Name: System do hodowli komórek nabłonka barwnikowego tęczówki do badania regeneracji soczewek u traszki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Poznaj metodę hodowli komórek nabłonka barwnikowego tęczówki do badania regeneracji soczewek u traszki. Technika obejmuje izolację, dwutygodniową kulturę in vitro oraz implantację komórek IPE.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu NIH nr Ey10540 przyznanego PAT.

1. Hodowla komórek tęczówki
<ol>
	<li>Pobrać gałki oczne od 7 traszek (znieczulonych 0,1% roztworem metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu przygotowanym w PBS) i umieścić je w roztworze Hanksa bez wapnia i magnezu (CMF).</li>
	<li>Zmienić rękawiczki i pracować w komorze do hodowli tkanek.</li>
	<li>Zsterylizować gałki oczne w mieszaninie Lugola i EtOH przez 3 sekundy.</li>
	<li>Przepłukać 2 razy w CMF.</li>
	<li>Przenieść oczy do roztworu Hanksa i rozpocząć sekcję.</li>
	<li>Wypreparować kompleks tęczówkowo-rogówkowy i usunąć siatkówkę nerwową.</li>
	<li>Przenieść kompleksy do nowej szalki z roztworem Hanksa.</li>
	<li>Za pomocą skalpela nr 15 podzielić kompleksy na połowy grzbietową i brzuszną.</li>
	<li>Usunąć fragmenty tęczówki (najpierw brzuszne) i umieścić je w szalce zawierającej 1 ml L-15.</li>
	<li>Dodać 15% (150 µl) objętości dyspazy (stężenie 7,5 units/ml).</li>
	<li>Inkubować w 27°C przez 2 godziny (owinąć szalkę parafilmem).</li>
	<li>Wyizolować komórki IPE ze zrębu (przygotować roztwór trypsyny w 27°C).</li>
	<li>Zebrać komórki IPE do probówki 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować przy 1000 rpm w RT (temperaturze pokojowej) przez 2 minuty, a następnie usunąć nadsącz.</li>
	<li>Przepłukać 1 ml roztworu Hanksa i wirować przy 1000 rpm w RT przez 2 minuty, a następnie usunąć nadsącz.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu trypsyny; inkubować przez 2 godziny w 27°C.</li>
	<li>Wirować przy 1000 rpm w RT przez 2 minuty, a następnie usunąć trypsynę.</li>
	<li>Dodać 1 ml L-15 w celu przemycia, wirować przy 1000 rpm przez 2 minuty.</li>
	<li>Dodać 800 µl L-15, powoli pipetować w górę i w dół ok. 10 razy (więcej niż 12 razy zmniejsza adhezję).</li>
	<li>Wysiać komórki IPE na płytkę 24-dołkową powleczoną kolagenem i inkubować w 27°C przez 2 tygodnie (zazwyczaj od 7 traszek uzyskuje się 4 dołki grzbietowych i 4 brzusznych).</li>
	<li>Na tym etapie komórki nadają się do transfekcji genetycznej lub traktowania czynnikami w celu określenia ich roli w indukowaniu lub hamowaniu regeneracji soczewki.</li>
</ol>
2. Agregacja komórek tęczówki
<ol>
	<li>Do płytek zawierających komórki tęczówki dodać 20μl roztworu dyspazy do 400 μl pożywki, delikatnie zamieszać okrężnymi ruchami.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 27°C przez noc.</li>
	<li>Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby odczepić komórki.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki Eppendorf i wirować przez 2 minuty przy 1000 rpm w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i wypłukać, dodając 1 ml pełnej pożywki L-15, wirować przez 2 minuty przy 1000 rpm w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć pożywkę.</li>
	<li>Użyć od 2000 do 7000 komórek na jeden agregat. Do każdej probówki dodać 200 ul pożywki L-15 na agregat.</li>
	<li>Rozdzielić komórki (200 μl) do nowych probówek Eppendorf.</li>
	<li>Wirować przy 1000 rpm przez 2 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować przez 48 h w temperaturze 27°C.</li>
</ol>
3. Implantacja zagregowanych komórek
<ol>
	<li>Należy naciąć rogówkę oka traszki i usunąć soczewkę.</li>
	<li>Po usunięciu soczewki należy umieścić agregat komórek IPE bezpośrednio pod tkanką rogówki po stronie brzusznej oka.</li>
	<li>Traszki są utrzymywane przez miesiąc, aby umożliwić regenerację soczewki.</li>
</ol>
4. Zatapianie oka traszki
<ol>
	<li>Wyjąć oczy traszy z implantowanym agregatem i umieścić je w soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).</li>
	<li>Utrwalić w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4°C przez co najmniej 4 h lub przez noc.</li>
	<li>Przemyć w PBS, 4°C przez 30 minut.</li>
	<li>Potraktować 0,85% roztworem soli fizjologicznej: 4°C, 30 minut.</li>
	<li>Przemyć w roztworze soli fizjologicznej/etanolu (1:1): RT przez 15 minut.</li>
	<li>Przemyć w 70% etanolu: RT, 15 minut. Powtórzyć tę czynność raz.</li>
