Name: Test bioluminescencji wapnia do analizy funkcjonalnej receptorów sprzężonych z białkiem G komarów (Aedes aegypti) i kleszczy (Rhipicephalus microplus) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj test bioluminescencji wapnia do analizy relacji struktura-aktywność neuropeptydów stawonogów na receptorach GPCR komarów Aedes aegypti i kleszczy Rhipicephalus microplus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy wdzięczność dr. C. J. P. Grimmelikhuijzenowi i dr. Michaelowi Williamsonowi z Uniwersytetu Kopenhaskiego (Dania) za udostępnienie plazmidu aequoriny. Dziękujemy naszemu współpracownikowi, dr. Ronaldowi J. Nachmanowi z ARS-USDA (TX, USA), za syntezę peptydów oraz udostępnienie czytnika płytek NOVOstar.

<ol><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+5%27-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).</li>
<li>Nachman, R., Pietrantonio, P. V. Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNachman%2C+R+%22Neuropeptide+systems+as+Targets+for+Parasite+and+Pest+Control%22">Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control</a>. Geary, T. , Landes Bioscience. Madamme Curie Library. (2010).</li>
<li>Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+development+of+novel+pest+management+agents+based+upon+insect+kinin+neuropeptide+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biostable+agonists+that+match+and%2For+exceed+the+activity+of+insect+kinins+on+recombinant+arthropod+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs.</a> General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+insect+kinin+analogs+with+cis-peptide+bond%2C+type+VI-turn+motifs+identifies+optimal+stereochemistry+for+interaction+with+a+recombinant+arthropod+kinin+receptor+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus.</a> Peptides. 29, 295-301 Forthcoming.</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+selective+and+non-selective%2C+biostable+beta-amino+acid+agonists+of+recombinant+insect+kinin+receptors+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+and+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti.</a> Peptides. 29, 302-309 Forthcoming.</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+structure-activity+analysis+of+insect+kinin+core+analogs+on+recombinant+kinin+receptors+drom+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+%28Acari%3A+Ixodidae%29+and+mosquito+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).</li>
<li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mosquito+Aedes+aegypti+%28L.%29+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).</li>
<li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+%28Acari%3A+Ixodidae%29+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).</li>
<li>Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+the+insect+adipokinetic+hormone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).</li>
<li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Dzięki zastosowaniu niniejszego protokołu udało nam się przeprowadzić charakterystykę funkcjonalną pierwszego receptora neuropeptydowego odkrytego u Arachnida (kleszcze, roztocza i pająki) – receptora kininowego kleszcza. Metoda ta ma trzy główne zastosowania. Po pierwsze, technikę tę można wykorzystać do deoatfania receptorów poprzez pomiary aktywności ligandów. Po drugie, test ten pozwala na określenie zależności między strukturą a aktywnością (SAR) ligandu i receptora. Po trzecie, metody te mogą być wykorzystane w procesie poszukiwania nowych leków. Co więcej, protokół ten może służyć do badania aktywności agonistów lub antagonistów niemal każdego GPCR. Rozpoczynamy proces adaptacji tego protokołu do skriningu małych bibliotek związków. Wykorzystana przez nas linia komórkowa nie wykazuje ekspresji powszechnego białka G, G16. Nie było ono wymagane, ponieważ receptory kininowe stawonogów sygnalizują poprzez białko Gq i wewnątrzkomórkową kaskadę wapniową, a właściwości sygnalizacyjne te zostają zachowane w komórkach ssaków, co wykazano w niniejszej pracy.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>komórki CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td>Manassas, VA, USA</td></tr><tr><td>pożywka F12K</td><td>Invitrogen</td><td>21127</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0643</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>15400</td><td></td></tr><tr><td>antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy</td><td>Invitrogen</td><td>15240</td><td></td></tr><tr><td>pożywka z obniżoną zawartością surowicy Opti-MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik Lipofectin</td><td>Invitrogen</td><td>18292-011</td><td></td></tr><tr><td>GENETICIN</td><td>Invitrogen</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>MC1061/P3 Ultracomp</td><td>Invitrogen</td><td>C663-03</td><td></td></tr><tr><td>zestaw QIAprep spin miniprep</td><td>Qiagen</td><td>19064</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik do transfekcji FuGENE 6</td><td>Roche Group</td><td>11 814 443 001</td><td></td></tr><tr><td>biała mikropłytka 96-dołkowa z cienkim dnem</td><td>Costar</td><td>3610</td><td></td></tr><tr><td>pożywka DMEM bez wapnia</td><td>Invitrogen</td><td>21068</td><td></td></tr><tr><td>C&amp;#8211;lenterazyna</td><td>Invitrogen</td><td>C-2944</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr Bright-Line</td><td>Hausser Scientific</td><td></td><td>Horsham, PA</td></tr><tr><td>NOVOstar</td><td>BMG Labtechnologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie Prism 4.0</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td>San Diego, CA, USA</td></tr><tr><td>kolby T-25 i T-75</td><td>BD Biosciences</td><td>353014 i 353135</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza funkcjonalna receptorów sprzężonych z białkiem g u komarów (aedes aegypti) i kleszczy (rhipicephalus microplus) z wykorzystaniem testu bioluminescencji wapniowej

