Polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie Xenopus w odpowiedzi na sygnalizację Wnt

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie zmian w lokalizacji subkomórkowej białek pod wpływem sygnalizacji czynników wzrostu. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie do blastomerów zwierzęcych wczesnych embrionów Xenopus RNA kodujących RFP oraz receptor sygnalizacyjny FRIZZLED 8. Następnie przygotowuje się preparaty z implantów elektrodermalnych i/lub kriostatyczne przekroje embrionów, a następnie poddaje się je barwieniu immunologicznemu.

Na koniec komórki poddane barwieniu immunocytochemicznemu obrazuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. W rezultacie można uzyskać dane pokazujące, w jaki sposób subkomórkowa lokalizacja konkretnego białka zależy od embrionalnych szlaków sygnalizacyjnych. Jako przykład wykazujemy, że białko diverse jest rekrutowane z centrosomu do błony komórkowej przez receptor FRIZZLED eight.

Metoda ta pozwala badaczom na wizualizację subkomórkowej lokalizacji białek sygnałowych in vivo z wykorzystaniem embrionów Xenopus. Może to pomóc w rozwiązaniu fundamentalnych pytań z zakresu biologii rozwoju i biologii komórki, takich jak badania nad przestrzenną regulacją sygnalizacji oraz mechanizmami priorytetyzacji komórek. Aby rozpocząć proces zapłodnienia in vitro, należy pozyskać komórki jajowe od samic żab, którym wstrzyknięto ludzką gonadotropinę kosmówkowej.

Na 12 godzin przed eksperymentem dodać od 0,5 do 1 ml roztworu 1X Marx modified ringer na jaja i przeprowadzić zapłodnienie in vitro przy użyciu niewielkiego fragmentu wypreparowanego jądra. Po dwóch do trzech minutach obniżyć stężenie soli za pomocą roztworu 0,1XMMR, aby aktywować ruchliwość plemników. Inkubować przez 20 minut.

Po zapłodnieniu jaja orientują się biegunami zwierzęcymi do góry. Usunąć otoczkę galaretowatą jaj poprzez zastąpienie roztworu MMR 3% roztworem cysteiny w wodzie na pięć minut. Przepłukać jaja trzykrotnie roztworem 0,1 XMMR.

Inkubować w temperaturze 13 stopni Celsjusza do stadium dwóch do czterech komórek. Następnie przenieść embriony do 3% fi. Call w 0,5 XMMR do mikroiniekcji.

Zsyntetyzować RNA z linearyzowanych matryc DNA, używając zestawu M message M machine, a następnie rozcieńczyć wodą wolną od RNaz do stężenia od 0,1 do 1 µg/µL. RNA kodujące RFP, marker błony GFP CX oraz FRIZZLED 8 stosuje się w ilości od 0,1 do 1 ng na jedną iniekcję. Przed iniekcją przygotować igły do wstrzykiwania z rurek kapilarnych, używając wyciągarki do igieł oraz szlifierki do igieł.

Kalibruj każdą igłę za pomocą wody, aby podczas wstrzykiwania wydzielać 10 litrów cieczy na jedną iniekcję. Umieść embriony na plastikowej szalce w dużej kropli 3%fial 0.5 XMMR. Pobierz jeden mikrolitr roztworu RNA do igły iniekcyjnej za pomocą wąskiego mikroinjektora shige.

Wstrzyknij 10 nanolitrów RNA do każdego z dwóch blastomerów zarodków dwukomórkowych. Przenieś wstrzyknięte zarodki do dołka płytki 12-dołkowej i inkubuj w temperaturze 13 °C aż do osiągnięcia wczesnego stadium gastrulacji.

Przenieść zarodki w stadium gastruli do roztworu 0,6 XMMR w plastikowym szalce o średnicy sześciu centymetrów pokrytej 1% aeros. Ręcznie usunąć błonę witelinową za pomocą pincety. Następnie, używając igły tsin oraz pętli z włosia, wyciąć eksplantaty ektodermalne z zarodków.

Utrwalone próbki inkubowano w 3,7% formaldehydzie w PBS przez 30 minut. Wyjaśnione X przemyto trzykrotnie w PBS przez 10 minut w każdym cyklu. W celu barwienia jąder komórkowych do trzeciego przemywania dodano davi.

Następnie zamocuj eksplant X na szkiełku przedmiotowym, umieszczając go pomiędzy dwoma paskami taśmy klejącej, tak aby niepigmentowana strona wewnętrzna eksplantu X była skierowana w stronę obiektywu. Dodaj od dwóch do trzech kropli po 20 µL medium montażowego. Na górze umieść szkiełko nakrywkowe.

Wstrzyknięte embriony można poddać kriosekcjonowaniu w celu wizualizacji rozkładu białek fluorescencyjnych w komórce oraz przeprowadzenia barwienia swoistymi przeciwciałami. W stadium 10 utrwal embriony przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej przy użyciu utrwalacza gęstego w szklanej fiolce o pojemności czterech mililitrów. Następnie, po przemyciu w PBS, zatop embriony w roztworze 15% żelatyny rybiej i 15% sacharozy w tej samej fiolce.

Następnego dnia przenieść zatopione embriony do plastikowej formy. Szybko zamrozić zatopione embriony na suchym lodzie. Następnie wykonać skrawki kriostatyczne przy użyciu kriotomu.

Przeprowadź barwienie immunofluorescencyjne na skrawkach, zamontuj preparaty i wykonaj obrazowanie embrionów przekrojonych poprzecznie, stosując tę samą metodę, która została opisana dla implantów ektodermy. Pozyskaj obrazy za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu Zeiss Axio plan z odpowiednimi filtrami oraz funkcją umożliwiającą identyfikację i obrazowanie konkretnych płaszczyzn Z w obrębie przekroju X. Na tej rycinie ersin jest zlokalizowany w centrosomie w komórkach ektodermalnych, ale trans jest zlokalizowany w błonie komórkowej.

W odpowiedzi na Frizzled eight, cex GFP znakuje błonę komórkową na zielono. Diverse in RFP jest widoczne na czerwono, a jądra znakowane DPI na niebiesko. Diverse in RFP jest rekrutowane do błony komórkowej przez Frizzled eight w krioskrawkach embrionów.

Gamma-tubulina jest markerem centrosomalnym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat użyteczności embrionów XUS oraz komórek embrionalnych w badaniach nad procesami dokowania i sygnalizacji białek w rozdzielczości subkomórkowej.