Name: Elastomerowe rusztowania PGS w inżynierii tkanek tętniczych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-08T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Naucz się tworzyć porowate rusztowania rurowe z biodegradowalnych elastomerów do inżynierii tętniczej. Ta metoda wykorzystuje dynamiczne warunkowanie mechaniczne w bioreaktorze przepływowym z komórkami mięśniówki gładkiej naczyń krwionośnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor dziękuje dr. Jin Gao za syntezę PGS, dr. Peter Crapo za wnikliwą dyskusję na temat konfiguracji bioreaktora oraz dr. Mohamed Ezzelarab i dr. Wei Wu za wyizolowanie tętnic szyjnych pawianów. Badanie to zostało sfinansowane z grantu National Institutes of Health (R01 HL089658).

1. Wytwarzanie rusztowania rurkowatego
<ol>
<li>Przygotować rurkę szklaną (długość = 70 mm, średnica zewnętrzna = 9,0 mm, grubość ścianki = 1,0 mm; Small Parts, Miramar, FL) jako formę do rusztowania.</li>
<li>Przygotować 1,0% (mas/obj) roztwór kwasu hialuronowego (HA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), rozpuszczając 10 mg HA w 10 ml wody dejonizowanej. Mieszać za pomocą rotatora przez noc, aż w roztworze nie będzie pęcherzyków powietrza.</li>
<li>Wlać 1,0% roztwór HA do górnej części rurki szklanej. Pozostawić go, aby powoli spłynął po wewnętrznej ściance formy. Obrócić rurkę za pomocą rotatora, gdy roztwór dotrze do dna formy, i powtarzać ten krok, aż wewnętrzna ścianka formy zostanie równomiernie pokryta roztworem.</li>
<li>Po pokryciu wysuszyć wszystkie rurki szklane w piecu próżniowym w temperaturze 37°C przez 24 h.</li>
<li>Zmielić i przesiać cząsteczki soli (rozmiar = 25-32 μm) używane jako porogeny.</li>
<li>Złożyć rurkę szklaną (pokrytą wewnątrz 1,0% roztworem HA), trzpień (stal nierdzewna osłonięta rurką PTFE), tulejkę termokurczliwą (HS) oraz pierścień PTFE zgodnie z wcześniejszym opisem8.</li>
<li>Dodać cząsteczki soli o pożądanej wielkości do formy szklanej za pomocą szpatułki przez lejek z gumy silikonowej. Delikatnie postukać w formę, aby zapewnić równomierny rozkład cząsteczek soli. Zebrać nadmiar cząsteczek soli z górnej części formy, używając boku szpatułki.</li>
<li>Włączyć inkubator do hybrydyzacji na 30 min przed przeniesieniem formy wypełnionej solą. Wyłączyć inkubator do hybrydyzacji i umieścić formę wypełnioną solą w inkubatorze w celu stopienia soli.</li> 
<li>Wyjąć formy z inkubatora do hybrydyzacji i wysuszyć je w piecu próżniowym w temperaturze 37°C przez 24 h.</li>
<li>Wyjąć formy wypełnione solą z pieca próżniowego i pozwolić im ostygnąć w temperaturze pokojowej. Usunąć trzpień ze stali nierdzewnej, pchając go w dół, trzymając pierścień PTFE. Jeśli trzpień przylega zbyt ciasno do formy, użyć pęsety igłowej, aby go wyciągnąć. Usunąć pierścień PTFE z dna formy.</li>
<li>Umieścić formy w piecu w temperaturze 120 °C na 5 min, aby obkurczyć tulejkę HS. Sprawdzić, czy tulejka HS została obkurczona. Usunąć tulejkę HS z form wypełnionych solą i pozwolić im ostygnąć w temperaturze pokojowej. Przechowywać formy w eksykatore aż do momentu użycia.</li>
<li>Przygotować roztwór PGS, rozpuszczając 3 g PGS w 15 ml tetrahydrofuranu (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), aby uzyskać 20% (mas/obj) roztwór.</li>
<li>Dodać roztwór PGS do światła form wypełnionych solą, wkraplając go za pomocą pipety w komorze dyfuzyjnej. Przechylić szklaną formę pod kątem około 45° i wkraplać roztwór PGS do wewnętrznego światła, powoli obracając formę. Sprawdzić, czy roztwór PGS spływa po ściance formy. Jeśli zauważone zostaną suche miejsca, dodać więcej roztworu.</li> 
<li>Po dodaniu roztworu PGS umieścić formy w komorze dyfuzyjnej na co najmniej 30 min w celu odparowania THF.</li> 
<li>Umieścić formy w piecu próżniowym na określony czas utwardzania (np. 24/ 36/ 48 h) przy ciśnieniu 10 mTorr i temperaturze 150°C w celu utwardzenia PGS.</li>
<li>Po utwardzeniu wyjąć formy i pozostawić w temperaturze pokojowej do ostygnięcia. Powoli zanurzyć każdą formę w pozycji pionowej w wodzie dejonizowanej. Nie zanurzać ich w wodzie gwałtownie, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą spowodować przerwanie rusztowania.</li>
<li>Ostrożnie przenieść formy do łaźni wodnej i ustawić pod kątem na 1 h, używając rurki silikonowej, aby ułatwić rozpuszczenie HA. Sprawdzić, czy HA rozpuściło się z formy. Jeśli z formy nie uwalnia się HA, powoli pchnąć jeden koniec rusztowania szpatułką, aby uwolnić je z formy. Powtórzyć ten krok na drugim końcu rusztowania i powoli potrząsać formą w przód i w tył w łaźni wodnej. Sprawdzić, czy rusztowanie przesuwa się wewnątrz formy.</li>
<li>Ostrożnie przenieść rusztowanie do innej łaźni wodnej z mieszadłem. Nie chwytać rusztowania zbyt mocno, co mogłoby doprowadzić do jego pęknięcia. Umieścić rusztowanie w łaźni wodnej na co najmniej 3 dni, zmieniając wodę w celu wymycia cząsteczek soli.</li>
<li>Po wymyciu cząsteczek soli przenieść każde rusztowanie do probówki wirówki o pojemności 15 ml wypełnionej wodą dejonizowaną i umieścić w pojemniku z suchym lodem na 1 h w celu zamrożenia. Umieścić probówki w liofilizatorze (wszystkie zakrętki probówek muszą być otwarte) i liofilizować przez 2 dni.</li>
<li>Umieścić wszystkie rusztowania w eksykatore aż do momentu ich użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie rusztowania do wysiewu komórek
<ol>
<li>Wyjąć rusztowania z desykatora i przyciąć je do długości 25-30 mm.</li> 
