Name: Test śmierci komórki na bazie β-glukuronidazy (GUS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj szybką metodę oceny śmierci komórkowej w roślinach z wykorzystaniem systemu reporterowego GUS i transformacji Agrobacterium. Technika ta umożliwia wizualną i ilościową analizę ekspresji genów w liściach Nicotiana benthamiana.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nicotiana benthamiana są hodowane w komorze wzrostowej z kontrolowaną temperaturą 25°C. Do badań wykorzystuje się w pełni rozwinięte, zdrowe liście roślin w wieku od 3 do 6 tygodni.
Wskazówka: Lepsze wyniki uzyskuje się, wykorzystując nowo powstające liście
1. Protokół przejściowej infiltracji Agrobacterium:
Dzień 1
<ol>
 <li>Na płytkach agarowych LB/Rifampicyna (25 μg/ml)/Kanamycyna (100 μg/ml) wysiej z mrożonek w glicerolu szczepy Agrobacterium tumefaciens (szczep LBA4404) zawierające odpowiednie wektory z genem (genami) badanymi pod kątem śmierci komórek oraz wektor zawierający kasetę GUS pod promotorem konstytutywnym. Zawsze należy uwzględnić kontrolę z pustym wektorem jako kontrolę negatywną.</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 28°C przez 2 dni.</li> 
</ol>
Dzień 3
<ol>
 <li>Zaszczepić 2 ml pożywki LB zawierającej ryfampicynę (25 μg/ml) i kanamycynę (100 μg/ml) pojedynczą kolonią z każdej wcześniej wysianej płytki LB/ryfampicyna/kanamycyna.</li>
 <li>Inkubować każdą kulturę w wytrząsaniu w temperaturze 28°C przez 24 godziny przy 200 rpm, aż do osiągnięcia maksymalnej gęstości wzrostu.</li>
</ol>
Wskazówka: Czasami obserwuje się tworzenie grudek; w takim przypadku przed kontynuacją należy dokładnie resuspender kultury (np. poprzez pipetowanie w górę i w dół).
Dzień 4
<ol>
<li>Po inkubacji zwiększyć objętość całkowitą do 10 mL, dodając świeże pożywkę LB (zawierającą odpowiednie antybiotyki) oraz acetosyringon (stężenie końcowe 25 μM).</li>
<li>Inkubować każdą kulturę w wytrząsaniu w temperaturze 28 °C przez kolejne 16 h.</li>
</ol>
Dzień 5
<ol>
 <li>Następnego dnia przemyj każdą hodowlę dwukrotnie, dodając 10 ml podłoża do infiltracji (10 mM MgSO4.7H2O, 9 mM MES, pH 5,6; nie dodawać acetosyringony) i odwiruj przy 4000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Po ostatnim etapie wirowania resuspenderuj każdą hodowlę w 5 ml podłoża do infiltracji zawierającego acetosyringonę (100 μM).</li>
<li>Zmierz OD600nm; akceptowalne są wartości pomiarów między 0,1 a 0,9. Wskazówka: Wartości OD600nm tak niskie jak 0,1 były stosowane bez problemu, jednak wyższe wartości OD mogą przynieść bardziej powtarzalne wyniki.</li>
<li>Inkubuj hodowle przez kolejne 3 h, aby przygotować hodowle Agrobacterium do infekcji.</li>
<li>Wymieszaj hodowle zawierające analizowany gen (geny) oraz kontrolę negatywną (Agrobacterium zawierające pusty wektor) w stosunku 1:1 z hodowlą zawierającą kasetę GUS.</li>
<li>Przeprowadź infiltrację strony abaksjalnej (dolnej) nowo powstających liści, używając strzykawki 1 ml bez igły (Rys. 1). 
Wskazówka: Infiltruj zarówno mieszaninę kontrolną negatywną (pusty wektor + kaseta GUS), jak i mieszaninę zawierającą badany gen (gen x + kaseta GUS) na przeciwległych liściach tej samej rośliny. Dla każdej serii zabiegów użyj trzech roślin.
</li>
<li>3 dni po infiltracji wycięte infiltrowane liście poddaj analizie w celu oznaczenia ekspresji białka GUS.</li>
</ol>
2. Histochemiczna analiza GUS
Dzień 8
<ol>
<li>Przenieś podciśnieniowo podłoże z substratem X-gluc do wyciętych liści.</li>
<li>Inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc lub do momentu pojawienia się wyraźnego niebieskiego zabarwienia.</li>
</ol>
Dzień 9
<ol>
 <li>Przepłukać wodą destylowaną.</li>
<li>Inkubować w 70% etanolu aż do usunięcia chlorofilu, a następnie ponownie przenieść do wody destylowanej. Wizualnie ocenić poziom ekspresji GUS.</li>
</ol>
3. Fluorometryczny test MUG:
Dzień 8
<ol>
 <li>Wyizolować białko całkowite poprzez rozcieranie zainfiltrowanych krążków liściowych w moździerzu z wykorzystaniem ciekłego azotu. Dodać 100 uL buforu do ekstrakcji GUS (50 mM NaPi pH 7.0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% sól sodowa N-lauroylosarkozyny, β-merkaptoetanol (0,7 μl/ml)), utrzymując próbkę na lodzie.</li>
<li>Odwirować zawiesinę przy 14 000 g przez 5 min w temperaturze 4 °C i pobrać supernatant jako białko całkowite rozpuszczalne.</li> 
<li>Zmierzyć stężenie za pomocą nanodropu zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
<li>Dostosować stężenie białka do 100 μg białka całkowitego rozpuszczalnego dla każdej próbki, używając buforu do ekstrakcji GUS.</li>
<li>Dodać substrat MUG (trihydrat 4-metyloumbeliferylo-β-D-glukuronidu) przygotowany w buforze do ekstrakcji GUS do stężenia końcowego 2 mM. Całkowita objętość 100 μL na próbkę (białko + substrat MUG) powinna być wystarczająca.</li>
<li>Inkubować reakcje przez 1 h w temperaturze 37 °C.</li>
<li>Zatrzymać reakcje poprzez dodanie 800 μl buforu zatrzymującego GUS (0,2 M Na2CO3).</li>
<li>Zmierzyć fluorescencję za pomocą czytnika płytek przy długości fali wzbudzenia 365 nm i długości fali emisji 455 nm, a następnie porównać wartości z krzywą standardową MU. Wyniki aktywności GUS podać jako nmol MU / μg białka całkowitego rozpuszczalnego / min.</li> 
</ol>
4. Roztwory treściwe i robocze:
<ol>
<li>Roztwór stokowy acetosyringonu (1 M) (FW = 196.2 g) – 0,981 g w 5 mL DMSO</li>
<li>Roztwór stokowy kanamycyny (100 mg/ml) – przygotować w dH20 – wysterylizować przez filtrację</li>
<li>Roztwór stokowy ryfampicyny (25 mg/ml) – przygotować w DMSO</li>
<li>Płynna pożywka wzrostowa Luria-Bertani (LB): (1L) 
1 % (w/v) tryptony bakteryjnej, 10 g 
0,5 % (w/v) ekstraktu z drożdży bakteryjnych, 5 g 
170 mM chlorku sodu, 10 g 
pH - 7
</li>
<li>Acetosyringon (25 μM) = 25 μl roztworu stokowego 1 M w końcowej objętości 1 ml</li>
<li>Pożywka do infiltracji: (1L) 
10 mM MgSO4.7dH20(FW = 246.48 g), 2,4648 g 
9 mM MES(FW = 213.25 g), 1,91925 g 
pH – 5,6</li>
<li>Acetosyringon (100 μM) = 100 μl roztworu stokowego 1M w końcowej objętości 1 ml</li>
<li>Bufor do ekstrakcji GUS 
50 mM NaPi pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 0,1 % soli sodowej N-lauroylosarkozyny, β-merkaptoetanol (0,7 μl/ml)</li>
<li>2x bufor fosforanowy 
0,2M NaH2PO4 i 0,2 M Na2HPO4 pH 7</li>
<li>Roztwór substratu X-Gluc 
Rozpuścić 1 mg 5-bromo-4-chloro-3-indolylu b-D-glukuronidu (X-Gluc) w 0,1 ml metanolu. Dodać 1 ml 2x buforu fosforanowego, 20 μl 0,1M ferrycyjanku potasu, 10μl 10% Triton X-100 oraz 850 μl wody destylowanej.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Stosując niniejszy protokół, w przypadku wystąpienia śmierci komórkowej oczekiwany jest zanik ekspresji GUS. Wykazaliśmy jednoczesną ekspresję genu reporterowego, β-glukuronidazy (GUS), wraz z członkiem rodziny białek cytoprotekcyjnych Arabidopsis Rodzina genów BAG (Bcl-2 Associated athanoGene). Przeprowadziliśmy ko-infiltrację N. benthamiana liście z kasetą ekspresyjną BAG sterowaną promotorem 35S oraz wektorem GUS pCAMBIA 2301 przy użyciu Agrobacterium szczep LBA4404. Jak pokazano na rysunku 2, po tej infiltracji zaobserwowano widoczny wzrost barwienia GUS. Z kolei w przypadku zastosowania BAX, znanego proapoptotycznego białka z rodziny Bcl-2, zaobserwowano wyraźny spadek barwienia GUS (Rys. 2). W obu tych przypadkach ekspresja GUS była widocznie inna w porównaniu z kontrolą. Jednak w sytuacjach, gdy różnica w ekspresji jest mniej oczywista, można przeprowadzić fluorometryczne testy MUG w celu ilościowego oznaczenia ekspresji GUS.
<img src="/files/ftp_upload/2680/2680fig1.jpg" alt="Eksperyment wstrzykiwania do rośliny; strzykawka i siewka, wchłanianie składników odżywczych z gleby, metoda badawcza w botanice." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przykład infiltracji strony abaksjalnej liści N. benthamiana mieszaniną Agrobacterium przy użyciu strzykawki 1 ml bez igły.
<img src="/files/ftp_upload/2680/2680fig2.jpg" alt="Wyniki barwienia GUS w tkankach liści dla ekspresji genów z wektorami pustym, przeciwśmiertnym i prośmiertnym." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. W liściach N. benthamiana koeksprymowano wektor GUS z genem przeciwśmiertnym oraz znanym induktorem śmierci komórek. Poziomy GUS porównano z kontrolą z pustym wektorem (kontrola GUS).

