Name: Impulsywne zwiększanie ciśnienia w komórkach neuronalnych w badaniu urazowego uszkodzenia mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj metodę impulsywnego zwiększania ciśnienia w komórkach neuronalnych przy użyciu urządzenia Kolsky'ego do badania mechanizmów urazowego uszkodzenia mózgu. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę parametrów ciśnienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować instytucjom finansującym: Army-UNL Center for Trauma Mechanics (DoD/ARO, #W911NF-11-1-0033, PI: Dr. Namas Chandra) oraz UNL Layman Award (26-1110-0033-001, PI: Lim).

1. Hodowla komórek neuronalnych
<ol>
<li>Jako model komórkowy można wykorzystać komórki mózgu, w tym neurony, astrocyty oraz ich kokultury. W ramach demonstracji wykonalności przedstawiono impulsowe ciśnienie przyłożone do linii komórkowej neuronów.</li>
<li>Komórki neuroblastoma człowieka SH-SY5Y (ATCC, CRL-226) hoduje się na szklanych kryształkach o średnicy 18 mm. Komórki wysiewa się z gęstością 3×103 cells/cm2 w medium wzrostowym składającym się z DMEM uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Szkiełka z hodowlami komórkowymi przechowuje się w inkubatorze z 5% CO2 w warunkach uwilgotnienia i temperaturze 37°C.</li>
<li>W celu uzyskania różnicowania neuronów z komórek SH-SY5Y, komórki poddaje się działaniu medium dodatkowo uzupełnionego o 10 μM kwasu retinowego (RA) przez 7 dni, zmieniając medium co dwa dni. W 7. dniu komórki są gotowe do poddania procesowi ciśnieniowemu.</li>
</ol>
2.	Sprzęt do wytwarzania ciśnienia: rura Kolsky'ego
<ol>
<li>Pręt Kolsky'ego, opracowany przez Kolsky'ego1 w 1949 roku, jest wykorzystywany do pomiaru właściwości mechanicznych materiału przy bardzo wysokiej prędkości obciążania. Aparatura składa się z dwóch prętów z próbką umieszczoną w kontakcie między nimi. Fala naprężeń, wytworzona na pręcie dopadającym, rozchodzi się do próbki, gdzie dzieli się na falę odbitą i transmitowaną. Naprężenie w próbce jest proporcjonalne do fali transmitowanej. W niniejszym badaniu wykorzystujemy komorę do naprzężania komórek, która zostaje umieszczona pomiędzy dwoma prętami w układzie Kolsky'ego.</li>
<li>Dwa pręty ze stopu aluminium (każdy o długości 6 m) są zawieszone na wyrównanych mosiężnych łożyskach, a pomiędzy nimi umieszczona jest komora do naprzężania komórek in vitro. Prętem dopadającym jest pręt przedni, z masą 130 lb zacisniętą na jednym z końców. Zacisk cierny jest umieszczony w pozycji, która zapewni pożądaną długość impulsu. Poprzez zaangażowanie zacisku i dokręcenie podnośnika nożycowego między masą a podporą obciążeniową, sekcja zacisk-masa pręta dopadającego jest wstępnie ściśnięta do pożądanego poziomu. Wymuszenie nagłego zerwania naciętego śrubowego zamka blokującego zacisk za pomocą systemu hydraulicznego gwałtownie uwalnia zmagazynowaną kompresję, generując w ten sposób impuls ciśnienia. Impuls ten rozchodzi się przez pręt dopadający, napędza tłok komory testowej i impulsowo zwiększa ciśnienie płynu oraz komórek wewnątrz komory. Naprzężanie komory z kolei inicjuje impuls ciśnienia rozchodzący się w pręcie transmitowanym w dół strumienia. Odkształcenia związane z impulsami ciśnienia w prętach są mierzone za pomocą złożonych tensometrów o wysokiej rezystancji wzbudzonych napięciem 45 voltów. Sygnały z tensometrów są rejestrowane cyfrowym oscyloskopem z częstotliwością 1 MHz jako historia obciążania.</li>
<li>Komora do naprzężania komórek in vitro składa się z układu tłok-cylinder. Cylinder ma średnicę wewnętrzną 2,6 cm i średnicę zewnętrzną 3,8 cm oraz mały otwór wykonany w podstawie wnęki. Otwór ten służy jako odpowietrznik powietrza i nadmiaru płynu podczas instalacji próbki komórkowej. Tłok ma długość 7,5 cm i jest wykonany z tego samego materiału co pręty. Tłok jest owinięty dwiema lub trzema warstwami taśmy teflonowej, która służy jako uszczelnienie o niskim tarciu. Nakrętka końcowa ma długość 32 mm i posiada dwie małe śruby ze stali nierdzewnej, które zabezpieczają szklane przykrycia (na których hodowane są komórki) podczas obciążania.</li>
</ol>
3. Impulsowe ciśnienie komórek neuronalnych
<ol>