<li>Przygotować dwa silikonowe korki (średnica = 20 mm, grubość ścianki = 6,35 mm, średnica otworu środkowego = 3 mm) i połączyć dwie rurki PTFE (średnica zewnętrzna = 3,97 mm, średnica wewnętrzna = 2,38 mm, grubość ścianki = 0,79 mm, długość = 60 mm i 40 mm) przez otwory środkowe każdego korka.</li>
<li>Odciąć pierścień z HS o długości 1,5 mm i umieścić go na jednym końcu rusztowania. Wsunąć jedną rurkę PTFE (połączoną z silikonowym korkiem) w jeden koniec rusztowania, zachowując jak najmniejszą część nakładki.</li>
<li>Umieścić rusztowanie i rurkę PTFE w piekarniku w temperaturze 120 °C przez 10 min, aby skurczyć pierścień HS. Sprawdzić, czy pierścień HS się skurczył i czy rusztowania są mocno połączone z rurką PTFE.</li>
<li>Wyjąć rusztowanie i rurkę PTFE i pozostawić je w temperaturze pokojowej do ostygnięcia. Umieścić zespół rusztowanie-rurka PTFE w rurce z poliwęglanu (średnica zewnętrzna = 15,5 mm, średnica wewnętrzna = 9 mm, długość = 50 mm), która będzie służyć jako komora bioreaktora.</li> 
<li>Połączyć drugi koniec rurki PTFE z rusztowaniem zgodnie z krokami 2.3) i 2.4).</li> 
<li>Dopasować dwa silikonowe korki tak, aby ich powierzchnie wewnętrzne przylegały do obu końców rurki z poliwęglanu. Przymocować obie powierzchnie zewnętrzne silikonowych korków do dwóch płyt ze stopu aluminium (górnej i dolnej; szerokość = 20 mm, długość = 70 mm, grubość = 6,35 mm). Włożyć dwa pręty gwintowane w otwory boczne płyt i przymocować rurkę z poliwęglanu (zawierającą wewnątrz rusztowanie) do płyt poprzez dokręcenie nakrętek motylkowych na płytach.</li>
<li>Zmierzyć długość możliwą do zasiewu każdego rusztowania (odległość między dwoma pierścieniami HS) i obliczyć powierzchnię wewnętrzną (π x średnica wewnętrzna x długość możliwa do zasiewu) każdego rusztowania w celu zasiewania komórek.</li> 
<li>Owinąć jedną jednostkę komory bioreaktora folią aluminiową i wysterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 30 min. Sterylizować każdą część bioreaktora (zbiornik na pożywkę, rurki pompy, wymiennik gazowy, kolektory i zawór iglicowy) w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 30 min i złożyć je wewnątrz komory do hodowli komórkowej.</li>
<li>Przetraktować wstępnie i przepłukać rusztowania serią perfuzji (etanol 70, 50 i 25 % przez 1 h, bufor fosforanowy (PBS; Mediatech, Herndon, VA) przez 2 h oraz pożywka hodowlana SMC przez 24 h), używając pompy perystaltycznej z przepływem 1,0 ml/min w obiegu.</li>
</ol>
3. Wysiewanie i hodowla komórek
<ol>
<li>Wyizolować pierwotne komórki mięśni gładkich tętnic (SMCs) z tętnic szyjnych młodych samców pawianów (Papio Anubis) i scharakteryzować je w hodowli dwuwymiarowej (2D) przed pasażowaniem i wysiewaniem zgodnie z wcześniejszym opisem9.</li>
<li>Namnażać SMCs, używając pożywki MCDB 131 (Mediatech, Herndon, VA) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (Lonza, Walkersville, MD), 1% L-glutaminy (Mediatech), 50 μg/ml kwasu askorbinowego (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) oraz roztworu antybiotykowo-antymykotycznego (10 0 IU/ml penicyliny, 10 0 μg/ml streptomycyny i 25 μg/ml amfoterycyny B; Mediatech).</li>
<li>Odłączyć każdą komorę bioreaktora od obwodu przepływowego w bioreaktorze. Wysiać SMCs (pasaż 4-6) na rusztowanie z gęstością 2x106 komórek/cm2, wstrzykując zawiesinę strzykawką o pojemności 5 ml do światła rusztowań po odcięciu przepływów abluminalnego (wlotowego) i luminalnego (wylotowego).</li> 
<li>Umieścić wszystkie komory bioreaktora w inkubatorze do hybrydyzacji w temperaturze 37 °C i obracać je z prędkością 2 rpm przez 4 h, aby umożliwić komórkom równomierne rozprzestrzenienie się w rusztowaniu.</li>
<li>Wyjąć komory bioreaktora z inkubatora do hybrydyzacji i ponownie podłączyć je do obwodu przepływowego bioreaktora w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przenieść cały system bioreaktora do inkubatora do hodowli komórkowych.</li>
<li>Podłączyć przewody pompy (średnica wewnętrzna = 1,6 mm) do głowicy pompy perystaltycznej i napełnić zbiornik świeżą pożywką hodowlaną. Rozpocząć perfuzję przezścienną (z luminalnej na abluminalną) z prędkością 1,0 ml/min przez 15 min, a następnie kontynuować wyłącznie przepływ luminalny.</li> 
<li>Stopniowo zwiększać natężenie przepływu i ciśnienie z 1,0 ml/min (naprężenie ścinające w świetle: 1,1 dynes/cm2) i 20 mmHg w dniu 1. do 14,2 ml/min (15,3 dynes/cm2) i 120 mmHg w dniu 21. Wymienić przewody pompy (średnica wewnętrzna = 3,2 mm) w 4. dniu oraz wymieniać pożywkę raz w tygodniu.</li>
</ol>
4. Pobieranie tkanek i przygotowanie próbek do analizy
<ol>
<li>Po 21-dniowej hodowli zatrzymać pompę i zacisnąć przewody (wlotowy i wylotowy) zbiornika z pożywką. Odłączyć przewody pompy od głowicy pompy perystaltycznej i przenieść system bioreaktora do komory z laminarnym przepływem powietrza.</li>
<li>Zacisnąć przewody wlotowe i wylotowe każdej komory bioreaktora i odłączyć je od obiegu przepływu. Otworzyć przewód wlotowy i przygotować szalkę Petriego przy przewodzie wylotowym w celu zebrania pożywki hodowlanej z wnętrza rurki poliwęglanowej. Powoli otworzyć przewód wylotowy i usunąć pożywkę z komory.</li>
<li>Odłączyć igłę cewnikową abluminalną oraz silikonowy przewód luminalny z komory, a następnie zdjąć płyty aluminiowe po poluzowaniu śrub motylkowych. Wyjąć rurkę poliwęglanową i odłączyć jeden koniec konstruktu tkankowego od przewodu PTFE.</li>
<li>Przygotować szalkę Petriego wypełnioną 10 ml PBS i odłączyć drugi koniec konstruktu od przewodu PTFE. Umieścić konstrukt w PBS i wypłukać trzykrotnie.</li>
