizuj w autoklawie.
<ol>
<li>W komorze do hodowli tkankowej umieścić sterylne szkiełka podstawowe w odpowiednio dobranej wielkością płytce wielodołkowej &nbsp;. </li>
<li>Pokryć szkiełka podstawowe lamininą w celu zapewnienia adhezji komórek. Inkubować szkiełka w roztworze 10 µg/ml poli-D-lizyny (PDL) w sterylnej wodzie przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć PDL i inkubować szkiełka w roztworze 20 µg/ml lamininy w EMEM przez 4 godziny lub przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37°C. <ol>
<li>Uwaga: W celu zapoznania się ze sposobem resuspensji i zliczania hNSPCs należy odwołać się do artykułu Passaging Human Neural Stem Cells (<a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a>) oraz artykułu Counting Human Neural Stem Cells (<a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262</a>). </li>
</ol></li>
<li>Przepłukać pokryte lamininą szkiełka podstawowe PBS i zasiać komórki do każdego dołka zawierającego szkiełko z określoną gęstością (w przypadku komórek przeznaczonych do immunobarwienia często stosujemy początkową gęstość wysiewu 100,000-300,000 komórek/ml). </li>
<li>Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37°C i pozwolić komórkom przytwierdzić się do szkiełek podstawowych (zazwyczaj wymagane jest minimum 4 godziny).</li>
</ol>
Dzień 2: Fixacja, permeabilizacja, blokowanie i dodawanie przeciwciała pierwszorzędowego do komórek
Uwaga: W celu zachowania morfologii komórek stosujemy następujący utrwalacz z 4% paraformaldehydu. Receptura obejmuje zmianę pH, która umożliwia przejście paraformaldehydu do roztworu. Preferujemy tę metodę zamiast ogrzewania w celu rozpuszczenia paraformaldehydu, ponieważ wyższe temperatury mogą prowadzić do powstania kwasu mrówkowego, co może zwiększyć tło podczas barwienia fluorescencyjnego. Niektóre składniki utrwalacza pomagają zachować strukturę cytoszkieletu (MgCl2 i EGTA), podczas gdy inne pomagają utrzymać ogólną morfologię (sukroza).
4% utrwalacz paraformaldehydowy do komórek
<table style="border-collapse: collapse; border: medium none" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
<tr>
<td>Odczynniki i etapy:</td>
<td>Ilość na 100 ml utrwalacza:</td>
</tr>
<tr>
<td>Woda MilliQ</td>
<td>75 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyd (odważyć w dygestorium)</td>
<td>4 g</td>
</tr>
<tr>
<td>10N NaOH, mieszać i dodawać kroplowo do momentu przejrzystości roztworu</td>
<td>według potrzeb</td>
</tr>
<tr>
<td>10X PBS</td>
<td>10 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>1M MgCl2</td>
<td>0,5 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>0,5 M EGTA</td>
<td>2 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Sacharoza</td>
<td>4 g</td>
</tr>
<tr>
<td>6N HCl, miareczkować do pH 7,4</td>
<td>według potrzeb</td>
</tr>
<tr>
<td>Woda MilliQ</td>
<td>dopełnić do 100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">Przechowywać w 4°C do 1 tygodnia. Przed użyciem ogrzać do 37°C</td>
</tr>
</tbody>
</table>
<ol>
<li>Na blacie roboczym usunąć medium i dodać uprzednio ogrzany utrwalacz. Inkubować przez 5-15 minut (zależnie od wykrywanego antygenu, zazwyczaj stosujemy 10 minut). Ten oraz kolejne kroki należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej. </li>
<li>Utrwalacz należy wylać do odpowiedniego pojemnika, ponieważ &nbsp;w wielu instytucjach paraformaldehyd jest traktowany jako odpad niebezpieczny. Przemyć komórki 3 razy PBS, po 5 minut za każdym razem. Podczas usuwania roztworów z komórek należy uważać, aby odsysanie nie doprowadziło do wyschnięcia komórek. Należy również zawsze mieć przygotowany kolejny roztwór do dodania do komórek przed usunięciem roztworu z nich, aby komórki nie wyschły. </li>
<li>Jeśli interesujący antygen znajduje się wewnątrz komórki, błona komórkowa musi zostać przepuszczczona, aby umożliwić wniknięcie przeciwciała. W celu permeabilizacji komórek należy użyć świeżego 0,3% roztworu Triton X-100 w PBS. Pipetować powoli, ponieważ Triton jest lepki, i upewnić się, że detergent jest całkowicie rozpuszczony w PBS przed dodaniem do komórek. Permeabilizować komórki przez 5 minut, a następnie przemyć komórki 3 razy PBS, po 5 minut za każdym razem. </li>