<li>Wszystkie części komory ciśnieniowej są sterylizowane w autoklawie i przechowywane pod lampą UV. Montaż komory odbywa się wewnątrz dygestorium do hodowli komórkowych. Śruba odpowietrzająca w komorze jest lekko wkręcona w otwór wentylacyjny u podstawy wnęki. Do komory pipetuje się uprzednio ogrzane (37°C) świeże medium wzrostowe, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza. Następnie pobiera się szkiełko przedmiotowe z hodowlą komórek i umieszcza je na nakrętce tłoka (komórkami skierowanymi na zewnątrz). Małe śruby mocujące są dokręcane do szkiełka, aby utrzymać je na miejscu. Tłok ze szkiełkiem przedmiotowym z hodowlą komórek jest lekko włożony do wnęki komory, a cały zespół jest przechylony tak, aby otwór wentylacyjny znajdował się w najwyższym punkcie. Śruba odpowietrzająca zostaje wyjęta, a tłok jest wpychany do wnęki, najpierw wypychając pęcherzyki powietrza, a następnie nadmiar cieczy. Jako prowadnica służy znacznik referencyjny lub szablon, aby zapewnić taką samą objętość medium hodowlanego dla każdego testu. Wymiar osiowy medium w komorze wynosi około 6 mm. Należy zdezynfekować śrubę odpowietrzającą i wkręcić ją z powrotem, aby zapewnić szczelność komory. Komora nie powinna przeciekać pod tym obciążeniem statycznym; jeśli przecieka, konieczna jest wymiana lub wzmocnienie owinięcia teflonowego.</li>
<li>W tym momencie system prętów Kolsky'ego jest resetowany. Ciężka masa zostaje przesunięta do pozycji wyjściowej, a zużyty (złamaną) sworzeń blokujący zostaje zastąpiony nowym. Nowy sworzeń blokujący zostaje zakleszczony za pomocą układu hydraulicznego pod ciśnieniem około 20 psi. Użyj podnośnika nożycowego, aby ścisnąć sekcję wstępnego obciążenia pręta uderzeniowego do ciśnienia nieco wyższego niż wartość zadana, a następnie poluzuj go, aby w pełni wykorzystać tarcie śruby podnośnika. System akwizycji danych jest teraz uzbrojony.</li>
<li>Zmontowana komora ciśnieniowa do komórek jest montowana w systemie. Zostaje ona umieszczona w bloku V wspieranym przez mały laboratoryjny podnośnik nożycowy i wyrównana względem dwóch prętów. Każdy styk należy przesmarować cienką warstwą smaru i przetrzeć powierzchnie styku o siebie, aby wyeliminować wszelkie szczeliny powietrzne pomiędzy nimi.</li>
<li>Test jest teraz gotowy do przeprowadzenia. Śruba blokująca zacisk zostaje gwałtownie zerwana poprzez szybkie pompowanie hydraulicznego napędu zacisku. Zacisk rozdzieli się, a system akwizycji danych powinien wyświetlić wyniki. Historia ciśnienia w komorze komórkowej jest wyznaczana z pomiarów z czujnika pręta transmitującego. Jeśli użyty pręt transmitujący jest wystarczająco długi, pomiar ten powinien obejmować okres od pierwszej perturbacji do momentu, w którym pomiary wykażą ciśnienie ujemne. Czas trwania impulsu transmitowanego może być krótszy niż impulsu uderzeniowego w przypadku uwięzienia pęcherzyka powietrza. Amplituda może nie osiągnąć wartości impulsu uderzeniowego, ale powinna posiadać wystarczająco długi plateau przed rozładowaniem. W przeciwnym razie mógł wystąpić albo duży pęcherzyk powietrza w szczelnej komorze, albo rozregulowanie zespołu względem pręta.</li>
<li>Następnie komora ciśnieniowa do komórek jest wyjmowana i demontowana wewnątrz dygestorium do hodowli komórkowych. Śruba odpowietrzająca zostaje wykręcona, a tłok wyciągnięty z komory. Szkiełko przedmiotowe z hodowlą komórek zostaje zdjęte z końca tłoka.</li>
</ol>
4. Ocena zachowania komórek pod ciśnieniem
<ol>
<li>Po przeprowadzeniu nadciśnienia komórki można poddać natychmiastowej inspekcji lub inkubować dalej w celu późniejszego badania. Przy zastosowaniu odpowiednich procesów aseptyki możliwa jest dłuższa inkubacja po nadciśnieniu.</li>
<li>Komórki poddane nadciśnieniu można badać za pomocą wszystkich technik biologii molekularnej i komórkowej. W przypadku nadciśnienia komórek neuronalnych, w celu zbadania fizjologii komórkowej i molekularnej w warunkach TBI, można przeprowadzić testy oceniające zmiany indukowane ciśnieniem w obrastaniu neurytów, zmiany cytoszkieletu mikrotubularnego, ekspresji genów neuronalnych, apoptozie itp. Jako kontrolne próbki komórek wykorzystuje się komórki hodowane w ten sam sposób i przechowywane w komorze nadciśnieniowej przez ten sam czas, ale niepoddane nadciśnieniu (tzw. kontrola komory).</li>
<li>W celu oceny zmian w obrastaniu neurytów komórki poddane nadciśnieniu oraz komórki kontrolne z komory bada się pod mikroskopem optycznym natychmiast po nadciśnieniu oraz po 1 i 24 h inkubacji. Przykład obrazów komórek neuronalnych przedstawiono w sekcji „Representative Results” (Rysunek 2). Zmianę długości neurytów można ilościowo określić za pomocą immunofluorescencyjnego barwienia aktyny i analizy obrazu. Komórki utrwala się roztworem paraformaldehydu 4% w/v, płucze buforem myjącym Tween-20 0,05% v/v i permeabilizuje roztworem Triton X-10 0,1% v/v. Po blokowaniu roztworem albuminy surowicy bydlęcej 1% w/v komórki inkubuje się z faloidyną sprzężoną z izotiocyjanianem tetrametylorodaminy (TRITC). Obrazy immunofluorescencyjne komórek wykonuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, a długości neurytów dla komórek poddanych nadciśnieniu i kontrolnych quantyfikuje się przy użyciu oprogramowania ImageJ (NIH).</li>