<li>Odciąć fragment konstruktu o długości 5 mm za pomocą żyletki. Zamrozić go w zamrażarce do -80 °C w celu przeprowadzenia analizy biochemicznej, przenieść do probówki wirówkowej 15 ml wypełnionej 5 ml świeżej pożywki do testów mechanicznych lub zamrozić gwałtownie w Tissue-Tek optimal cutting temperature compound (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA) do barwienia histologicznego/immunofluorescencyjnego.</li> 
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Rurkowate rusztowania PGS zostały wykonane z biodegradowalnego elastomeru metodą fuzji soli (Rys. 1A). Każda komora bioreaktora zapewniała przepływy zarówno luminalne, jak i abluminalne, a także mogła być odłączana jako oddzielna jednostka od głównego obiegu przepływu (Rys. 1B). System bioreaktora został zaprojektowany do hodowli czterech rusztowań jednocześnie poprzez kontrolowanie i monitorowanie przepływu oraz ciśnienia (Rys. 1C i D). 
Schemat hodowli w bioreaktorze przedstawiono na Rys. 2. Po zasiewie komórek SMC każda komora bioreaktora była obracana w temperaturze 37 °C przez 4 h, aby równomiernie rozprzestrzenić komórki w świetle rusztowania. Następnie do rusztowań stosowano przepływ pulsacyjny do 14. dnia, stopniowo zwiększając szybkość przepływu (Rys. 2A) oraz ciśnienie (Rys. 2B). Po 14. dniu przepływ i ciśnienie utrzymywano na stałym poziomie do końca hodowli (dzień 21).
Morfologię powierzchni rusztowania PGS zbadano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Mikrografie elektronowe wykazały, że rusztowanie posiadało jednorodną grubość ścianek (539 ± 18 μm) (Rys. 3A) oraz losowo rozmieszczone makro- i mikropory na powierzchni luminalnej (Rys. 3B). Parametry morfometryczne rusztowania zmierzono za pomocą mikrotomografii komputerowej (micro-CT) oraz analizy obrazu. Średnia wielkość porów wynosi 23,3 ± 3,9 μm, a ich wzajemna łączność to 9,4 ± 0,62 %, co oznacza, że wszystkie pory w rusztowaniu są w pełni połączone. Porowatość zmierzona metodą wypierania etanolu wynosi 75,6 ± 2,7 %.
Morfologię komórkową konstruktu PGS badano za pomocą SEM (Rys. 4). Wielowarstwowe SMC całkowicie pokrywały powierzchnię luminalną i były zorientowane prostopadle do kierunku przepływu. Wyniki te pokazują, że warunkowanie mechaniczne w bioreaktorze z przepływem pulsacyjnym sprzyja orientacji SMC w rusztowaniu.
Obecność macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) oraz włókien elastycznych zbadano za pomocą barwienia H&amp;E oraz autofluorescencji elastyny (Rys. 5). Barwienie H&amp;E wykazało, że komórki i białka ECM całkowicie pokrywały światło konstrukcji z PGS. Autofluorescencja elastyny wykazała również obecność obwodowo zorganizowanych włókien elastycznych na powierzchni luminalnej konstrukcji. Produkcja białek ECM w konstrukcjach z PGS została zmierzona za pomocą analiz biochemicznych. Zawartość nierozpuszczalnej elastyny i kolagenu wynosiła odpowiednio 20,2 ± 9,1 μg/mg tkanki oraz 6,3 ± 1,9 μg/mg tkanki.
<img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig1.jpg" alt="Schemat wytwarzania rusztowania polimerowego i konfiguracje sprzętowe: proces utwardzania, montaż materiałów, analiza danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Wytwarzanie rusztowania i system bioreaktora. (A) Schemat wytwarzania rusztowania rurkowego. (B) Komora bioreaktora. Rusztowania podłączono do rurek PTFE, umieszczono w rurce z poliwęglanu i zamocowano za pomocą silikonowych korków oraz płyt ze stopu aluminium. Każda komora posiada dwie ścieżki przepływu: przepływ luminalny (poprzez rurkę silikonową) i abluminalny (poprzez igłę). (C) System bioreaktora umieszczony wewnątrz inkubatora. Obejmuje on zbiornik na medium, moduł pompy perystaltycznej, wymiennik gazowy, przetworniki ciśnienia, dwa rozdzielacze (górny i dolny) oraz zawór iglicowy. (D) System bioreaktora umieszczony na zewnątrz inkubatora. Obejmuje on monitor ciśnienia, jednostkę kontroli przepływu, system akwizycji danych oraz komputer.
<img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig2.jpg" alt="Schemat eksperymentu przepływu pulsacyjnego, oś czasu wzrostu, wykresy ciśnienia (dzień 1, 4, 7, 14) do analizy przepływu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schemat hodowli w bioreaktorze. (A) Protokół hodowli. (B) Profile przyłożonego ciśnienia w poszczególnych punktach czasowych (dzień 1, 4, 7 i 14). 
<img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig3.jpg" alt="Obrazy z mikroskopu elektronowego; panel A przedstawia przekrój materiału kompozytowego, panel B szczegóły struktury porowatej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3. Morfologia powierzchni rusztowania PGS. (A) Przekrój poprzeczny. (B) Prześwit. 
<img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig4.jpg" alt="Mikrografia z elektronowego mikroskopu skaningowego, analiza powierzchni materiału, porównanie morfologii strukturalnej, duże powiększenie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Morfologia komórkowa konstrukcji PGS. (A) Lumen. (B) Przekrój poprzeczny 45° przekrój. Strzałki na obu rycinach reprezentują kierunek przepływu.
<img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig5.jpg" alt="Analiza histologiczna, porównanie mikroskopowe, barwione i znakowane fluorescencyjnie przekroje tkanek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Histo- i autofluorescencja elastyny w konstrukcie PGS. (A) H&amp;Barwienie E. (B) Odpowiadająca autofluorescencja elastyny. L: światło naczynia. Powiększenie: 40X. Pasek skali: 50 μm.

