Name: Spolaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie Xenopus w odpowiedzi na sygnalizację Wnt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Poznaj metodę badania polaryzacji komórkowej w ektodermie Xenopus poprzez wizualizację lokalizacji białek fluorescencyjnych. Technika ta pozwala analizować przestrzenną regulację sygnalizacji Wnt in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania w laboratorium Sokol są sponsorowane przez National Institutes of Health.

1. In vitro Zapłodnienie Xenopus Jaja
<ol>
	<li>Pozyskać jaja od samic żab, którym 12 godzin przed eksperymentem wstrzyknięto ludzką gonadotropinę kosmówkową (400 unit/frog).</li>
	<li>Umieścić jaja w niewielkiej ilości (0,5-1 ml) 1 x zmodyfikowanego roztworu Ringera według Marca (MMR)10 i zapłodnić je in vitro za pomocą małego fragmentu wypreparowanego jądra. Po 2-3 min dodać 0,1 x MMR, aby pokryć całą powierzchnię jaj. W ciągu 20 minut usunąć otoczkę galaretowatą jaj za pomocą 3 % cysteiny - HCL (skorygowanej do pH 8 wodorotlenkiem sodu). Jaja przemyć trzykrotnie roztworem 0,1 x MMR i pozostawić w zimnym inkubatorze (13° C) do czasu iniekcji.</li>
	<li>Pozwolić zapłodnionym jajax rozwinąć się do stadium 2-4 komórek. Do iniekcji embriony przenieść do roztworu zawierającego 3 % Ficoll oraz 0,5 x MMR.</li>
</ol>
2. Mikroiniekcja RNA
<ol>
	<li>RNA są syntetyzowane z linearyzowanych matryc DNA przy użyciu zestawu mMessage mMachine (Ambion), a następnie rozcieńczane wodą wolną od RNaz do stężenia zapasowego 0,1-1 μg/μl. Optymalne dawki RNA do iniekcji są ustalane w eksperymentach pilotażowych. RNA dla Diversin-RFP, markera błonowego GFP-CAAX oraz Frizzled 8 są stosowane w ilości 0,1-1 ng na iniekcję.</li>
	<li>Igły do iniekcji są przygotowywane z kapilary przy użyciu wyciągacza igieł (needle puller), a następnie szlifierki do igieł. Przed iniekcją każda igła jest kalibrowana wodą, aby dozować 10 nl cieczy na jedną iniekcję.</li>
	<li>Do iniekcji embriony umieszcza się na plastikowej szalce w dużej kropli 3% Ficollu i 0,5 x MMR. Jeden mikrolitr roztworu RNA jest zasysany do igły iniekcyjnej za pomocą mikroinjektora Narishige. 10 nl RNA jest wstrzykiwanych do blastomerów zwierzęcych embrionów w stadium 8 komórek 2-3 razy. Iniektywne embriony są przenoszone do dołka płytki 12-dołkowej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie eksplantatów ektodermalnych
<ol>
	<li>Gdy wstrzyknięte embriony osiągną wczesny etap gastruli, przenosi się je do roztworu 0.6 x MMR w plastikowym naczyniu o średnicy 3 cm pokrytym 1 % agarozy. Błonę witelinową usuwa się ręcznie za pomocą pincety. Eksplantaty ektodermy wycina się z embrionów, używając igły wolframowej i pętli z włosia.</li>
	<li>Eksplantaty ektodermy przenosi się do szklanej fiolki i utrwala w 3.7 % formaldehydzie w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) przez 30 minut. Utrwalone eksplantaty płucze się w PBS trzykrotnie (po 10 minut każde płukanie). DAPI dodaje się do trzeciego płukania w celu zabarwienia jąder komórkowych.</li>
	<li>Eksplantaty montuje się na szkiełku podstawowym. Do szkiełka przykleja się dwa paski taśmy klejącej, a eksplantaty umieszcza pomiędzy nimi. Ponieważ zewnętrzna powierzchnia eksplantatów jest pigmentowana, ich strona wewnętrzna powinna być skierowana w stronę obiektywu mikroskopu. Dodaje się dwie lub trzy krople po 20 μl medium montażowego (70 % glicerolu w PBS z dodatkiem 25 mg/ml DABCO, odczynnika zapobiegającego blaknięciu)11. Na wierzch nakłada się szkiełko nakrywkowe.</li>
</ol>
4. Obrazowanie eksplantów pod mikroskopem fluorescencyjnym
<ol>
	<li>Próbki ogląda się pod fluorescencyjnym mikroskopem Zeiss Axioplan z odpowiednimi filtrami.</li>
	<li>Obrazy wykonuje się za pomocą przystawki Apotome, aby zwizualizować konkretną płaszczyznę z kilku niezależnych eksplantów.</li>
</ol>
5. Kriosekcjonowanie
Kriosekcjonowanie jest alternatywną metodą wizualizacji rozkładu białek fluorescencyjnych w komórce i znajduje szersze zastosowanie w immunobarwieniu. W stadium 10 zarodki utrwala się przez 1-2 godziny w utrwalaczu Denta (20% DMSO, 80% metanolu), przemywa PBS i zatapia w 15% roztworze żelatyny rybiej i 15% sacharozy11. Zatopione zarodki szybko zamraża się na suchym lodzie, a następnie wykonuje krioprzekroje za pomocą kriostatu Leica. Przekroje poprzeczne obejmują komórki ektodermalne, które odziedziczyły wstrzyknięte RNA oraz ich przetłumaczone produkty białkowe. Sekcje zachowują fluorescencję i mogą być poddane immunobarwieniu swoistymi przeciwciałami, a następnie znakowane przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z fluoroforem. Jądra komórkowe barwi się DAPI. Pośredniki do montowania są takie same, jak opisano powyżej. Obrazowanie można przeprowadzić zgodnie z powyższym opisem.
6. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2700/2700fig1.jpg" alt="Proces przekroju RNA; obraz nałożony; mikroskopia fluorescencyjna; RFP, γ-Tubulin, DAPI; badanie komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Receptor Frizzled rekrutuje Diversynę do błony komórkowej. Komórki ektodermy wykazujące ekspresję RNA Frizzled 8 (Xfz8) oraz Div-RFP ujawniają obecność Div-RFP w błonie komórkowej, zamiast w centrosomie (co wykazano poprzez wspólne barwienie z g-tubuliną). Schemat eksperymentu znajduje się u góry; przedstawiono typowy przekrój.

