Oznaczanie stężenia kwasów nukleinowych i białek przy użyciu mikroobjętościowego spektrofotometru Bio-spec Nano
17 lutego 2011
Niniejszy komunikat przedstawia dane dotyczące dokładności i powtarzalności spektrofotometru UV-VIS BioSpec-nano w oznaczaniu ilościowym dsDNA oraz białek. Nawet przy ultra małych objętościach (1 do 2 µL) powtarzalność jest doskonała, natomiast zautomatyzowana funkcja przecierania zwiększa wydajność i minimalizuje zjawisko przeniesienia próbki, co pozwala na uzyskanie bardziej precyzyjnych wyników.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest dokładne i powtarzalne oznaczenie stężeń kwasów nukleinowych oraz białek przy użyciu mikroobjętościowego spektrofotometru. Jest to realizowane poprzez wybór odpowiedniej długości drogi optycznej dla mierzonej próbki. Drugim krokiem procedury jest pomiar próbki ślepej.
Następnie dokonuje się pomiaru próbki DNA lub białka. Ostatnim krokiem procedury jest zapisanie danych w formacie PDF lub CSV. W efekcie uzyskuje się wysoce powtarzalne wyniki dla DNA i białka.
Ilościowe oznaczenie można przeprowadzić szybko i dokładnie za pomocą tej metody. Główną zaletą tej techniki jest jej szybkość, precyzja i powtarzalność. Aby rozpocząć procedurę oznaczania ilości DNA, włącz spektrofotometr BIOS spec nano.
Otwórz oprogramowanie BIOS spec nano z pulpitu komputera. Kliknij kartę simple nucleic acid D-S-D-N-A. Oprogramowanie nawiąże komunikację z urządzeniem i uruchomi sekwencję inicjalizacji.
Potwierdza to, że instrument działa zgodnie ze specyfikacją. Następnie należy wybrać długość drogi optycznej za pomocą suwaka długości drogi optycznej.
Dostępne są trzy opcje dla próbek o objętości mikrolitrowej. Można zastosować kuwetę o drodze optycznej 0,2 mm lub 0,7 mm. W przypadku próbek rozcieńczonych istnieje możliwość użycia kuwety o drodze optycznej 5 mm.
W tym pokazie do pomiaru próbki o objętości 2 µL wybrano wartość 0,7 mm. Wszystkie obliczenia opierają się na wybranej długości drogi optycznej. Następnie w oprogramowaniu należy kliknąć kartę konfiguracji i wybrać ustawienia automatycznego wycierania.
Wybierz jedną sztukę do jednego przetarcia. Przed pomiarem próbki lub za każdym razem po wybraniu nowej długości drogi optycznej wymagane jest wykonanie pomiaru tła. Dla długości drogi optycznej 0,7 mm nanieś pipetą 2 µL wody lub buforu na postument. Kliknij blank, aby wykonać pomiar tła.
Górne okienko przesunie się, aby nawiązać kontakt z kroplą próbki, a następnie widoczne będą błyski ksenonowe. Po zakończeniu pomiaru wycieraczka automatycznie usunie próbkę. Teraz można przeprowadzić pomiar próbki.
Ważne jest użycie homogenicznego roztworu próbki, ponieważ obecność nierozpuszczonych cząstek w próbce spowoduje uzyskanie nieodtwarzalnych danych. Aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza, należy ostrożnie aspirować 2 µL próbki, a następnie równomiernie nanieść ją z końcówki pipety na postument.
Naciśnij przycisk start w urządzeniu. Podobnie jak wcześniej, górne okno przesunie się, aby nawiązać kontakt z kropelką próbki, a następnie można zaobserwować błyski ksenonu. Aby określić powtarzalność, należy powtórzyć pomiar tej samej próbki trzy razy; wszystkie zarejestrowane dane są automatycznie zapisywane jako plik A BUD. Aby zapisać dane jako plik PDF lub CCSV, kliknij save P-D-F-C-S-V.
Wyniki można również zapisać w formacie pliku CSV, korzystając z odpowiedniego wyboru w zakładce zapisu. Oznaczenie ilości białka można przeprowadzić metodą absorbancji przy dwóch długościach fali. Aby przeprowadzić oznaczanie ilości białka, należy wybrać zakładkę oznaczania ilości białka.
Wprowadź współczynnik ekstynkcji epsilon 280, jeśli jest znany; jeśli epsilon 280 nie jest znany, oblicz go za pomocą funkcji Epsilon 280 calc. Na suwaku długości drogi optycznej wybierz 0,2 mm, aby zmierzyć próbkę o objętości 3 µL. Następnie w oprogramowaniu kliknij kartę setup i wybierz auto wiping setup. Wybierz wartość 2 dla dwóch cykli przecierania, aby zapobiec przenoszeniu próbek i zapewnić dokładny odczyt.