<ol><li>Jefferson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUS+fusions%3A+%2C+%CE%B2-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).</li>
<li>Nishihara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+%CE%B2-Glucuronidase+Gene+in+Pollen+of+Lily+%28Lilium+longiflorum%29%2C+Tobacco+%28Nicotiana+tabacum%29%2C+Nicotiana+rustica%2C+and+Peony+%28Paeonia+lactiflora%29+by+Particle+Bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment.</a> Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).</li>
<li>Hodal, L. Plant Science. 87, 115-115 (1992).</li>
<li>Kabbage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BAG+proteins%3A+a+ubiquitous+family+of+chaperone+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci.+%22%5BJournal%5D)">The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators.</a> Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).</li>
<li>Kang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtBAG6%2C+a+novel+calmodulin-binding+protein%2C+induces+programmed+cell+death+in+yeast+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants.</a> Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).</li>
<li>Yan, J. Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).</li>
<li>Takayama, S., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperone+targeting+and+regulation+by+BAG+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins.</a> Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).</li>
<li>Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+analysis+of+BAG-1%3A+a+novel+Bcl-2-binding+protein+with+anti-cell+death+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity.</a> Cell. 80 (2), 279-279 (1995).</li>
<li>Vitha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+%CE%B2-glucuronidase+assay+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants.</a> Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).</li>
<li>Otha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+Expression+in+Tobacco+of+a+%CE%B2-Glucuronidase+%28GUS%29+Reporter+Gene+Containing+an+Intron+Within+the+Coding+Sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence.</a> Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Często trudno jest stosować w roślinach techniki wykrywania śmierci komórek, które są powszechne w systemach ssaków. W połączeniu z systemem reporterowym GUS przedstawiamy czułą, opartą na roślinach metodę wykrywania i analizy czynników odpowiedzialnych za śmierć komórek. Metoda ta wykorzystuje prosty fakt, że do wystąpienia ekspresji GUS niezbędne są żywe komórki. Aby zapewnić wiarygodne wyniki i powtarzalność, krytyczne jest, aby kultury zawierające kasetę GUS oraz badany gen były infiltrowane w równych proporcjach. P...