<li>Neuryty można zidentyfikować jako aksony lub dendryty. Aby ocenić zmiany morfologiczne w aksonach lub dendrytach, można powtórzyć opisane powyżej eksperymenty, stosując przeciwciała wykrywające każdą z tych struktur, tj. przeciwciało przeciwko neurofilamentom (NF) dla aksonów oraz przeciwciało przeciwko białku stowarzyszonemu z mikrotubulami (MAP2) dla dendrytów.</li>
<li>Mikrotubule są jednym z kluczowych składników cytoszkieletu neuronów, a uszkodzenia mikrotubul są wykorzystywane jako marker uszkodzenia neuronalnego.2 Mikrotubule można zwizualizować immunofluorescencyjnie za pomocą przeciwciała przeciwko β-tubulinie. Komórki utrwala się po 0 i 24 h od nadciśnienia, barwi przeciwciałem przeciwko β-tubulinie i obserwuje pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
<li>Aby ocenić wpływ impulsywnego nadciśnienia na ekspresję genów neuronalnych i apoptotycznych, z komórek poddanych nadciśnieniu i kontrolnych ekstrahuje się całkowite RNA. Ekspresję genów można zbadać, wykonując ilościowe RT-PCR lub RT-PCR w czasie rzeczywistym, zgodnie z naszymi opublikowanymi protokołami.3</li>
</ol>
5.	Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="Wykres zależności ciśnienia od czasu, przykładanie ciśnienia do komórek, analiza danych w badaniu z zakresu biomechaniki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Przykład profilu ciśnienia przyłożonego do komórek wewnątrz komory ciśnieniowej. Aparatura z prętem Kolsky'ego skutecznie generuje impulsowe ciśnienie typu jednopulsowego na poziomie 2 MPa o czasie trwania około 0,7 ms.
<img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="Porównanie wzrostu komórek w warunkach kontrolnych i pod wpływem ciśnienia; obraz mikroskopowy; morfologia komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rycina 2. Przykład odpowiedzi komórek neuronalnych na impulsowe ciśnienie. Komórki SH-SY5Y poddane impulsowemu ciśnieniu o wartości 2 MPa wykazują wyraźną degradację neurytów/aksonów w porównaniu z komórkami kontrolnymi w komorze.
6.	Trudności i rozwiązania
<ol>
<li>Uszczelnienie komory jest jedną z głównych przeszkód, które należy pokonać. Stwierdzono, że szerokie dyski z o-ringami powodują problem żłobienia oraz zwiększone tarcie. Aby wyeliminować efekty tarcia, a także zapobiec żłobieniu, zastosowano prostą metodę owijania tłoka teflonową taśmą hydrauliczną. Rozwiązuje to wymienione problemy i pozwala uzyskać pożądany poziom oraz czas trwania ciśnienia.</li>
<li>Zachowanie komórek neuronalnych pod ciśnieniem, zwłaszcza przy ocenie mechanizmów wtórnych TBI lub efektów długoterminowych, należy badać po długim czasie po inkubacji. Komora zawierająca komórki jest narażona na potencjalnie niesterylne warunki podczas przenoszenia do pręta Kolsky’ego, procesu tłoczenia i powrotu do dygestorium do hodowli komórkowych. Dzięki wstępnej sterylizacji części komory oraz prawidłowemu montażowi i demontażowi szkiełka z hodowlą komórkową i komory wewnątrz dygestorium, możliwa jest długoterminowa inkubacja po zabiegu, trwająca nawet kilka tygodni.</li>
<li>Powtarzalność danych jest istotnym parametrem w eksperymentach z mechaniczną stymulacją komórkową. W przypadku naszego urządzenia powtarzalność odpowiedzi komórek neuronalnych określa się na podstawie tego, czy pożądany profil impulsowego ciśnienia – zarówno pod względem poziomu, jak i czasu trwania – jest uzyskiwany wielokrotnie. Ponieważ rejestrujemy uzyskany profil ciśnienia dla każdego procesu tłoczenia, dane dotyczące odpowiedzi komórkowej z niepożądanych profili ciśnienia mogą być później ręcznie wykluczone.</li>
<li>Cały proces tłoczenia, obejmujący montaż komory, przeniesienie i zamocowanie w pręcie Kolsky’ego, samo tłoczenie, przeniesienie z powrotem oraz demontaż komory, trwa mniej niż 10 min. Kolejne szkiełko z hodowlą komórkową może zostać poddane tłoczeniu natychmiast po poprzednim cyklu. Dzięki temu można efektywnie przeprowadzić wystarczającą liczbę eksperymentów. Nasza konfiguracja wykorzystuje szkiełka przedmiotowe o średnicy 18 mm. Jeden eksperyment nie dostarcza wystarczającej ilości białek do western immunoblottingu ze względu na rozmiar podłoża (a także częściowo dlatego, że niektóre z poddanych ciśnieniu komórek obumierają). Około trzech powtórnych eksperymentów dostarcza ilość białka wymaganą do immunoblottingu. Ponownie, powtarzalność jest każdorazowo sprawdzana na podstawie profilu ciśnienia.</li>
</ol>