<ol><li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+induction+---+molecular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic induction --- molecular aspects.</a> Development. 99, 285-306 (1987).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Principles+of+Developmental+Genetics%22">Principles of Developmental Genetics</a>. Moody, S. A. , Academic Press. (2007).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127, 469-480 (2006).</li>
<li>Klaus, A., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+and+its+impact+on+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling and its impact on development and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).</li>
<li>Gordon, M. D., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling%3A+multiple+pathways%2C+multiple+receptors%2C+and+multiple+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors.</a> J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).</li>
<li>Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ankyrin+repeat+protein+Diversin+recruits+Casein+kinase+Iepsilon+to+the+beta-catenin+degradation+complex+and+acts+in+both+canonical+Wnt+and+Wnt%2FJNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling.</a> Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).</li>
<li>Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversin+regulates+heart+formation+and+gastrulation+movements+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).</li>
<li>Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomal+localization+of+Diversin+and+its+relevance+to+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling.</a> J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).</li>
<li>Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Xenopus+Frizzled+8+in+dorsal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development.</a> Mech Dev. 74, 145-157 (1998).</li>
<li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos%3A+I.+characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30, 675-686 (1982).</li>
<li>Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localization+is+required+for+Dishevelled+function+in+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling.</a> J Biol. 4, 3-3 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Powyższy protokół zastosowaliśmy do charakterystyki lokalizacji subkomórkowej Diversiny. W eksplantach bieguna zwierzęcego Diversina-RFP została wykryta w sąsiedztwie jądra i kolokalizowała z g-tubuliną, markerem centrosomalnym, w sekcjach mrożonych (Rysunek 1). Po zidentyfikowaniu lokalizacji subkomórkowej białka można stworzyć konstrukty delecyjne, aby ustalić, które domeny białkowe są niezbędne i wystarczające dla danej lokalizacji subkomórkowej. Stosując to podejście, domeny lokalizacji centrosomalnej Diversiny zmapo...

polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie xenopus w odpowiedzi na sygnalizację wnt

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polaryzacja komórek jest fundamentalną właściwością komórek eukariotycznych, która jest dynamicznie regulowana przez czynniki wewnętrzne i zewnętrzne podczas rozwoju embrionalnego 1, 2. Jedną z szlaków sygnalizacyjnych zaangażowanych w tę regulację jest szlak Wnt, który jest wielokrotnie wykorzystywany podczas embriogenezy i ma kluczowe znaczenie dla patogenezy chorób u ludzi3, 4, 5. Liczne komponenty molekularne tego szlaku współdziałają w regulacji sygnalizacji w sposób przestrzennie ograniczony, jednak mechanizmy leżące u podstaw tego procesu nie są w pełni poznane. Embrionalne komórki nabłonkowe Xenopus stanowią doskonały system do badania subkomórkowej lokalizacji różnych białek sygnałowych. Białka fuzyjne z fluorescencyjnymi znacznikami są ekspresjonowane w embrionach Xenopus poprzez mikroiniekcję RNA, następnie przygotowuje się eksplanty ektodermy, a lokalizację białek ocenia za pomocą epifluorescencji. W niniejszym protokole eksperymentalnym opisujemy sposób wizualizacji subkomórkowej lokalizacji Diversiny – białka cytoplazmatycznego, którego udział wykazano w sygnalizacji i określaniu polaryzacji komórkowej6, 7 – w komórkach ektodermy Xenopus w celu zbadania transdukcji sygnału Wnt8. Współekspresja liganda Wnt lub receptora Frizzled zmienia rozkład Diversiny połączonej z czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP), rekrutując ją do błony komórkowej w sposób spolaryzowany 8, 9. Ten protokół ex vivo powinien stanowić użyteczne uzupełnienie badań in vitro na hodowlach komórek ssaków, w których kontrola przestrzenna sygnalizacji różni się od tej w nienaruszonym tkance i jest znacznie trudniejsza do analizy.

Zewnętrzna warstwa ektodermy embrionalnej Xenopus stała się atrakcyjnym modelem do badań polaryzacji komórkowej. Opisano analizę, w której ocenia się subkomórkową dystrybucję białek fluorescencyjnych w komórkach ektodermy. Niniejszy protokół pomoże w odpowiedzi na pytania dotyczące przestrzennej kontroli sygnalizacji.

Polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie Xenopus w odpowiedzi na sygnalizację Wnt

Polaryzacja komórkowa jest fundamentalną właściwością komórek eukariotycznych, która jest dynamicznie regulowana przez czynniki wewnętrzne i zewnętrzne podczas rozwoju embrionalnego...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie zmian w lokalizacji subkomórkowej białek pod wpływem sygnalizacji czynników wzrostu. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie do blastomerów zwierzęcych wczesnych embrionów Xenopus RNA kodujących RFP oraz receptor sygnalizacyjny FRIZZLED 8. Następnie przygotowuje się preparaty z implantów elektrodermalnych i/lub kriostatyczne przekroje embrionów, a następnie poddaje się je barwieniu immunologicznemu.Na koniec komórki poddane barwieniu immunocytochemicznemu obrazuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. W rezultacie można uzyskać dane pokazujące, w jaki sposób subkomórkowa lokalizacja konkretnego białka zależy od embrionalnych szlaków sygnalizacyjnych. Jako przykład wykazujemy, że białko diverse jest rekrutowane z centrosomu do błony komórkowej przez receptor FRIZZLED eight.Metoda ta pozwala badaczom na wizualizację subkomórkowej lokalizacji białek sygnałowych in vivo z wykorzystaniem embrionów Xenopus. Może to pomóc w rozwiązaniu fundamentalnych pytań z zakresu biologii rozwoju i biologii komórki, takich jak badania nad przestrzenną regulacją sygnalizacji oraz mechanizmami priorytetyzacji komórek. Aby rozpocząć proces zapłodnienia i

polarized-translocation-fluorescent-proteins-xenopus-ectoderm

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w Xenopus ektoderma w odpowiedzi na sygnał Wnt