Aby przeprowadzić pomiar tła, nanieś trzy µL wody lub buforu na podstawkę, a następnie kliknij „blank”, aby zmierzyć tło. Następnie ostrożnie nanieś trzy µL próbki białka na podstawkę. Kliknij „start” w oprogramowaniu lub naciśnij przycisk start na urządzeniu, aby rozpocząć pomiar próbki, dbając o to, by nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
Powtórz pomiar tej samej próbki trzy razy, aby określić wykazaną powtarzalność. Poniżej znajdują się dane z pomiarów typowej próbki dwuniciowego DNA. Wzór stosowany do obliczania stężenia DNA to: stężenie próbki równa się DF pomnożone przez wartość OD 260 minus OD 320 pomnożone przez NACF, gdzie DF oznacza czynnik rozcieńczenia próbki, a NACF oznacza czynnik stężenia kwasów nukleinowych.
Współczynnik stężenia kwasów nukleinowych jest ustawiany zgodnie z wybranym analitym. Wyświetlane są obliczone stężenie kwasów nukleinowych oraz stosunek OD 260/280. Tabela ta zawiera wyniki testów powtarzalności dla oznaczania ilości DNA.
Zestawione dane wykazują wyniki o wysokiej powtarzalności, co potwierdza niska względna odchyłka standardowa wynosząca 0.26%. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki analizy stężenia białka dla BSA. Stężenie białka w µg/mL oparto na wartości Epsilon 280. Na koniec, tabela ta przedstawia analizę powtarzalności oznaczania ilości białka.
Względna odchyłka standardowa wynosząca 0,51% wskazuje, że BIOS spec nano dokonuje dokładnych pomiarów nie tylko w przypadku DNA, ale również białek. Po opanowaniu tej metody można analizować wiele próbek w ciągu jednej minuty.
Przegląd
Niniejsze badanie ocenia dokładność i powtarzalność spektrofotometru BioSpec-nano UV-VIS w oznaczaniu ilościowym dsDNA oraz białek. Metoda ta wykazuje doskonałą powtarzalność nawet przy ultramałych objętościach próbek, zwiększając przepustowość przy minimalnym zanieczyszczeniu przeniesionym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Chemia analityczna
- Biotechnologia
Wstęp
- Dokładne oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych i białek jest kluczowe w badaniach biologicznych.
- Spektrofotometria mikrometryczna umożliwia przeprowadzanie analiz przy minimalnym zapotrzebowaniu na próbkę.
- Funkcje automatyzacji mogą zwiększyć efektywność i dokładność pomiarów.
- Powtarzalność jest niezbędna dla uzyskania wiarygodnych wyników eksperymentalnych.
Cel badania
- Ocena wydajności spektrofotometru BioSpec-nano w ilościowym oznaczaniu kwasów nukleinowych i białek.
- Opracowanie protokołu dokładnych pomiarów z wykorzystaniem niewielkich objętości próbek.
- Wykazanie niezawodności wyników poprzez pomiary powtórzone.
Zastosowane metody
- Wybór odpowiedniej długości drogi optycznej do pomiaru próbki.
- Pomiar tła przed analizą próbki.
- Automatyczne wycieranie w celu zapobiegania zanieczyszczeniom krzyżowym między próbkami.
- Zapisywanie danych w formatach PDF lub CSV do dalszej analizy.
Główne wyniki
- Wysoko powtarzalne wyniki oznaczania ilości DNA ze względnym odchyleniem standardowym wynoszącym 0,26%.
- Oznaczanie ilości białka również wykazało wysoką dokładność przy względnym odchyleniu standardowym 0,51%.
- Przy użyciu BioSpec-nano można uzyskać szybkie i precyzyjne pomiary.
- Możliwość szybkiej analizy wielu próbek zwiększa przepustowość procesu.
Wnioski
- Spektrofotometr BioSpec-nano zapewnia niezawodne ilościowe oznaczenie zarówno dsDNA, jak i białek.
- Funkcje automatyzacji znacząco zwiększają wydajność pomiarów.