<ol><li>The American Heart Association Statistics Committee Stroke Statistics Subcommittee. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((American+Heart+Association%3A+Heart+disease+and+stroke+statistics-2009+update%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">American Heart Association: Heart disease and stroke statistics-2009 update.</a> Circulation. 119, 480-486 (2009).</li>
<li>Isenberg, B. C., Williams, C., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-diameter+artificial+arteries+engineered+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Small-diameter artificial arteries engineered in vitro.</a> Circ Res. 98, 25-35 (2006).</li>
<li>Conte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ideal+small+arterial+substitute%3A+a+search+for+the+Holy+Grail%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The ideal small arterial substitute: a search for the Holy Grail.</a> FASEB J. 12, 43-45 (1998).</li>
<li>Wang, X., Lin, P., Yao, Q., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+small-diameter+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Development of small-diameter vascular grafts.</a> World J Surg. 31, 682-689 (2007).</li>
<li>L'Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+biological+tissue-engineered+human+blood+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A completely biological tissue-engineered human blood vessel.</a> FASEB J. 12, 47-56 (1998).</li>
<li>Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+arteries+grown+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional arteries grown in vitro.</a> Science. 284, 489-493 (1999).</li>
<li>Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tough+biodegradable+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A tough biodegradable elastomer.</a> Nat Biotechnol. 20, 602-606 (2002).</li>
<li>Crapo, P. M., Gao, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seamless+tubular+poly%28glycerol+sebacate%29+scaffolds%3A+high-yield+fabrication+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Seamless tubular poly(glycerol sebacate) scaffolds: high-yield fabrication and potential applications.</a> J Biomed Mater Res A. 86, 354-363 (2008).</li>
<li>Gao, J., Ensley, A. E., Nerem, R. M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28glycerol+sebacate%29+supports+the+proliferation+and+phenotypic+protein+expression+of+primary+baboon+vascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Poly(glycerol sebacate) supports the proliferation and phenotypic protein expression of primary baboon vascular cells.</a> J Biomed Mater Res A. 83, 1070-1075 (2007).</li>
<li>Murphy, W. L., Dennis, R. G., Kileny, J. L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+fusion%3A+an+approach+to+improve+pore+interconnectivity+within+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Salt fusion: an approach to improve pore interconnectivity within tissue engineering scaffolds.</a> Tissue Eng. 8, 43-52 (2002).</li>
<li>Gao, J., Crapo, P. M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroporous+elastomeric+scaffolds+with+extensive+micropores+for+soft+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Macroporous elastomeric scaffolds with extensive micropores for soft tissue engineering.</a> Tissue Eng. 12, 917-925 (2006).</li>
<li>Wilson, E., Mai, Q., Sudhir, K., Weiss, R. H., Ives, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+strain+induces+growth+of+vascular+smooth+muscle+cells+via+autocrine+action+of+PDGF%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical strain induces growth of vascular smooth muscle cells via autocrine action of PDGF.</a> J Cell Biol. 123, 741-747 (1993).</li>
<li>Leung, D. Y., Glagov, S., Mathews, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+stretching+stimulates+synthesis+of+matrix+components+by+arterial+smooth+muscle+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cyclic stretching stimulates synthesis of matrix components by arterial smooth muscle cells in vitro.</a> Science. 191, 475-477 (1976).</li>
<li>Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+strain+regulates+the+development+of+engineered+smooth+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue.</a> Nat Biotechnol. 17, 979-983 (1999).</li>
<li>Yang, J., Motlagh, D., Webb, A. R., Ameer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+biphasic+elastomeric+scaffold+for+small-diameter+blood+vessel+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Novel biphasic elastomeric scaffold for small-diameter blood vessel tissue engineering.</a> Tissue Eng. 11, 1876-1886 (2005).</li>
<li>Stankus, J. J., Soletti, L., Fujimoto, K., Hong, Y., Vorp, D. A., Wagner, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+cell+microintegrated+blood+vessel+constructs+through+electrohydrodynamic+atomization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of cell microintegrated blood vessel constructs through electrohydrodynamic atomization.</a> Biomaterials. 28, 2738-2746 (2007).</li>
<li>Nieponice, A., Soletti, L., Guan, J., Deasy, B. M., Huard, J., Wagner, W. R., Vorp, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+tissue-engineered+vascular+graft+combining+a+biodegradable+scaffold%2C+muscle-derived+stem+cells+and+a+rotational+vacuum+seeding+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of a tissue-engineered vascular graft combining a biodegradable scaffold, muscle-derived stem cells and a rotational vacuum seeding technique.</a> Biomaterials. 29, 825-833 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Technika wytwarzania z wykorzystaniem biodegradowalnego elastomeru opisana w niniejszej pracy posiada kilka charakterystycznych cech. (1) Jako środek oddzielający od formy zastosowano kwas hialuronowy (HA). Ponieważ HA jest rozpuszczalny w wodzie, rusztowanie można było łatwo oddzielić od szklanej formy po namoczeniu w wodzie. W niniejszym raporcie użyto roztworu HA o stężeniu 1,0 wt/vol %, ponieważ roztwory o niskim stężeniu (&lt; 0,5 wt/vol %) nie są lepkie i spływają zbyt szybko podczas wlewania ich na szklaną rurkę. Aby równomiernie pokryć rurkę roztworem HA, obracano szklaną rurkę, gdy roztwór spływał na jej dno, i powtarzano ten krok. Powłoka z HA jest krytycznym elementem procedury wytwarzania w kontekście uwalniania gotowych rusztowań. (2) Do utrzymania soli w szklanej rurce zastosowano termokurczliwą (HS) tulejkę. Ponieważ sole były gęsto upakowane w przestrzeni między wewnętrzną ścianką szklanej rurki a tulejką HS, tulejka ta utrzymywała sole po usunięciu trzpienia i pierścienia PTFE z dna rurki. Tulejkę HS można było łatwo usunąć, umieszczając formę w piecu w temperaturze 120 °C przez 5 min, otrzymując w ten sposób rurkowe matryce solne. (3) Zastosowano metodę fuzji soli. Jest dobrze znane, że metoda fuzji soli może poprawić łączność porów oraz właściwości mechaniczne poprzez zmianę czasu fuzji10. Ponadto, dzięki zastosowaniu PGS, makropory powstawały wskutek obecności cząstek soli podczas procesu ługowania, natomiast mikropory prawdopodobnie generowały się w wyniku parowania glicerolu podczas sieciowania PGS, co opisano wcześniej11. Zatem metoda ta daje możliwość wytwarzania porowatych rurkowych rusztowań o różnych makro- i mikrostrukturach poprzez zmianę rodzaju cząstek soli oraz warunków sieciowania PGS.
Warunkowanie mechaniczne w bioreaktorze zapewniło perfuzję z przepływem pulsującym (maksymalny średni przepływ = 14 ml/min, maksymalne naprężenie ścinające = 15,3 dyne/cm2, częstotliwość = 0,5 - 1,7 Hz) oraz fizjologicznie istotne ciśnienie w rusztowaniu PGS, co doprowadziło do wzrostu i orientacji SMC (Rys. 4). Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi badaniami wskazującymi, że cykliczne rozciąganie przy tej częstotliwości oraz naprężenie ścinające zwiększają proliferację SMC12 oraz produkcję białek ECM13,14. Oprócz wzrostu i orientacji SMC, konstrukcja z PGS wspierała produkcję białek ECM, w szczególności obwodowo zorganizowanych włókien elastycznych (Rys. 5) w ciągu 3-tygodniowej hodowli w bioreaktorze. Niektóre badania wykorzystujące elastomerowe rusztowanie jako konstrukcję tętnicy o małej średnicy wykazały wytrzymałość mechaniczną i ciśnienie rozrywania porównywalne z tętnicami natywnymi15 oraz szybką integrację SMC w elastycznych rusztowaniach z użyciem kolby z mieszadłem16,17, przy czym w tych konstrukcjach nie stwierdzono obecności włókien elastycznych. Nasze wyniki sugerują, że cykliczne rozszerzanie radialne w bioreaktorze skuteczniej poprawiło transdukcję sygnałów mechanicznych do SMC w rusztowaniu PGS, co prawdopodobnie przyczyniło się do syntezy i organizacji elastyny.
Ponieważ w naszym podejściu naczyniowe SMC były jedynymi komórkami produkującymi białka ECM, spoczynkowe śródbłonie oraz poprawa wytrzymałości mechanicznej są niezbędne do opracowania klinicznie skutecznych konstruktów tętniczych o małej średnicy. Wykazaliśmy, że komórki śródbłonka współhodowane z SMC tworzyły konfluentną monowarstwę i wspierały ekspresję białek fenotypowych w naszych warunkach hodowli oraz kondycjonowania mechanicznego9. W związku z tym, w oparciu o opisane tutaj podejście, modyfikacja warunków eksperymentu współhodowli byłaby kolejnym krokiem w celu poprawy funkcji otrzymanych konstruktów oraz wytworzenia nietrombogenicznego, wytrzymałego i podatnego konstruktu tętniczego, podobnego do tętnic natywnych.