	<li>Przemyć w 85% etanolu i 95% etanolu w RT, po 30 minut w każdym roztworze.</li>
	<li>Przemyć w 100% etanolu: RT, 30 minut. Powtórzyć tę czynność raz.</li>
	<li>Przechowywać w 4°C lub kontynuować procedurę.</li>
	<li>Przemyć w 100% ksylenie: RT, 30 minut. Powtórzyć tę czynność raz.</li>
	<li>Potraktować mieszaniną ksylenu/parafiny (1:1): 60°C, 45 minut.</li>
	<li>Potraktować 100% parafiną: 60°C, 20 minut. Powtórzyć tę czynność jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Zatopić w formach do odlewania.</li>
</ol>
5. Krojenie na sekcje
<ol>
	<li>Przygotować skrawki osadzonego oka o grubości 15 μm za pomocą mikrotomu.</li>
	<li>Umieścić skrawki oka na szkiełku pokrytym żelatyną i pozostawić je na podgrzewaczu do szkiełek.</li>
</ol>
6. Barwienie
<ol>
	<li>Umieścić preparaty w ksylenie na 10 minut. Powtórzyć tę czynność jeszcze raz.</li>
	<li>Nawodnić w: 100%, 95%, 80%, 70%, 30% etanolu po 1 minucie w każdym roztworze.</li>
	<li>Płukać w wodzie dejonizowanej przez minutę.</li>
	<li>Przemyć w PBS przez 15 minut.</li>
	<li>Przemyć w PBST (0,2% Triton-X 100 w PBS) przez 15 minut.</li>
	<li>Przemyć w PBS przez 15 minut.</li>
	<li>Umieścić w roztworze blokującym (10% przeciwciała wtórnego koziego) na godzinę.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc.</li>
	<li>Przemyć przeciwciało pierwszorzędowe w PBS przez 15 minut.</li>
	<li>Przemyć w PBST przez 15 minut.</li>
	<li>Przemyć w PBS przez 15 minut.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem wtórnym przez 2 godziny w ciemności (rozcieńczenie 1:100 w PBS).</li>
	<li>Przemyć w PBS, PBST i PBS po 15 minut w każdym roztworze, a następnie zamontować preparat.</li>
	<li>Obserwować preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
Niniejsza procedura hodowli komórek tęczówki traszki była wykorzystywana do badania potencjału regeneracyjnego komórek IPE z części grzbietowej i brzusznej. Ponadto możliwe jest badanie specyficznych genów przyczyniających się do mechanizmu regeneracji soczewki w oku traszki. Po 2 tygodniach hodowli komórek (Rysunek 1) można przeprowadzić ich transfekcję genami w celu zbadania ich funkcji w regeneracji soczewki. Szczególne zainteresowanie budzą geny, które mogą indukować tęczówkę brzuszną. Ponieważ komórki tęczówki brzusznej nie potrafią ulec transdyferencjacji w soczewkę (Rysunek 2), można badać funkcję indukcyjną kandydującego genu. W przeszłości, stosując tę technikę, wykazaliśmy, że nadekspresja six-3 w obecności kwasu retinowego prowadziła do indukcji soczewki z tęczówki brzusznej 6. Na Rysunku 3 widać, że agregat z tęczówki brzusznej doprowadził do powstania w pełni wyrośniętej i zróżnicowanej soczewki (grot strzałki), która nie różni się od soczewki gospodarza z tęczówki grzbietowej (strzałka).
<img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy kultur komórkowych; analiza porównawcza morfologii komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. a) Komórki nabłonka pigmentowego grzbietowej części tęczówki hodowane in vitro przez okres 2 tygodni. b) Komórki nabłonka pigmentowego brzusznej części tęczówki hodowane in vitro przez okres 2 tygodni. Zauważmy, że pigmentacja utrzymuje się na tym etapie zarówno w komórkach grzbietowych, jak i brzusznych części tęczówki.
<img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig2.jpg" alt="Obraz mikroskopowy analizy struktury komórkowej, wyróżniający cechy różnicujące i komponenty komórkowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Zdolność do regeneracji hodowanych komórek IPE. a) Indukcja soczewki z agregatu grzbietowych komórek IPE (grot strzałki). Indukcja soczewki gospodarza z grzbietowej części tęczówki (strzałka), di: grzbietowa część tęczówki, vi: brzuszna część tęczówki, le: nabłonek soczewki, lf: włókna soczewki. b) Brak indukcji soczewki z agregatu brzusznych komórek IPE (grot strzałki). Indukcja soczewki gospodarza z grzbietowej części tęczówki (strzałka).
<img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig3.jpg" alt="Identyfikacja pasożyta, obraz mikroskopowy; Trichinella spiralis; analiza przekroju tkanki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Indukcja soczewki z agregatu brzusznego przetransfekowanego six-3 i traktowanego kwasem retinowym. Indukcja soczewki gospodarza z grzbietowej części tęczówki (strzałka). Indukcja soczewki z agregatu brzusznego (grot strzałki).

