Name: Prosty protokół hodowli komórek wiszących do generowania sferoid 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Naucz się generować sferoidy 3D metodą wiszących kropel do badań interakcji komórkowych. Ta technika pozwala tworzyć agregaty tkankopodobne w ciągu 24–48 godzin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor pragnie podziękować dr. Dongxuan Jia za pomoc techniczną. Niektóre z obrazów zamieszczonych w niniejszym artykule powstały we współpracy z dr. Malcolmem S. Steinbergiem z Katedry Biologii Molekularnej na Uniwersytecie Princeton. Autor dziękuje również Programowi Badań nad Rakiem Prostaty Departamentu Obrony (granty PC-030482 i PC-991552) oraz NCI/NIH (grant R01CA118755) za ich hojne wsparcie.

1. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Adherentne kultury komórkowe należy hodować do osiągnięcia 90% konfluencji, po czym monowarstwy należy dwukrotnie przepłukać PBS. Po dokładnym odlaniu płynu, dodać 2 ml (dla płytek 100 mm) 0,05% trypsyny-1 mM EDTA i inkubować w 37°C do czasu odklejenia się komórek. Proces trypsynizacji należy przerwać, dodając 2 ml pożywki kompletnej, a następnie delikatnie pipetować mieszaninę za pomocą pipety 5 ml do uzyskania zawiesiny komórkowej. Komórki przenieść do probówki stożkowej 15 ml.</li>
	<li>Dodać 40 μl roztoku DNAzy o stężeniu 10 mg/ml i inkubować przez 5 minut w RT. Krótko wymieszać na wortexie i wirować przy 200 XG przez 5 minut.</li>
	<li>Odlać nadsącz i przemyć osad 1 ml kompletnej pożywki do hodowli tkankowej. Powtórzyć czynność, a następnie resuspendować komórki w 2 ml kompletnej pożywki do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Policzyć komórki za pomocą hemacytometru lub automatycznego licznika komórek i dostosować stężenie do 2,5 x 106 komórek/ml. W niniejszej demonstracji użyto automatycznego licznika komórek BioRad TC10.</li>
</ol>
2. Formowanie kropel wiszących.
<ol>
	<li>Zdejmij pokrywkę z 60 mm szalki hodowlanej i wlej 5 mls PBS na dno szalki. Będzie ona pełnić funkcję komory nawilżającej.</li>
	<li>Odwróć pokrywkę i za pomocą pipety 20 μl nanieś krople o objętości 10 μl na jej wewnętrzną stronę. Upewnij się, że krople są rozmieszczone w odpowiednich odstępach, tak aby się nie stykały. Na jednej pokrywce można nanieść co najmniej 20 kropel.</li>
	<li>Nałóż odwróconą pokrywkę na dno szalki wypełnione PBS i inkubuj w temperaturze 37°C przy 5% CO2 i 95% wilgotności; monitoruj krople codziennie i inkubuj do czasu utworzenia się płatów komórkowych lub agregatów. Do oceny tworzenia się agregatów można użyć stereomikroskopu.</li>
	<li>Po utworzeniu się płatów można je przenieść do szklanych kolb z okrągłym dnem zawierających 3 mls pełnej pożywki i inkubować w wytrząsanej kąpieli wodnej w temperaturze 37°C i 5% CO2 aż do momentu powstania sferoidów.</li>
</ol>
3. Uwagi
<ol>
	<li>W zależności od wielkości komórek może być konieczna korekta stężenia w górę lub w dół.</li>
	<li>Przed utworzeniem kropli wiszącej komórki można barwić fluorescencyjnymi barwnikami interkalującymi w błonę.</li>
	<li>Dwa różne typy komórek można zbarwić różnymi barwnikami i wymieszać w stosunku 1:1 (lub innym) przed utworzeniem kropli wiszącej. Mogą to być komórki nowotworowe i stromalne, tkanki embrionalne lub komórki zmodyfikowane genetycznie tak, aby posiadały specyficzne sygnatury adhezyjne.</li>