Genetyczne mapowanie losu indukowalne (GIFM) pozwala na znakowanie i śledzenie komórek z precyzyjną kontrolą przestrzenną i czasową in vivo oraz wyjaśnia, w jaki sposób komórki z konkretnej linii genetycznej przyczyniają się do tworzenia tkanek w rozwoju i u dorosłych osobników. Przedstawione tutaj techniki umożliwiają mapowanie losu zarodków myszy w stadium E12.5 na potrzeby analizy epifluorescencyjnej i analizy eksplantatów.

Praktyczne podejście do genetycznego indukowalnego mapowania losów: wizualny przewodnik po znakowaniu i śledzeniu komórek in vivo

Opisujemy tutaj użycie wrażliwego na pH wariantu białka zielonej fluorescencji, pHluorin, do badania czasoprzestrzennej dynamiki receptorów naprowadzania aksonów przemieszczających się na powierzchni komórki. Receptor znakowany pHluoryną ulega ekspresji zarówno w hodowli komórkowej, jak i in vivo, za pomocą elektroporacji zarodka pisklęcia.

Stosowanie pHluorin do oceny dynamiki receptorów kierowania aksonami w hodowli komórkowej i w zarodku piskląt

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Prezentujemy przejściową transgenezę i knockdown genu u Ciona intestinalis, siostrzanej grupie strunowców kręgowców, przy użyciu technik mikroiniekcji i elektroporacji. Takie metody ułatwiają genomikę funkcjonalną u tego prostego bezkręgowca, który charakteryzuje się podstawowymi cechami kręgowców, w tym struną grzbietową i nabłonkiem czuciowym głowy, a także wieloma ortologiami genów związanych z chorobami ludzkimi.

Mikroiniekcja zarodka i elektroporacja w jelicie strunowca Ciona

Ten artykuł wideo szczegółowo opisuje prostą metodologię in vivo, która może być używana do systematycznego i efektywnego charakteryzowania składników złożonych szlaków sygnałowych i sieci regulacyjnych w wielu zarodkach bezkręgowców.

Siła prostoty: zarodki jeżowców jako modele rozwojowe in vivo do badania złożonych interakcji sieci sygnalizacyjnych między komórkami

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

Ten protokół pokazuje, jak śledzić translokację jądra białka pod wpływem stresu cieplnego, używając białka fuzyjnego białka zielonej fluorescencji (GFP) jako markera i barwienia 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). Protokół barwienia DAPI jest szybki i zachowuje sygnały lokalizacji subkomórkowej GFP i białka.

Wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem w Caenorhabditis elegans

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak mikrowstrzykiwać mieszaninę DNA/DOTAP do pąków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus laevis, oraz jak obrazować i rekonstruować indywidualne zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyrażające aksonalne trzpienie wzrokowe w tektalnych śródmózgowiu nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus.

Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus

Ilościowe oznaczanie pęknięć obu nici DNA z wykorzystaniem formowania γH2AX jako markera molekularnego stało się nieocenionym narzędziem w radiobiologii. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX po narażeniu komórek na promieniowanie.

Ilościowe oznaczanie ognisk &gamma;H2AX w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące

Poznaj metodę badania polaryzacji komórkowej w ektodermie Xenopus poprzez wizualizację lokalizacji białek fluorescencyjnych. Technika ta pozwala analizować przestrzenną regulację sygnalizacji Wnt in vivo.

Polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie Xenopus w odpowiedzi na sygnalizację Wnt

Przeglądaj więcej filmów