<ol><li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Prec.+Phys.+Soc.+London%22%5BJournal%5D)">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity%2C+microtubule+disassembly%2C+and+axon+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li>
<li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng%22%5BJournal%5D)">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li>
<li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li>
<li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explosive+blast+neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li>
<li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+percussion+barotrauma+chamber%3A+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li>
<li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li>
<li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li>
<li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Lat.+Am.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

W celu badania uszkodzeń komórek mózgowych w warunkach TBI (urazowego uszkodzenia mózgu) zastosowano wiele technik eksperymentalnych in vitro. Obejmują one m.in. rozciąganie neuronów/astrocytów, naprężenia ścinające indukowane przepływem, upuszczanie ciężarka, nacięcia rylcem, przecięcia laserowe oraz litotrypsję.4,5 Przyjęto, że dominującym czynnikiem fizycznym w przypadku TBI jest krótkotrwałe nadciśnienie.6,7 W szczególności fala uderzeniowa w blast TBI (urazie wywołanym wybuchem) ma czas trwania impulsu rzędu milisekund.4 W oparciu o to założenie i obserwacje opracowano komorę barometryczną zdolną do przejściowego zwiększania ciśnienia, która jest wykorzystywana do oceny zachowania komórek mózgu w warunkach TBI. Na przykład w komorze do barotraumy z uderzeniem cieczowym zastosowano impuls ciśnienia o czasie trwania 20-30 ms i ciśnieniu szczytowym do 0,5 MPa, aby zbadać zachowanie ludzkich komórek glejowych w warunkach TBI.6 Niedawno VandeVord i wsp.7 użyli barometrycznej komory z uderzeniem metalowej kuli do badania zachowania astrocytów w warunkach TBI, jednak uderzenie metalowej kuli generowało wielokrotne impulsy ciśnienia. W niniejszym badaniu opracowaliśmy nowatorskie urządzenie do kompresji komórek, które generuje impulsowe nadciśnienie typu jednopulsowego. Urządzenie zostało opracowane na podstawie układu pręta Kolsky'ego, który był wykorzystywany jako aparat do badań materiałowych w naszych8 oraz innych badaniach.1,9 Zdolność pręta Kolsky'ego do testowania materiałów przy bardzo wysokiej prędkości obciążania została zmodyfikowana tak, aby umożliwić przyłożenie nadciśnienia typu jednopulsowego do hodowanych komórek wewnątrz komory ciśnieniowej (Rysunek 1). Udało nam się skutecznie kontrolować wartość i czas trwania impulsowego nadciśnienia. Jako reprezentatywną odpowiedź komórkową wykazaliśmy, że przy ciśnieniu 2 MPa komórki neuronalne SH-SY5Y wykazują znaczną utratę neurytów i aksonów w porównaniu z komórkami kontrolnymi w nieociśnionej komorze.
Podsumowując, opracowaliśmy nowatorską aparaturę do impulsowego zwiększania ciśnienia w komórkach, wykorzystując specjalnie zaprojektowane urządzenie w postaci pręta Kolsky'ego, oraz wykazaliśmy potencjał jego zastosowania w badaniu odpowiedzi komórek neuronalnych w warunkach TBI. Zauważamy również, że technika ta jest bardzo wszechstronna, ponieważ dowolny typ komórek może zostać poddany działaniu ciśnień impulsowych o różnym natężeniu i czasie trwania. W związku z tym urządzenie może być wykorzystywane do badania zachowań mechanotransdukcji komórkowej indukowanej ciśnieniem impulsowym, nie tylko w celu uszkadzania komórek, ale także do ich pozytywnej stymulacji w zakresie funkcji i determinacji losu komórkowego.