	<li>Komórki można odłączyć od naczyń hodowlanych, używając 0,05% trypsyny/2 mM wapnia, aby zachować funkcję kadheryn.</li>
	<li>W zależności od eksperymentu można zmierzyć wielkość arkuszy lub wykorzystać agregaty do testów mechanicznych bądź do analiz biochemicznych lub molekularnych.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Tworzenie się arkusza lub sferoidy zazwyczaj następuje w ciągu 24 godzin, jednak czas ten może być dłuższy w zależności od typu komórek. Rysunek 1 przedstawia obrazy wykonane po 18 godzinach inkubacji nieleczonych komórek raka prostaty MAT-LyLu (MLL) w kulturze kropli wiszących (Rysunek 1A) oraz komórek traktowanych inhibitorem MEK PD98059 w stężeniu 25 μm. Należy zauważyć, że zastosowanie MEKi prowadzi do wyraźnego zagęszczenia arkusza komórkowego. Zagęszczenie można określić ilościowo, mierząc rozmiar 10–20 (lub więcej) kropli wiszących i porównując średnią wielkość między grupami badawczymi. Zazwyczaj analizujemy obrazy przy użyciu oprogramowania ImageJ, stosując progowanie każdego obrazu, a następnie konwertując obrazy na tryb binarny, po czym przeprowadzamy analizę cząstek w celu wyznaczenia całkowitej powierzchni obrazu w pikselach. Wartość tę można następnie łatwo przeliczyć na mikrony kwadratowe. Rysunek 2 przedstawia porównanie wielkości nieleczonych i traktowanych MEKi komórek MLL. Jak zaznaczono, zastosowanie MEKi znacząco redukuje wielkość arkusza, co potwierdzono testem t Studenta (P&lt;0.0001). Do tego porównania zmierzono 10 agregatów dla każdej z grup komórek nieleczonych i traktowanych. Rysunek 3 przedstawia sferoidę embrionalnej wątroby kurczaka, utworzoną po 24 godzinach w kulturze kropli wiszących i 2 dniach w łaźni wytrząsowej.
Test wiszącej kropli można również zmodyfikować, aby objął więcej niż jeden typ komórek, co pozwala na ujawnienie przyjmowanego rozmieszczenia przestrzennego. Na przykład można wyizolować embrionalne komórki wątroby kurczaka, zabarwić je fluorescencyjnym barwnikiem interkalującym w błonę i zmieszać z embrionalnymi komórkami serca kurczaka, które zostały zabarwione innym markerem fluorescencyjnym. Rycina 4A pokazuje, że zamiast pozostać wymieszane, komórki wątroby i serca mają tendencję do „sortowania się” od siebie i przyjmowania konfiguracji sfery wewnątrz sfery, w której komórki serca są otoczone przez komórki wątroby. Konfigurację tę można wyjaśnić różnicami w adhezji międzykomórkowej między komórkami wątroby a komórkami serca. Koncepcja ta została skodyfikowana w hipotezie różnicowej adhezji (Differential Adhesion Hypothesis), która była wykorzystywana do wyjaśnienia zachowania sortowania komórek między tkankami zarodkowych warstw embrionów płazów3 i ryb kostnoszkieletowych 4, organizacji komórek wysepek trzustkowych 5 oraz sortowania komórek między dwiema populacjami komórek identycznymi pod każdym względem z wyjątkiem poziomów ekspresji tego samego typu kadheryny (6 i Rycina 4B). Wynik ten jest szczególnie istotny dla zademonstrowania, w jaki sposób zaprojektowanie prostej różnicy w adhezji między populacjami komórek może prowadzić do powstania struktury narządu, na przykład wysepki trzustkowej 5.
 <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig1.jpg" alt="Porównanie agregacji komórek, obraz mikroskopowy; A: duży agregat, B: mały agregat do badań." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Obrazy komórek inkubowanych w kulturze kropli wiszącej przez 18 godzin w obecności (B) lub w nieobecności (A) 25 μm inhibitora MEK PD98059. Obrazy zostały wykonane przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego Nikon Eclipse TE 300 oraz cyfrowej kamery Photometrics CoolSnap ES.