<table><tbody><tr><td>Sód kwasu hialuronowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7630</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>15-100-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Lonza Inc.</td><td>BW14-502F</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-005-CV</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A62-500</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotyk-antymykotyk</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowo-buforowana sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek optimal cutting temperature compound, 4583</td><td>Sakura Finetek</td><td>25608-930</td><td></td></tr></tbody></table>

elastomeryczne rusztowania pgs w inżynierii tkanki tętniczej

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Choroby układu sercowo-naczyniowego są jedną z głównych przyczyn śmiertelności w USA, a w szczególności choroba wieńcowa nasila się wraz ze starzeniem się populacji i rosnącym wskaźnikiem otyłości1. Obecnie w powszechnym użyciu jako zamienniki tętnic znajdują się operacje pomostowania z wykorzystaniem naczyń autologicznych, allograftów oraz graftów syntetycznych2. Jednakże zastosowanie tych graftów jest ograniczone w przypadku tętnic o średnicy wewnętrznej mniejszej niż 6 mm ze względu na niską dostępność, powikłania zakrzepowe, niedopasowanie podatności oraz późną hiperplazję intimy3,4. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, inżynieria tkankowa została z powodzeniem zastosowana jako obiecująca alternatywa w opracowywaniu małymi średnicą konstruktów tętniczych, które są nietrombogenne, wytrzymałe i podatne. W kilku poprzednich badaniach opracowano małymi średnicą konstrukty tętnicze o strukturze trójwarstwowej, doskonałych właściwościach mechanicznych i ciśnieniu rozrywania porównywalnym z tętnicami natywnymi5,6. Mimo uzyskania wysokiej wytrzymałości na rozciąganie i wysokiego ciśnienia rozrywania poprzez zwiększenie produkcji kolagenu z sztywnego materiału lub rusztowania z arkuszy komórkowych, konstrukty te wciąż charakteryzowały się niską produkcją elastyny i niską podatnością, co stanowi główny problem prowadzący do niepowodzenia graftu po implantacji. Biorąc pod uwagę te kwestie, postawiliśmy hipotezę, że biomateriał elastomeryczny w połączeniu z kondycjonowaniem mechanicznym zapewni elastyczność i będzie efektywniej przekazywać sygnały mechaniczne do komórek naczyniowych, co zwiększy produkcję macierzy pozakomórkowej i wesprze orientację komórkową.
Celem niniejszego raportu jest przedstawienie techniki wytwarzania porowatych rusztowań rurkowatych oraz dynamicznego warunkowania mechanicznego w celu ich zastosowania w inżynierii tkankowej tętnic. Do wytworzenia porowatych rusztowań rurkowatych metodą fuzji soli wykorzystaliśmy biodegradowalny elastomer, poli(sebacjan glicerolu) (PGS)7. Pierwotne komórki mięśni gładkich (SMCs) pobrane od dorosłych pawianów zasiano w świetle rusztowań, które następnie inkubowano w zaprojektowanym przez nas bioreaktorze z przepływem pulsującym przez 3 tygodnie. Rusztowania z PGS charakteryzowały się jednorodną grubością oraz losowo rozmieszczonymi makro- i mikroporami. Warunkowanie mechaniczne w bioreaktorze z przepływem pulsującym wspierało orientację SMC i zwiększało produkcję ECM w rusztowaniach. Wyniki te sugerują, że rusztowania elastomerowe oraz warunkowanie mechaniczne w hodowli bioreaktorowej mogą stanowić obiecującą metodę w inżynierii tkankowej tętnic.

Elastomeryczne rusztowania PGS z hodowanymi komórkami mięśni gładkich naczyń w bioreaktorze z przepływem pulsacyjnym mogą prowadzić do uzyskania obiecujących konstruktów tętniczych o małej średnicy z produkcją natywnej ECM w stosunkowo krótkim okresie hodowli.

Elastomeryczne rusztowania PGS w inżynierii tkanki tętniczej

Choroby układu sercowo-naczyniowego są jedną z głównych przyczyn śmiertelności w USA, a w szczególności choroba wieńcowa, której częstotliwość występowania rośnie wraz ze starzeniem się populacji i ...