<table><tbody><tr><td>ludzkie komórki neuroblastoma SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szklane laminki o średnicy 18 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pożywka do hodowli komórkowej: DMEM, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kwas retinowy (10 &amp;mu;M) do indukowania neurogenezy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>urządzenie do impulsowegoy pressuryzacji z prętem Kolsky'ego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tłokowo-cylindryczna komora do pressuryzacji komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>śruby ze stali nierdzewnej do mocowania laminki z hodowlą komórek na tłoku</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>smar do powierzchni styku między komorą komórkową a prętem Kolsky'ego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ogólne odczynniki do biologii molekularnej do oceny odpowiedzi komórek na pressuryzację (utrwalacz, przeciwciała, barwnik fluorescencyjny, odczynniki do PCR itp.)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

impulsywne zwiększanie ciśnienia w komórkach neuronalnych na potrzeby badań nad urazowym uszkodzeniem mózgu

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Opracowano nowatorski eksperyment impulsywnego zwiększania ciśnienia w komórkach z wykorzystaniem urządzenia typu pręt Kolskiego w celu zbadania urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) wywołanego falą uderzeniową. W niniejszym artykule wideo demonstrujemy, w jaki sposób impulsywne zwiększanie ciśnienia, istotne w kontekście TBI wywołanego falą uderzeniową, jest stosowane wobec komórek neuronalnych in vitro. Jest to osiągane poprzez wykorzystanie dobrze kontrolowanego impulsu ciśnienia wytworzonego przez specjalistyczne urządzenie typu pręt Kolskiego, przy jednoczesnym zapisie pełnej historii ciśnienia wewnątrz komory do zwiększania ciśnienia w komórkach. Komórki neuronalne poddane ciśnieniu są badane bezpośrednio po zabiegu lub inkubowane dalej, aby zbadać długofalowe efekty impulsywnego zwiększania ciśnienia na wzrost neurytów/aksonów, ekspresję genów neuronalnych, apoptozę itp. Zaobserwowano, że impulsywne zwiększanie ciśnienia do około 2 MPa indukuje wyraźną utratę neurytów w porównaniu z komórkami niepoddanymi ciśnieniu. Nasza technika stanowi nową metodę badania mechanizmów molekularnych i komórkowych blast TBI poprzez impulsywne zwiększanie ciśnienia w komórkach mózgu przy dobrze kontrolowanej wartości i czasie trwania ciśnienia.

Opracowano nowy eksperyment impulsowego zwiększania ciśnienia w komórkach z wykorzystaniem pręta Kolsky'ego w celu zbadania mechanizmów molekularnych i komórkowych urazowego uszkodzenia mózgu wywołanego falą uderzeniową.

Impulsywne zwiększanie ciśnienia w komórkach neuronalnych na potrzeby badań nad urazowym uszkodzeniem mózgu

