Prosty protokół hodowli komórek wiszących do generowania sferoid 3D

Celem tego eksperymentu jest wygenerowanie tkanki 3D, takiej jak sterydy. Osiąga się to poprzez najpierw zebranie hodowanych komórek, a następnie wytworzenie zawiesiny pojedynczej komórki. Kolejne krople zawiesiny komórkowej osadzają się na spodniej stronie odwróconej pokrywki z naczynia do hodowli tkankowej.

Następnie pokrywka jest odwracana do komory hydracyjnej. Ostatnim krokiem jest inkubacja wiszących kropli przez 24 do 48 godzin, aby umożliwić uformowanie się agregatów. Można je następnie przenieść do łaźni wodnej z wytrząsaniem i inkubować przez okres do pięciu dni.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują różnice w kohezji zagregowanej lub sortowaniu komórek za pomocą testów zagęszczania, symetrii powierzchni tkanki 10 lub mikroskopii epifluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak na przykład konwencjonalna hodowla tkankowa 2D, jest to, że komórki hodowane w 3D bardziej naśladują interakcje komórkowe doświadczane przez komórki w środowisku tkankowym. Zademonstruję tę metodę, aby pokazać Ci, że jest ona tak prosta, że nawet PI może to zrobić.

Aby rozpocząć ten eksperyment, zbierz komórki adhezyjne z płynnością 90%CO. Najpierw odessać pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przepłukać arkusz komórek PBS. Następnie odessać PBS i odpipetować dwa mililitry 0,05% ruchu w roztworze EDTA na warstwę jednowarstwową.

Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj, aż komórki się odłączą. Następnie wyjąć płytkę z inkubatora i przerwać jego trwanie. Dodanie dwóch mililitrów kompletnego podłoża.

Użyj pięciomililitrowej pipety, aby roztrzeć mieszaninę, aż komórki będą całkowicie w zawiesinie. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Odpipetować 40 mikrolitrów 10 miligramów na mililitr roztworu DNA do zawiesiny komórki i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut po inkubacji.

Krótko zwirować zawiesinę komórkową, a następnie odwirować przy 200-krotności grawitacji przez pięć minut. Po zakończeniu wirowania odessać supernatant S i wyrzucić, a następnie ponownie zawiesić paletę w jednym mililitrze kompletnego podłoża do przemycia. Powtórz wirowanie i Reese z osadu w jednym mililitrze kompletnego podłoża.

Następnie wykonaj zliczanie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. Dostosuj zawiesinę komórek z pożywką do końcowego stężenia 2,5 razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Następnie przystąp do tworzenia wiszących kropli.

Przygotuj komorę nawadniającą, zdejmując pokrywkę z 60-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowych i pipetując pięć mililitrów PBS na dno naczynia. Odwróć pokrywkę płytki i odpipetuj do 2010 mikrolitrów kropli zawiesiny komórek na spodnią stronę pokrywki. Upewnij się, że krople są wystarczająco oddalone od siebie, aby się nie stykały.

Delikatnie założyć pokrywkę zawierającą kultury kroplowe z powrotem na dno naczynia zawierającego PBS. Umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze do hodowli tkankowych. Ustaw na 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności i inkubuj przez noc.

Codziennie monitoruj krople i kontynuuj inkubację, aż utworzą się arkusze komórek lub agregaty. Po uformowaniu się arkuszy komórek lub agregatów przenieść je do okrągłodennych szklanych kolb do wytrząsania zawierających trzy mililitry kompletnego podłoża. Inkubować kolby zawierające arkusze komórek lub agregaty w wytrząsającej łaźni wodnej.

Utrzymywany w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez około 24 godziny, aż powstanie steroidu będzie można uwidocznić pod mikroskopem preparacyjnym. Po utworzeniu sterydów, wpływ manipulacji eksperymentalnych na tworzenie sterydów może być określony ilościowo zgodnie z procedurą opisaną w pisemnym protokole. Również interkalacja membranowa wszelkich wcześniej włączonych barwników fluorescencyjnych może być teraz wizualizowana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Ten obraz mikroskopowy w jasnym polu pokazuje agregację komórek MLL raka prostaty szczura po 18 godzinach inkubacji przy użyciu metody wiszącej kropli. Zdjęcie przedstawia drugi agregat komórek MLL powstały po 18 godzinach hodowli metodą wiszącej kropli. Komórki te hodowano w obecności 25 mikromolowych inhibitora MEK PD 9 8 0 5 9, co dało znacznie bardziej zwartą agregację komórek.

W tym miejscu wykazano różnicę między hodowlą MLL w zawieszeniu traktowaną inhibitorem MEK, wielkością agregatu i wielkością agregatu kontrolnego bez poddanego działaniu inhibitora. Gwiazdka reprezentuje statystycznie istotną różnicę P mniejszą niż 0,0001. Jak ustalili studenci, test T między agregatami nietraktowanymi i traktowanymi inhibitorem MEK sugeruje, że leczenie inhibitorem MEK skutkuje znacznie mniejszymi i bardziej zwartymi agregatami.

Zdjęcie zostało wykonane za pomocą mikroskopu stereoskopowego Nikon Smz 800 i ilustruje steryd powstały w wyniku inkubacji embrionalnych komórek wątroby piskląt w hodowli wiszącej kropli przez 18 godzin. Następnie w kąpieli wodnej wstrząsającej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Ten obraz mikroskopu konfokalnego pokazuje zachowanie sortowania, które występuje, gdy niektóre populacje komórek są hodowane przy użyciu metody wiszącej kropli przed przystąpieniem do hodowli w zawieszeniu, embrionalne komórki wątroby piskląt zostały wybarwione barwnikiem pkh two błony międzypowłokowej i embrionalnym pisklęcia.

Komórki serca barwiono barwnikiem PKH 26. Zawiesiny komórek zostały następnie zmieszane i zawieszone krople. Hodowlę prowadzono przez 18 godzin, a następnie przez 48 godzin inkubowano w łaźni wodnej wstrząsającej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Z części optycznej widać, że komórki serca w kolorze żółtym są otoczone komórkami wątroby. Pseudo zabarwione na niebiesko tutaj, dwa nardi i transfekowane klony komórek L wyrażające NCA na swoich powierzchniach. W stosunku 2,4 do jednego, wybarwiono membraną fluorescencyjną na barwniki zbierające, PKH dwa i PK KH 26 zmieszano w równych proporcjach i hodowano jako wiszące krople, jak poprzednio.

W tym przykładzie wysokiej klasy komórki wyrażające ekspresję kadianu, które są pseudo koloru zielonego, są otoczone przez te wyrażające niższe poziomy en cadian, które są pseudo pokolorowane na czerwono. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 30 minut lub krócej, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.