Analiza funkcjonalna receptorów sprzężonych z białkiem G u komarów (Aedes aegypti) i kleszczy (Rhipicephalus microplus) z wykorzystaniem testu bioluminescencji wapniowej

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest analiza zależności struktura-aktywność syntetyzowanych neuropeptydów stawonogów w odniesieniu do ich cognate gpcr. Jest to realizowane poprzez transfekcję pustych komórek jajnika chomika syryjskiego (CHO-K1) odpowiednim wektorem ekspresyjnym G PCR R w celu otrzymania stabilnie przekształconych linii komórkowych pochodzących z pojedynczej komórki. W drugim kroku stabilna linia komórkowa jest transfekowana plazmidem quaran, który niesie gen reporterowy Quaran służący do pomiaru wewnątrzkomórkowej bioluminescencji w płytkowym teście bioluminescencji wapniowej. Następnie przeprowadzany jest płytkowy test bioluminescencji wapniowej w celu określenia poziomu wapnia w cytoplazmie po zastosowaniu ligandu peptydowego do tych rekombinowanych komórek.

Uzyskane wyniki wykazują różnice w jednostkach bioluminescencji po zastosowaniu peptydów o różnych strukturach lub różnych stężeń peptydów w odniesieniu do komórek rekombinowanych, w zależności od wywołanego uwalniania wapnia wewnątrzkomórkowego, wykrywanego przez reporter corrin w teście na płytce. Główną zaletą wykorzystania stabilnie transformowanych klonalnych linii komórkowych wykazujących ekspresję rekombinowanych GPCR w porównaniu z przejściowymi protokołami ekspresji jest większa jednorodność poziomów ekspresji receptorów, co zapewnia spójność wyników. Ponadto, ukierunkowanie białka akwaryjnego na mitochondria umożliwia czułe pomiary wapnia za pomocą bioluminescencji, co zostanie zademonstrowane w dzisiejszym eksperymencie przez dwóch doktorantów, Shall in Lie i Simona Kersch oraz postdoca z mojego laboratorium.

Aby utworzyć stabilne linie komórkowe, należy rozpocząć od hodowli komórek jajnika chomika chińskiego, K1 empty w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 i odpowiednim nawilżeniem. Utrzymuj komórki empty w pożywce wzrostowej z 1x antybiotykiem i antymykotykiem, gdy komórki będą rozwijać się prawidłowo. Przesiej komórki jajnika chomika chińskiego K1 do kolb tkankowych T25 i hoduj je przez noc w pożywce wzrostowej bez antybiotyków, aż osiągną około 30% konfluencji.

Przed transfekcją należy przygotować wektor ekspresyjny DNA zawierający interesujący receptor GPCR zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Połączyć DNA ze 100 µL medium z obniżoną zawartością surowicy Optum.

Wymieszać 6 µL odczynnika do lipofekcji ze 100 µL bezserwatkowego medium F 12 K i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 do 45 minut. Po inkubacji delikatnie wymieszać roztwory DNA i lipofekcyjnego, dodając je do siebie kroplami. Pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut w probówce o pojemności 15 ml.

Delikatnie dodaj mieszaninę do transfekcji do 1,8 ml świeżej pożywki F 12 K, dozując ją kroplami. Następnie przemyj komórki PBS i dodaj nowy roztwór do transfekcji do komórek. Po 18-godzinnej inkubacji.

Wymień pożywkę na F 12 K z dodatkiem 10% FBS bez antybiotyków i inkubuj przez noc. Następnego dnia podziel komórki do dwóch kolb T 25 z pożywką F 12 K z dodatkiem 10% FBS bez antybiotyków, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej. Inkubuj przez kolejne 18 godzin.

Wymień medium na podłoże selekcyjne. Następnie hoduj komórki na podłożu selekcyjnym przez okres od trzech do czterech tygodni. Pozwoli to na wyselekcjonowanie komórek, które stabilnie włączyły plazmid do swojego DNA genomowego.

Kontynuuj hodowlę komórek z użyciem medium podtrzymującego, okresowo mrożąc linie komórkowe, aby zapobiec ich utracie w przypadku nieoczekiwanego zanieczyszczenia. Aby wyselekcjonować klonalne linie komórkowe, najpierw poddaj komórki trypsynizacji i odwiruj je w medium podtrzymującym, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie resuspenduj komórki w pięciu mililitrach medium podtrzymującego.