Niniejszy film prezentuje sposób wytwarzania porowatych rusztowań rurkowatych oraz poddawania ich dynamicznemu warunkowaniu mechanicznemu w celu inżynierii tkanki tętniczej. Proces ten rozpoczyna się od wytworzenia rusztowań przy użyciu biodegradowalnego elastomeru i metody fuzji termicznej. Następnie rusztowania są przygotowywane do zasiewu komórek i montowane w systemie bioreaktora.W bioreaktorze komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych zasiewają rusztowania, a następnie są hodowane. Po kilku tygodniach tkanka jest pobierana i analizowana przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej, barwienia H&amp;E oraz autofluorescencji elastyny. Powstały mięsień gładki jest wielowarstwowy i zorientowany prostopadle.Główną zaletą tej techniki, podobnie jak w przypadku odbarwiania cząsteczkowego, jest wykorzystanie szklanej formy do wytwarzania porowatego rusztowania rurkowego z kwasu hialuronowego. Po usunięciu formy, rusztowanie zostaje przygotowane z odcinka rurki szklanej. Umieść rurkę w uchwycie i wlej do niej przygotowany dzień wcześniej roztwór kwasu hialuronowego.Kwas hialuronowy powoli spływa po wewnętrznej ściance. Gdy dotrze on do dna formy, należy obrócić formę. Powtarzaj ten krok, aż wewnętrzna ścianka formy zostanie równomiernie pokryta roztworem.Po nałożeniu powłoki wysuszyć wszystkie przygotowane formy szklane w suszarce próżniowej w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Zazwyczaj przygotowuje się cztery formy jednocześnie podczas suszenia form szklanych. Przygotować porcje cząstek soli, mieląc i przesiewając cząstki soli do rozmiaru od 25 do 32 µm.Następnego dnia zmontuj przygotowany trzpień szklanej formy, rurkę PTFE, rurkę termokurczliwą oraz pierścień PTFE. Najpierw włóż trzpień do 65 milimetrowych odcinków rurki PTFE i wypiecz je w temperaturze 120 °C przez pięć minut. Aby obkurczyć PTFE, w czasie oczekiwania wstępnie podgrzej inkubator do hybrydyzacji do 37 °C przez co najmniej 30 minut.Po opasaniu trzpieni rurką, nasuń rurkę termokurczliwą na trzpień tak, aby poruszała się swobodnie. Następnie umieść trzpień w szklanej formie i przymocuj pierścień A-P-T-F-E do dolnej części trzpienia. Sprawdź, czy pierścień PTFE ściśle przylega do dna szklanej formy.Następnie, używając szpatułki i lejka z gumy silikonowej, należy wprowadzić zawiesinę cząsteczek soli do szklanej formy. Następnie delikatnie opukać formę szpatułką w celu równomiernego rozłożenia cząsteczek i zebrać nadmiar soli. Teraz należy wyłączyć podgrzewany inkubator i szybko włożyć do niego wypełnione solą formy; sól spoi się w ciągu kolejnych 30 minut, po czym formy należy suszyć w piecu próżniowym w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.Następnego dnia, po schłodzeniu, wyjmij stalowy trzpień z form, wypychając go przy jednoczesnym przytrzymaniu pierścienia z PTFE. W razie potrzeby użyj szczypiec półokrągłych. Następnie zdejmij pierścień z PTFE z dna formy.Następnie wypiecz formy, aby obkurczyć tulejkę, a następnie wyjmij obkurczone tulejki z form. Pozostaw formy do ostygnięcia przed kolejnym użyciem i przechowuj je w eksyكاته w dygestorium. Używając pipety, przechyl szklane formy pod kątem 45 stopni i wlewaj roztwór PGS do ich wewnętrznego światła, powoli obracając formę.Sprawdzić, czy roztwór PGS spływa po ściance formy. W przypadku wystąpienia suchych miejsc należy dodać więcej PGS. Następnie pozwolić THF odparować w dygestorium przez co najmniej 30 minut. Po całkowitym odparowaniu THF formy należy utwardzić w piecu próżniowym.Po jednodniowym utwardzaniu schłodzić formy do temperatury pokojowej, a następnie powoli, w pionie, zanurzyć je w wodzie dejonizowanej o temperaturze 24°C. Zbyt szybkie pochylanie form powoduje powstawanie pęcherzyków powietrza, które rozrywają rusztowanie. Ostrożnie przenieść formy do łaźni wodnej.Ustaw je pod kątem, używając rurki silikonowej, i pozostaw kwas hialuronowy do rozpuszczenia przez godzinę. Jeśli po godzinie kwas hialuronowy nie oddzielił się od formy, to przy zachowaniu zanurzenia formy należy za pomocą szpatułki powoli wypchnąć kwas hialuronowy z obu końców, a następnie powoli potrząsnąć formą. Następnie należy sprawdzić, czy rusztowania nie przesunęły się wewnątrz