<table><tbody><tr><td>Rifampicyna</td><td>VWR international</td><td>IC19549001</td><td>stok 25mg/mL w DMSO</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;-hydroksy-3&amp;rsquo;,5&amp;rsquo;-dimetoksyoacetofenon (Acetosyringona)</td><td>VWR international</td><td>TCD2666</td><td>0.981 g/mL w DMSO (stok 1M)</td></tr><tr><td>Kwas 2-(4-morfolino)etanosulfonowy monohydrat (MES)</td><td>VWR international</td><td>EM-6110</td><td>1.92 g/L w wodzie do przygotowania 1 L pożywki do infiltracji</td></tr><tr><td>Bacto-tryptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td>10g/L w wodzie do przygotowania 1 L pożywki LB</td></tr><tr><td>Bacto-ekstrakt drożdżowy</td><td>VWR international</td><td>EM1.03753.0500</td><td>5g/L w wodzie do przygotowania 1 L pożywki LB</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>VWR international</td><td>EM-7710</td><td>10g/L w wodzie do przygotowania 1 L pożywki LB</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednopodstawny monohydrat</td><td>VWR international</td><td>MK-7868-12</td><td>2.5g/L w wodzie do przygotowania 50mM buforu NaPi</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwupodstawny heptahydrat</td><td>VWR international</td><td>EMD-SX0715-1</td><td>5g/L w wodzie do przygotowania 50mM buforu NaPi</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu heptahydrat</td><td>VWR international</td><td>EM-MX0070-1</td><td>2.5 g/L w wodzie do przygotowania 1 L pożywki do infiltracji</td></tr><tr><td>N-lauroylosarkozyna</td><td>VWR international</td><td>TCL0151-500G</td><td>0.1% v/v w buforze GUS</td></tr><tr><td>Sól cykloheksyloamoniowa 5-bromo-4-chloro-3-indoksyl-beta-D-glukuronidu (X-gluc)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G1281C</td><td>1mg/100uL w metanolu 100%</td></tr><tr><td>Hydrat 4-metyloumbellyferylowego-&amp;mu;-D-glukuronidu (MUG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5664</td><td>2 mM w 100 uL buforu do ekstrakcji GUS</td></tr><tr><td>Ferrocyjanek potasu trihydrat</td><td>VWR international</td><td>EM-PX1460-1</td><td>stok 100mM do roztworu substratu X-gluc</td></tr><tr><td>&amp;#946;-metyloumbellyferon (MU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1381</td><td>Do krzywej wzorcowej MU użyć buforu do ekstrakcji GUS</td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>VWR international</td><td>EM-SX0395-11</td><td>0.2 M w wodzie do przygotowania buforu zatrzymującego GUS</td></tr></tbody></table>

