Trójwymiarowa mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej
3 maja 2011
Mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej (OR-PAM) to nowa technologia zdolna do obrazowania kontrastów absorpcji optycznej in vivo z rozdzielczością komórkową i czułością. W tym miejscu udostępniamy wizualizowaną instrukcję dotyczącą protokołów eksperymentalnych OR-PAM, w tym konfiguracji systemu, wyrównania systemu, typowych procedur eksperymentalnych in vivo i schematów obrazowania funkcjonalnego.
Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie in vivo mikroskopii fotoakustycznej w rozdzielczości optycznej lub/lub Pam mikrokrążenia, która jest nieinwazyjna i wolna od znaczników. Osiąga się to poprzez uprzednie znieczulenie zwierzęcia doświadczalnego. Drugim krokiem procedury jest ustawienie obszaru zainteresowania poprzez translację głowicy obrazowania o rozdzielczości optycznej, następnie ustawia się parametry skanowania mikroskopu fotoakustycznego i rozpoczyna akwizycję obrazu.
Ostatecznie rozkłady całkowitego stężenia tlenu i nasycenia hemoglobiny tlenem uzyskuje się poprzez obliczenie danych eksperymentalnych o wielu długościach fali. Mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej opiera się na wzbudzeniu laserowym i detekcji ultradźwiękowej. Krótka wiązka lasera po zakończeniu jest skupiana w tkance biologicznej.
Absorpcja światła generuje przejściowe ogrzewanie, a następnie emisję ultradźwiękową, która jest odbierana w celu utworzenia obrazu. Unikalną zaletą Pam jest bezziemna detekcja i wyjątkowa czułość na absorpcję optyczną. W przeciwieństwie do tego, istniejące technologie odbicia, a nie mikroskopii optycznej, są przede wszystkim wrażliwe na rozpraszanie optyczne lub fluorescencję Zdolne do zapewnienia obrazowania absorpcji optycznej lub RPM bez etykiet vavo znalazły szerokie zastosowania biomedyczne w neurologii, okulistyce, biologii naczyniowej i dermatologii.
Mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej lub pamm składa się zarówno z elementów optycznych, jak i ultradźwiękowych. Źródłem promieniowania optycznego jest laser barwnikowy pompowany przez laser impulsowy na ciele stałym. Wyjściowa wiązka laserowa jest tłumiona przez filtr o neutralnej gęstości i sprzężona ze światłowodem jednomodowym w celu dostarczania światła, aby umożliwić mechaniczne skanowanie głowicy obrazowania mikroskopu, a nie żywego obiektu, aby skutecznie połączyć wielomodową wiązkę laserową ze światłowodem jednomodowym.
Najpierw jest filtrowany przez otwór o średnicy 50 mikrometrów. Otworek jest umieszczony nieco z dala od ogniska soczewki kondensatora, aby dopasować jego średnicę do średnicy wiązki modów podstawowych. Aby uzyskać prawie ograniczone dyfrakcją ogniskowanie optyczne, wyjście światłowodu jednomodowego jest sortowane i wypełnia tylną aperturę mikroskopu. Cel.
Detekcja ultradźwiękowa obejmuje domowej roboty akustyczny łącznik wiązki optycznej połączony z przetwornikiem ultradźwiękowym. Sumator wyrównuje współosiowo promieniowanie optyczne i detekcję akustyczną. Sferyczna wnęka jest mielona w dnie sumatora w celu wytworzenia soczewki akustycznej o aperturze numerycznej 0,5 w wodzie, która zapewnia akustyczną średnicę ogniskowej 43 mikrometrów przy częstotliwości centralnej 50 megaherców.
W pierwszym wyrównaniu pomocne jest użycie ultradźwięków echa impulsowego w celu określenia położenia akustycznej płaszczyzny ogniskowej. Głowica obrazująca jest ustawiana w pionie, aż do momentu zaobserwowania maksymalnego sygnału ultradźwiękowego echa impulsowego. Aby zmaksymalizować czułość wykrywania, ogniska optyczne i akustyczne są wyrównane. Ogniskowy.
Cel pochłaniający optycznie, taki jak kawałek czarnej taśmy izolacyjnej, umieszcza się w akustycznej płaszczyźnie ogniskowej. Następnie regulowana jest optyczna pozycja ogniskowej, aby zmaksymalizować sygnał fotoakustyczny. W skład systemu PAM wchodzą również wzmacniacze elektroniczne i przetwornik analogowo-cyfrowy, skaner mechaniczny oraz sterownik skanera.