<li>Komórki muszą zostać poddane działaniu czynnika blokującego, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu przeciwciał. Jako czynnika blokującego stosujemy albuminę surowiczą bydlęcą (BSA). Roztwór blokujący przygotowuje się poprzez rozpuszczenie 5% BSA w PBS (na wytrząsacie lub rotatorze, ponieważ rozpuszczanie trwa) a następnie przefiltrowanie roztworu za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 µm. Blokować komórki w 5% roztworze BSA/PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (które powinno być specyficzne dla białka docelowego) do wcześniej określonego stężenia w 1% BSA/PBS (przygotowanym przez rozcieńczenie 5% BSA/PBS). Nanieść rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe (30 µl na szkiełko podstawowe 25 mm, 20 µl na szkiełko podstawowe 18 mm, 15 µl na szkiełko podstawowe 12 mm) na płytkę szklaną pokrytą parafilmem. Podnieść szkiełko podstawne z unieruchomionymi komórkami, odwrócić je tak, aby komórki znajdowały się na dole, i położyć na roztworze przeciwciał, tak aby komórki miały kontakt z przeciwciałami. Przykryć całą konstrukcję drugim paskiem parafilmu. Inkubować przez noc w temperaturze 4°C.
Dzień 3: Płukanie, inkubacja z przeciwciałem wtórnym, barwienie jąder i montaż preparatu
<ol>
<li>Ostrożnie usuń górny pasek parafilmu, podnieś szkiełko nakrywkowe, odwróć je i umieść z powrotem w płytce z PBS w każdym dołku do przemywania, tak aby komórki były skierowane do góry. </li>
<li>Przemyj komórki 3 razy PBS, po 5 minut za każdym razem. </li>
<li>Wybierz przeciwciało wtórne, które wykryje przeciwciało pierwotne; na przykład, jeśli przeciwciało pierwotne zostało wytworzone u królika, przeciwciało wtórne powinno rozpoznawać królicze IgG. Należy zadbać o dopasowanie izotypu przeciwciała (IgG, IgM itp.). W przypadku stosowania wielu przeciwciał pierwotnych upewnij się, że pochodzą one od różnych gatunków lub mają różne izotypy, i zaplanuj detekcję za pomocą różnych markerów dołączonych do przeciwciał wtórnych. Na przykład można użyć przeciwciała wtórnego przeciwkróliczego sprzężonego z czerwonym fluorophorem oraz przeciwciała wtórnego przeciwmysiego sprzężonego z zielonym fluorophorem. Inkubuj komórki w roztworze przeciwciała wtórnego rozcieńczonym do odpowiedniego stężenia w 1% BSA przez 2 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej, stosując tę samą technikę co w przypadku przeciwciał pierwotnych (kroki niewykazane na filmie). Objętość przeciwciała wtórnego potrzebna do inkubacji może być nieco większa niż w przypadku przeciwciała pierwotnego, jeśli przeciwciało wtórne jest przechowywane jako roztwór glicerolu (40 µl na szkiełko nakrywkowe 25 mm, 30 µl na szkiełko nakrywkowe 18 mm, 25 µl na szkiełko nakrywkowe 12 mm). 
<ul>
<li>Uwaga: Jeśli do wizualizacji przeciwciała wtórnego używasz cząsteczek fluorescencyjnych, próbka musi być chroniona przed światłem po dodaniu przeciwciała wtórnego. Inkubuj w ciemności lub w płytce owiniętej folią. </li>
</ul>
</li>
<li>Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe z parafilmu, zgodnie z opisem dla przeciwciała pierwotnego. Przemyj komórki 2 razy PBS, po 5 minut za każdym razem, a następnie inkubuj przez 1 minutę w barwniku jądrowym Hoechst w stężeniu 2 µg/ml rozcieńczonym w PBS (jeśli preferowane jest przeciwbarwienie jąder). Jeśli barwnik Hoechst jest stary i sygnał jest zbyt słaby, można zwiększyć czas inkubacji i/lub stężenie. Po inkubacji z Hoechst przemyj 1 raz PBS przez 5 minut. </li>
<li>Szkiełka nakrywkowe należy zamontować na szkiełku przedmiotowym za pomocą medium montażowego w celu wizualizacji pod mikroskopem. W przypadkach, gdy do wizualizacji przeciwciała wtórnego użyto cząsteczki fluorescencyjnej, medium montażowe powinno zawierać substancje minimalizujące fotoblaknięcie. Jako medium montażowe do fluorescencji stosujemy Vectashield. Nanieś kroplę Vectashield o odpowiedniej wielkości na szkiełko przedmiotowe (12 µl na szkiełko nakrywkowe 25 mm, 6 µl na szkiełko nakrywkowe 18 mm, 3 µl na szkiełko nakrywkowe 12 mm). </li>
<li>Ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe i opłucz jego tył wodą dejonizowaną, aby usunąć sole (z PBS). Odchłoń nadmiar wody za pomocą chusteczki typu kimwipe lub ręcznika papierowego i połóż szkiełko na kropli Vectashield komórkami skierowanymi w dół. Połóż szkiełko nakrywkowe pod kątem i pozwól mu powoli opaść, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza. Opisz szkiełko przedmiotowe, podając datę i wszelkie informacje o próbce. </li>
<li>Pozostaw szkiełka z nakrywkami do wyschnięcia (w ciemności), a następnie odessać nadmiar Vectashield z krawędzi szkiełka nakrywkiego. Krawędzie szkiełka nakrywkiego można teraz uszczelnić lakierem do paznokci, jeśli jest to pożądane (szczególnie przydatne, jeśli szkiełka nakrywkowe będą obserwowane pod mikroskopem odwróconym). Zazwyczaj przechowujemy nasze szkiełka w zamrażarce w temperaturze -20°C.</li>
</ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamin+A%2C+the+Arp2%2F3+complex%2C+and+the+morphology+and+function+of+cortical+actin+filaments+in+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells.</a> J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).</li>
<li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of stem cells.</a> In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li>
</ol>