<ol><li>Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regeneration in vertebrates.</a> Dev Biol. 221, 273-284 (2000).</li>
<li>Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newt%27s+eye+view+of+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A newt's eye view of lens regeneration.</a> Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).</li>
<li>Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+regeneration+at+the+molecular+age%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Eye regeneration at the molecular age.</a> Dev. Dyn. , 226-2211 (2003).</li>
<li>Okamoto, M., Ito, M., Owaribe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+between+dorsal+and+ventral+iris+in+lens+producing+potency+in+normal+lens+regeneration+is+maintained+after+dissociation+and+reaggregation+of+cells+from+the+adult+newt%2C+Cynops+pyrrhogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Difference between dorsal and ventral iris in lens producing potency in normal lens regeneration is maintained after dissociation and reaggregation of cells from the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> Develop Growth Differ. 40, 11-18 (1998).</li>
<li>Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+system+for+functional+gene+analysis+in+adult+amphibian+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection system for functional gene analysis in adult amphibian lens regeneration.</a> Develop Growth Differ. 43, 361-370 (2001).</li>
<li>Grogg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+inhibition-driven+regulation+of+six-3+underlies+induction+of+newt+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BMP inhibition-driven regulation of six-3 underlies induction of newt lens regeneration.</a> Nature. 438, 858-862 (2005).</li>
<li>Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+in+Newt+Lens+Regeneration%3A+Specific+Control+of+Proliferation+and+Evidence+for+miRNA+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miRNAs in Newt Lens Regeneration: Specific Control of Proliferation and Evidence for miRNA Networking.</a> PLoS One. 5, e12058-e12058 (2010).</li>
<li>Madhavan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax-6+in+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The role of Pax-6 in lens regeneration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14848-14853 (2006).</li>
<li>Maki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-type+linker+histone+B4+is+required+for+transdifferentiation+of+somatic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Oocyte-type linker histone B4 is required for transdifferentiation of somatic cells in vivo.</a> FASEB J. 24, 3462-3467 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Niniejszy protokół ustanowił system in vitro do badania mechanizmów regeneracji soczewki u salamander. Ponieważ agregaty (zarówno grzbietowe, jak i brzuszne) wiernie odwzorowują zachowanie in vivo podczas regeneracji, technika ta może ograniczyć ogromny wysiłek wymagany przy transgenezie u salamander i może być wykorzystywana w eksperymentach typu „gain of function” (zyskanie funkcji), jak i „loss of function” (utrata funkcji) 7,8,9 . Ponadto agregaty lub tęczówki jako całość mogą być łatwo traktowane czynnikami wzrostu w celu zbadania ich efektów, zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Przykładowo, za pomocą tej techniki zbadano rolę szlaku BMP 6.