test śmierci komórek oparty na &#946;-glukuronidazie (gus)

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

Opracowaliśmy nowy system przejściowej ekspresji roślinnej, który jednocześnie wykazuje ekspresję genu reporterowego, β-glukuronidazy (GUS), oraz domniemanych pozytywnych lub negatywnych regulatorów śmierci komórkowej. W systemie tym liście N. benthamiana są współinfiltrowane z kasetą ekspresyjną sterowaną promotorem 35S, zawierającą analizowany gen, oraz wektorem GUS pCAMBIA 2301 z wykorzystaniem szczepu Agrobacterium LBA4404 jako nośnika. Ponieważ do ekspresji GUS niezbędne są żywe komórki, spodziewany jest zanik aktywności GUS, gdy ten gen markerowy jest współwyrażany z pozytywnymi regulatorami śmierci komórkowej. Równie tak zwiększoną aktywność GUS obserwuje się przy zastosowaniu genów antyapoptotycznych w porównaniu z kontrolą wektorową. Jak pokazano poniżej, z sukcesem wykorzystaliśmy ten system w naszym laboratorium do analizy czynników pro- oraz anty-śmierciowych. Należą do nich roślinna antyapoptotyczna rodzina genów BAG (Bcl-2 Associated athanoGene), a także znane ssacze induktory śmierci komórkowej, takie jak BAX. Dodatkowo wykorzystaliśmy ten system do analizy funkcji śmierci specyficznych trunkacji w obrębie białek, co może dostarczyć wskazówek na temat możliwej potranslacyjnej modyfikacji lub aktywacji tych białek. Przedstawiamy tutaj szybką i czułą metodę opartą na roślinach, stanowiącą wstępny etap badania funkcji śmierci specyficznych genów.

Testy programowanej śmierci komórek powszechnie stosowane w systemach ssaków, takie jak analiza drabinowania DNA lub testy TUNEL, są często trudne do odtworzenia u roślin. W połączeniu z systemem raportującym GUS proponujemy szybki, transientny test oparty na roślinach do analizy potencjalnych właściwości indukowania śmierci komórek przez specyficzne geny.