Pobrać 0,5 mililitra zawiesiny komórkowej i dodać 4,5 mililitra świeżego medium konserwującego, aby przygotować rozcieńczenie 10-krotne, a następnie przenieść 100 mikrolitrów tego rozcieńczenia do 12 studzienek płytki 96-dołkowej w celu wyselekcjonowania pojedynczych komórek. Kontynuować wykonywanie 10-krotnych rozcieńczeń seryjnych tych komórek około 19 razy, aż do uzyskania teoretycznej końcowej zawiesiny zawierającej jedną komórkę na 100 mikrolitrów, i przenieść 100 mikrolitrów z każdego rozcieńczenia seryjnego do 12 studzienek płytki 96-dołkowej. Po 18 godzinach inkubacji obejrzeć płytki 96-dołkowe pod odwróconym mikroskopem światła przechodzącego lub fluorescencyjnym i zaznaczyć studzienki, które wydają się zawierać tylko jedną komórkę lub dwie komórki, które ewidentnie powstały z podziału jednej komórki.

Obserwuj płytki każdego dnia, wymieniając pożywkę co trzy dni. Pozostaw komórki do wzrostu na jeden tydzień, aż osiągną około 80% konfluencji. Następnie przepłucz zaznaczone studzienki 200 µL PBS i trypsyny.

Przemyj je 100 µL roztworu PBS tripsina EDTA. Usuń roztwór PBS tripsina EDTA. Dodaj 100 µL podłoża utrzymującego i przenieś komórki z każdej oznakowanej studni do jednej studni płytki sześcio studzienkowej zawierającej 1 mL podłoża utrzymującego.

Po hodowli komórek na płytce sześciodołkowej przez trzy dni, przenieś komórki do poszczególnych kolbek T 25. Okresowo mroź linię komórkową, aby umożliwić ich odzyskanie w przypadku, gdy komórki przestaną wykazywać spójne wyniki. Aby wyłonić linię komórkową o najwyższej odpowiedzi, przetestuj przeniesione komórki za pomocą testu bioluminescencji wapnia z użyciem aktywnego ligandu, takiego jak receptor, peptyd, ligand lub inny pozytywny kontrolny agonista.

Analiza bioluminescencji wapnia zostanie szczegółowo zaprezentowana później w tym filmie. Przed przystąpieniem do eksperymentu przeprowadź selekcję pojedynczych komórek po raz drugi. W przypadku wyboru klonalnych linii komórkowych do analiz i ich utrzymywania w hodowli, krytyczne jest śledzenie numerów pasaży, ponieważ komórki o wysokim numerze pasażu mogą przestać funkcjonować w kolbie T 25.

Hoduj linie komórkowe wykazujące ekspresję pożądanego receptora w medium utrzymującym do około 90% konfluencji. Po spróbowaniu i odwirowaniu komórek, zawieś je w medium utrzymującym, rozcieńcz komórki około 10-krotnie medium utrzymującym i policz liczbę komórek za pomocą cytometru hematologicznego. Następnie dostosuj liczbę komórek do około 2 × 10⁵ komórek na ml. Wysiej 2 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 6-dołkowej i inkubuj płytkę przez 24 godziny, po których komórki powinny osiągnąć około 60% konfluencji przed rozpoczęciem płytkowego testu bioluminescencji wapnia.

Przygotuj interesujący gen reporterowy w konstrukcie wektora ekspresyjnego. W niniejszym przypadku zastosowano raport quorum ekspresyjny w mitochondriach. Następnie przeprowadź transfekcję komórek za pomocą jednego mikrograma tego plazmidu reporterowego zgodnie z opisem w protokole pisemnym.

Po inkubacji komórek w płytce 6-dołkowej przez 24 godziny, należy przeprowadzić trypsynizację, wirowanie oraz resuspensję. Następnie należy odliczyć komórki do stężenia 400 000 komórek na mililitr i przenieść 100 µL do każdego dołka białej, cienkodنnej płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej. Inkubować przez kolejne 24 godziny, aż zostanie osiągnięta konfluencja na poziomie około 80%. Jest to optymalne stężenie komórek dla testu bioluminescencji. Następne kroki powinny być wykonywane w ciemności, jednak tutaj przedstawiono je w świetle.

