System hodowli komórek nabłonka pigmentowego tęczówki do badania regeneracji soczewki u traszki

Ogólnym celem niniejszej procedury jest hodowla barwnikowych komórek nabłonkowych tęczówki w celu zbadania regeneracji soczewki u traszki. Osiąga się to poprzez uprzednie znieczulenie traszki w roztworze usypiającym i usunięcie gałek ocznych.

Drugim krokiem procedury jest wyizolowanie barwnikowych komórek nabłonka tęczówki z tkanki oka, poprzez najpierw usunięcie tkanki siatkówki, a następnie przecięcie fragmentów tęczówki rogówki na połowy grzbietową i brzuszną. Komórki tęczówki są następnie oddzielane od zrębu i hodowane in vitro przez dwa tygodnie. Po dwóch tygodniach Turingu komórki IPE ulegają agregacji, a następnie są implantowane do biorcy, który został lin optimiz.

Po miesiącu gojenia badanie histologiczne wykazuje potencjał regeneracyjny soczewki komórek IPE z części grzbietowej i brzusznej. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa na etapach hodowli komórkowej i implantacji, które są trudne do opanowania, ponieważ wymagają biegłości w wielu umiejętnościach z zakresu mikrodissekcji i zabiegów chirurgicznych. Rozpocznij od znieczulenia co najmniej siedmiu myszy nudes za pomocą 0,1% etylowego estrze trójaminobenzoesanu w kwasie metanosulfonowym, a następnie chirurgicznie usuń ich oczy, używając pęsety i nożyczek chirurgicznych, odcinając powiekę wraz z błoną spojęźniczą. Następnie przetnij nerw wzrokowy.

Następnie szybko przenieś wypreparowane oczy do komory z wyciągiem i wysterylizuj je w etanolu Lugola przez trzy sekundy. Potem przemyj oczy dwukrotnie w roztworze Hanksa wolnym od wapnia i magnezu. Przenieś je do świeżego roztworu Hanksa i kontynuuj dyssekcję.

Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie w oku. Następnie użyj nożyczek, aby wyciąć obszar wokół brzegu rogówki. Usuń soczewkę i odetnij pozostałą tkankę siatkówki wraz z twardówką.

Przenieś kompleksy tęczówkowo-rogówkowe do szalki z nową pożywką Hanksa, używając skalpela nr 15. Rozdziel kompleksy na połowy grzbietową i brzuszną. Tęczówki grzbietowe i brzuszne rozpoznaje się po obecności czarnych plamek na twardówce po stronie grzbietowej oraz V-kształtnym nacięciu na tęczówce brzusznej.

Oddziel brzuszna część tęczówki od grzbietowej części tęczówki. Zbierz fragmenty tęczówki do naczynia o średnicy 35 milimetrów zawierającego 1 mililitr roztworu L 15. Przechowuj połowę grzbietową i brzuszną w osobnych naczyniach.

Następnie dodaj 150 µL roztworu dispa do płytek i inkubuj je przez dwie godziny w temperaturze 27 °C. Aby zebrać komórki IPE ze zrostu, za pomocą pęsety delikatnie oddziel komórki IPE od wszystkich zebranych fragmentów tkanki.

Następnie przenieść komórki IPE do probówki o pojemności 1,5 ml i wirować przy 1000 RPM przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, po czym odrzucić nadsącz. Resuspender osad w 1 ml roztworu Hanksa i powtórzyć wirowanie w celu oddzielenia komórek. Odrzucić roztwór Hanksa i resuspender osad.

W jednym mililitrze roztworu trypsyny w stężeniu 1:250 inkubować przez dwie godziny w temperaturze 27 °C; w celu wypłukania komórek odwiruj je i usuń trypsynę. Dodać jeden mililitr roztworu L 15 i ponownie odwirować, powtórzyć płukanie jeszcze raz, a następnie zastąpić medium 800 µL świeżego roztworu L 15 i delikatnie resuspendować komórki za pomocą pipety. Następnie wysiać komórki na płytki 24-dołkowe pokryte kolagenem.

Zazwyczaj z siedmiu N otrzymuje się cztery studzienki z komórkami grzbietowymi i cztery studzienki z komórkami brzusznymi. Po dwóch tygodniach inkubujy szalkę przez kolejne dwa tygodnie w temperaturze 27 °C. Przedstawione tutaj IPE można transfekować genami w celu zbadania ich funkcji w regeneracji soczewki.

Ta dwutygodniowa hodowla brzusznych komórek IPE wykazuje taką samą morfologię jak komórki grzbietowe. Należy zauważyć, że pigmentacja utrzymuje się na tym etapie zarówno w komórkach grzbietowych, jak i brzusznych tęczówki. Przed implantacją komórki IPE muszą zostać zagregowane poprzez dodanie 20 µL dyse w 400 µL świeżej pożywki hodowlanej do komórek, delikatne zakręcenie płytką i pozostawienie komórek na noc w inkubatorze w temperaturze 27 °C.

Następnego dnia, delikatnie pipetując, odczep komórki, a następnie przenieś je do probówek o pojemności 1,5 ml. Teraz przemyj komórki, wirując probówki i zastępując supernatant 1 ml pożywki L 15. Powtórz ten krok dwukrotnie. Pobierz 10 µl zawiesiny komórkowej, aby obliczyć liczbę komórek przy użyciu standardowych metod.

Po obliczeniach przygotować od 3000 do 5 000 komórek w 200 µL medium L 15 na jeden agregat. Następnie odwirować komórki i inkubować je przez 48 godzin. W temperaturze 27 °C komórki można teraz zaimplantować do zwierzęcia biorcy.

Zacznij od znieczulenia dorosłego osobnika w roztworze usypiającym do momentu, aż przestanie się poruszać. Następnie za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie w rogówce oka. Po tym użyj pęsety, aby usunąć soczewkę.

Po usunięciu soczewki umieść agregat komórek IPE tuż pod tkanką rogówki na brzusznej stronie oka. Następnie przenieś traszkę do osobnego pojemnika i pozostaw ją do wygojenia. W tym czasie obchodź się z traszką ostrożnie, aby nie uszkodzić gojącej się tkanki.

Przeszczepione komórki wymagają miesiąca na regenerację w nową soczewkę. Po upływie miesiąca należy usunąć nowe oczy z implantowanymi agregatami komórkowymi i utrwalić tkankę. Stosując standardowy protokół odwadniania, utrwalony materiał można zalać w formach do zatapiania odpowiednich do wycinania i barwienia przekrojów o grubości 15 µm.

Po implantacji agregatu do oka z nową soczewką, agregat z grzbietowych komórek IPE indukuje tworzenie nowej soczewki. Obserwuje się również indukcję soczewki gospodarza z tęczówki grzbietowej w oku z implantem brzuszny. Nie obserwuje się indukcji soczewki z agregatu przygotowanego z brzusznych komórek IPE; gdy gen six 3 jest nadekspresowany w obecności kwasu retinowego, obserwuje się indukcję soczewki z agregatu brzusznego.

Obserwowano również indukcję soczewki gospodarza z grzbietowej części tęczówki oka po jej rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie regeneracji soczewki do zbadania roli różnych genów w nowym kontekście.