Niniejszy protokół opisuje procedurę immunobarwienia dla hNSPCs, która minimalizuje objętość niezbędnych przeciwciał i zapewnia wiarygodne barwienie komórek. Opisana procedura jest optymalna dla antygenów wewnątrzkomórkowych, ale może zostać zmodyfikowana w celu barwienia cząsteczek powierzchniowych komórek lub wzmocnienia barwienia cytoszkieletu.

<table><tbody><tr><td>Kryszalki z niemieckiego szkła (Deutsche Spiegelglas)</td><td>Narzędzie</td><td>Carolina Biological</td><td>WW-63-3029</td><td>dostępne kryszalki o średnicach 12, 15, 18, 22, 25 mm</td></tr><tr><td>Detergent bezfosforowy Liquinox</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273279</td><td>bardzo lepki</td></tr><tr><td>Hydrobromek poli-D-lizyny</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Laminina, naturalna mysia</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>Odczynnik</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>Dystrybuowane przez Fisher pod wskazanym numerem katalogowym</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>bardzo lepki</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>potencjalny kancerogen, zachować ostrożność podczas stosowania w formie proszku i roztworu</td></tr><tr><td>Seryjna albumina wołowa, wolna od IgG</td><td>Odczynnik</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-161</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>H-1399</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Odczynnik</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>lepki</td></tr></tbody></table>