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Receptory hormonalne stawonogów są potencjalnymi celami dla nowych pestycydów, ponieważ regulują one wiele istotnych procesów fizjologicznych i behawioralnych. Większość z nich należy do superrodziny receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR). Skupiliśmy się na charakterystyce receptorów kinin stawonogów u kleszczy i komarów. Kininy stawonogów to wielofunkcyjne neuropeptydy o działaniu myotropowym, diuretycznym i neurotransmitującym. W niniejszej pracy opisano metodę systematycznych analiz zależności struktura-aktywność kinin owadziech w dwóch heterologicznych systemach ekspresji receptorów kinin. Dostarczamy istotnych informacji przydatnych w opracowywaniu biostabilnych analogów kinin z potencjałem do zaburzania procesów diuretycznych, myotropowych i/lub trawiennych u kleszczy i komarów.
Receptory kinin z kleszcza bydła, Boophilus microplus (Canestrini), oraz komara Aedes aegypti (Linnaeus), zostały stabilnie wyekspresjonowane w ssaczej linii komórkowej CHO-K1. Analizy funkcjonalne tych receptorów przeprowadzono przy użyciu płytkowego testu bioluminescencji wapnia, który mierzy wewnątrzkomórkową bioluminescencję w celu określenia poziomu wapnia cytoplazmatycznego po zastosowaniu peptydów do tych komórek rekombinowanych. Metoda ta wykorzystuje białko ekworynę, fotobiałko wyizolowane z bioluminescencyjnych meduz. Przejściowo przetransfekowaliśmy plazmid ekworyny (mtAEQ/pcDNA1) w liniach komórkowych stabilnie eksponujących receptory kinin. Następnie komórki te poddano działaniu kofaktora koelenterazyny, która tworzy kompleks z wewnątrzkomórkową ekworyną. Wiązanie to rozpada się w obecności wapnia, emitując poziomy luminescencji wskazujące na stężenie wapnia. Ponieważ receptor kinin sygnalizuje poprzez uwalnianie wewnątrzkomórkowego wapnia, intensywność sygnału jest powiązana z aktywnością peptydu.
Niniejszy protokół stanowi syntezę kilku wcześniej opisanych procedur z wprowadzonymi modyfikacjami; przedstawia on instrukcje krok po kroku dotyczące stabilnej ekspresji GPCR w linii komórkowej ssaków poprzez funkcjonalne testy płytkowe (Staubly et al., 2002 oraz Stables et al., 1997). Wykorzystując tę metodologię, udało nam się ustanowić stabilne linie komórkowe wykazujące ekspresję receptorów kinin komarów i kleszczy, porównać aktywność trzech kinin komara, zidentyfikować krytyczne pozycje aminokwasowe dla oddziaływania ligand-receptor oraz przeprowadzić półautomatyczny screening biblioteki peptydów. Ponieważ kininy owadzie są podatne na szybką degradację enzymatyczną przez endogenne peptydazy, ich zastosowanie w narzędziach do zwalczania szkodników lub w badaniach endokrynologicznych jest znacznie ograniczone. W związku z tym przetestowaliśmy również analogi kinin zawierające kwas aminizobutyrowy (Aib) w celu zwiększenia ich aktywności i biostabilności. Ten analog odporny na działanie peptydaz stanowi istotny punkt wyjścia w opracowywaniu biostabilnych analogów kinin owadziego i może pomóc w rozwoju strategii kontroli stawonogów opartych na neuropeptydach.