- Metoda ta jest odpowiednia do zastosowań wysokoprzepustowych w badaniach biologicznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Precyzyjne i powtarzalne oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych oraz białek jest niezbędne do walidacji celu i opracowywania testów we wczesnej fazie poszukiwania leków. Spektrofotometr mikroobjętościowy BioSpec-nano umożliwia pomiary o wysokiej przepustowości przy niskim zużyciu próbki dzięki zautomatyzowanej obsłudze próbek, co redukuje zmienność i zwiększa wiarygodność danych w procesach identyfikacji związków wiodących. Szybki cykl pomiarowy oraz niskie odchylenie standardowe wspierają pewność prognostyczną w późniejszych etapach przesiewowych i zastosowaniach translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia precyzyjną kwantyfikację próbek kwasów nukleinowych i białek, co wspiera analizę ekspresji celu oraz badanie szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Ogranicza zużycie próbek i liczbę etapów manualnej obsługi, zwiększając przepustowość testowania hipotez w biologii odkrywczej.
- Wartość prognostyczna: Niskie względne odchylenie standardowe (0,26% dla DNA, 0,51% dla białka) zwiększa pewność danych ilościowych wykorzystywanych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go).
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Zapewnia powtarzalne pomiary absorbancji (OD260-OD320 dla DNA, OD280 dla białka), odpowiednie do standaryzacji testów i kwalifikacji odczynników.
- Wartość operacyjna: Automatyczne przecieranie i zerowanie minimalizują zanieczyszczenia przeniesione i zapewniają spójność pomiarów pomiędzy płytkami lub partiami.
- Skalowalność: Trzypunktowy czas pomiaru umożliwia szybki screening bibliotek próbek lub produktów frakcjonowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera kwantyfikację biomarkerów oraz analizę próbek farmakokinetycznych, w których wymagane jest wykrywanie wysokiej precyzji przy małych objętościach.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Dokładne dane o stężeniu białek (wyliczone na podstawie ε280 z reszt Trp, Tyr, Cys-S-S) umożliwiają prawidłowe dozowanie w testach funkcjonalnych.
- Integracja przepływu pracy: Wyniki w formacie PDF/CSV ułatwiają śledzenie danych i wymianę informacji między zespołami badawczymi a przedklinicznymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
BioSpec-nano wpisuje się w kontinuum procesu odkrywczego, od wstępnej walidacji celu, przez rozwój testów, aż po przedkliniczną analizę próbek, szczególnie w sytuacjach, gdy kluczowe są oszczędność materiału i powtarzalność pomiarów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ilościowe oznaczanie kwasów nukleinowych (np. konstruktów ekspresji genów) i białek (np. oczyszczonych celów, przeciwciał) w ramach walidacji celów terapeutycznych w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewanie: Umożliwia kontrolę jakości próbek wejściowych i produktów reakcji w testach biochemicznych lub komórkowych przy minimalnych wymaganiach co do objętości.
- Analityka: Zapewnia ilościowe odczyty oparte na OD z automatyczną korektą długości drogi optycznej i obliczaniem współczynnika ekstynkcji dla białek.
- Badania translacyjne: Kompatybilna z małymi objętościami próbek przedklinicznych (np. osocza, lizatów tkankowych), wymagającymi dokładnej normalizacji stężeń.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Funkcjonuje jako wspólny zasób centralnego laboratorium do standaryzowanego oznaczania ilościowego w wielu projektach i modalnościach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Poprawa jakości i powtarzalności danych w oznaczaniu ilości kwasów nukleinowych i białek, co ogranicza liczbę wyników fałszywie ujemnych i fałszywie dodatnich we wczesnych badaniach przesiewowych.
- Wartość operacyjna: Automatyzacja kontaktu z próbką, pomiaru i czyszczenia zmniejsza zmienność wynikającą z błędów użytkownika i zwiększa efektywność laboratorium.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybszą iterację w optymalizacji związków wiodących poprzez dostarczanie wiarygodnych pomiarów ilościowych do badań zależności struktura-aktywność (SAR).
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowanie alokacji zasobów do ryzyka poprzez dostarczanie wiarygodnych danych ilościowych niezbędnych do priorytetyzacji celów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest znajomość zasad działania spektrofotometru oraz doboru długości drogi optycznej w zależności od stężenia próbki.
- Wymagany jest dostęp do komputera z oprogramowaniem BioSpec-nano oraz okresowa konserwacja powierzchni optycznych.
- Zaleca się stosowanie ustandaryzowanych procedur SOP dotyczących zerowania, wycierania i nakładania próbek w celu zapewnienia spójności wyników między różnymi użytkownikami.
- Urządzenie można dostosować do różnych typów próbek (DNA, białka, inne analizyty) poprzez konfigurację oprogramowania i regulację długości drogi optycznej.
- Zastosowanie ogranicza się do kwantyfikacji opartej na absorbancji; urządzenie nie nadaje się do analiz fluorescencyjnych lub luminescencyjnych bez dodatkowej aparatury.