immunocytochemia: ludzkie neuralne komórki macierzyste

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemia jest bardzo potężną i stosunkowo prostą metodą określania obecności, lokalizacji wewnątrzkomórkowej oraz względnej liczebności badanego antygenu, najczęściej białka, w hodowlach komórkowych. Niniejszy protokół przedstawia łatwą do naśladowania serię kroków, która pozwoli badaczom ograniczyć zużycie przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, zapewniając jednocześnie wysoką jakość oraz powtarzalność uzyskanych danych jakościowych i ilościowych z barwienia. Protokół ten zawiera dwa aspekty pomagające zminimalizować objętość przeciwciał niezbędną do barwienia. Po pierwsze, komórki są hodowane na małych, okrągłych szkiełkach nakrywek umieszczonych w dołkach płytki do hodowli tkanek. Po fiksacji komórki na szkiełkach nakrywek mogą zostać usunięte z dołków płytki. W celu barwienia przeciwciałami, szkiełko nakrywka z komórkami jest odwrócone na małą kroplę roztworu przeciwciał na parafilmie i przykryte drugim kawałkiem parafilmu, aby zapobiec wysychaniu. Stosując tę metodę, do każdego szkiełka nakrywki (lub próbki) przeznaczonego do barwienia potrzeba jedynie ~25 μl roztworu przeciwciał. Protokół ten opisuje immunobarwienie ludzkich komórek macierzystych/prekursorowych układu nerwowego (hNSPCs), jednak może być stosowany w przypadku wielu innych typów komórek.

Immunocytochemia jest potężną metodą pozwalającą określić obecność, lokalizację subkomórkową oraz względną obfitość interesującego antygenu w hodowlach komórkowych. Niniejszy protokół przedstawia łatwą do naśladowania serię kroków, które umożliwią oszczędność przeciwciał i zoptymalizują proces barwienia.

Immunocytochemia: ludzkie neuralne komórki macierzyste

Immunocytochemia jest bardzo skuteczną i stosunkowo prostą metodą określania obecności, lokalizacji wewnątrzkomórkowej oraz względnej zawartości...