 <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig2.jpg" alt="Wykres słupkowy porównujący rozmiar agregatów MLL i MLL+MEKi do analizy statystycznej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Ilościowe określenie kondensacji komórek MLL raka prostaty szczura indukowanej przez MEKi. Hodowle w kropelkach wiszących z nieleczonych i leczonych MEKi komórek MLL inkubowano przez 18 godzin, po czym określono rozmiar agregatów zgodnie z powyższym opisem. Analizę statystyczną rozmiaru agregatów przeprowadzono za pomocą testu t Studenta. Gwiazdka oznacza statystycznie istotną różnicę w rozmiarze agregatów (P&lt;0.0001) między komórkami nieleczonymi a leczonymi MEKi i sugeruje, że leczenie MEKi prowadzi do powstania znacznie mniejszych i bardziej zwartych agregatów.
 <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig3.jpg" alt="Równowaga statyczna; sfera na krawędzi; schemat fizyczny; stabilność; analiza równowagi." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Sferoid powstały w wyniku inkubacji zarodkowych komórek wątroby kurczaka w kulturze wiszącej kropli przez 18 godzin, a następnie w inkubatorze z wytrząsarką przez 48 godzin. Obraz został wykonany przy użyciu stereomikroskopu Nikon SMZ800 i kamery Sony Black CCD.
 <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig4.jpg" alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej, struktura komórkowa, analiza emisji, wyniki zakodowane kolorami." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Hodowla w kropelce wiszącej wykazuje zachowanie sortowania między różnymi typami komórek. Na panelu A komórki zarodkowej wątroby kurczaka barwiono barwnikiem wbudowującym się w błonę PKH-2 i mieszano w równych proporcjach z komórkami zarodkowego serca kurczaka barwionymi PKH-26. Na panelu B dwa klony komórek L z transfekcją N-kadheryny (LN4 i LN2a), wykazujące ekspresję N-kad na swojej powierzchni w stosunku 2,4:1, zostały również zabarwione fluorescencyjnymi barwnikami wbudowującymi się w błonę PKH-2 i PKH-26 (Sigma-Aldrich), zmieszane w równych proporcjach i hodowane w kropelkach wiszących7. Po 18 godzinach hodowli arkusze komórkowe przeniesiono do kolb z wytrząsarką i inkubowano przez kolejne 48 godzin. Agregaty utrwalono w 2% paraformaldehydzie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem i obrazowano za pomocą systemu skaningowego laserowego mikroskopu konfokalnego BioRad MRC600 połączonego z mikroskopem Nikon Optiphot-2. Zebrano przekroje optyczne z kanału zielonego i czerwonego, a stacja robocza Silicon Graphix Crimson VGX wyposażona w oprogramowanie do obrazowania Vital Images Voxel View Ultra służyła do przypisania kolorów sztucznych do obu kanałów i do nałożenia obrazów, co ujawniło powstałe konfiguracje anatomiczne. (A) Konfokalny przekrój optyczny przez agregat wykazujący otaczanie komórek serca (tutaj w pseudokolorze żółtym) przez komórki wątroby w pseudokolorze niebieskim (z 8). (B) Konfokalny przekrój optyczny przez agregat wykazujący otaczanie komórek o wysokiej ekspresji N-kadheryny (zielone) przez komórki o niższym poziomie ekspresji N-kadheryny (czerwone) (z 6).