<table><tbody><tr><td>Roztwór Lugola&amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6146</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 3-aminobenzoesanu etylu metanosulfonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>Dyspaza</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 1:250</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>L-15 (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4386</td><td></td></tr><tr><td>DNaza 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>100x, 15160</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone (roztwór amfoterycyny B)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa powlekana kolagenem</td><td>BD Biosciences</td><td>354408</td><td></td></tr></tbody></table>

system hodowli komórek nabłonka pigmentowego tęczówki do badania regeneracji soczewki u traszki

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamandry, takie jak traszki i aksolotle, posiadają zdolność do regeneracji wielu utraconych części ciała, w tym kończyn, ogona wraz z rdzeniem kręgowym, oka, mózgu, serca oraz żuchwy 1. W szczególności traszki wyróżniają się zdolnością do regeneracji soczewki. Po usunięciu soczewki komórki nabłonka pigmentowego tęczówki (IPE) z grzbietowej części tęczówki ulegają transdyferencjacji w komórki soczewki, co w ciągu około miesiąca prowadzi do utworzenia nowej soczewki 2,3. Właściwość regeneracyjna ta nigdy nie występuje w przypadku komórek brzusznej części tęczówki. Potencjał regeneracyjny komórek tęczówki można badać poprzez przeszczepy komórek IPE hodowanych in vitro. W celu przeprowadzenia hodowli, komórki grzbietowej i brzusznej części tęczówki są najpierw izolowane z oka, a następnie hodowane oddzielnie przez okres 2 tygodni (Rysunek 1). Hodowane komórki są reaggregowane i reimplantowane do oka traszki. Dotychczasowe badania wykazały, że reaggregat grzbietowy zachowuje zdolność do tworzenia soczewki, podczas gdy agregat brzuszny nie tworzy soczewki, co odtwarza tym samym proces zachodzący in vivo (Rysunek 2) 4,5. Ten system określania potencjału regeneracyjnego komórek grzbietowej i brzusznej części tęczówki jest bardzo użyteczny w badaniu roli genów i białek zaangażowanych w regenerację soczewki.

U salamandry soczyście zielonej soczewka regeneruje się zawsze z grzbietowej części tęczówki poprzez transdyferencjację barwnikowych komórek nabłonka tęczówki (IPEs). W niniejszej pracy opisujemy procedurę hodowli komórek IPE z grzbietowej i brzusznej części tęczówki salamandry oraz ich implantację do oka tego zwierzęcia. Implantowane komórki są następnie analizowane za pomocą technik sekcjonowania tkanek i immunohistochemii.