Cześć, jestem Steve. Pracuję w laboratorium doktora Flanagana na Wydziale Patologii Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine. A dzisiaj pokażę wam, jak przeprowadzić immunochemię ludzkich nerwowych komórek prekursorowych.Protokół ten obejmuje umieszczanie komórek na powlekanych szkiełkach nakrywkowych oraz blokowanie i inkubację komórek w pierwotnym przeciwciałie przez noc, a następnie wykonanie kilku testów i nałożenie przeciwciała drugorzędowego w temperaturze pokojowej. I wreszcie, montaż pokrywy wsuwa się na loty mikroskopów. Zacznijmy.Więc najpierw zamierzam umieścić trzy sterylne niemieckie szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 milimetrów w 24-dołkowej płytce, aby pokryć je laminatem. Więc teraz mam moje szkiełka nakrywkowe na płytce i najpierw dodam roztwór polilizyny PDL, a następnie zamierzam inkubować suby okładki w PDL przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Więc teraz, po pięciu minutach, zamierzam usunąć PDL i nałożyć lamininę, a następnie zamierzam inkubować szkiełka nakrywkowe w laminacie przez co najmniej cztery godziny lub lepiej przez noc.Tak więc inkubowałem płytkę przez noc w laminacie, a teraz zamierzam przepłukać szkiełka nakrywkowe PBS i płytką ludzkich nerwowych komórek prekursorowych, które już policzyłem. Więc właśnie usunąłem roztwory laminowane, a teraz zamierzam okiełznać szkiełka nakrywkowe za pomocą PBS. Więc teraz zamierzam usunąć PBS i założyć rozwiązanie multimedialne.I w końcu jestem gotowy, aby zobaczyć komórki. Zobaczę więc komórki w ilości stu tysięcy komórek na promil, co oznacza, że na płytkę 24-dołkową dodam 50 000 komórek na studzienkę, ponieważ każda studzienka zawiera pół mililitra. Zamierzam więc przechylić płytkę z boku na bok, aby upewnić się, że komórki równomiernie rozkładają się na powierzchni szkiełka nakrywkowego.A teraz zamierzam umieścić je w inkubatorze na co najmniej 24 godziny, aby mogły się uspokoić i rozłożyć do immunochemii. Tak więc komórki rosną od 24 godzin, a ja spojrzałem na nie i są przyczepione i ładnie rozłożone. Więc teraz zamierzam naprawić je z 4% wysokością przez pięć minut.Ale najpierw zamierzam usunąć pożywkę i nie chcę, aby komórki wyschły. Więc zamierzam usunąć nośnik i dodać utrwalacz w tym samym czasie. Nazywa się to techniką oburęczną.Więc teraz zamierzam inkubować komórki w utrwalaczu przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Minęło więc pięć minut. Zamierzam usunąć PFA i umieścić go w pojemniku na odpady PFA i dodać PBS w tym samym czasie, gdy usuwam PFA, aby komórki nie wyschły.Więc zamierzam użyć jednej z tych plastikowych pipet ssących do podciągnięcia PFA i zamierzam ustawić minutnik na pięć minut. Tak więc, podczas gdy moje komórki są w praniu PBS, zamierzam przygotować rozwiązanie do wizualizacji trwałej ondulacji przy użyciu Triton X 100. Jest to detergent niejonowy i jest bardzo, bardzo lepki.Dlatego ważne jest, aby poczekać, aż cały roztwór dostanie się i trafi do pipety. Więc zamierzam przygotować 0,3% roztwór w PBS, zamierzam dodać 10 milili PBS. A do tych 10 mililitrów PBS dodam 30 mikrolitrów tri next 100.Więc zamierzam dodać 30 mikrolitrów tri następnie 100 do 10 mililitrów PBS. Więc dodam około 10 sekund, aby cały roztwór dostał się do końcówki. Więc ja, mam tutaj moje rozwiązanie do wykorzystania trwałej ondulacji.Kładę go na rotatorze na 10 minut, a następnie wiruję, aby upewnić się, że lepki trykot całkowicie