<ol><li>Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+with+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell interactions with three-dimensional matrices.</a> Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).</li>
<li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+extracellular+matrix%2C+scaffolds%2C+and+signaling%3A+tissue+architecture+regulates+development%2C+homeostasis%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).</li>
<li>Davis, G. S., Phillips, H. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-layer+surface+tensions+and+%26quot%3Btissue+affinities%26quot%3B+in+Rana+pipiens+gastrulae%3A+quantitative+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ-layer surface tensions and &quot;tissue affinities&quot; in Rana pipiens gastrulae: quantitative measurements.</a> Dev Biol. 192, 630-644 (1997).</li>
<li>Schotz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+differences+in+tissue+surface+tension+influence+zebrafish+germ+layer+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning.</a> HFSP J. 2, 42-56 (2008).</li>
<li>Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+surface+tensions+guide+in+vitro+self-assembly+of+rodent+pancreatic+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells.</a> Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).</li>
<li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+adhesion+hypothesis%3A+a+direct+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation.</a> Dev Biol. 278, 255-263 (2005).</li>
<li>Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+casein+kinase+2+subunits+in+Chinese+hamster+ovary+and+3T3+L1+cells+provides+information+on+the+role+of+the+enzyme+in+cell+proliferation+and+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of the casein kinase 2 subunits in Chinese hamster ovary and 3T3 L1 cells provides information on the role of the enzyme in cell proliferation and the cell cycle.</a> J Biol Chem. 274, 32988-32996 (1999).</li>
<li>Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+tensions+of+embryonic+tissues+predict+their+mutual+envelopment+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior.</a> Development. 122, 1611-1620 (1996).</li>
<li>Wendt, D., Riboldi, S. A., Cioffi, M., Martin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+and+bottlenecks+of+bioreactors+in+3D+cell+culture+and+tissue+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Potential and bottlenecks of bioreactors in 3D cell culture and tissue manufacturing.</a> Adv Mater. 21, 3352-3367 (2009).</li>
<li>Berry, D. P., Harding, K. G., Stanton, M. R., Jasani, B., Ehrlich, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+wound+contraction%3A+collagen+organization%2C+fibroblasts%2C+and+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Human wound contraction: collagen organization, fibroblasts, and myofibroblasts.</a> Plast Reconstr Surg. 102, 124-131 (1998).</li>
<li>Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+biology+in+three-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices.</a> Trends Cell Biol. 13, 264-269 (2003).</li>
<li>Wang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+between+beta1-integrin+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+three-dimensional+basement+membrane+breast+cultures%3A+a+different+perspective+in+epithelial+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14821-14826 (1998).</li>
<li>Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li>
<li>Boudreau, N., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+apoptosis+by+basement+membrane+requires+three-+dimensional+tissue+organization+and+withdrawal+from+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of apoptosis by basement membrane requires three- dimensional tissue organization and withdrawal from the cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 3509-3513 (1996).</li>
<li>Croix, B., Rak, J. W., Kapitain, S., Sheehan, C., Graham, C. H., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+by+hyaluronidase+of+adhesion-dependent+multicellular+drug+resistance+in+mammary+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nat.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Reversal by hyaluronidase of adhesion-dependent multicellular drug resistance in mammary carcinoma cells.</a> J. Nat. Cancer Inst. 88, 1285-1296 (1996).</li>
<li>Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+structure%2C+nuclear+organization%2C+and+gene+expression+in+normal+and+malignant+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast.</a> Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).</li>
<li>Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+tumor+spheroid+in+a+microgravity+environment+as+a+3D+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 523-534 (2009).</li>
<li>Napolitano, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+three-dimensional+cell+culture+utilizing+micromolded+nonadhesive+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Biotechniques. 43, 494-496 (2007).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103, 655-663 (2009).</li>
</ol>