Zdigitalizowany sygnał jest przesyłany do komputera w celu utworzenia obrazu. Oprogramowanie przekształca surowe dane w sekwencję przekrojowych obrazów bcan. Gdy raster głowicy mikroskopu skanuje obiekt, zarejestrowane obrazy mogą być następnie wyświetlane jako indywidualne obrazy przekrojowe, obrazy projekcyjne 2D o maksymalnej amplitudzie lub renderingi 3D.
Zbiornik na wodę służy do umieszczenia głowicy obrazowania mikroskopu. Okienko obrazowania jest wycinane na szalce Petriego i uszczelniane przezroczystą ultradźwiękowo i optycznie membraną polietylenową. Fala fotoakustyczna generowana przez obiekt jest akustycznie sprzężona z detektorem ultradźwiękowym najpierw przez żel ultradźwiękowy między obiektem a membraną polietylenową, a następnie przez dejonizowaną wodę na szalce Petriego.
Te wynalazki i zastosowania dostępnej optyki, laserów i przetwornika ultradźwiękowego składają się na system lub pam. W następnym segmencie zobrazujemy mikrokrążenie żywej myszy z tym systemem. Jeśli obrazowane zwierzę nie jest nagą myszą, na 24 godziny przed eksperymentem idealnie jest to zrobić.
W ten sposób podrażnienie układu naczyniowego skóry zostaje odzyskane. Znieczulił mysz 3% fluorem ISO odparowanym w tlenach klasy medycznej. Typowe natężenie przepływu wynosi od jednego do 1,5 litra na minutę.
W zależności od masy ciała zwierzęcia. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 1% fluoru ISO Przez cały czas trwania eksperymentu wykonuj szczypanie palca u nogi, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona. Przenieś mysz do etapu stereotaktycznego za pomocą poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza.
Teraz spłaszcz ucho na plastikowej płytce. Następnie nałóż warstwę żelu ultradźwiękowego na wierzch ucha. Unikaj zatrzymywania pęcherzyków powietrza wewnątrz żelu.
Nałóż również maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu lub przypadkowemu uszkodzeniu lasera. Unikaj bezpośredniego dotykania oka aplikatorem. Następnie umieść ucho pod okienkiem obrazowania i powoli podnoś stopień zwierzęcia, aż żel ultradźwiękowy zetknie się z dolną częścią membrany.
Wymagany jest miękki kontakt, ponieważ dociskanie ucha do błony może wpływać na przepływ krwi w uchu. Następnie podejmij kilka środków ostrożności ze zwierzęciem, aby monitorować jego stan fizjologiczny. Zamocuj pulsoksymetr na myszy, nodze lub ogonie.
Teraz opuść głowicę obrazowania, aż soczewka akustyczna zostanie zanurzona w wodzie dejonizowanej i usuń pęcherzyki uwięzione pod soczewką akustyczną. Ustaw laser w trybie wyzwalania zewnętrznego i rozpocznij skanowanie próbne. Dostosuj pozycję Z głowicy obrazowej, aż podwójne ogniska optyczne i akustyczne znajdą się na środku ucha.
Teraz ustaw parametry skanowania i rozpocznij formalną akwizycję obrazu. Aby zmierzyć całkowite stężenie hemoglobiny. Ustaw długość fali na punkt spastyczny ISO, w którym oksyhemoglobina i deoksyhemoglobina mają równe współczynniki ekstynkcji molowej.
Aby zmierzyć nasycenie hemoglobiny tlenem, ustaw drugą długość fali na miejsce, w którym współczynniki ekstynkcji molowej oksyhemoglobiny i deoksyhemoglobiny mają wyraźną różnicę. Po zakończeniu wyczyść ucho myszy i umieść mysz w inkubatorze. Przy temperaturze otoczenia ustawionej na 37 stopni Celsjusza, gdy się obudzi, w naturalny sposób wróć mysz do obiektu dla zwierząt.
Ten obraz projekcji o maksymalnej amplitudzie pokazuje anatomię naczyniową żywego, nagiego ucha myszy zobrazowaną przy użyciu lub Pam w odległości 570 nanometrów. Ten obraz projekcyjny pokazuje nasycenie hemoglobiny tlenem w tym samym uchu. Oblicza się go na podstawie obrazów uzyskanych przy spastycznej długości fali ISO wynoszącej 570 nanometrów i dominującej długości fali absorpcji deoksyhemoglobiny wynoszącej 561 nanometrów.
Bliższe przyjrzenie się obszarowi ramkowemu pokazuje rozdzielczość oramm. Gęsto upakowane złoże kapilarne jest wyraźnie rozdzielone. W tym filmie zademonstrowaliśmy typowy protokół eksperymentalny dla ORPM, w tym konfigurację systemu, procedurę eksperymentalną dopasowania systemu in vivo i schemat obrazowania funkcjonalnego.