się rozpuścił. Więc teraz jestem gotowa do wykonania kroku wizualizacji trwałej ondulacji. Zamierzam więc spędzić pięć minut w temperaturze pokojowej.Minęło więc pięć minut. Zamierzam teraz wykonać trzy pięciominutowe prania PBS, aby upewnić się, że zmyję cały tryton. Więc po raz kolejny zamierzam przestawić zegar na pięć minut.Więc właśnie zakończyłem wszystkie etapy prania, więc jestem gotowy do wykonania kroku blokowania. Tak więc na etapie blokowania przygotowałem rozwiązanie 5%BSA w PBS. I tak jak w przypadku wszystkich prań, zamierzam usunąć PBS i jednocześnie dodać roztwór blokujący.A etap blokowania będzie trwał godzinę w temperaturze pokojowej. Tak więc, podczas gdy moje komórki są w bloku, zamierzam przygotować płytkę do inkubacji przeciwciał pierwotnych. Zacznę od tej szklanej płytki i wytnę kawałek folii para, który jest mniej więcej tego rozmiaru.Owinąłem to owinięciem i potrzebowałem trochę taśmy, więc będę potrzebował czterech kawałków taśmy. Więc po prostu przygotuję je wszystkie. Wezmę więc ten kawałek folii parafilmowej i wyprostuję go tak, aby powierzchnia była ładna i gładka.A potem wezmę każdy koniec i przykleję go do tylnej części szklanej płyty. Więc teraz zamierzam pociągnąć to za drugi koniec, aby upewnić się, że powierzchnie są proste, a drugi koniec przykleję taśmą do tyłu. Więc teraz potrzebuję kolejnego kawałka folii dla par o tym samym rozmiarze co pierwsza.I w zasadzie zamierzam zrobić to samo. Przykleiłem więc drugi kawałek folii parafilmowej na pierwszym, tak jak pierwszy, z wyjątkiem tego, że zostawiłem jeden koniec drugiego kawałka perfilu luźno, ponieważ zamierzam umieścić roztwór przeciwciała, a następnie poślizgnie się prąd na pierwszym kawałku. A potem położę na nim drugi kawałek, który robi kanapkę.Ale w tej chwili zamierzam oznaczyć miejsce, w którym zamierzam umieścić roztwór przeciwciał i przykryć. Tak więc, komórki są w roztworze blokującym już od godziny, a ja zamierzam teraz nałożyć szkiełka nakrywkowe na kropelki przeciwciała pierwotnego do inkubacji przez noc. Więc zamierzam umieścić kroplę 35 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego i będę bardzo ostrożny, aby nie wydalić całego płynu, ponieważ może to spowodować powstanie pęcherzyków, a bąbelki mogą zakłócać wiązanie przeciwciała z antygenem.Chcę więc starać się uniknąć pęcherzyków w kropli, wszystkich trzech kroplach przeciwciała pierwotnego, i jestem gotowy, aby umieścić osłonę, przykrywki z komórkami na tych kroplach. Więc to, co teraz zrobię, to wezmę kartkę nakrywkową. Więc najpierw przesunę szkiełko nakrywkowe na bok i spróbuję delikatnie je podnieść przy otwartej pęsetie.Gdy tylko poczuję, że udało mi się uchwycić szkiełko nakrywkowe, zamknę się, aby powoli zamknąć pęsetę i delikatnie wyjąć szkiełko nakrywkowe z dołka. Tak więc komórki w tej chwili znajdują się na wierzchu szkiełka nakrywkowego. Więc to, co zamierzam zrobić, to odwrócić odwrócenie i delikatnie dotknąć kropli i powoli położyć ją na kropli, nie tworząc żadnych bąbelków.Powtórzę więc tę samą procedurę z drugim i trzecim szkiełkiem okładkowym. Ostatnim krokiem jest umieszczenie drugiego kawałka folii para. Sposób, w jaki zamierzam to zrobić, polega na tym, że zamierzam odłożyć to jednym ruchem, w ten sposób.Chcę starać się unikać poruszania się, przesuwania go z boku na bok. A na koniec zamierzam przymocować go do spodu płyty za pomocą kolejnego kawałka taśmy. A teraz w końcu