Brak deklarowanych konfliktów interesów.

Badania wykazały, że hodowanie komórek w kontekście trójwymiarowym (3D) prowadzi do powstania odmiennej morfologii komórkowej i sygnalizacji w porównaniu z sztywnym systemem hodowli dwuwymiarowej (2D)9. Na przykład żele kolagenowe zasiedlone przez fibroblasty wykazują, że morfologia fibroblastów w 3D znacząco różni się od tej obserwowanej w 2D 10,11. Podobnie, hodowla 3D może indukować tkankowo swoistą różnicowanie komórek nabłonkowych gruczołu piersiowego. Systemy hodowli 3D były wykorzystywane do ...

<table><tbody><tr><td>automatyczny licznik komórek</td><td>Bio-Rad</td><td>TC10</td><td></td></tr><tr><td>potrząsowa łaźnia wodna z pokrywą CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Labline Instruments</td><td>3540</td><td></td></tr></tbody></table>

prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3d

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Badania nad kohezją międzykomórkową i adhezją komórek do podłoża były historycznie prowadzone na kulturach monowarstwy przylegających do sztywnych podłoży. Jednakże komórki w obrębie tkanki są zazwyczaj zamknięte w gęsto upakowanej masie tkankowej, w której nawiązują one bliskie połączenia z wieloma sąsiednimi komórkami oraz z elementami macierzy pozakomórkowej. W związku z tym środowisko chemiczne i siły fizyczne, którym podlegają komórki w tkance 3D, różnią się zasadniczo od tych, których doświadczają komórki hodowane w monowarstwie. Wykazano, że ma to znaczący wpływ na morfologię i sygnalizację komórkową. Opracowano kilka metod generowania 3D kultur komórkowych, w tym enkapsulację komórek w żelach kolagenowych1 lub w rusztowaniach z biomateriałów2. Metody te, choć użyteczne, nie odtwarzają ścisłej architektury bezpośredniej adhezji międzykomórkowej występującej w normalnych tkankach. Raczej bardziej przypominają one systemy hodowli, w których pojedyncze komórki są luźno rozproszone w trójwymiarowej sieci produktów ECM. Tutaj opisujemy prostą metodę, w której komórki umieszcza się w hodowli w kropli wiszącej i inkubuje w warunkach fizjologicznych do czasu utworzenia prawdziwych sferoidów 3D, w których komórki pozostają w bezpośrednim kontakcie ze sobą oraz z elementami macierzy pozakomórkowej. Metoda ta nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może zostać dostosowana tak, aby umożliwić dodanie dowolnego czynnika biologicznego w bardzo małych ilościach, co może być istotne w wyjaśnianiu wpływu na interakcje międzykomórkowe lub interakcje komórka-ECM. Metodę tę można również wykorzystać do ko-hodowli dwóch (lub więcej) różnych populacji komórek, aby wyjaśnić rolę interakcji międzykomórkowych lub interakcji komórka-ECM w określaniu relacji przestrzennych między komórkami. Kohezja międzykomórkowa i adhezja komórka-ECM stanowią fundamenty badań nad rozwojem embrionalnym, interakcją komórek nowotworowych ze stroma w inwazji złośliwej, gojeniem ran oraz zastosowaniami w inżynierii tkankowej. Ta prosta metoda zapewni sposób generowania przypominających tkankę agregatów komórkowych do pomiaru właściwości biomechanicznych lub do analiz molekularnych i biochemicznych w fizjologicznie istotnym modelu.

Opisujemy prostą i szybką metodę generowania trójwymiarowych sferoid tkankopodobnych oraz ich potencjalne zastosowanie w ilościowym określaniu różnic w oddziaływaniach międzykomórkowych.

Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Badania nad kohezją międzykomórkową oraz adhezją komórek do podłoża były historycznie przeprowadzane na kulturach monowarstw przylegających do sztywnych podłoży. Komórki ...