System hodowli komórek nabłonka pigmentowego tęczówki do badania regeneracji soczewki u traszki

Salamandry, takie jak traszki i aksolotle, posiadają zdolność do regeneracji wielu utraconych części ciała, m.in. kończyn, ogona wraz z rdzeniem kręgowym, oka oraz mózgu.

Ogólnym celem niniejszej procedury jest hodowla barwnikowych komórek nabłonkowych tęczówki w celu zbadania regeneracji soczewki u traszki. Osiąga się to poprzez uprzednie znieczulenie traszki w roztworze usypiającym i usunięcie gałek ocznych.Drugim krokiem procedury jest wyizolowanie barwnikowych komórek nabłonka tęczówki z tkanki oka, poprzez najpierw usunięcie tkanki siatkówki, a następnie przecięcie fragmentów tęczówki rogówki na połowy grzbietową i brzuszną. Komórki tęczówki są następnie oddzielane od zrębu i hodowane in vitro przez dwa tygodnie. Po dwóch tygodniach Turingu komórki IPE ulegają agregacji, a następnie są implantowane do biorcy, który został lin optimiz.Po miesiącu gojenia badanie histologiczne wykazuje potencjał regeneracyjny soczewki komórek IPE z części grzbietowej i brzusznej. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa na etapach hodowli komórkowej i implantacji, które są trudne do opanowania, ponieważ wymagają biegłości w wielu umiejętnościach z zakresu mikrodissekcji i zabiegów chirurgicznych. Rozpocznij od znieczulenia co najmniej siedmiu myszy nudes za pomocą 0,1% etylowego estrze trójaminobenzoesanu w kwasie metanosulfonowym, a następnie chirurgicznie usuń ich oczy, używając pęsety i nożyczek chirurgicznych, odcinając powiekę wraz z błoną spojęźniczą. Następnie przetnij nerw wzrokowy.Następnie szybko przenieś wypreparowane oczy do komory z wyciągiem i wysterylizuj je w etanolu Lugola przez trzy sekundy. Potem przemyj oczy dwukrotnie w roztworze Hanksa wolnym od wapnia i magnezu. Przenieś je do świeżego roztworu Hanksa i kontynuuj dyssekcję.Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie w oku. Następnie użyj nożyczek, aby wyciąć obszar wokół brzegu rogówki. Usuń soczewkę i odetnij pozostałą tkankę siatkówki wraz z twardówką.Przenieś kompleksy tęczówkowo-rogówkowe do szalki z nową pożywką Hanksa, używając skalpela nr 15. Rozdziel kompleksy na połowy grzbietową i brzuszną. Tęczówki grzbietowe i brzuszne rozpoznaje się po obecności czarnych plamek na twardówce po stronie grzbietowej oraz V-kształtnym nacięciu na tęczówce brzusznej.Oddziel brzuszna część tęczówki od grzbietowej części tęczówki. Zbierz fragmenty tęczówki do naczynia o średnicy 35 milimetrów zawierającego 1 mililitr roztworu L 15. Przechowuj połowę grzbietową i brzuszną w osobnych naczyniach.Następnie dodaj 150 µL roztworu dispa do płytek i inkubuj je przez dwie godziny w temperaturze 27 °C. Aby zebrać komórki IPE ze zrostu, za pomocą pęsety delikatnie oddziel komórki IPE od wszystkich zebranych fragmentów tkanki.Następnie przenieść komórki IPE do probówki o pojemności 1,5 ml i wirować przy 1000 RPM przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, po czym odrzucić nadsącz. Resuspender osad w 1 ml roztworu Hanksa i powtórzyć wirowanie w celu oddzielenia komórek. Odrzucić roztwór Hanksa i resuspender osad.W jednym mililitrze roztworu