Jednym z najważniejszych aspektów projektowania i eksploatacji przyrządu jest optyczne akustyczne wyrównanie konfokalne, co ma kluczowe znaczenie dla czułości obrazowania, mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej w połączeniu z mikroskopią fotoakustyczną o głębokiej rozdzielczości akustycznej i fotoakustyczną tomografią komputerową obiecuje in vivo, obrazowanie funkcjonalne i molekularne oraz wiele skal końcowych, paznokcie narządów, komórki, tkanki, i aż do narządów mogą być obrazowane z tym samym kontrastem. Geneza, taka jak skalowalność obrazowania, ma potencjał, aby zrewolucjonizować badania nad systemami wieloskalowymi, biologią i translacją. Od mikroskopowych odkryć laboratoryjnych po makroskopową praktykę kliniczną.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół mikroskopii fotoakustycznej o rozdzielczości optycznej (OR-PAM), techniki obrazowania nieinwazyjnego, która zapewnia rozdzielczość komórkową in vivo. Procedura obejmuje znieczulenie zwierzęcia, pozycjonowanie głowicy obrazu i pozyskiwanie obrazów do analizy mikrokrążenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Techniki obrazowania
- Mikroskopia fotoakustyczna
Tło
- OR-PAM to nowa technologia obrazowania.
- Pozwola na obrazowanie kontrastów absorpcji optycznej.
- Technika jest bezznacznikowa i nieinwazyjna.
- Zapewnią wgląd w mikrokrążenie i poziomy tlenu w tkankach.
Cel badania
- Aby wykazać zastosowanie OR-PAM in vivo.
- Aby zapewnić wizualizowane instrukcje dotyczące protokołów eksperymentalnych.
- Aby zwiększyć zrozumienie dynamiki mikrokrążenia.
Stosowane metody
- Znieczulenie zwierzęcia eksperymentalnego.
- Pozycjonowanie obszaru zainteresowania do obrazowania.
- Ustawienie parametrów skanowania do pozyskiwania obrazu.
- Obliczanie całkowitej koncentracji tlenu i nasycenia na podstawie danych wielofalowych.
Główne wyniki
- Udane obrazowanie mikrokrążenia in vivo.
- Pozyskanie danych dotyczących koncentracji i nasycenia tlenu.
- Demonstracja nieinwazyjnego charakteru techniki.
- Walidacja OR-PAM jako narzędzia do obrazowania funkcjonalnego.
Wnioski
- OR-PAM jest skuteczna w obrazowaniu mikrokrążenia.
- Technika dostarcza cenny informacji o utlenianiu tkanek.
- Ma potencjalne zastosowania w różnych dziedzinach badań biomedycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Three-dimensional optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) enables non-invasive, label-free, high-resolution imaging of tissue optical absorption, providing functional and physiological insights at the microvascular level. This capability addresses a critical gap in discovery-stage imaging by quantifying oxygenation and hemoglobin dynamics in vivo, supporting mechanistic de-risking and translational continuity. OR-PAM's integration of optical and acoustic detection offers unique value for target validation and predictive confidence in preclinical research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of tissue oxygenation and hemoglobin saturation for functional target interrogation.
- Supports biological de-risking by quantifying physiological responses in intact microvasculature.
- Facilitates predictive confidence in target engagement through quantitative, label-free imaging outputs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated in vivo models for downstream compound screening and mechanistic studies.
- Delivers reproducible, quantitative measurements of microvascular function and oxygenation.
- Enables assay standardization and platform scalability for high-content imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant physiological biomarkers such as oxygen saturation.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting multi-scale, functional imaging.
- De-risks advancement decisions by enabling direct measurement of tissue-level pharmacodynamics.
Pipeline & Workflow Integration
OR-PAM fits within the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies and translational biomarker validation through quantitative, in vivo imaging.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring real-time physiological changes in microcirculation.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible imaging of vascular and oxygenation parameters for compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative readouts of hemoglobin concentration and oxygen saturation for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects functional imaging data to preclinical biomarker strategies when aligned with disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for multi-scale, multi-organ functional studies across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable imaging workflows for in vivo studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing actionable physiological data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on functional imaging evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical and acoustic system alignment and in vivo imaging protocols.
- Demands access to specialized laser, ultrasound, and data acquisition instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data analysis workflows.
- May require adaptation for different tissue types or animal models based on optical properties.
- Imaging sensitivity and resolution depend on precise optical-acoustic confocal alignment.