Celem niniejszego eksperymentu jest wytworzenie trójwymiarowych struktur tkankowych przypominających steroidy. Osiąga się to poprzez najpierw zebranie hodowli komórkowych, a następnie przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek. Następnie krople zawiesiny komórkowej nanosi się na wewnętrzną stronę odwróconej pokrywki naczynia do hodowli tkanek.Następnie pokrywkę odwraca się i nakłada na komorę nawilżania. Ostatnim krokiem jest inkubacja wiszących kropel przez 24 do 48 godzin w celu umożliwienia formowania się agregatów. Następnie można je przenieść do wytrząsanej kąpieli wodnej i inkubować przez kolejne pięć dni.Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące różnice w kohezji agregatów lub sortowaniu komórek poprzez testy kondensacji, analizę symetrii powierzchni tkanki lub mikroskopię epifluorescencyjną. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak np. konwencjonalna hodowla tkankowa 2D, jest fakt, że komórki hodowane w 3D dokładniej naśladują oddziaływania międzykomórkowe występujące w środowisku tkankowym. Zaprezentuję tę metodę, aby pokazać, że jest ona na tyle prosta, iż poradzi sobie z nią nawet kierownik projektu.Aby rozpocząć ten eksperyment, należy zebrać komórki adhezyjne przy 90% konfluencji. Najpierw odessać pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przepłukać warstwę komórek roztworem PBS. Następnie odessać PBS i nanieść pipetą 2 mL 0,05% roztworu trypsyny w EDTA na monowarstwę.Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj do momentu odklejenia się komórek. Następnie wyjmij płytkę z inkubatora i przerwij proces trypsynizacji, dodając dwa mililitry pełnej pożywki.Za pomocą pipety 5 ml należy utritrować mieszaninę, aż komórki zostaną całkowicie zawieszone. Następnie przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki 15 ml. Do zawiesiny komórkowej pipetować 40 µl roztworu DNA o stężeniu 10 mg/ml i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut po inkubacji.Krótko wymieszaj zawiesinę komórkową za pomocą wortexa, a następnie odwiruj z prędkością 200 ×g przez pięć minut. Po zakończeniu wirowania odessij i odrzuć supernatant S, a następnie zawieś osad w 1 ml pełnej pożywki w celu przemycia. Powtórz wirowanie i ponownie zawieś osad w 1 ml pełnej pożywki.Następnie wykonaj zliczanie komórek przy użyciu automatycznego licznika komórek lub hemosytometru. Doprowadź zawiesinę komórkową do końcowego stężenia 2,5 × 10⁶ komórek/ml, dodając odpowiednią ilość pożywki. Następnie przystąp do przygotowania kropel wiszących.Przygotować komorę nawilżania, zdejmując pokrywkę z 60 milimetrowej szalki do hodowli tkanek i pipetując 5 ml PBS na dno szalki. Odwrócić pokrywkę szalki i nanieść pipetą do 20 kropli zawiesiny komórkowej o objętości 10 µl na jej wewnętrzną stronę. Należy upewnić się, że krople są rozmieszczone w wystarczających odstępach, aby się nie stykały.Ostrożnie nałóż pokrywkę z kulturami w kropelkach z powrotem na dno naczynia zawierającego PBS. Umieść płytkę z hodowlą w inkubatorze do kultur tkankowych. Ustaw temperaturę na 37°C, stężenie dwutlenku węgla na 5% oraz wilgotność na 95% i inkubuj przez noc.Monitoruj krople codziennie i kontynuuj inkubację do czasu utworzenia się arkuszy komórkowych lub agregatów. Po uformowaniu się arkuszy komórkowych lub agregatów przenieś je do szklanych kolb z wytrząsarką o okrągłym dnie zawierających 3 mL kompletnej pożywki. Inkubuj kolby z arkuszami komórkowymi lub agregatami w wodnej łaźni z wytrząsaniem.Próbki utrzymywano w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla przez około 24 godziny, aż do momentu, gdy tworzenie się steroidów można było zaobserwować pod mikroskopem stereoskopowym. Po uformowaniu się steroidów wpływ manipulacji eksperymentalnych na ich powstawanie można określić ilościowo zgodnie z procedurą opisaną w protokole pisemnym. Ponadto w tym momencie można zwizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej interkalację w błonie wszelkich wcześniej dodanych barwników fluorescencyjnych.Ten obraz z mikroskopu w świetle przechodzącym przedstawia agregację komórek raka prostaty szczura MLL po 18 godzinach inkubacji metodą wiszącej kropli. Obraz ten ukazuje drugi agregat komórek MLL utworzony po 18 godzinach hodowli metodą wiszącej kropli. Komórki te hodowano w obecności 25 µM inhibitora MEK PD 9 8 0 5 9, co doprowadziło do powstania znacznie bardziej zwartego agregatu komórek.Tutaj przedstawiono różnicę w wielkości agregatów między hodowlą kropelkową MLL traktowaną inhibitorem MEK a wielkością agregatów w grupie kontrolnej nieleczonej. Gwiazdka oznacza statystycznie istotną różnicę przy P mniejszym niż 0,0001. Wynik ten, ustalony za pomocą testu t studenta pomiędzy agregatami nieleczonymi a traktowanymi inhibitorem MEK, sugeruje, że zastosowanie inhibitora MEK prowadzi do powstania znacznie mniejszych i bardziej zwartych agregatów.Zdjęcie to zostało wykonane przy użyciu stereomikroskopu Nikon Smz 800 i przedstawia steroid powstały w wyniku inkubacji komórek zarodkowej wątroby kurczaka w kulturze kropel wiszących przez 18 godzin, a następnie w wytrząsanej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. To obraz z mikroskopu konfokalnego demonstruje zachowanie sortowania, które występuje, gdy określone populacje komórek są współhodowane metodą kropel wiszących; przed przystąpieniem do hodowli w kropelach wiszących komórki zarodkowej wątroby kurczaka zabarwiono barwnikiem do powłok błonowych pkh two oraz zarodkowymi komórkami kurczaka.Komórki serca zabarwiono barwnikiem PKH 26. Następnie zmieszano zawiesiny komórkowe i zastosowano metodę wiszącej kropli. Hodowla trwała 18 godzin, po czym nastąpiła 48-godzinna inkubacja w shaking water bath w temperaturze 37 degrees Celsius.Na przekroju optycznym widać, że komórki serca zabarwione na żółto są otoczone przez komórki wątroby. Tutaj, w pseudokolorach niebieskich, znajdują się dwa klony komórek L przetransfekowanych, wykazujących obecność NCA na ich powierzchniach. W stosunku 2,4:1 zostały one zabarwione fluorescencyjnymi barwnikami do błon, PKH 2 i PK CH 26, zmieszanymi w równych proporcjach, a następnie hodowane w formie wiszących kropel, jak opisano wcześniej.W tym przykładzie komórki wykazujące wysoką ekspresję kadheryny, zaznaczone pseudokolorem zielonym, są otoczone przez komórki wykazujące niższą ekspresję kadheryny, zaznaczone pseudokolorem czerwonym. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zająć 30 minut lub mniej.

