Oznaczanie stężenia kwasów nukleinowych i białek za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru Bio-spec Nano
February 17th, 2011
Ta wiadomość przedstawia dane na temat dokładności i odtwarzalności spektrofotometru BioSpec-nano UV-VIS do oznaczania ilościowego dsDNA i białek. Nawet w przypadku bardzo małych objętości (od 1 do 2 l) powtarzalność jest doskonała, a automatyczna funkcja wycierania poprawia przepustowość i skutkuje minimalnym przenoszeniem w celu uzyskania bardziej precyzyjnych wyników.
Ogólnym celem tej procedury jest dokładne i powtarzalne określenie stężeń kwasów nukleinowych i białek za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Osiąga się to poprzez wybór odpowiedniej długości ścieżki dla mierzonej próbki. Drugim krokiem procedury jest zmierzenie ślepej próby.
Następnie mierzy się próbkę DNA lub białka. Ostatnim krokiem procedury jest zapisanie danych w formacie PDF lub CSV. Ostatecznie, wysoce powtarzalne wyniki dla DNA i białka.
Dzięki tej metodzie można szybko i dokładnie uzyskać ocenę ilościową. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka, precyzyjna i powtarzalna. Aby rozpocząć procedurę kwantyfikacji DNA, włącz spektrofotometr nano specyfikacji BIOS.
Otwórz oprogramowanie BIOS spec nano z pulpitu komputera. Kliknij zakładkę prosty kwas nukleinowy D-S-D-N-A. Oprogramowanie nawiąże komunikację z urządzeniem i uruchomi sekwencję inicjalizacji.
Sprawdza to, czy instrument działa zgodnie ze specyfikacją. Następnie wybierz długość ścieżki. Na suwaku długości ścieżki.
Dostępne są trzy opcje dla próbek o objętości mikrolitrów. Można użyć 0,2 milimetra lub 0,7 milimetra. W przypadku rozcieńczonych próbek istnieje możliwość użycia ścieżki o długości pięciu milimetrów.
W tej demonstracji do pomiaru próbki o objętości dwóch mikrolitrów wybiera się 0,7 milimetra. Wszystkie obliczenia są oparte na wybranej długości ścieżki. Następnie w oprogramowaniu kliknij kartę ustawień i wybierz konfigurację automatycznego czyszczenia.
Wybierz jedno dla jednego wymazywania. Przed pomiarem próbki lub za każdym razem, gdy wybierana jest nowa długość ścieżki, wymagany jest ślepy pomiar W przypadku pipety o długości ścieżki 0,7 milimetra należy umieścić na cokole dwa mikrolitry wody lub bufora. Kliknij puste, aby wyświetlić pusty pomiar
.Górne okienko przesunie się, aby zetknąć się z kroplą próbki i można zaobserwować błyski ksenonowe. Po zakończeniu pomiaru wycieraczka automatycznie zetrze próbkę. Teraz próbkę można zmierzyć.
Ważne jest, aby używać jednorodnego roztworu próbki, ponieważ obecność cząstek stałych jest nierozpuszczona. Cząstka próbki spowoduje niepowtarzalne dane. Aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza, należy ostrożnie zassać dwa mikrolitry próbki, a następnie równomiernie odpipetować próbkę z końcówki pipety na cokół.
Naciśnij przycisk start na instrumencie. Tak jak poprzednio, górne okno przesunie się, aby zetknąć się z kroplą próbki i można zaobserwować błyski ksenonowe w celu określenia odtwarzalności, powtórzyć pomiar tej samej próbki trzy razy, wszystkie zarejestrowane dane są automatycznie zapisywane jako plik BUD. Aby zapisać jako plik PDF lub CCSV, kliknij przycisk Zapisz P-D-F-C-S-V.
Wyniki można również zapisać jako plik CSV, korzystając z odpowiedniego wyboru w zakładce zapisu. Kwantyfikacja białka może być wykonana za pomocą metody absorbancji dwa 80. W celu określenia ilościowego białka wybierz zakładkę Oznaczanie ilościowe białka.