Test śmierci komórek oparty na &#946;-glukuronidazie (GUS)

Opracowaliśmy nowy system przejściowej ekspresji w roślinach, który umożliwia jednoczesną ekspresję genu reporterowego, $\beta$-glukuronidazy (GUS), oraz domniemanego...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie systemu reporterowego Gus do analizy potencjalnych właściwości letalnych specyficznych genów. Geny zainteresowania są klonowane do kasety Gus i namnażane w odpowiednich wektorach agrobakteryjnych pod promotorem 35 s. Następnie wektory te są transformowane do szczepu Agrobacterium LBA 44 0 4, a następnie mieszane z kulturą zawierającą kasetę ekspresyjną Gus w celu infiltracji liści Nick Oceana Hamana.Aktywność Gus można ocenić wizualnie poprzez barwienie histochemiczne lub ilościowo za pomocą fluorometrycznego pomiaru aktywności. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak drabinkowanie DNA czy test TUNEL, które są powszechnie stosowane w systemach ssaczych, lecz trudne do powtórzenia u roślin, jest to, że jest to czuły i szybki przejściowy test na roślinach, wykorzystujący prosty fakt, że do ekspresji gas niezbędne są żywe komórki. Procedura zostanie dziś zaprezentowana przez Hua RAOs.Współpracownik naukowy na etapie postdoc w naszym laboratorium. Infiltracja wymaga w pełni rozwiniętych zdrowych liści roślinnicotiana hamana w wieku od trzech do sześciu tygodni, hodowanych w temperaturze 25 °C. Protokół należy zaplanować na osiem dni. Pierwszego dnia należy wykonać posiewy z banków w glicerolu agrobacterium tumor fassan zawierających wektory do testu śmierci komórek oraz wektor z kasetą ekspresyjną Gus; zawsze należy dołączyć pusty wektor jako kontrolę negatywną lub wypełniacz w przypadku testowania wielu kombinacji kultur.Inkubuj płytki w temperaturze 28 °C przez dwa dni. Trzeciego dnia zaszczep 2 mL selektywnego podłoża LB pojedynczą kolonią z każdej płytki. Inkubuj każdą kulturę w warunkach wytrząsania w temperaturze 28 °C przez 24 h przy 200 RPM, aż do osiągnięcia maksymalnej gęstości wzrostu.Po 24 godzinach inkubacji, w przypadku wystąpienia grudek, całkowicie resuspenduj kulturę poprzez pipetowanie, a następnie zwiększ całkowitą objętość każdej kultury do 10 mililitrów, dodając świeżą selektywną pożywkę LB, aby indukowane zostały geny wirulencji agrobacterium. Dodaj aceton do stężenia 25 micromolar i inkubuj każdą kulturę z wytrząsaniem w temperaturze 28 stopni Celsius przez kolejne 16 godzin. Następnym krokiem jest odwirowanie każdej kultury przy 4 000 Gs przez 10 minut w temperaturze pokojowej i resuspensja osadu w 10 mililitrach medium do infiltracji.Nie dodawać acetonu, ponownie odwirować kultury, a następnie resuspender. Każdy osad zawiesić w pięciu mililitrach podłoża do infiltracji zawierającego 100 µM acetonu. Następnie zmierzyć OD przy 600 nm.Dopuszczalne są stężenia tak niskie jak 0,1, jednak jeśli przekraczają one 0,9, należy rozcieńczyć je do 0,9 za pomocą medium infiltracyjnego i acetonu przed infiltracją. Po inkubacji ponownie inkubuj kultury w temperaturze 28 °C z wstrząsaniem przez trzy godziny. Wymieszaj kultury eksperymentalne i kontrolne w stosunku jeden do jednego z kulturą zawierającą kasetę Gus.W przypadku każdej hodowli należy użyć strzykawki bezigłowej o pojemności 1 ml, aby przeprowadzić infiltrację w miejscu uszczelnienia ABA lub na spodniej stronie nowo powstających liści. Objętość infiltratu nie ma kluczowego znaczenia. Po uformowaniu się obszaru nasączonego wodą, należy przeprowadzić infiltrację kontroli negatywnej oraz badanego genu na przeciwległych liściach tej samej rośliny, a następnie w ten sam sposób zinfiltrować dwie kolejne rośliny.W związku z tym dla każdej hodowli przygotowano rośliny w trzech powtórzeniach. Trzy dni po infiltracji nadszedł czas na zebranie liści i analizę ekspresji białka gust. Analizę histochemiczną należy rozpocząć od infiltracji próżniowej całego liścia substratem xlu, aż zostanie on całkowicie nasiąknięty.Następnie inkubuj liście w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc lub do momentu pojawienia się wyraźnego niebieskiego barwienia. Przepłucz liście wodą destylowaną i inkubuj je w 70% etanolu przez noc, aż do usunięcia chlorofilu. Następnego dnia opłucz liście wodą destylowaną i oceń poziomy ekspresji GUS.Aby określić poziom ekspresji Gus, substrat mug jest przekształcany w fluorescencyjny produkt mu, który można zmierzyć. Procedurę rozpoczyna się od rozcierania zinfiltrowanych krążków liściowych w moździerzu przy użyciu ciekłego azotu. Następnie, utrzymując próbkę na lodzie, należy dodać 100 µL buforu do ekstrakcji GUS. Suspensję odwiruj w wirowarce przy 14 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C, a następnie zbierz nadsącz zawierający całkowite białka rozpuszczalne, w tym Gus.Zmierz całkowite stężenie białek rozpuszczalnych za pomocą NanoDrop i dostosuj stężenie do 100 µg całkowitego białka dla każdej próbki w buforze ekstrakcyjnym Gus. Następnie do każdej próbki dodaj substrat mug w buforze ekstrakcyjnym Gus do stężenia końcowego 2 mM mug. Całkowita objętość 100 µL na próbkę powinna być wystarczająca; wymieszaj roztwór poprzez pipetowanie i inkubuj reakcję przez godzinę w temperaturze 37 °C.Po godzinie reakcję zatrzymuje się poprzez dodanie 800 µL buforu stopującego GUS. Aby przeprowadzić kwantyfikację, 100 µL każdej próbki nanosi się na płytkę mikrotytrującą, którą analizuje się za pomocą czytnika płytek; mierzy się fluorescencję przy długości fali wzbudzenia 365 nm i emisji 455 nm, a następnie porównuje wyniki z krzywą wzorcową. Aktywność GUS można następnie podać jako jednostki mu na mikrogram całkowitego rozpuszczalnego białka na minutę reakcji. Wykrywa się różne poziomy GUS w zależności od użytego konstruktu, gdy kaseta ekspresyjna GUS jest współinfiltrowana z negatywnym regulatorem śmierci komórkowej lub genem przeciwśmierciowym.W porównaniu obserwuje się wysokie poziomy Gus. Poziomy Gus w kontroli z pustym wektorem są znacznie niższe. I odwrotnie, gdy zastosowany zostanie pozytywny regulator śmierci komórkowej lub gen proapoptotyczny, obserwuje się wyraźny spadek ekspresji Gus w porównaniu do kontroli z pustym wektorem.Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w ciągu około jednego tygodnia. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że technika ta służy jako krok wstępny do określenia potencjału specyficznych genów. Niezbędne są dodatkowe prace w celu potwierdzenia tych wstępnych wyników oraz określenia rodzaju zaangażowanych komórek.