Niniejszy protokół zawiera instrukcje dotyczące selekcji klonalnych linii komórkowych oraz testu bioluminescencji wapniowej w celu analizy relacji struktura-aktywność syntetycznych neuropeptydów stawonogów względem ich pokrewnych receptorów GPCR. Test ten może być wykorzystany do deorfanizacji receptorów oraz badań relacji struktura-aktywność na potrzeby projektowania analogów syntetycznych oraz odkrywania peptydów i potencjalnych leków.

Analiza funkcjonalna receptorów sprzężonych z białkiem G u komarów (Aedes aegypti) i kleszczy (Rhipicephalus microplus) z wykorzystaniem testu bioluminescencji wapniowej

Receptory hormonów stawonogów są potencjalnymi celami dla nowych pestycydów, ponieważ regulują one wiele istotnych procesów fizjologicznych i behawioralnych. ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest analiza zależności struktura-aktywność syntetyzowanych neuropeptydów stawonogów w odniesieniu do ich cognate gpcr. Jest to realizowane poprzez transfekcję pustych komórek jajnika chomika syryjskiego (CHO-K1) odpowiednim wektorem ekspresyjnym G PCR R w celu otrzymania stabilnie przekształconych linii komórkowych pochodzących z pojedynczej komórki. W drugim kroku stabilna linia komórkowa jest transfekowana plazmidem quaran, który niesie gen reporterowy Quaran służący do pomiaru wewnątrzkomórkowej bioluminescencji w płytkowym teście bioluminescencji wapniowej. Następnie przeprowadzany jest płytkowy test bioluminescencji wapniowej w celu określenia poziomu wapnia w cytoplazmie po zastosowaniu ligandu peptydowego do tych rekombinowanych komórek.Uzyskane wyniki wykazują różnice w jednostkach bioluminescencji po zastosowaniu peptydów o różnych strukturach lub różnych stężeń peptydów w odniesieniu do komórek rekombinowanych, w zależności od wywołanego uwalniania wapnia wewnątrzkomórkowego, wykrywanego przez reporter corrin w teście na płytce. Główną zaletą wykorzystania stabilnie transformowanych klonalnych linii komórkowych wykazujących ekspresję rekombinowanych GPCR w porównaniu z przejściowymi protokołami ekspresji jest większa jednorodność poziomów ekspresji receptorów, co zapewnia spójność wyników. Ponadto, ukierunkowanie białka akwaryjnego na mitochondria umożliwia czułe pomiary wapnia za pomocą bioluminescencji, co zostanie zademonstrowane w dzisiejszym eksperymencie przez dwóch doktorantów, Shall in Lie i Simona Kersch oraz postdoca z mojego laboratorium.Aby utworzyć stabilne linie komórkowe, należy rozpocząć od hodowli komórek jajnika chomika chińskiego, K1 empty w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 i odpowiednim nawilżeniem. Utrzymuj komórki empty w pożywce wzrostowej z 1x antybiotykiem i antymykotykiem, gdy komórki będą rozwijać się prawidłowo. Przesiej komórki jajnika chomika chińskiego K1 do kolb tkankowych T25 i hoduj je przez noc w pożywce wzrostowej bez antybiotyków, aż osiągną około 30% konfluencji.Przed transfekcją należy przygotować wektor ekspresyjny DNA zawierający interesujący receptor GPCR zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Połączyć DNA ze 100 µL medium z obniżoną zawartością surowicy Optum.Wymieszać 6 µL odczynnika do lipofekcji ze 100 µL bezserwatkowego medium F 12 K i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 do 45 minut. Po inkubacji delikatnie wymieszać roztwory DNA i lipofekcyjnego, dodając je do siebie kroplami. Pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut w probówce o pojemności 15 ml.Delikatnie dodaj mieszaninę do transfekcji do 1,8 ml świeżej pożywki F 12 K, dozując ją kroplami. Następnie przemyj komórki PBS i dodaj nowy roztwór do transfekcji do komórek. Po 18-godzinnej inkubacji.Wymień pożywkę na F 12 K z dodatkiem 10% FBS bez antybiotyków i inkubuj przez noc. Następnego dnia podziel komórki do dwóch kolb T 25 z pożywką F 12 K z dodatkiem 10% FBS bez antybiotyków, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej. Inkubuj przez kolejne 18 godzin.Wymień medium na podłoże