Wprowadź współczynnik ekstynkcji epsilon two 80, jeśli jest znany, jeśli Epsilon two 80 nie jest znany, oblicz go za pomocą Epsilon two 80 calc, wybierz 0,2 milimetra na suwaku długości ścieżki, aby zmierzyć próbkę o wielkości trzech mikrolitrów. Następnie w oprogramowaniu kliknij kartę ustawień i wybierz konfigurację automatycznego czyszczenia. Wybierz dwie chusteczki na dwie, aby zapobiec przenoszeniu próbki i zapewnić dokładny odczyt.
Aby odmierzyć ślepą pipetę trzy mikrolitry wody lub buforu na cokole, kliknij puste miejsce, aby zmierzyć ślepą próbę. Następnie ostrożnie odpipetuj trzy mikrolitry próbki białka na cokół. Nie wprowadzając żadnych pęcherzyków powietrza, aby rozpocząć pomiar próbki, kliknij start w oprogramowaniu lub naciśnij przycisk start na urządzeniu.
Powtórzyć pomiar tej samej próbki trzy razy, aby określić wykazaną odtwarzalność. Oto dane z pomiarów na typowej próbce dwuniciowego DNA. Wzór stosowany do obliczania stężenia DNA to stężenie próbki równe DF razy ilość OD dwa 60 minus OD trzy 20 razy NACF, gdzie DF równa się współczynnikowi rozcieńczenia próbki, a NACF równa się współczynnikowi stężenia kwasu nukleinowego.
Współczynnik stężenia kwasu nukleinowego ustala się zgodnie z wybranym analitem. Wskazane jest obliczone stężenie kwasu nukleinowego i stosunek OD 2 62 80. Poniższa tabela zawiera wyniki testów odtwarzalności dla oceny ilościowej DNA.
Łącznie dane pokazują wyniki, które są wysoce powtarzalne, co wynika z niskiego względnego odchylenia standardowego wynoszącego 0,26%Reprezentatywne wyniki analizy stężenia białka dla BSA przedstawiono tutaj. Stężenie białka w mikrogramach na mililitr jest oparte na wartości Epsilon two 80. Na koniec poniższa tabela przedstawia analizę odtwarzalności oznaczania ilościowego białka.
Względne odchylenie standardowe wynoszące 0,51% wskazuje, że specyfikacja BIOS nano mierzy dokładnie od nie tylko dla DNA, ale także dla białek. Po opanowaniu wiele próbek można analizować w ciągu jednej minuty.
Przegląd
To badanie ocenia dokładność i powtarzalność spektrofotometru BioSpec-nano UV-VIS do ilościowego oznaczania dsDNA i białek. Metoda wykazuje doskonałą powtarzalność nawet przy ultra-małych objętościach próbek, zwiększając wydajność przy minimalnym przenoszeniu pozostałości.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Chemia analityczna
- Biotechnologia
Tło
- Dokładne ilościowe oznaczanie kwasów nukleinowych i białek jest kluczowe w badaniach biologicznych.
- Mikrowolumenowa spektrofotometria umożliwia analizę przy minimalnych wymaganiach dotyczących próbek.
- Automatyczne funkcje mogą poprawić wydajność i dokładność pomiarów.
- Powtarzalność jest niezbędna dla wiarygodnych wyników eksperymentów.
Cel badania
- Ocenienie wydajności spektrofotometru BioSpec-nano do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych i białek.
- Ustanowienie protokołu dla dokładnych pomiarów przy użyciu małych objętości próbek.
- Wykazanie wiarygodności wyników poprzez wielokrotne pomiary.
Stosowane metody
- Wybór odpowiedniej długości ścieżki dla pomiaru próbki.
- Pomiar próbki blank przed analizą próbki.
- Automatyczne czyszczenie w celu zapobiegania przenoszeniu pozostałości między próbkami.
