Obrazowanie 3D próbek biologicznych ex-vivo w wysokiej rozdzielczości za pomocą mikrotomografii komputerowej

Nieniszcząca wizualizacja objętości może być osiągnięta tylko za pomocą technik tomograficznych, z których najbardziej efektywną jest rentgenowska mikrotomografia komputerowa (CT).

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie mikrotomografii rentgenowskiej 3D tkanek zmineralizowanych i niezmineralizowanych. Osiąga się to poprzez ekstrakcję próbek, które mają być badane, a następnie unieruchomienie i umieszczenie próbek w instrumencie do mikrotomografii komputerowej. Trzecim krokiem procedury jest ustawienie parametrów akwizycji dla każdej próbki i zebranie obrazów.

Ostatecznie uzyskuje się obraz 3D próbki w wysokiej rozdzielczości za pomocą rentgenowskiej tomografii komputerowej. Główną zaletą tej techniki w naszych istniejących metodologiach, takich jak rezonans magnetyczny, ultrasonografia czy mikroskopia elektronowa, jest to, że dostarcza ona informacji o objętościach kleszczy z rozdzielczością jednego mikrona D. Ta metoda może zapewnić wgląd w wiele tkanek biologicznych. Może być również stosowany w elektronice, materiałoznawstwie i archeologii.

Preparat jest różny dla tkanek zmineralizowanych i niezmineralizowanych. Zmineralizowane tkanki muszą być szczelnie zamknięte w pojemnikach o ścisłym dopasowaniu, tak aby pozycja próbki nie uległa zmianie. Chociaż wykonywane są pomiary w wysokiej rozdzielczości, kształt pojemnika będzie się różnił w zależności od morfologii tkanki.

Na przykład kość udowa myszy pobrana z zarodka w wieku 18,5 D może zmieścić się w końcówce pipety. Zacznij od uszczelnienia wąskiego końca polistyrenowej końcówki pipety klejem, takim jak żywica epoksydowa. Następnie napełnij końcówkę działającym buforem.

W tym przypadku PBS teraz mocno dopasowuje nogę z odsłoniętą kością udową do końcówki i umieszcza końcówkę pipety w odpowiednim uchwycie, a drugi koniec uszczelnia ofiarą z arkusza folii para, a następnie perfekuje zwierzę, jak opisano w dołączonym rękopisie. Następnie wyekstrahuj poplamione płuca i serce i przenieś je do przygotowanej 50-mililitrowej probówki. Umieść narządy na suchej kartce papieru.

Umieść próbki w końcowych probówkach pomiarowych na dnie probówki to tkanina do tłumienia etanolu. Aby stworzyć środowisko nasycone etanolem, próbka powinna ściśle przylegać do probówki. Jeśli próbka jest luźna, zaciśnij ją drutem i unieruchom, w pobliżu dna probówki, tuż nad szmatką.

Następnie przyklej lub przykręć rurkę do uchwytu instrumentu i przystąp do ustawiania obrazu. Parametry akwizycji. Zacznij od umieszczenia uchwytu na próbkę w stoliku obrotowym instrumentu.

Następnie, korzystając z dowolnie dobranych wartości napięcia i prądu, wykonaj zdjęcie rentgenowskie. Jeśli obraz jest zbyt ciemny. Wprowadzaj zmiany, najpierw stopniowo zwiększając liczbę fotonów.

Odbywa się to poprzez stopniowe zwiększanie prądu. Jeśli obraz nie stał się jaśniejszy po zwiększeniu prądu do 200 mikroamperów, należy dokonać niewielkiego stopniowego zwiększania energii fotonów promieniowania rentgenowskiego poprzez zwiększenie napięcia. Jeśli obraz jest zbyt jasny, najpierw zmniejsz napięcie, a następnie zmniejsz prąd, aż obraz będzie zadowalający.

Benning może być również używany do zwiększania jasności obrazu kosztem rozdzielczości. Wartość inningu równa dwa sprawi, że obraz będzie około cztery razy jaśniejszy przy połowie rozdzielczości. Po ustawieniu optymalnej jasności zoptymalizuj czas naświetlania aparatu, aby osiągnąć kompromis między najlepszym uzyskanym kontrastem a rozsądnym czasem trwania eksperymentu.

