Test śmierci komórki na bazie β-glukuronidazy (GUS)

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie systemu reporterowego Gus do analizy potencjalnych właściwości śmierci określonych genów. Interesujące nas geny są klonowane do kasety Gus i hodowane w odpowiednich wektorach agrobacterium pod promotorem 35 s. Wektory te są następnie przekształcane w szczep Agrobacterium, LBA 44 0 4, i są mieszane z kulturą zawierającą kasetę ekspresji Gus w celu infiltracji liści Nicka Oceana Hamana.

Aktywność Gus można ocenić wizualnie za pomocą barwienia histochemicznego lub ilościowo za pomocą testu kubka fluorescencyjnego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak drabinkowanie DNA lub test tunelowy, jest powszechnie stosowana w systemach ssaków, ale trudna do odtworzenia w roślinach, jest to, że jest to czuły, szybki test przejściowy oparty na roślinach, który wykorzystuje prosty fakt, że żywe komórki są wymagane do wystąpienia ekspresji gazu. Dzisiejszą procedurę zademonstrują Hua RAOs.

Pracownik naukowy z tytułem doktora w naszym laboratorium Infiltracja wymaga w pełni rozwiniętych zdrowych liści trzy- do sześciotygodniowych roślin nicotiana hamana uprawianych w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Zaplanuj realizację tego protokołu w ciągu ośmiu dni. W pierwszym dniu smuga się z zapasami glicerolu guza agrobacterium fassan zawierającego wektory do testu śmierci komórki, a wektor z kasetą ekspresji Gus zawsze zawiera również pusty wektor jako kontrolę ujemną lub nadziewacz, gdy testowanych jest wiele kombinacji kultur.

Inkubuj płytki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dwa dni. Trzeciego dnia zaszczepić dwa mililitry selektywnego LB pojedynczą kolonią z każdej płytki. Inkubuj każdą kulturę, wstrząsając w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 24 godziny przy 200 obr./min, aż do osiągnięcia maksymalnej gęstości wzrostu.

Po 24 godzinach inkubacji całkowicie ponownie zawiesić kulturę przez pipetowanie, jeśli występuje zbrylanie, i zwiększyć całkowitą objętość każdej kultury do 10 mililitrów za pomocą świeżego selektywnego LB w celu indukcji genów wirulencji agrobacterium. Dodaj aceton do 25 mikromolów i inkubuj każdą kulturę, wstrząsając w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez kolejne 16 godzin. Następnym krokiem jest odwirowanie każdej kultury w temperaturze 4 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i Resus, zawieszenie osadu w 10 mililitrach pożywki infiltracyjnej.

Nie dodawaj acetonu, ponownie odwiruj kultury, ale teraz Resus. Zawiesić każdą osadkę w pięciu mililitrach pożywki infiltracyjnej zawierającej 100 mikromolowy aceton. Teraz zmierz średnicę zewnętrzną przy 600 nanometrach.

Dopuszczalne są stężenia tak niskie, jak 0,1, ale jeśli są większe niż 0,9, przed infiltracją rozcieńczyć do 0,9 z infiltracją, pożywką i acetonem. Ponownie inkubować kultury w temperaturze 28 stopni Celsjusza, wstrząsając przez trzy godziny po inkubacji. Zmieszać kultury eksperymentalne i kultury kontrolne w stosunku jeden do jednego z kulturą zawierającą kasetę Gus.

Dla każdej kultury użyj jednomililitrowej strzykawki bezigłowej, aby nacieknąć uszczelkę ABA lub spód nowo pojawiających się liści. Objętość infiltracji nie jest ważna. Gdy utworzy się obszar nasiąknięty wodą, zostanie dodana wystarczająca ilość wody, infiltruj zarówno kontrolę negatywną, jak i gen do przeznaczenia na przeciwległych liściach tej samej rośliny, a następnie infiltruj dwie kolejne rośliny w ten sam sposób.

Tak więc dla każdej kultury istnieją potrójne rośliny. Trzy dni po infiltracji nadszedł czas na zebranie liści i oznaczenie ekspresji białka podmuchu. Rozpocznij analizę histochemiczną od próżniowego naciekania całego liścia substratem xlu, aż do całkowitego namoczenia.

Teraz inkubuj liście w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc lub do momentu, gdy pojawi się wyraźne niebieskie zabarwienie, gdy widoczne jest niebieskie zabarwienie. Opłucz liście w wodzie destylowanej i inkubuj je w 70% etanolu przez noc, aż ich chlorofil zostanie usunięty. Następnego dnia spłucz liście i wodę destylowaną i oceń poziom ekspresji GUS.

Aby określić ilościowo ekspresję Gusa, kubek z substratem jest przekształcany w produkt fluorescencyjny mu, który można zmierzyć na początku od zmielenia infiltrowanych krążków liściowych w moździerzu przy użyciu ciekłego azotu. Następnie dodać 100 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego GUS, trzymając próbkę na lodzie. Teraz odwirować zawiesinę w stężeniu 14 000 GS na pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant zawierający wszystkie rozpuszczalne białka, w tym Gus.

Zmierz całkowite stężenie białka rozpuszczalnego za pomocą NanoDrop i dostosuj stężenie do 100 mikrogramów białka całkowitego dla każdej próbki w buforze ekstrakcyjnym Gus. Teraz dodaj substrat kubka w buforze ekstrakcyjnym Gus do każdej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie dwóch milimolowych kubków. Całkowita objętość 100 mikrolitrów na próbkę powinna być wystarczająca, zmieszana przez pipetowanie i inkubować reakcję przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po godzinie zatrzymaj reakcję, dodając 800 mikrolitrów buforu zatrzymującego podmuchy. Aby określić ilościowo mu 100 mikrolitrów każdej próbki ładuje się na płytkę mikromiareczkową, która jest analizowana w czytniku płytek fluorescencja przy wzbudzeniu 365 nanometrów, mierzy się długości fal emisji 455 nanometrów i porównuje z krzywą standardową, aktywność Gussa można następnie podać jako M mu na mikrogram całkowitego rozpuszczalnego białka na minutę reakcji. W zależności od użytego konstruktu wykrywane są różne poziomy podmuchów, gdy kaseta ekspresji GUS jest współinfiltrowana ujemnym regulatorem śmierci komórki lub genem anty-śmierci.

Dla porównania obserwuje się wysokie poziomy porywów. Poziomy Gus w pustym sterowaniu wektorem są znacznie niższe. I odwrotnie, gdy stosuje się pozytywny regulator śmierci komórki lub gen pro-śmierci, obserwuje się rynkowe zmniejszenie ekspresji Gus w porównaniu z kontrolą pustego wektora.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około tygodnia. Podejmując próbę tej procedury, należy pamiętać, że technika ta jest stosowana jako pierwszy krok do określenia potencjału określonych genów. Należy wykonać dodatkowe prace, aby potwierdzić te wstępne wyniki i określić typ komórki, która była zaangażowana.