- Zapisywanie danych w formatach PDF lub CSV do dalszej analizy.
Główne wyniki
- Wysoce powtarzalne wyniki ilościowego oznaczania DNA z względną odchyleniem standardowym 0,26%.
- Ilościowe oznaczanie białek również wykazało wysoką dokładność z względnym odchyleniem standardowym 0,51%.
- Możliwe są szybkie i precyzyjne pomiary za pomocą BioSpec-nano.
- Wiele próbek może być analizowanych szybko, co zwiększa wydajność.
Wnioski
- Spektrofotometr BioSpec-nano zapewnia wiarygodne ilościowe oznaczanie zarówno dsDNA, jak i białek.
- Automatyczne funkcje znacząco poprawiają wydajność pomiarów.
- Ta metoda nadaje się do zastosowań o wysokiej wydajności w badaniach biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate and reproducible quantification of nucleic acids and proteins is essential for target validation and assay development in early drug discovery. The BioSpec-nano micro-volume spectrophotometer enables high-throughput, low-sample-consumption measurements with automated sample handling, reducing variability and improving data reliability for lead identification workflows. Its rapid measurement cycle and low relative standard deviation support predictive confidence in downstream screening and translational applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise quantification of nucleic acid and protein samples to support target expression analysis and pathway interrogation.
- Operational Value: Reduces sample consumption and manual handling steps, increasing throughput for hypothesis testing in discovery biology.
- Predictive Value: Low relative standard deviation (0.26% for DNA, 0.51% for protein) enhances confidence in quantitative data used for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides reproducible absorbance measurements (OD260-OD320 for DNA, OD280 for protein) suitable for assay standardization and reagent qualification.
- Operational Value: Automated wiping and blanking minimize carryover and ensure measurement consistency across plates or batches.
- Scalability: Three-second measurement time enables rapid screening of sample libraries or fractionation outputs.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker quantification and pharmacokinetic sample analysis where low-volume, high-precision detection is required.
- Mechanistic De-risking: Accurate protein concentration data (via ε280 calculation from Trp, Tyr, Cys-S-S residues) enables correct dosing in functional assays.
- Workflow Integration: Outputs in PDF/CSV format facilitate data tracking and cross-functional sharing between discovery and preclinical teams.
Pipeline & Workflow Integration
The BioSpec-nano fits within the discovery continuum from initial target validation through assay development and into preclinical sample analysis, particularly where sample conservation and measurement reproducibility are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven quantification of nucleic acids (e.g., gene expression constructs) and proteins (e.g., purified targets, antibodies) for target validation.
- Screening: Enables QC of sample inputs and reaction outputs in biochemical or cell-based assays with minimal volume requirements.
- Analytics: Delivers quantitative OD-based readouts with automated pathlength correction and extinction coefficient calculation for proteins.
- Translational Research: Compatible with low-volume preclinical samples (e.g., plasma, tissue lysates) requiring accurate concentration normalization.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared core lab resource for standardized quantitation across multiple projects and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves data quality and reproducibility in nucleic acid and protein quantitation, reducing false negatives/positives in early screening.
- Operational Value: Automation of sample contact, measurement, and cleaning reduces user variability and increases lab efficiency.
- Strategic Value: Enables faster iteration in lead optimization by providing reliable quantification for structure-activity relationship (SAR) studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted resource allocation by delivering trustworthy quantitative data for target prioritization.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with spectrophotometer principles and pathlength selection based on sample concentration.
- Needs access to a PC with BioSpec-nano software and periodic maintenance of optical surfaces.
- Benefits from standardized SOPs for blanking, wiping, and sample application to ensure cross-user consistency.
- Adaptable to various sample types (DNA, protein, other analytes) via software configuration and pathlength adjustment.
- Limited to absorbance-based quantification; not suitable for fluorescent or luminescent assays without additional instrumentation.