komórki są gotowe do inkubacji w temperaturze czterech stopni przez noc i to jest koniec pierwszego dnia immunochemii.To jest drugi dzień chemii immunologicznej i zamierzam umyć szkiełka nakrywkowe w PB S3 razy przez pięć minut. A potem zamierzam inkubować w przeciwciałach drugorzędowych przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Najpierw zamierzam przyciąć folię para, aby móc usunąć szkiełka nakrywkowe.I zamierzam powoli podnieść górną część folii para, aby ślizgi okładki pozostały na dolnym kawałku folii do pielęgnacji. Usunąłem więc pierwszą sztukę i mam gotową płytkę z roztworem do mycia PBS. Więc zamierzam podnieść każdą zupę i umieścić ją w studzience, aby zmyć resztki pierwotnego przeciwciała, które nie przyczepiły się do epitopu.Tak więc, aby podnieść szkiełko nakrywkowe, najpierw przytrzymam je w ten sposób żyletką i po prostu delikatnie spróbuję je podnieść. A ponieważ komórki są, mamy do czynienia z roztworem przeciwciał, zamierzam je obrócić tak, aby były teraz na wierzchu i wsunąć je do studzienki, aby nadal pozostały na wierzchu. I zamierzam powtórzyć procedurę dla pozostałych poślizgnięć mocy.Będą więc myte przez pięć minut. Minęło więc pięć minut. Zamierzam wymienić rozwiązanie PBS.Dodam matrycę do haków. Teraz zamierzam go inkubować przez pięć minut. Tak więc inkubacja haków jest zakończona, a teraz jestem gotowy do zamontowania osłon sos i przyjrzenia się im.Więc najpierw zamierzam alk quad vector shield, który pomaga utrzymać fluorescencyjne dziesięciocentówki przed wybielaniem. Zamierzam, no cóż, najpierw oznaczę slajd numerami szkiełek nakrywkowych, a następnie umieszczę 10 mikrolitrów tarczy wektorowej. Tarcza wektorowa jest, jest olejem i jest naprawdę lepka, więc ważne jest również, aby trochę poczekać, aż wszystko dostanie się do końcówki.Umieściłem więc osłonę wektorową na szkiełku mikroskopowym, a teraz jestem gotowy do nałożenia szkiełek nakrywkowych na szkiełko mikroskopu. Więc to, co zamierzam najpierw zrobić, to wezmę szkiełko nakrywkowe i spłuczę tylną część szkiełka nakrywkowego wodą dejonizowaną, ponieważ jeśli tego nie zrobię, kiedy wyschnie, sól, która była w PBS, skrystalizuje i będzie zakłócać właściwości optyczne matryc fluorescencyjnych. Więc zamierzam to zrobić, mam gotową wodę dejonizowaną.Podniosę więc szkiełko nakrywkowe i spłuczę jego tył wodą dejonizowaną. A potem dotknę blaszanej chusteczki, żeby ją wysuszyć. A potem zamierzam odwrócić to ponownie, tak aby strona komórki była odwrócona i schodziła w dół na szkiełko mikroskopu.I tak jak poprzednio, zamierzam dotknąć kropli tarczy wektorowej i powoli ją opuścić, nie zatrzymując żadnych bąbelków. I zamierzam powtórzyć to samo, tę samą procedurę dla wszystkich przewracanych ładunków. A teraz spójrzmy.To jest przykład tego, co możesz uzyskać po zrobieniu chemii immunologicznej i uzyskaniu zdjęć, zrobieniu nakładek i tym podobnych. Na tym zdjęciu widać komórki macierzyste neuro hipokampa wyizolowane z wgnieceń u myszy po urodzeniu. Dzisiaj pokazałem Wam, jak przeprowadzić immunochemię ludzkich neuronalnych komórek prekursorowych.A jeśli zauważysz, ta technika pozwala zaoszczędzić ekspansywny odczynnik przeciwciała. Użyliśmy bardzo małej objętości przeciwciała pierwszorzędowego i drugorzędowego, umieszczając małą kroplę na perfilu i odwracając szkiełko nakrywkowe z komórkami na nim. Więc kontynuuj, zajmij się chemią immunoterapii i dziękuję za obserwowanie mnie.