selekcyjne. Następnie hoduj komórki na podłożu selekcyjnym przez okres od trzech do czterech tygodni. Pozwoli to na wyselekcjonowanie komórek, które stabilnie włączyły plazmid do swojego DNA genomowego.Kontynuuj hodowlę komórek z użyciem medium podtrzymującego, okresowo mrożąc linie komórkowe, aby zapobiec ich utracie w przypadku nieoczekiwanego zanieczyszczenia. Aby wyselekcjonować klonalne linie komórkowe, najpierw poddaj komórki trypsynizacji i odwiruj je w medium podtrzymującym, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie resuspenduj komórki w pięciu mililitrach medium podtrzymującego.Pobrać 0,5 mililitra zawiesiny komórkowej i dodać 4,5 mililitra świeżego medium konserwującego, aby przygotować rozcieńczenie 10-krotne, a następnie przenieść 100 mikrolitrów tego rozcieńczenia do 12 studzienek płytki 96-dołkowej w celu wyselekcjonowania pojedynczych komórek. Kontynuować wykonywanie 10-krotnych rozcieńczeń seryjnych tych komórek około 19 razy, aż do uzyskania teoretycznej końcowej zawiesiny zawierającej jedną komórkę na 100 mikrolitrów, i przenieść 100 mikrolitrów z każdego rozcieńczenia seryjnego do 12 studzienek płytki 96-dołkowej. Po 18 godzinach inkubacji obejrzeć płytki 96-dołkowe pod odwróconym mikroskopem światła przechodzącego lub fluorescencyjnym i zaznaczyć studzienki, które wydają się zawierać tylko jedną komórkę lub dwie komórki, które ewidentnie powstały z podziału jednej komórki.Obserwuj płytki każdego dnia, wymieniając pożywkę co trzy dni. Pozostaw komórki do wzrostu na jeden tydzień, aż osiągną około 80% konfluencji. Następnie przepłucz zaznaczone studzienki 200 µL PBS i trypsyny.Przemyj je 100 µL roztworu PBS tripsina EDTA. Usuń roztwór PBS tripsina EDTA. Dodaj 100 µL podłoża utrzymującego i przenieś komórki z każdej oznakowanej studni do jednej studni płytki sześcio studzienkowej zawierającej 1 mL podłoża utrzymującego.Po hodowli komórek na płytce sześciodołkowej przez trzy dni, przenieś komórki do poszczególnych kolbek T 25. Okresowo mroź linię komórkową, aby umożliwić ich odzyskanie w przypadku, gdy komórki przestaną wykazywać spójne wyniki. Aby wyłonić linię komórkową o najwyższej odpowiedzi, przetestuj przeniesione komórki za pomocą testu bioluminescencji wapnia z użyciem aktywnego ligandu, takiego jak receptor, peptyd, ligand lub inny pozytywny kontrolny agonista.Analiza bioluminescencji wapnia zostanie szczegółowo zaprezentowana później w tym filmie. Przed przystąpieniem do eksperymentu przeprowadź selekcję pojedynczych komórek po raz drugi. W przypadku wyboru klonalnych linii komórkowych do analiz i ich utrzymywania w hodowli, krytyczne jest śledzenie numerów pasaży, ponieważ komórki o wysokim numerze pasażu mogą przestać funkcjonować w kolbie T 25.Hoduj linie komórkowe wykazujące ekspresję pożądanego receptora w medium utrzymującym do około 90% konfluencji. Po spróbowaniu i odwirowaniu komórek, zawieś je w medium utrzymującym, rozcieńcz komórki około 10-krotnie medium utrzymującym i policz liczbę komórek za pomocą cytometru hematologicznego. Następnie dostosuj liczbę komórek do około 2 × 10⁵ komórek na ml. Wysiej 2 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 6-dołkowej i inkubuj płytkę przez 24 godziny, po których komórki powinny osiągnąć około 60% konfluencji przed rozpoczęciem płytkowego testu bioluminescencji wapnia.Przygotuj interesujący gen reporterowy w konstrukcie wektora ekspresyjnego. W niniejszym przypadku zastosowano raport quorum ekspresyjny w mitochondriach. Następnie przeprowadź transfekcję komórek za pomocą jednego mikrograma tego plazmidu reporterowego zgodnie z opisem w protokole pisemnym.Po inkubacji komórek w płytce 6-dołkowej przez 24 godziny, należy przeprowadzić trypsynizację, wirowanie oraz resuspensję. Następnie należy odliczyć komórki do stężenia 400 000 komórek na mililitr i przenieść 100 µL do każdego dołka białej, cienkodنnej płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej. Inkubować przez kolejne 24 