szklanej formy; jeśli tak, należy powoli wyciągnąć rusztowanie pęsetą, aby uwolnić je z formy.Następnie wypłucz cząsteczki soli, ostrożnie przenosząc delikatne rusztowania do kąpieli z wodą dejonizowaną przy łagodnym mieszaniu. Proces ten potrwa co najmniej trzy dni i wymaga codziennej wymiany wody. Po całkowitym wypłukaniu soli przenieś każde rusztowanie do probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów wypełnionej wodą dejonizowaną i zamroź je w pojemniku z suchym lodem przez jedną godzinę. Umieść zamrożone probówki wirówkowe w liofilizatorze na trzy dni z otwartymi nakrętkami.Po liofilizacji przechowywać rusztowania w eksykatorze do momentu ich użycia. Należy rozpocząć od pocięcia rusztowań na odcinki o długości od 25 do 30 milimetrów. Następnie przygotować dwa silikonowe korki, przekładając rurkę PTFE przez otwory środkowe każdego z korków.Następnie odciąć odcinki pierścienia kurczliwego (HS) o długości 1,5 mm i nasunąć jeden z nich na jeden koniec rusztowania. Wsunąć rurkę PTFE przymocowaną do korka w ten sam koniec rusztowania, z zachowaniem wystarczającego nakładania się, aby znajdowała się pod pierścieniem HS, co zapewni trwałe połączenie rusztowania z rurką; skurczyć pierścień HS w piekarniku i pozwolić całemu zestawowi ostygnąć do temperatury pokojowej. Teraz na rusztowanie nasuwa się poliwęglanową rurkę o długości 50 mm, która pełni funkcję komory bioreaktora, a następnie mocuje ją na wewnętrznej powierzchni korka z gumy silikonowej.Podobnie jak wcześniej, drugi wężyk PTFE i korek zostają zamocowane na drugim końcu rusztowania za pomocą pierścienia hs, aby domknąć komorę. Drugi korek zostaje przymocowany do drugiego końca rurki z poliwęglanu. Następnie zewnętrzne powierzchnie korków zostają przytwierdzone do dwóch płyt ze stopu aluminium.Wprowadź dwie gwintowane pręty do otworu bocznego w każdej płytce i zabezpiecz płytki śrubami motylkowymi. Przymocuj rusztowanie do bioreaktora. Następnie zmierz widoczną długość każdego rusztowania, która jest odległością między dwoma pierścieniami hs, i oblicz ich wewnętrzne powierzchnie.Do wysiewu komórek. W autoklawie wysterylizuj komory, z których każda powinna być indywidualnie zawinięta w folię, wraz z każdą częścią jednostki bioreaktora. Po sterylizacji zmontuj bioreaktor wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza.Poddaj rusztowanie wstępnej obróbce i przemyj je za pomocą serii perfuzji, wykorzystując pompę perystaltyczną przy prędkości przepływu 1 mm/min w obiegu. Rozpocznij od płukania 70% etanolem, 50% etanolem, a następnie 25% etanolem przez jedną godzinę dla każdego roztworu. Po trzech płukaniach etanolem przeprowadź dwugodzinne płukanie w PBS.Na koniec przeprowadź perfuzję bioreaktora pożywką do hodowli SMC przez 24 godziny, po czym będzie on gotowy do zasiewu komórek i prowadzenia eksperymentów. Następnie, zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym manuskrypcie, zasiej bioreaktor w zagęszczeniu 2 milionów komórek na centymetr kwadratowy, a przez kolejne 21 dni wymieniaj pożywkę w przewodach i koryguj prędkość pompy. Stopniowo ciśnienie w konstrukcie wzrośnie z około 4 mmHg w pierwszym dniu hodowli do ponad 100 mmHg po dwóch tygodniach hodowli; po trzech tygodniach hodowli zbierz komórki i przygotuj je do analizy zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie.Te rurkowate rusztowania z PGS zostały wykonane metodą fuzji soli. Mikrografie z pomiarów skaningowego mikroskopu elektronowego wykazały, że wszystkie rusztowania posiadały jednorodną grubość ścianek i nie stwierdzono częściowych defektów w ich przekrojach poprzecznych. Na powierzchni luminalnej wszystkich rusztowań zaobserwowano losowo rozmieszczone makropory i mikropory.Po hodowli komórkowej wielowarstwowe SMC rosły w orientacji prostopadłej do kierunku przepływu. Co więcej, komórki i białka DCM całkowicie pokryły światło wszystkich konstruktów PGS. Autofluorescencja elastyny wykazała również obwodowo zorganizowane włókna elastyczne na powierzchni luminalnej konstruktu.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak przygotować porowaty rusztowanie rurkowe, zaobserwować komórki oraz hodować rusztowanie z wykorzystaniem specjalnie zaprojektowanego bioreaktora.