immunocytochemistry-human-neural-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Immunocytochemia: Ludzkie neuronalne komórki macierzyste

Immunocytochemiczne barwienie w zawiesinie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs) pod kątem markerów powierzchniowych komórek (SSEA-3/SSEA-4) zostało przeprowadzone z wykorzystaniem własnego urządzenia do cytocentryfugacji w celu stworzenia monowarstwy komórek do obserwacji i kwantyfikacji.

Analiza immunocytochemiczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem własnoręcznie wykonanego urządzenia do cytocentryfugacji

Niniejszy protokół wideo demonstruje sposób rozróżniania i zliczania rzeczywistych komórek macierzystych układu nerwowego w mieszanej populacji komórek prekursorowych układu nerwowego z wykorzystaniem testu tworzenia kolonii neuronalnych.

Test tworzenia kolonii neuronalnych: metoda różnicowania rzeczywistych komórek macierzystych układu nerwowego od komórek progenitorowych układu nerwowego

Ten film demonstruje procedurę barwienia nowo rozmnożonych nerwowych komórek macierzystych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą inkorporacji EdU, a następnie immunofluorescencji w celu wizualizacji określonych białek, zwiększając zrozumienie dynamiki i proliferacji komórek.

Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji rozproszyłych nerwowych komórek macierzystych w wycinkach mózgu myszy

Źródło: Becker-Kojić, Z. A.,  i inni. al., Wolne od GMO pokolenie komórek neuronalnych pochodzących z krwi. J. Vis. Exp. (2021)Film przedstawia protokół przygotowania komórek nerwowych pochodzących z przeprogramowanych komórek krwi obwodowej do mikroskopii fluorescencyjnej, prezentując różne typy komórek i etapy rozwoju za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego.

Mikroskopia immunofluorescencyjna komórek nerwowych zróżnicowanych z obwodowych komórek krwiopochodnych 

Neuronalne komórki macierzyste pobrane z dorosłego mózgu są coraz częściej wykorzystywane w różnych zastosowaniach, począwszy od podstawowych badań nad rozwojem układu nerwowego, a skończywszy na odkrywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych w medycynie regeneracyjnej. To sprawia, że rygorystyczna kontrola warunków izolacji i hodowli stosowanych do hodowli tych komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania solidnych wyników eksperymentalnych.

Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Dostarczamy szczegółowy opis protokołu analizy cytometrycznej powierzchni i/lub antygenów wewnątrzkomórkowych w typach komórek nerwowych. Wyjaśniono kluczowe aspekty planowania eksperymentalnego, procedury metodologiczne krok po kroku i podstawowe zasady cytometrii przepływowej, aby umożliwić neurobiologom wykorzystanie tej potężnej technologii.

Protokoły cytometrii przepływowej do powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych analiz antygenowych typów komórek nerwowych

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) odnoszą się do komórek, które mogą samoodnawiać się i różnicować w trzy linie nerwowe. W tym miejscu opisujemy protokół określania częstości NSC w danej populacji komórek za pomocą tworzenia i różnicowania neurosfery w warunkach klonalnych.

Liczenie nerwowych komórek macierzystych za pomocą testów klonalnych

Ten protokół demonstruje metodologie dla mysiego modelu urazowego mózgu z otwartą czaszką i przeszczepu hodowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do miejsca urazu. W skrócie opisano również testy behawioralne i histologiczne wyników tych procedur.

Kontrolowany model wpływu kory mózgowej uszkodzenia mózgu myszy z terapeutycznym przeszczepem ludzkich pluripotencjalnych komórek nerwowych pochodzących z komórek macierzystych

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje strategie identyfikacji i wzbogacania stanu komórki w pierwotnych hodowlach dorosłych mysich nerwowych komórek macierzystych za pomocą obrazowania autofluorescencyjnego przy użyciu i) mikroskopu konfokalnego, ii) aktywowanego fluorescencyjnie sortera komórek do wykonywania obrazowania intensywności, lub iii) mikroskopu wielofotonowego do wykonywania obrazowania czasu życia fluorescencji.

Klasyfikacja stanu aktywacji neuronalnych komórek macierzystych in vitro za pomocą autofluorescencji

Poznaj metodę immunocytochemii do analizy ludzkich komórek macierzystych nerwowych. Ten protokół optymalizuje zużycie przeciwciał i zapewnia wyraźne wizualizowanie antygenów w mikroskopii fluorescencyjnej.

Immunocytochemia: ludzkie neuralne komórki macierzyste

Przeglądaj więcej filmów