trypsyny w stężeniu 1:250 inkubować przez dwie godziny w temperaturze 27 °C; w celu wypłukania komórek odwiruj je i usuń trypsynę. Dodać jeden mililitr roztworu L 15 i ponownie odwirować, powtórzyć płukanie jeszcze raz, a następnie zastąpić medium 800 µL świeżego roztworu L 15 i delikatnie resuspendować komórki za pomocą pipety. Następnie wysiać komórki na płytki 24-dołkowe pokryte kolagenem.Zazwyczaj z siedmiu N otrzymuje się cztery studzienki z komórkami grzbietowymi i cztery studzienki z komórkami brzusznymi. Po dwóch tygodniach inkubujy szalkę przez kolejne dwa tygodnie w temperaturze 27 °C. Przedstawione tutaj IPE można transfekować genami w celu zbadania ich funkcji w regeneracji soczewki.Ta dwutygodniowa hodowla brzusznych komórek IPE wykazuje taką samą morfologię jak komórki grzbietowe. Należy zauważyć, że pigmentacja utrzymuje się na tym etapie zarówno w komórkach grzbietowych, jak i brzusznych tęczówki. Przed implantacją komórki IPE muszą zostać zagregowane poprzez dodanie 20 µL dyse w 400 µL świeżej pożywki hodowlanej do komórek, delikatne zakręcenie płytką i pozostawienie komórek na noc w inkubatorze w temperaturze 27 °C.Następnego dnia, delikatnie pipetując, odczep komórki, a następnie przenieś je do probówek o pojemności 1,5 ml. Teraz przemyj komórki, wirując probówki i zastępując supernatant 1 ml pożywki L 15. Powtórz ten krok dwukrotnie. Pobierz 10 µl zawiesiny komórkowej, aby obliczyć liczbę komórek przy użyciu standardowych metod.Po obliczeniach przygotować od 3000 do 5 000 komórek w 200 µL medium L 15 na jeden agregat. Następnie odwirować komórki i inkubować je przez 48 godzin. W temperaturze 27 °C komórki można teraz zaimplantować do zwierzęcia biorcy.Zacznij od znieczulenia dorosłego osobnika w roztworze usypiającym do momentu, aż przestanie się poruszać. Następnie za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie w rogówce oka. Po tym użyj pęsety, aby usunąć soczewkę.Po usunięciu soczewki umieść agregat komórek IPE tuż pod tkanką rogówki na brzusznej stronie oka. Następnie przenieś traszkę do osobnego pojemnika i pozostaw ją do wygojenia. W tym czasie obchodź się z traszką ostrożnie, aby nie uszkodzić gojącej się tkanki.Przeszczepione komórki wymagają miesiąca na regenerację w nową soczewkę. Po upływie miesiąca należy usunąć nowe oczy z implantowanymi agregatami komórkowymi i utrwalić tkankę. Stosując standardowy protokół odwadniania, utrwalony materiał można zalać w formach do zatapiania odpowiednich do wycinania i barwienia przekrojów o grubości 15 µm.Po implantacji agregatu do oka z nową soczewką, agregat z grzbietowych komórek IPE indukuje tworzenie nowej soczewki. Obserwuje się również indukcję soczewki gospodarza z tęczówki grzbietowej w oku z implantem brzuszny. Nie obserwuje się indukcji soczewki z agregatu przygotowanego z brzusznych komórek IPE; gdy gen six 3 jest nadekspresowany w obecności kwasu retinowego, obserwuje się indukcję soczewki z agregatu brzusznego.Obserwowano również indukcję soczewki gospodarza z grzbietowej części tęczówki oka po jej rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie regeneracji soczewki do zbadania roli różnych genów w nowym kontekście.