a-glucuronidase-gus-based-cell-death-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test oparty na β-glukuronidazie (GUS) do oceny śmierci komórkowej

W tym filmie opisujemy prostą i solidną metodę określania potencjału cytotoksycznego leku trypanobójczego przeciwko pasożytowi, Trypanosoma cruzi, wyrażającemu enzym β-galaktozydazy. β-galaktozydaza służy jako wskaźnik lizy komórek, a jej aktywność może być wykorzystana do oceny efektów działania leku.

Test β-galaktozydazy do oceny cytotoksyczności wywołanej lekiem u pasożytów

Ten film demonstruje test dehydrogenazy mleczanowej do wykrywania śmierci makrofagów za pośrednictwem inflamasomów. Makrofagi są poddawane działaniu lipopolisacharydu w celu pobudzenia, a następnie ekspozycji na nigerycynę w celu spowodowania śmierci komórek wywołanej inflamasomem, która jest określana przez test dehydrogenazy mleczanowej.

Test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia śmierci makrofagów po ekspozycji na nigerycynę

Ten film demonstruje test in vitro wykorzystujący β-glukany do aktywacji komórek mikrogleju do produkcji rodników ponadtlenkowych, reaktywnych form tlenu. W komórkach raka mózgu generowane reaktywne utleniacze aktywnie hamują proliferację komórek nowotworowych i indukują śmierć komórki.

