Impulsywne zwiększanie ciśnienia w komórkach neuronalnych na potrzeby badań nad urazowym uszkodzeniem mózgu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest podanie i obserwacja impulsowego wzrostu ciśnienia w hodowlach komórek mózgu na potrzeby badań nad urazowąy traumą mózgu. Jest to realizowane poprzez uprzednią indukcję różnicowania neuronalnego komórek hodowanych z użyciem kwasu retinowego. Następnie komórki neuronalne umieszcza się w urządzeniu doy pressuryzacji komórek opartym na konstrukcji ksky bar, gdzie są one poddawane impulsowemu ciśnieniu o wartości i czasie trwania odpowiadających urazowym traumom mózgu wywołanym przez falę uderzeniową.

Na koniec komórki poddaje się analizom biologii molekularnej w celu oceny uszkodzeń komórkowych i potencjalnych mechanizmów urazowego uszkodzenia mózgu. Wyniki badania mikroskopowego wykazują śmierć komórek neuronalnych oraz utratę struktury aksonów neurytów przy impulsowym podwyższeniu ciśnienia o wartości dwóch megapaskali i czasie trwania 0,7 milisekundy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak perkusja płynowa, jest brak etapów ciśnienia ujemnego oraz precyzyjna kontrola czasu trwania impulsu.

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie urazowych obrażeń mózgu (TBI), takie jak próg śmierci lub uszkodzenia komórek nerwowych w zależności od ciśnienia impulsowego, jego wielkości, czasu trwania oraz kształtu obciążenia. Choć metoda ta była dotychczas stosowana w naszej grupie do badania TBI wywołanego wybuchem, może ona być również wykorzystywana w innych rodzajach urazowych obrażeń mózgu, na przykład w TBI wywołanym uderzeniem. Procedura zostanie zaprezentowana przez Matthew, doktoranta z laboratorium profesor Chen fang, oraz przez li ha, technika z mojego laboratorium.

W niniejszym eksperymencie wykorzystano zestaw prętów Ksky skonfigurowany jako aparat doywyżania ciśnienia w komórkach. Aparatura składa się z dwóch sześciometrowych prętów ze stopu aluminium zawieszonych na wyrównanych łożyskach mosiężnych oraz komory doywyżania ciśnienia w komórkach in vitro. Komora doywyżania ciśnienia, umieszczona pomiędzy prętami, składa się z cylindra tłokowego.

Cylinder posiada niewielki otwór gwintowany w podstawie wnęki, który podczas instalacji próbki komórek odprowadza powietrze i nadmiar płynu. Tłok jest wykonany z tej samej rurki co pręt i owinięty dwiema lub trzema warstwami taśmy Teflon. Nakrętka mocuje szklane lamelki za pomocą dwóch małych śrub ze stali nierdzewnej.

W tej demonstracji wykorzystano ludzkie komórki neuroblastoma SH-SY5Y. Protokół ten można jednak zastosować do wielu innych kultur modeli komórkowych. Komórki naniesiono na szklane zakrycia o średnicy 18 mm z gęstością 3000 komórek na cm².

W uzupełnionej pożywce DMEM, podczas inkubacji komórek, wywołaj ich różnicowanie poprzez dodanie do medium 10 µM kwasu retinowego przez siedem dni, wymieniając pożywkę co dwa dni. Siódmego dnia komórki wykazują dobrze rozwiniętą strukturę aksonalną neurytów i są gotowe do poddania działaniu ciśnienia. Wszystkie części komory ciśnieniowej wysterylizuj w autoklawie i przechowuj pod światłem UV podczas montażu komory.

W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy upewnić się, że śruba wentylacyjna w komorze jest luźno osadzona w otworze wentylacyjnym. Na dnie wgłębienia należy wypełnić komorę świeżo przygotowaną, ciepłą pożywką wzrostową. Następnie do nakrętki tłoka należy przykręcić szkiełko przedmiotowe z hodowlą komórek, tak aby komórki były skierowane na zewnątrz, a następnie ostrożnie włożyć tłok do wnętrza komory.

Odkręć śrubę odpowietrzającą, przechyl otwór odpowietrznika do góry i wciśnij tłok do komory do wcześniej wyznaczonej linii referencyjnej. Pozostawi to około sześciu milimetrów głębokości cieczy wewnątrz komory ciśnieniowej ogniwa. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza, zdezynfekować śrubę odpowietrzającą i wkręcić ją z powrotem, aby zapewnić szczelność komory.

Komora nie powinna przeciekać pod obciążeniem statycznym. Zresetuj system poprzeczny Ksky. Przenieś ciężką masę z powrotem do jej pierwotnej pozycji i zamontuj śrubę blokującą.

