Elastomerowe rusztowania PGS w inżynierii tkanek tętniczych
8 kwietnia 2011
Elastomerowe rusztowania PGS z komórkami mięśni gładkich naczyń krwionośnych hodowanymi w pulsacyjnym bioreaktorze przepływowym mogą prowadzić do powstania obiecujących konstruktów tętniczych o małej średnicy z natywną produkcją ECM w stosunkowo krótkim okresie hodowli.
Ten film pokazuje, jak wytwarzać porowate rusztowania rurowe i poddawać je dynamicznemu kondycjonowaniu mechanicznemu w celu inżynierii tkanek tętniczych. Osiąga się to poprzez najpierw wytworzenie rusztowań przy użyciu biodegradowalnego elastomeru i metody fuzji szturmowej. Rusztowania są następnie przygotowywane do wysiewu komórek i montowane w systemie bioreaktora.
W bioreaktorze komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych tworzą nasiona rusztowań i są hodowane. Kilka tygodni później tkanka jest pobierana i analizowana za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, barwienia h i e oraz autofluorescencji elastyny. Powstałe mięśnie gładkie są zarówno wielowarstwowe, jak i zorientowane prostopadle.
Główną zaletą tej techniki, podobnie jak wybielanie cząstek stałych, jest użycie szklanej formy do wytworzenia porowatego rusztowania rurowego i kwasu hialuronowego. Gdy forma usuwa, forma rusztowania jest przygotowywana z kawałka szklanej rurki. Umieść rurkę w uchwycie i wlej do niej przygotowany dzień wcześniej roztwór kwasu hialuronowego.
Kwas hialuronowy spływa powoli w dół wzdłuż wewnętrznej ściany. Gdy dotrze do dna formy, odwróć foremkę. Powtarzaj ten krok, aż wewnętrzna ściana formy zostanie równomiernie pokryta roztworem.
Po pokryciu wszystkie przygotowane formy szklane wysuszyć w piecu próżniowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Zazwyczaj cztery formy są przygotowywane jednocześnie, podczas gdy szklane formy wysychają. Przygotuj cząstki soli wylewane, miel i SVE cząstki soli do 25 do 32 mikrometrów.
Następnego dnia zmontuj przygotowany trzpień formy szklanej, rurkę PTFE, tuleję termokurczliwą i pierścień PTFE. Najpierw załaduj trzpień do rurki PTFE o długości 65 milimetrów i piecz je w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez pięć minut. Aby obkurczyć PTFE w oczekiwaniu przedwojennego inkubatora hybrydyzacyjnego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut.
Gdy rurka otoczy trzpienie, wciśnij tuleję termokurczliwą na trzpień, aby poruszała się swobodnie. Następnie umieść trzpień w szklanej formie i przymocuj pierścień A-P-T-F-E do dolnej części trzpienia. Sprawdź, czy pierścień PTFE jest dobrze dopasowany do dna szklanej formy.
Następnie za pomocą szpatułki i lejka z gumy silikonowej dodaj kaszki z cząstkami soli do szklanej formy. Następnie delikatnie postukaj szpatułką w foremkę, aby równomiernie rozprowadzić cząsteczki i zeskrob nadmiar soli. Teraz wyłącz rozgrzany inkubator i szybko go załaduj Dzięki foremkom wypełnionym solą sól połączy się w ciągu najbliższych 30 minut, po czym wysusz formy w piekarniku próżniowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.
Następnego dnia po schłodzeniu wyjmij trzpień ze stali nierdzewnej z form, wypychając go jednocześnie zabezpieczając pierścień PTFE. W razie potrzeby użyj szczypiec półpłaskich. Następnie zdejmij pierścień PTFE z dna formy.
Następnie upiecz foremki, aby obkurczyć rękaw i usuń skurczone rękawy z foremek. Pozwól foremkom ostygnąć, aż zostaną użyte i przechowuj je w osuszaczu w okapie. Za pomocą zakraplacza apo ustaw szklane formy pod kątem 45 stopni i wrzuć roztwór PGS do ich wewnętrznego światła, powoli obracając formę.
Sprawdź, czy roztwór PGS spływa wzdłuż ścianki formy. Jeśli jest suche miejsce, dodaj więcej PGS Teraz pozwól THF odparować w okapie przez co najmniej 30 minut. Gdy THF zniknie, utwardź formy w piecu próżniowym.
Po utwardzeniu przez jeden dzień schłodzić foremki do temperatury pokojowej i powoli, pionowo zanurzyć je w dejonizowanej wodzie o temperaturze 24 stopni Celsjusza. Zbyt szybkie ich przechylanie tworzy pęcherzyki powietrza, które rozrywają rusztowanie. Ostrożnie przenieś foremki do łaźni wodnej.