elastomeric-pgs-scaffolds-in-arterial-tissue-engineering

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Elastomerowe rusztowani PGS w inżynierii tkankowej tętnic

Nasz zespół opracował system hodowli w bioreaktorze, który naśladuje fizjologiczne naprężenia pulsacyjne układu sercowo-naczyniowego w celu regeneracji wszczepialnych zastążek naczyniowych o małej średnicy.

Projektowanie biologicznych przeszczepów naczyniowych z wykorzystaniem bioreaktora pulsacyjnego

Niniejszy protokół koncentruje się na wykorzystaniu naturalnej zdolności komórek macierzystych do reagowania na sygnały z otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej i indukowania ich różnicowania w wiele fenotypów. Niniejszy artykuł metodologiczny rozszerza nasz opis i charakterystykę modelu wykorzystującego dwuwarstwowy hydrożel, składający się z PEG-fibryny i kolagenu, do jednoczesnego współróżnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej1.

Projektowanie dwuwarstwowego hydrożelu w celu kontrolowania różnicowania ASC

Zgłoszono syntezę i wytwarzanie długich włókien elektroprzędzionych obejmujących większy obszar złoża za pomocą nowo zaprojektowanego kolektora z nowego biodegradowalnego polimeru o nazwie poli(dodekanian glicerolu) (PGD). Włókna były w stanie wspierać wzrost komórek pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych myszy.

Elektroprzędzone rusztowania włókniste z poli(dodekanodianu glicerolu) do inżynierii tkanek nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

Rusztowania dla inżynierii tkankowej muszą podsumować złożone biochemiczne i biofizyczne mikrośrodowisko niszy komórkowej. W tym miejscu pokazujemy zastosowanie międzyfazowych włókien kompleksowania polielektrolitów jako platformy do tworzenia kompozytowych, wieloskładnikowych rusztowań polimerowych o przedłużonym uwalnianiu biochemicznym.

Rusztowania kompozytowe z międzyfazowych włókien polielektrolitowych do czasowo kontrolowanego uwalniania biomolekuł

Przygotowano rusztowanie do wstrzykiwań inżynierii tkankowej składające się z mikrocząsteczek poli(N-izopropylacrylamidu)-siarczanu chondroityny (PNIPAAm-g-CS)-zawierającego poli(N-izopropylacrylamid). W tym badaniu analizowana jest siła adhezji, właściwości pęcznienia i biokompatybilność in vitro. Opracowane tutaj techniki charakterystyki mogą mieć zastosowanie do innych systemów termożelowania.

Synteza termożelujących kompozytów siarczanowych poli(N-izopropylacyloamidu)-grafto-chondroityny z mikrocząstkami alginianowymi dla inżynierii tkankowej

W tej pracy, rusztowania z poli(kwasu mlekowego)/glikolu polietylenowego (PLA/PEG) zostały przygotowane przy użyciu kombinacji mieszania stopionego i selektywnego ługowania. Omawiana tu metoda pozwoliła na opracowanie rusztowań trójwarstwowych poprzez ścisłą kontrolę zarówno porowatości, jak i wielkości porów. Właściwości mechaniczne oceniano również w środowisku fizjologicznym.

Łatwa i przyjazna dla środowiska metoda wytwarzania rusztowań z poli(kwasu mlekowego) o stopniowanej wielkości porów

Opisano tutaj krok po kroku protokół do nieniszczącego i długoterminowego monitorowania procesu przebudowy naczyń krwionośnych i degradacji rusztowań w czasie rzeczywistym biodegradowalnych naczyń krwionośnych opartych na polimerowych rusztowaniach z pulsacyjną stymulacją za pomocą optycznej koherentnej tomografii.

Nieniszczące monitorowanie rozwoju naczyń krwionośnych opartych na degradowalnych rusztowaniach za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Prezentowany tutaj jest prosty w użyciu, trójwymiarowy zestaw do biodruku z rdzeniem/powłoką, do jednoetapowego wytwarzania pustych rusztowań, odpowiedni do inżynierii tkankowej naczyń krwionośnych i innych struktur rurowych.

Rusztowania drukarskie rdzeniowe / skorupowe do inżynierii tkankowej struktur rurowych

Rekonstrukcja przełyku jest wymagającą procedurą, a opracowanie inżynierii tkankowej przełyku, która umożliwia regenerację błony śluzowej i mięśni przełyku i która może być wszczepiona jako sztuczny przeszczep, jest konieczna. Tutaj przedstawiamy nasz protokół generowania sztucznego przełyku, w tym produkcję rusztowań, hodowlę bioreaktorów i różne techniki chirurgiczne.

Przeszczep inżynierii tkankowej do obwodowej rekonstrukcji przełyku u szczurów

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie dynamicznej ko-hodowli ludzkich makrofagów i miofibroblastów w rurowych rusztowaniach elektroprzędzonych w celu zbadania regeneracji tkanek sterowanej materiałem, przy użyciu bioreaktora, który umożliwia oddzielenie naprężeń ścinających od cyklicznego rozciągania.

Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

Naucz się tworzyć porowate rusztowania rurowe z biodegradowalnych elastomerów do inżynierii tętniczej. Ta metoda wykorzystuje dynamiczne warunkowanie mechaniczne w bioreaktorze przepływowym z komórkami mięśniówki gładkiej naczyń krwionośnych.

Elastomeryczne rusztowania PGS w inżynierii tkanki tętniczej

Przeglądaj więcej filmów