Opracowano nową metodę eksperymentalnego impulsowego zwiększania ciśnienia w komórce z wykorzystaniem urządzenia w postaci pręta Kolsky’ego w celu zbadania urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) wywołanego falą uderzeniową. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest podanie i obserwacja impulsowego wzrostu ciśnienia w hodowlach komórek mózgu na potrzeby badań nad urazowąy traumą mózgu. Jest to realizowane poprzez uprzednią indukcję różnicowania neuronalnego komórek hodowanych z użyciem kwasu retinowego. Następnie komórki neuronalne umieszcza się w urządzeniu doy pressuryzacji komórek opartym na konstrukcji ksky bar, gdzie są one poddawane impulsowemu ciśnieniu o wartości i czasie trwania odpowiadających urazowym traumom mózgu wywołanym przez falę uderzeniową.Na koniec komórki poddaje się analizom biologii molekularnej w celu oceny uszkodzeń komórkowych i potencjalnych mechanizmów urazowego uszkodzenia mózgu. Wyniki badania mikroskopowego wykazują śmierć komórek neuronalnych oraz utratę struktury aksonów neurytów przy impulsowym podwyższeniu ciśnienia o wartości dwóch megapaskali i czasie trwania 0,7 milisekundy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak perkusja płynowa, jest brak etapów ciśnienia ujemnego oraz precyzyjna kontrola czasu trwania impulsu.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie urazowych obrażeń mózgu (TBI), takie jak próg śmierci lub uszkodzenia komórek nerwowych w zależności od ciśnienia impulsowego, jego wielkości, czasu trwania oraz kształtu obciążenia. Choć metoda ta była dotychczas stosowana w naszej grupie do badania TBI wywołanego wybuchem, może ona być również wykorzystywana w innych rodzajach urazowych obrażeń mózgu, na przykład w TBI wywołanym uderzeniem. Procedura zostanie zaprezentowana przez Matthew, doktoranta z laboratorium profesor Chen fang, oraz przez li ha, technika z mojego laboratorium.W niniejszym eksperymencie wykorzystano zestaw prętów Ksky skonfigurowany jako aparat doywyżania ciśnienia w komórkach. Aparatura składa się z dwóch sześciometrowych prętów ze stopu aluminium zawieszonych na wyrównanych łożyskach mosiężnych oraz komory doywyżania ciśnienia w komórkach in vitro. Komora doywyżania ciśnienia, umieszczona pomiędzy prętami, składa się z cylindra tłokowego.Cylinder posiada niewielki otwór gwintowany w podstawie wnęki, który podczas instalacji próbki komórek odprowadza powietrze i nadmiar płynu. Tłok jest wykonany z tej samej rurki co pręt i owinięty dwiema lub trzema warstwami taśmy Teflon. Nakrętka mocuje szklane lamelki za pomocą dwóch małych śrub ze stali nierdzewnej.W tej demonstracji wykorzystano ludzkie komórki neuroblastoma SH-SY5Y. Protokół ten można jednak zastosować do wielu innych kultur modeli komórkowych. Komórki naniesiono na szklane zakrycia o średnicy 18 mm z gęstością 3000 komórek na cm².W uzupełnionej pożywce DMEM, podczas inkubacji komórek, wywołaj ich różnicowanie poprzez dodanie do medium 10 µM kwasu retinowego przez siedem dni, wymieniając pożywkę co dwa dni. Siódmego dnia komórki wykazują dobrze rozwiniętą strukturę aksonalną neurytów i są gotowe do poddania działaniu ciśnienia. Wszystkie części komory ciśnieniowej wysterylizuj w autoklawie i przechowuj pod światłem UV podczas montażu komory.W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy upewnić się, że śruba wentylacyjna w komorze jest luźno osadzona w otworze wentylacyjnym. Na dnie wgłębienia należy wypełnić komorę świeżo przygotowaną, ciepłą pożywką wzrostową. Następnie do nakrętki tłoka należy przykręcić szkiełko przedmiotowe z hodowlą komórek, tak aby komórki były skierowane na zewnątrz, a następnie ostrożnie włożyć tłok do wnętrza komory.Odkręć śrubę odpowietrzającą, przechyl otwór odpowietrznika do góry i wciśnij tłok do komory do wcześniej wyznaczonej linii referencyjnej. Pozostawi to około sześciu milimetrów głębokości cieczy wewnątrz komory ciśnieniowej ogniwa. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza, zdezynfekować śrubę odpowietrzającą i wkręcić ją z powrotem, aby zapewnić szczelność komory.Komora nie powinna przeciekać pod obciążeniem statycznym. Zresetuj system poprzeczny Ksky. Przenieś ciężką masę z powrotem do jej pierwotnej pozycji i zamontuj śrubę blokującą.Zatrzask blokujący generuje siłę zacisku, która zapobiega przesunięciu pręta uderzającego do momentu złamania pinów. Za pomocą siłownika hydraulicznego dociśnij nowy zatrzask blokujący do ciśnienia około 200 PSI. Użyj podnośnika nożycowego, aby ścisnąć sekcję wstępnego naprężenia pręta uderzającego do ciśnienia nieco wyższego niż wartość docelowa, a następnie poluzuj go, aby w pełni wykorzystać tarcie śruby JAK. Teraz skonfiguruj system akwizycji danych, ponieważ procesy ciśnieniowe trwają około jednej milisekundy.Ustaw częstotliwość próbkowania na 1 MHz, używając tensometrów o rezystancji 2000 ohm w układzie mostka Wheatstone'a. Napięcie na pręcie nadawczym powinno zostać ustawione na 45 V. Zamontuj komorę z ogniwem tak, aby tłok był skierowany w stronę pręta nadawczego.Umieść komorę pomiarową w bloku V wspieranym przez mały laboratoryjny podnośnik nożycowy i wyrównaj ją z dwoma prętami. Lekko nasmaruj każdą powierzchnię styku i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza między stykającymi się powierzchniami, delikatnie pocierając je o siebie. System jest teraz przygotowany.Uruchom system akwizycji danych i przeprowadź test, szybko pompując hydrauliczny siłownik zacisku. Spowoduje to przełamanie rygla blokującego, co doprowadzi do rozdzielenia zacisku i przesłania fali ciśnienia do komórek. Po zakończeniu testu wyjmij preparat z komory w komorze z laminarnym przepływem powietrza i przystąp do oceny zachowania komórek.Przy odpowiednim doświadczeniu aparat może być wykorzystany do poddania ciśnieniu około dziewięciu slajdów z hodowlami komórkowymi na godzinę. Podczas analizy odczytu na początku sygnału paska transmisyjnego mogą pojawić się błędy wynikające z obecności pęcherzyków powietrza, jednak nie występują one w niniejszej demonstracji.Jeśli pasek transmitancji jest wystarczająco długi, najważniejsze dane powinny zaczynać się od pierwszego zaburzenia i kończyć w miejscu, gdzie pomiary wykazują ujemne ciśnienie; odczyt tego napięcia jest proporcjonalny do naprężeń doświadczanych przez komórki w analizie tensometrycznej. Czas trwania impulsu przenikającego może być krótszy niż impulsu padającego. Jeśli w cieczy wewnątrz komory ciśnieniowej komórki zostanie uwięziony mały pęcherzyk, amplituda impulsu przenikającego może nie przekroczyć amplitudy impulsu padającego, ale powinna on posiadać wystarczająco długie plateau przed odciążeniem.W przeciwnym razie w zamkniętej komorze uwięziony został duży pęcherzyk powietrza lub zespół i pręt są niewspółosiowe. Po naprężeniu komór można poddać natychmiastowej inspekcji lub inkubować dalej w celu późniejszej analizy. Należy porównać komórki poddane naprężeniu z komórkami kontrolnymi z komory, które były traktowane w identyczny sposób, ale nie poddano ich naprężeniu, aby ocenić zmiany w długości neurytów za pomocą mikroskopii optycznej w różnych punktach czasowych po inkubacji.Barwienie immunofluorescencyjne aktyny może być wykorzystane do oceny zmian w cytoszkielecie. Można również zastosować przeciwciało przeciwko białku MAP2 (mikrotubule-associated protein two) w celu wizualizacji zmian w jednym z kluczowych markerów neuronalnych.Aby ocenić wpływ impulsowego zwiększania ciśnienia na ekspresję genów neuronalnych i apoptotycznych, w razie potrzeby należy zastosować standardowe techniki biologii molekularnej, takie jak R-T-P-C-R. Wystarczającą ilość lizatów komórkowych do immunoblottingu można zebrać z kilku identycznie poddanych ciśnieniu próbek komórek. W tym przykładzie profilu ciśnienia aparat ksky bar z powodzeniem zastosował impulsowe ciśnienie typu pojedynczego impulsu o wartości 2 MPa i czasie trwania około 0,7 ms do hodowanych komórek neuronalnych, co widać na obrazach z mikroskopu optycznego; ludzkie komórki neuronalne SHSY five Y poddane impulsowemu ciśnieniu 2 MPa wykazują wyraźny rozpad aksonów neurytów w porównaniu z komórkami kontrolnymi, które nie były poddawane ciśnieniu.Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze trzymać komorę ciśnieniową w ten sposób, a nie w ten, ponieważ spowodowałoby to poddanie komórek podciśnieniu po ich wykształceniu. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny neuronauki do zgłębienia mechanizmów komórkowych urazowych obrażeń mózgu w kontrolowanych warunkach ciśnienia. Dziękujemy za wsparcie finansowe z Army UNL Center for Trauma Mechanics.