Ustaw je pod kątem za pomocą silikonowej rurki i pozwól kwasowi hialuronowemu rozpuścić się w ciągu godziny. Jeśli po godzinie kwas hialuronowy nie uwolni się z formy, to gdy pleśń jest nadal zanurzona, użyj szpatułki, aby powoli odepchnąć kwas hialuronowy z obu końców, a następnie powoli potrząśnij formą. Teraz sprawdź, czy rusztowania nie przesunęły się wewnątrz szklanej formy, a jeśli tak, powoli pociągnij rusztowanie kleszczami, aby uwolnić je z formy.
Następnie wypłucz cząsteczki soli, ostrożnie przenosząc delikatne rusztowania do dejonizowanej łaźni wodnej, delikatnie mieszając. Zajmie to co najmniej trzy dni i wymaga codziennej wymiany wody Po wypłukaniu całej soli przenieś każde rusztowanie do 15-mililitrowej probówki wirówkowej wypełnionej wodą dejonizowaną i zamroź je w pojemniku z suchym lodem na godzinę. Umieść zamrożone probówki wirówkowe w liofilizatorze na trzy dni z otwartymi nakrętkami.
Po zamrożeniu rusztowania przechowuj w suchym pojemniku do czasu ich użycia. Zacznij od przycięcia rusztowań na długości od 25 do 30 milimetrów. Następnie przygotuj dwa korki z gumy silikonowej, wprowadzając rurkę PTFE przez środkowe otwory każdego korka.
Następnie odetnij półtoramilimetrowy odcinek pierścienia hs i nasuń odcinek na jeden koniec rusztowania. Wsuń jedną rurkę PTFE przymocowaną do korka na ten sam koniec rusztowania tak, aby zachodziła na siebie na tyle tak, aby znalazła się pod pierścieniem HS, aby mocno połączyć rusztowanie z rurką, skurczyć pierścień HS w piekarniku i pozostawić zespół do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Teraz 50-milimetrowa rurka z poliwęglanu, która pełni funkcję komory bioreaktora, jest nasunięta na rusztowanie i zabezpieczona na wewnętrznej powierzchni korka z gumy silikonowej.
Podobnie jak poprzednio, kolejna rurka z PTFE i korek są zabezpieczone na drugim końcu rusztowania za pomocą pierścienia hs, aby uzupełnić komorę. Drugi korek jest przymocowany do drugiego końca rurki z poliwęglanu. Następnie zewnętrzne powierzchnie korków są przymocowane do dwóch płyt ze stopu aluminium.
Włóż dwa pręty gwintowane do bocznego otworu na każdej płycie i zabezpiecz płytki skrzydełkowymi. Przymocuj rusztowanie do bioreaktora. Teraz zmierz widoczną długość każdego rusztowania, która jest odległością między dwoma pierścieniami hs i oblicz ich wewnętrzne powierzchnie.
Do wysiewu komórek. W autoklawie wysterylizuj komory, z których każda jest owinięta indywidualnie w folię, wraz z każdą częścią bioreaktora. Po wysterylizowaniu zmontuj bioreaktor w okapie do hodowli komórkowych.
Wstępnie oczyścić i przepłukać rusztowanie serią perfuzji za pomocą pompy perystaltycznej z prędkością jednego milimetra na minutę w obiegu przepływu. Zacznij od płukania 70% etanolem, 50% etanolem, a następnie 25% etanolem przez godzinę każde. Postępuj zgodnie z trzema płukaniami etanolem za pomocą dwugodzinnego płukania PBS.
Na koniec należy perfaktor z pożywką hodowlaną SMC przez 24 godziny, po czym jest gotowy do wysiewu komórek i eksperymentów. Teraz, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym manuskrypcie, zasiej bioreaktor 2 milionami komórek na centymetr kwadratowy i w ciągu następnych 21 dni zmień media wężowe i dokonaj regulacji prędkości pompy. Stopniowo ciśnienie w konstrukcie wzrośnie z około czterech milimetrów słupa rtęci w pierwszym dniu hodowli do ponad 100 milimetrów słupa rtęci po dwóch tygodniach w hodowli, po trzech tygodniach w hodowli, pobraniu komórek i przygotowaniu ich do analizy, jak określono w dołączonym manuskrypcie.
Te rurowe rusztowania PGS zostały wykonane metodą fuzji soli. Skaningowe mikrofotografie elektronowe wykazały, że wszystkie rusztowania miały jednorodne grubości ścianek i nie było częściowych wad na ich przekrojach. Na powierzchni światła wszystkich rusztowań zaobserwowano losowo rozmieszczone makro i mikropory.
Po hodowli komórkowej wielowarstwowe SMC rosły z orientacją prostopadłą do kierunku przepływu. Co więcej, komórki i białka DCM całkowicie pokryły światło wszystkich konstruktów PGS. Autofluorescencja elastyny wykazała również obwodowo zorganizowane elastyczne włókna na powierzchni światła konstruktu.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś wiedzieć, jak zrobić porowate rusztowanie rurowe, zobaczyć rusztowanie komórek i hodowli za pomocą wstępnie zaprojektowanego bioreaktora.