a-system-for-culturing-iris-pigment-epithelial-cells-to-study-lens

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

System do hodowli komórek nabłonka barwnikowego tęczówki do badania regeneracji soczewki u salamandry

Niniejszy artykuł przedstawia metodę preparowania i inkubacji siatkówki królika oraz zapośredniczony przez cząsteczki transfer genów plazmidów kodujących GFP lub różne markery subkomórkowe do komórek zwojowych siatkówki.

Organotypowa hodowla siatkówki dorosłego królika

Eksplanty z regionu centralnego nabłonka soczewki szczura różnicują się synchronicznie podczas hodowli w obecności FGF-2. Mikroskopia immunofluorescencyjna takich hodowli może dostarczyć nowych informacji na temat ekspresji genów i zdarzeń sygnalizacyjnych związanych z różnicowaniem końcowym.<br...

Przygotowanie i hodowla eksplantów nabłonka soczewki szczura do badań nad różnicowaniem terminalnym

Przedstawiamy powtarzalną metodę hodowli konfluentnych monowarstw ludzkich płodowych komórek nabłonka pigmentowego siatkówki (hfRPE), które wykazują morfologię, fizjologię, polarność oraz wzorce ekspresji białek i genów charakterystyczne dla natywnej tkanki dorosłego organizmu. Praca ta została rozszerzona o model zwierzęcy kilku chorób oczu.

Modele eksperymentalne do badania fizjologii i patofizjologii nabłonka pigmentowego siatkówki

W tym filmie pokazujemy procedurę pozyskiwania komórek nabłonka pigmentowego oka od modelu królika. Komórki są pomocne w opracowywaniu strategii terapeutycznych w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki.

Izolowanie komórek IPE i RPE: technika pozyskiwania komórek nabłonka pigmentowego oka z oka królika

Ten film pokazuje procedurę izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) i komórek nabłonka barwnika tęczówki (IPE) z pobranych oczu bydła. Wyizolowane komórki można hodować w celu zbadania ich roli w leczeniu chorób oczu.

Izolowanie komórek RPE i IPE z oka bydła: procedura zbierania i hodowli pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego bydła

Opisane tutaj jest ustanowienie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów reakcji na uszkodzenia tkanek nabłonkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku.

Opracowanie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo do badania naprawy ran nabłonkowych w rodzimym mikrośrodowisku

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Celem tego protokołu jest pokazanie hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) na starzejącej się i/lub chorej ludzkiej błonie Brucha. Ta metoda jest odpowiednia do badania zachowania komórek RPE na uszkodzonej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na modelu ex vivo starzejącej się błony błony mięśniowej człowieka

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i transfekcji pierwotnych komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki od różnych ssaków (myszy, szczury, króliki, świnie i bydło). Metoda ta idealnie nadaje się do badania podejść do ocznej terapii genowej w różnych konfiguracjach do analiz ex vivo i badań in vivo, które można przenieść na ludzi.

Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół wideo do hodowli komórek nabłonka soczewki pierwotnej (LEC), mający na celu poprawę odtwarzalności i pomoc w badaniach nad zaćmą i zmętnieniem torebki tylnej (PCO). Oferuje instrukcje krok po kroku dotyczące rozwarstwiania soczewek, izolacji LEC i walidacji, służąc jako cenny przewodnik, szczególnie dla nowicjuszy w tej dziedzinie.

Optymalizacja hodowli komórek nabłonka soczewek pierwotnych myszy: kompleksowy przewodnik po trypsynizacji

Obecne protokoły opisują nowatorskie obrazowanie całego mocowania do wizualizacji struktur peryferyjnych w soczewce oka z metodami kwantyfikacji obrazu. Protokoły te mogą być wykorzystywane w badaniach w celu lepszego zrozumienia związku między strukturami mikroskali soczewek a rozwojem/funkcją soczewki.

Obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek

Poznaj metodę hodowli komórek nabłonka barwnikowego tęczówki do badania regeneracji soczewek u traszki. Technika obejmuje izolację, dwutygodniową kulturę in vitro oraz implantację komórek IPE.

System hodowli komórek nabłonka pigmentowego tęczówki do badania regeneracji soczewki u traszki

Przeglądaj więcej filmów