impulsive-pressurization-neuronal-cells-for-traumatic-brain-injury

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Impulsywne naciskanie komórek neuronowych w badaniach nad urazami mózgu

Przedstawiono metodę bocznego uderzenia płynnego (LFP), uznany model urazowego uszkodzenia mózgu u myszy. LFP spełnia trzy główne kryteria dla modeli zwierzęcych: poprawność, niezawodność i istotność kliniczną. Opisano procedurę składającą się z chirurgicznej kraniotomii, zamocowania adaptera oraz następującego po nich wywołania urazu, co prowadzi do powstania uszkodzeń ogniskowych i rozlanych.

Boczna perkusja płynowa: model urazowego uszkodzenia mózgu u myszy

Ten film demonstruje procedurę wywoływania urazowego uszkodzenia mózgu u myszy w otwartej czaszce poprzez wykonanie nacięcia w linii środkowej czaszki, przewiercenie czaszki i usunięcie płata kostnego w celu odsłonięcia kory mózgowej oraz zastosowanie wysokiego ciśnienia w celu wywołania urazu. Rana jest następnie zszywana w celu przygotowania modelu myszy do kolejnych eksperymentów.

Generowanie mysiego modelu urazowego uszkodzenia mózgu za pomocą sondy impaktorowej

Modele urazowego uszkodzenia mózgu in vitro są opracowywane do odtwarzania deformacji mózgu in vivo. Uraz wywołany rozciąganiem został zastosowany w przypadku astrocytów, neuronów, komórek glejowych, komórek aorty i śródbłonka mózgu. Jednak nasz system wykorzystuje model bariery krew-mózg (BBB), który posiada właściwości stanowiące legalny model bariery krew-mózg, aby ustanowić model TBI in vitro.

Rozciąganie w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (cEND) jako model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu bariery krew-mózg

Urazowe uszkodzenia mózgu (TBI) pozostają poważnym problemem zdrowotnym. Wykorzystując model chirurgii kontrolowanego wpływu kory mózgowej, można przeprowadzić badania nad skutkami TBI i możliwymi metodami leczenia.

Kontrolowany model uderzenia kory mózgowej w przypadku urazowego uszkodzenia mózgu

Ten artykuł opisuje nowy model pierwotnego uszkodzenia mózgu spowodowanego wybuchem. Rurka uderzeniowa napędzana sprężonym powietrzem służy do wystawiania in vitro mysich kultur hipokampa na pojedynczą falę uderzeniową. Jest to prosty i szybki protokół generujący powtarzalne uszkodzenie tkanki mózgowej o wysokiej przepustowości.

Nowatorski model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu

Tutaj prezentujemy protokół opisujący metody określania reaktywności naczyniowej ex vivo po pierwotnym uszkodzeniu mózgu (bTBI) przy użyciu izolowanych, ciśnieniowych, gryzoniowych segmentów środkowej tętnicy mózgowej (MCA). Indukcja bTBI odbywa się za pomocą rurki szokowej, znanej również jako urządzenie Advanced Blast Simulator (ABS).

Wpływ neurotraumy wywołanej wybuchem na tętnice środkowe mózgowe gryzoni pod ciśnieniem

Tutaj prezentujemy protokół do wywołania ciężkiego TBI za pomocą modelu bocznego uszkodzenia płynem płynowym (FPI) u dorosłych, samców szczurów rasy Wistar. Demonstrujemy również zastosowanie bezprzewodowego systemu telemetrycznego do zbierania ciągłych zapisów wideo-EEG i monitorowania wyładowań padaczkowych zgodnych z epileptogenezą pourazową.

Wykorzystanie bezprzewodowego systemu wideo-EEG do monitorowania wyładowań padaczkowych po bocznym urazowym uszkodzeniu mózgu wywołanym płynem

Tutaj opisujemy protokół indukcji mysiego urazowego uszkodzenia mózgu poprzez kontrolowane uderzenie w korę mózgową z otwartą głową.

Mysi model kontrolowanego wpływu na korę mózgową w celu indukcji urazowego uszkodzenia mózgu

Prezentujemy tutaj protokół modelu fali uderzeniowej dla gryzoni w celu zbadania neurobiologicznych i patofizjologicznych skutków łagodnego do umiarkowanego urazowego uszkodzenia mózgu. Stworzyliśmy zasilany gazem, laboratoryjny zestaw wyposażony w czujniki ciśnienia, co pozwala na niezawodne i powtarzalne generowanie łagodnych lub umiarkowanych urazowych uszkodzeń mózgu wywołanych wybuchem.

Model fali uderzeniowej o niskiej intensywności do przedklinicznej oceny łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u gryzoni

Przedstawione tutaj są metody wytwarzania powtarzających się ekspozycji na wybuchy o niskiej intensywności przy użyciu myszy.

Modelowanie wysoce powtarzalnej ekspozycji na podmuch o niskim poziomie u myszy

Protokół ten opisuje niestandardowy system powietrza nadciśnieniowego przeznaczony do wywoływania uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego (OUN) układu zamkniętego (OUN) u myszy, w tym urazów oczu, mózgu i rdzenia kręgowego. Celem tego protokołu jest zapewnienie naukowcom ram do łatwego dostosowywania i rozszerzania systemu do ich unikalnych badań nad urazami OUN.

System do leczenia ogniskowych, zamkniętych uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego

Poznaj metodę impulsywnego zwiększania ciśnienia w komórkach neuronalnych przy użyciu urządzenia Kolsky'ego do badania mechanizmów urazowego uszkodzenia mózgu. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę parametrów ciśnienia.

Impulsywne zwiększanie ciśnienia w komórkach neuronalnych na potrzeby badań nad urazowym uszkodzeniem mózgu

Przeglądaj więcej filmów