Test do analizy testowego β-glukanu jako strategii immunoterapii przeciwko komórkom raka mózgu

Testy multipleksowe mogą dostarczyć korzystnych informacji dla podstawowych mechanizmów komórkowych i wyeliminować marnotrawstwo odczynników oraz niepotrzebne powtarzalne eksperymenty. Opisujemy tutaj multipleksowy test aktywności kaspazy-3/7, przy użyciu metod fluorescencyjnych i luminescencyjnych, w celu określenia żywotności komórek w modelu podwzgórza in vitro po prowokacji oksydacyjnej kwasem palmitynowym.

Zastosowanie testu multipleksowania kaspazy w celu określenia apoptozy w modelu komórkowym podwzgórza

Opisujemy prosty, ilościowy test kolorymetryczny, który konkretnie mierzy aktywność proteolityczną ludzkiego, mysiego lub szczurzego Granzyme B (GzmB). Protokół ten można łatwo dostosować do określania aktywności proteazy innych granulowanych proteaz serynowych poprzez hydrolizę innych syntetycznych substratów peptydowych z odpowiednią sekwencją rozpoznawania.

Test kolorymetryczny, który specyficznie mierzy aktywność proteolityczną Granzyme B: hydroliza Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Istnieje zapotrzebowanie, aby testy przedkliniczne nowej klasy leków "sierocych" zwanych farmakologicznymi białkami opiekuńczymi były powtarzalne, szybkie i skuteczne. Opracowaliśmy prosty, wysoce ustandaryzowany i wszechstronny test oparty na hodowli komórkowych do badań przesiewowych dla kwalifikujących się pacjentów, a także nowatorskie farmakologiczne leki opiekuńcze.

In vitro Pomiar enzymów w celu zbadania farmakologicznej reakcji białka opiekuńczego w chorobie Fabry'ego i Pompego

Udało nam się wygenerować dwa testy γ sekretazy specyficzne dla substratu. Oba przedstawione tutaj testy komórkowe mają na celu ilościowe określenie aktywności enzymatycznej γ-sekretazy poprzez wyniki reporterów lucyferazy świetlika.

Ilościowy pomiar białka prekursorowego amyloidu za pośrednictwem γ-sekretazy i rozszczepienia Notch w komórkowych platformach testowych reporterowych lucyferazy

Starzenie się komórek jest kluczowym czynnikiem w rozwoju przewlekłych patologii związanych z wiekiem. Identyfikacja środków terapeutycznych ukierunkowanych na komórki starcze daje nadzieję na wydłużenie procesu starzenia się w dobrym zdrowiu. W tym miejscu przedstawiamy nowatorski test do badań przesiewowych w celu identyfikacji senoterapeutyków na podstawie pomiaru aktywności związanej ze starzeniem β-galaktozydazy w pojedynczych komórkach.

Test przesiewowy oparty na SA-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych

Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda oznaczania aktywności glikozylazy uracylo-DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF do bezpośredniej analizy produktu zawierającego miejsce apurinowe/apirymidynowe. Test okazał się dość prosty, specyficzny, szybki i łatwy w użyciu do pomiaru glikozylazy DNA.

Test glikozylazy uracylo-DNA za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Kwantyfikacja zarówno utlenionych, jak i zredukowanych form glutationu (odpowiednio GSSG i GSH) została osiągnięta dzięki zastosowaniu aldehydu ortoftaldehydu (OPA). OPA staje się wysoce fluorescencyjny po sprzęgnięciu z GSH, ale nie jest w stanie sprzęgnąć GSSG, dopóki nie zostanie zredukowany. W tym miejscu opisujemy test wieloparametryczny do ilościowego określenia obu przy użyciu kwantyfikacji białka w celu normalizacji.

Szybkie oznaczanie ilościowe utlenionych i zredukowanych form glutationu przy użyciu orto-ftaldehydu w hodowanych komórkach ssaków in vitro

Poznaj szybką metodę oceny śmierci komórkowej w roślinach z wykorzystaniem systemu reporterowego GUS i transformacji Agrobacterium. Technika ta umożliwia wizualną i ilościową analizę ekspresji genów w liściach Nicotiana benthamiana.

Test śmierci komórek oparty na β-glukuronidazie (GUS)

Przeglądaj więcej filmów