a-simple-hanging-drop-cell-culture-protocol-for-generation-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Prosty protokół hodowli komórkowej z zawieszeniem kropli do wytwarzania 3D sferoidów

Sferoidy to rodzaj modelu 3D hodowli komórkowej używany do dokładniejszego reprezentowania środowiska komórki w porównaniu do jednowarstwowych modeli hodowli komórkowych 2D. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują sferoidy z linii komórkowej raka jelita grubego i stosują obrazowanie żywych komórek do śledzenia wzrostu sferoid.

Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

Ten film opisuje technikę generowania trójwymiarowych sferoid metodą wiszącej kropli przy użyciu komórek czerniaka. Wygenerowany in vitro trójwymiarowy (3D) organotypowy model sferoidalny czerniaka może zobrazować architekturę czerniaka złośliwego in vivo i może dać wgląd w interakcje wewnątrz guza.

Metoda wiszącej kropli: technika generowania sferoid czerniaka 3D

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.

Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Tutaj prezentujemy kilka prostych metod oceny żywotności i śmierci w sferoidach komórek rakowych 3D, które znacznie lepiej naśladują gradienty fizykochemiczne guzów in vivo niż hodowla 2D. Model sferoidalny umożliwia zatem ocenę skuteczności leku przeciwnowotworowego z lepszą translacją do warunków in vivo.

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

Prezentujemy napędzane silnikiem odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe, które może hodować sferoidy komórek. Za pomocą tego urządzenia sferoidy jednego lub wielu typów komórek mogą być łatwo hodowane w warunkach wysokiej grawitacji.

Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Przedstawiamy protokół do hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności i ich charakterystyki fenotypowej za pomocą przechwytywania obrazów i proteomiki.

Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Naucz się generować sferoidy 3D metodą wiszących kropel do badań interakcji komórkowych. Ta technika pozwala tworzyć agregaty tkankopodobne w ciągu 24–48 godzin.

Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Przeglądaj więcej filmów