Przegląd
To badanie pokazuje wytwarzanie porowatych rurkowych szkieletów dla inżynierii tkanki tętniczej z wykorzystaniem biodegradowalnych elastomerów. Szkielety są hodowane z komórkami mięśni gładkich naczyń krwionośnych w pulsującym reaktorze przepływowym, co prowadzi do produkcji naturalnej tkanki pozakomórkowej w krótkim okresie hodowli.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkanki
- Biomateriały
- Biologia naczyń
Tło
- Szkielety elastomerowe są niezbędne do tworzenia małokalibrowych konstrukcji tętniczych.
- Dynamiczne warunkowanie mechaniczne poprawia rozwój tkanki.
- Komórki mięśni gładkich naczyń odgrywają kluczową rolę w integracji szkieletów.
- Produkcja naturalnej tkanki pozakomórkowej jest kluczowa dla funkcjonalnej inżynierii tkanki.
Cel badania
- Wytworzenie i kondycjonowanie porowatych rurkowych szkieletów do zastosowań tętniczych.
- Ocenienie żywotności i funkcjonalności komórek mięśni gładkich naczyń w inżynieryzowanych konstrukcjach.
- Ocenienie produkcji naturalnej tkanki pozakomórkowej w środowisku reaktora biologicznego.
Stosowane metody
- Wytwarzanie szkieletów z wykorzystaniem biodegradowalnych elastomerów i wymywania cząstek soli.
- Dynamiczne warunkowanie mechaniczne w pulsującym reaktorze przepływowym.
- Sianie komórek z wykorzystaniem komórek mięśni gładkich naczyń.
- Analiza zebranej tkanki z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej i barwienia histologicznego.
Główne wyniki
- Sukcesywne wytworzenie wielowarstwowej i zorientowanej tkanki mięśni gładkich.
- Wykazanie efektywnej integracji komórek w szkielecie.
- Produkcja szkieletów o znacznych cechach naturalnej tkanki pozakomórkowej.
- Ustanowienie niezawodnej metody tworzenia małokalibrowych konstrukcji tętniczych.
Wnioski
- Badanie przedstawia obiecujące podejście do inżynierii tkanki tętniczej.
- Dynamiczne warunkowanie znacząco poprawia rozwój tkanki.
- Przyszłymi zastosowaniami mogą być przekładanie kliniczne do przeszczepów naczyniowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Elastomeric scaffold technologies address critical limitations in small-diameter arterial graft development by improving compliance and reducing thrombotic risk. This approach supports predictive confidence in preclinical vascular models through enhanced extracellular matrix deposition and cellular alignment under physiological mechanical conditioning. The method enables mechanistic de-risking of arterial tissue constructs prior to lead identification stages in cardiovascular therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular smooth muscle cell responses to elastomeric substrates and dynamic mechanical cues.
- Operational Value: Provides reproducible porous tubular scaffolds with consistent wall thickness for standardized preclinical testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable extracellular matrix outputs including elastin autofluorescence and collagen deposition for assay readiness.
- Operational Value: Supports scalable scaffold fabrication via salt fusion method for multi-well or bioreactor-integrated screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates perfusion-conditioned smooth muscle alignment and multilayered tissue formation relevant to native artery morphology.
- Operational Value: Establishes a bioreactor-compatible workflow for longitudinal assessment of graft maturation and mechanical stability.
Pipeline & Workflow Integration
The scaffold fabrication and conditioning process integrates into early discovery workflows by providing compliant, thromboresistant vascular models for target validation and lead optimization in arterial disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of elastomeric biomaterials on vascular cell phenotype and extracellular matrix production.
- Screening: Enables standardized assessment of scaffold-cell interactions under pulsatile flow conditions for assay reproducibility.
- Analytics: Delivers quantitative readouts including elastin deposition, cell orientation, and scaffold porosity for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-stage scaffold maturation to preclinical continuity through native-like tissue development under mechanical conditioning.
- Enterprise Reuse: Positions the salt fusion and bioreactor conditioning method as a reusable platform for multiple vascular tissue engineering initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in graft performance through compliance-matched elastomeric scaffolds and physiological conditioning.
- Operational Value: Standardized, reproducible scaffold fabrication with tunable porosity and thickness for cross-team consistency.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk via early identification of non-thrombogenic, elastogenic vascular constructs.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of arterial graft candidates based on preclinical extracellular matrix maturation and cellular alignment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial synthesis, scaffold fabrication, and bioreactor operation.
- Depends on vacuum ovens, perfusion systems, and histological analysis infrastructure.
- Necessitates standardization of salt particle size, PGS solution concentration, and conditioning duration across laboratories.
- Involves adaptation considerations for different cell types or vessel diameters beyond baboon smooth muscle cells.
- Practical limitations include multi-day salt leaching and lyophilization steps affecting throughput.