godziny, aż zostanie osiągnięta konfluencja na poziomie około 80%. Jest to optymalne stężenie komórek dla testu bioluminescencji. Następne kroki powinny być wykonywane w ciemności, jednak tutaj przedstawiono je w świetle.W celach demonstracyjnych przygotuj odpowiednią ilość pożywki DME wolnej od wapnia, zawierającej pięć mikromoli CHO terezin, wyliczając 90 µL na każdą studzienkę. Usuń starą pożywkę z płytki i dodaj 90 µL do każdej studzienki. Inkubuj płytki przez trzy godziny w ciemności w temperaturze 37 °C i 5% CO2, po czym komórki będą gotowe do testów.Niniejsza demonstracja została przeprowadzona przy użyciu czytnika płytek Nova star w trybie bioluminescencji. Przed rozpoczęciem procesu płukania płytki z próbkami należy umieścić w uchwycie w ciemności. Peptydy należy rozpuścić w probówce EOR o pojemności 1,5 mililitra.Należy przygotować odpowiednią ilość DME wolnego od wapnia oraz pożywki, aby uzyskać 10 µL 10-krotnego stężenia peptydów na każdą studzienkę. Przed użyciem należy ustawić głębokość aspiracji oraz pozycję wyznaczania roztworu peptydów. Następnie należy poddać komórki działaniu 10 µL peptydu i bezzwłocznie rozpocząć pomiar emisji światła.W tej demonstracji urządzenie zostało ustawione tak, aby rejestrować emisję światła przy 465 nanometrach dla każdej studzienki co dwie sekundy przez łączny czas 50 sekund. Po zakończeniu pomiaru należy przepłukać pompy urządzenia. Powtórz ten proces dla każdej próbki peptydowej, zapisz dane, a następnie ponownie przepłucz pompy urządzenia po zakończeniu analizy.Dane emisji światła z każdej dołki są automatycznie przenoszone przez program komputerowy do arkusza danych Microsoft Excel. Wklej dane z programu Excel do oprogramowania Prism 4.0. Wygeneruj wykres z różnymi stężeniami peptydów na osi x oraz jednostkami bioluminescencji.Na osi Y należy wybrać analizę dopasowania krzywej regresji nieliniowej, aby uzyskać krzywe odpowiedzi stężeniowej dla każdego peptydu i odpowiadające im wartości EC 50. Każdy eksperyment powinien zostać powtórzony trzykrotnie w celu analizy danych. W przypadku ekspresji w komórkach K1 jajnika chomika syryjskiego, receptor kininowy komara Aedes aegypti zachowywał się jako receptor wieloligandowy i wykazywał odpowiedź funkcjonalną przy stężeniu tak niskim jak 1 nM.W przypadku trzech endogennych kinin z gatunku eighties, przetestowanych pojedynczo za pomocą płytkowego testu bioluminescencji wapniowej, określono statystycznie różne wartości EC 50 wynoszące około 16 nanomolar dla eighties aegypti kininy 3, 26 nanomolar dla eighties aegypti kininy 2 oraz 49 nanomolar dla eighties aegypti kininy 1, co pozwoliło na ustalenie hierarchii mocy, w której najsilniejszą okazała się eighties kinina 3, a najsłabszą eighties kinina 1. Poniżej przedstawiono porównanie aktywności sześciu analogów kininy z kwasem alfa-aminomasłowym na linii komórkowej CHO K1 jajnika chomika syryjskiego wykazującej ekspresję receptora kininy kleszcza, ocenione za pomocą płytkowego testu bioluminescencji wapniowej.Oś Y przedstawia procent maksymalnych jednostek bioluminescencji dla każdego analogu, wyrażony jako stosunek bioluminescencji zaobserwowanej przy danej stężeniu do maksymalnej odpowiedzi zaobserwowanej dla wszystkich przetestowanych stężeń każdego analogu; analog KININE HEXA peptide F-F-F-S-W-G amide stanowi kontrolę pozytywną dla aktywności receptora. Analog kininy z pojedynczym zastąpieniem, double F amino ISO butyric acid WG amide, był bardziej aktywny niż pozytywny kontrolny analog HEXA peptide KININE; analog KININE z dwoma zastąpieniami kwasem aminomaślanowym, aminobutyric acid FF aminobutyric acid WG amide, okazał się najsilniejszym z przetestowanych analogów z podwójnym zastąpieniem. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobre zrozumienie procesu ekspresji A-G-P-C-R oraz otrzymywania klonalnych linii komórkowych w celu analizy relacji struktura-aktywność ligandów w receptorach za pomocą testu bioluminescencyjnego wapnia.