Zatrzask blokujący generuje siłę zacisku, która zapobiega przesunięciu pręta uderzającego do momentu złamania pinów. Za pomocą siłownika hydraulicznego dociśnij nowy zatrzask blokujący do ciśnienia około 200 PSI. Użyj podnośnika nożycowego, aby ścisnąć sekcję wstępnego naprężenia pręta uderzającego do ciśnienia nieco wyższego niż wartość docelowa, a następnie poluzuj go, aby w pełni wykorzystać tarcie śruby JAK. Teraz skonfiguruj system akwizycji danych, ponieważ procesy ciśnieniowe trwają około jednej milisekundy.

Ustaw częstotliwość próbkowania na 1 MHz, używając tensometrów o rezystancji 2000 ohm w układzie mostka Wheatstone'a. Napięcie na pręcie nadawczym powinno zostać ustawione na 45 V. Zamontuj komorę z ogniwem tak, aby tłok był skierowany w stronę pręta nadawczego.

Umieść komorę pomiarową w bloku V wspieranym przez mały laboratoryjny podnośnik nożycowy i wyrównaj ją z dwoma prętami. Lekko nasmaruj każdą powierzchnię styku i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza między stykającymi się powierzchniami, delikatnie pocierając je o siebie. System jest teraz przygotowany.

Uruchom system akwizycji danych i przeprowadź test, szybko pompując hydrauliczny siłownik zacisku. Spowoduje to przełamanie rygla blokującego, co doprowadzi do rozdzielenia zacisku i przesłania fali ciśnienia do komórek. Po zakończeniu testu wyjmij preparat z komory w komorze z laminarnym przepływem powietrza i przystąp do oceny zachowania komórek.

Przy odpowiednim doświadczeniu aparat może być wykorzystany do poddania ciśnieniu około dziewięciu slajdów z hodowlami komórkowymi na godzinę. Podczas analizy odczytu na początku sygnału paska transmisyjnego mogą pojawić się błędy wynikające z obecności pęcherzyków powietrza, jednak nie występują one w niniejszej demonstracji.

Jeśli pasek transmitancji jest wystarczająco długi, najważniejsze dane powinny zaczynać się od pierwszego zaburzenia i kończyć w miejscu, gdzie pomiary wykazują ujemne ciśnienie; odczyt tego napięcia jest proporcjonalny do naprężeń doświadczanych przez komórki w analizie tensometrycznej. Czas trwania impulsu przenikającego może być krótszy niż impulsu padającego. Jeśli w cieczy wewnątrz komory ciśnieniowej komórki zostanie uwięziony mały pęcherzyk, amplituda impulsu przenikającego może nie przekroczyć amplitudy impulsu padającego, ale powinna on posiadać wystarczająco długie plateau przed odciążeniem.

W przeciwnym razie w zamkniętej komorze uwięziony został duży pęcherzyk powietrza lub zespół i pręt są niewspółosiowe. Po naprężeniu komór można poddać natychmiastowej inspekcji lub inkubować dalej w celu późniejszej analizy. Należy porównać komórki poddane naprężeniu z komórkami kontrolnymi z komory, które były traktowane w identyczny sposób, ale nie poddano ich naprężeniu, aby ocenić zmiany w długości neurytów za pomocą mikroskopii optycznej w różnych punktach czasowych po inkubacji.

Barwienie immunofluorescencyjne aktyny może być wykorzystane do oceny zmian w cytoszkielecie. Można również zastosować przeciwciało przeciwko białku MAP2 (mikrotubule-associated protein two) w celu wizualizacji zmian w jednym z kluczowych markerów neuronalnych.

Aby ocenić wpływ impulsowego zwiększania ciśnienia na ekspresję genów neuronalnych i apoptotycznych, w razie potrzeby należy zastosować standardowe techniki biologii molekularnej, takie jak R-T-P-C-R. Wystarczającą ilość lizatów komórkowych do immunoblottingu można zebrać z kilku identycznie poddanych ciśnieniu próbek komórek. W tym przykładzie profilu ciśnienia aparat ksky bar z powodzeniem zastosował impulsowe ciśnienie typu pojedynczego impulsu o wartości 2 MPa i czasie trwania około 0,7 ms do hodowanych komórek neuronalnych, co widać na obrazach z mikroskopu optycznego; ludzkie komórki neuronalne SHSY five Y poddane impulsowemu ciśnieniu 2 MPa wykazują wyraźny rozpad aksonów neurytów w porównaniu z komórkami kontrolnymi, które nie były poddawane ciśnieniu.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze trzymać komorę ciśnieniową w ten sposób, a nie w ten, ponieważ spowodowałoby to poddanie komórek podciśnieniu po ich wykształceniu. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny neuronauki do zgłębienia mechanizmów komórkowych urazowych obrażeń mózgu w kontrolowanych warunkach ciśnienia. Dziękujemy za wsparcie finansowe z Army UNL Center for Trauma Mechanics.