Kontrast obrazu, szczególnie w przypadku próbek o wysokiej absorpcji, można poprawić, stosując filtry w celu zmniejszenia strumienia fotonów o niskiej energii. Teraz wybierz powiększenie robocze od 0,5 x do 40 x i dopasuj pole widzenia, aby objąć całą próbkę, maksymalizując rozdzielczość. Aby zwiększyć rozdzielczość, umieść źródło promieniowania rentgenowskiego bliżej próbki.

Aby zwiększyć pole widzenia, umieść detektor bliżej próbki. W przypadku obrazowania 3D próbka musi zmieścić się w polu widzenia pod dowolnym kątem obrotu, więc oś obrotu musi być wyśrodkowana. Zacznij od obrócenia próbki do minus 20 stopni.

Jeśli żądana objętość przesunęła się na boki, zmień położenie osi obrotu. Kontynuuj wykonywanie zdjęć przy dalszych obrotach i kontynuuj wprowadzanie poprawek, aż próbka będzie w pełni widoczna od ujemnych 90 do dodatnich 90 stopni, a następnie kontynuuj pomiar pod wszystkimi kątami od minus 90 do 90 stopni. Uruchomienie programu do obrazowania może zająć dużo czasu, więc zaplanuj odpowiednio.

Na przykład, aby zobrazować największą kość udową w powiększeniu Forex z rozdzielczością ośmiu mikronów, potrzeba 1000 obrazów projekcyjnych. Zajmuje to tylko trzy godziny. Jednak zebranie 2500 obrazów projekcyjnych potrzebnych do wizualizacji płuc szczura w powiększeniu 0,5 x i rozdzielczości 16 mikronów zajmuje 10 godzin.

Dla przyszłego porównania obrazów konieczna jest kalibracja obrazu poprzez wykonanie zdjęć standardowego fantomu wykonanego ze sztucznych materiałów, które mają absorpcję promieniowania rentgenowskiego podobnego do kości i wody w tych samych warunkach eksperymentalnych. Jeśli chodzi o próbkę, to po nagraniu wszystkich obrazów projekcyjnych rekonstruowana jest pełna objętość. Aby skalibrować zrekonstruowany obraz do wartości dla fantomu, należy użyć pola psów gończych lub skali CT.

Na przykład przy powiększeniu na rynku Forex wartość podobna do wody w fantomie jest ustawiona na zero, a wartość podobna do kości jest ustawiona na 3000 z tego zakresu. Wszystkie inne wartości są interpolowane lub ekstrapolowane. Obrazy można teraz analizować za pomocą dowolnego pakietu oprogramowania, który obsługuje pliki o rozmiarze 20 gigabajtów, takiego jak darmowy obraz J lub Fidżi.

To renderowanie objętości pokazuje kość udową myszy cztery dni po zainicjowaniu mineralizacji kości, frakcję zmineralizowaną obliczoną na poziomie 18%, a gęstość mineralną kości można porównać z kośćmi w innych stadiach rozwoju. To tomograficzne odwzorowanie objętości płuc 12-tygodniowej samicy nagiego szczura ma rozdzielczość 16 mikronów. Barwienie płuc służy do odsłonięcia naczyń krwionośnych o średnicy 20 mikronów.

W tym przekroju szeregowym analiza tych samych płuc. Wiele guzków nowotworowych można zobaczyć jako jednolite szare kształty w ciągu czterech tygodni od wszczepienia komórek nowotworowych. W tych płucach guzki rozrosły się, pokrywając 17% objętości płuc.

Większość barwienia płuc stwierdzono w obwodowych obszarach guzów. Wewnątrz guzków znajdują się również naczynia krwionośne, które pokrywają około 3% ich objętości. Po opanowaniu pozycjonowanie próbki można wykonać w ciągu 15 do 20 minut, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.

Czas obrazowania wraz z automatyczną rekonstrukcją objętości, która zwykle nie wymaga obecności osoby obsługującej, zależy od próbki i może trwać nawet 50 godzin. Nie zapominaj, że praca ze środkami utrwalającymi i barwiącymi może być bardzo niebezpieczna. Zawsze noś rękawice laboratoryjne i unikaj wdychania oparów z próbek.