a-calcium-bioluminescence-assay-for-functional-analysis-mosquito

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Test bioluminescencji wapnia do analizy funkcjonalnej komara (Aedes aegypti) i kleszcza (Rhipicephalus microplus) receptorów sprzężonych z białkiem G

Opisano metody wykorzystania systemów transdukcyjnych alfawirusów do ekspresji reporterów fluorescencyjnych in vitro oraz u dorosłych komarów. Technikę tę można dostosować w celu ekspresji dowolnego białka docelowego zamiast reportera lub dodatkowo do niego.

System transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji w wektorach komarzych

Źródło: Lark, A. R., et. al., Podejście do funkcjonalnego obrazowania mózgu in vivo oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin. J. Vis. exp. (2016)Ten film przedstawia obrazowanie dynamiki wapnia w czasie rzeczywistym za pomocą Greena bioluminescencja białka fluorescencyjnego i aequoryny w głębokich strukturach mózgu .

Obrazowanie bioluminescencyjne do badania stanów przejściowych wapnia w strukturach mózgu Drosophila

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Przednie nogi i trąbka Drosophila zawierają bogaty repertuar smakowych neuronów czuciowych. W tym artykule przedstawiono metodę wykorzystującą obrazowanie wapnia do pomiaru fizjologicznych odpowiedzi neuronów czuciowych w przedniej nodze i trąbce żywych much po egzogennym zastosowaniu feromonu smakowego.

Pomiar fizjologicznych reakcji neuronów czuciowych Drosophila na feromony lipidowe za pomocą obrazowania wapnia na żywo

Tutaj prezentujemy nowatorskie podejście do obrazowania Ca2+ za pomocą bioluminescencyjnego reportera. Podejście to wykorzystuje stopiony konstrukt GFP-aequorin, który wiąże się z Ca2+ i emituje światło, eliminując potrzebę wzbudzenia światła. Co istotne, metoda ta pozwala na długie, ciągłe obrazowanie, dostęp do głębokich struktur mózgu i wysoką rozdzielczość czasową.

In vivo (in vivo) Funkcjonalne obrazowanie mózgu oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

Ten protokół opisuje metodologię mikroiniekcji, którą ustandaryzowaliśmy i stosowaliśmy przez kilka lat, aby dostarczyć określone ilości kwasów nukleinowych bezpośrednio do hemolimfy komarów i much domowych. Protokół ten skutkuje minimalną śmiertelnością po wstrzyknięciach i umożliwia pomiary płodności skorelowane z dawką.

Powtarzalny test biologiczny mikroiniekcji dsRNA i składania jaj u komarów i much domowych

Opisana to oszczędzająca czas i miejsce metoda liczenia jaj i określania szybkości wylęgu poszczególnych komarów za pomocą 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych, co może znacznie zwiększyć skalę i szybkość testów płodności i płodności.

Ulepszony test płodności i płodności dla Aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (płytki EAgaL)

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Opisano procedury badania zachowań komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach za pomocą elektropenetracji AC-DC.

Elektropenetrografia AC-DC do badania zachowań sondujących i połykanych komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach

Poznaj test bioluminescencji wapnia do analizy relacji struktura-aktywność neuropeptydów stawonogów na receptorach GPCR komarów Aedes aegypti i kleszczy Rhipicephalus microplus.

Test bioluminescencji wapnia do analizy funkcjonalnej receptorów sprzężonych z białkiem G komarów (Aedes aegypti) i kleszczy (Rhipicephalus microplus) (Wideo) | JoVE Journal

Analiza funkcjonalna receptorów sprzężonych z białkiem G u komarów (Aedes aegypti) i kleszczy (Rhipicephalus microplus) z wykorzystaniem testu bioluminescencji wapniowej

Przeglądaj więcej filmów