W celach demonstracyjnych przygotuj odpowiednią ilość pożywki DME wolnej od wapnia, zawierającej pięć mikromoli CHO terezin, wyliczając 90 µL na każdą studzienkę. Usuń starą pożywkę z płytki i dodaj 90 µL do każdej studzienki. Inkubuj płytki przez trzy godziny w ciemności w temperaturze 37 °C i 5% CO2, po czym komórki będą gotowe do testów.

Niniejsza demonstracja została przeprowadzona przy użyciu czytnika płytek Nova star w trybie bioluminescencji. Przed rozpoczęciem procesu płukania płytki z próbkami należy umieścić w uchwycie w ciemności. Peptydy należy rozpuścić w probówce EOR o pojemności 1,5 mililitra.

Należy przygotować odpowiednią ilość DME wolnego od wapnia oraz pożywki, aby uzyskać 10 µL 10-krotnego stężenia peptydów na każdą studzienkę. Przed użyciem należy ustawić głębokość aspiracji oraz pozycję wyznaczania roztworu peptydów. Następnie należy poddać komórki działaniu 10 µL peptydu i bezzwłocznie rozpocząć pomiar emisji światła.

W tej demonstracji urządzenie zostało ustawione tak, aby rejestrować emisję światła przy 465 nanometrach dla każdej studzienki co dwie sekundy przez łączny czas 50 sekund. Po zakończeniu pomiaru należy przepłukać pompy urządzenia. Powtórz ten proces dla każdej próbki peptydowej, zapisz dane, a następnie ponownie przepłucz pompy urządzenia po zakończeniu analizy.

Dane emisji światła z każdej dołki są automatycznie przenoszone przez program komputerowy do arkusza danych Microsoft Excel. Wklej dane z programu Excel do oprogramowania Prism 4.0. Wygeneruj wykres z różnymi stężeniami peptydów na osi x oraz jednostkami bioluminescencji.

Na osi Y należy wybrać analizę dopasowania krzywej regresji nieliniowej, aby uzyskać krzywe odpowiedzi stężeniowej dla każdego peptydu i odpowiadające im wartości EC 50. Każdy eksperyment powinien zostać powtórzony trzykrotnie w celu analizy danych. W przypadku ekspresji w komórkach K1 jajnika chomika syryjskiego, receptor kininowy komara Aedes aegypti zachowywał się jako receptor wieloligandowy i wykazywał odpowiedź funkcjonalną przy stężeniu tak niskim jak 1 nM.

W przypadku trzech endogennych kinin z gatunku eighties, przetestowanych pojedynczo za pomocą płytkowego testu bioluminescencji wapniowej, określono statystycznie różne wartości EC 50 wynoszące około 16 nanomolar dla eighties aegypti kininy 3, 26 nanomolar dla eighties aegypti kininy 2 oraz 49 nanomolar dla eighties aegypti kininy 1, co pozwoliło na ustalenie hierarchii mocy, w której najsilniejszą okazała się eighties kinina 3, a najsłabszą eighties kinina 1. Poniżej przedstawiono porównanie aktywności sześciu analogów kininy z kwasem alfa-aminomasłowym na linii komórkowej CHO K1 jajnika chomika syryjskiego wykazującej ekspresję receptora kininy kleszcza, ocenione za pomocą płytkowego testu bioluminescencji wapniowej.

Oś Y przedstawia procent maksymalnych jednostek bioluminescencji dla każdego analogu, wyrażony jako stosunek bioluminescencji zaobserwowanej przy danej stężeniu do maksymalnej odpowiedzi zaobserwowanej dla wszystkich przetestowanych stężeń każdego analogu; analog KININE HEXA peptide F-F-F-S-W-G amide stanowi kontrolę pozytywną dla aktywności receptora. Analog kininy z pojedynczym zastąpieniem, double F amino ISO butyric acid WG amide, był bardziej aktywny niż pozytywny kontrolny analog HEXA peptide KININE; analog KININE z dwoma zastąpieniami kwasem aminomaślanowym, aminobutyric acid FF aminobutyric acid WG amide, okazał się najsilniejszym z przetestowanych analogów z podwójnym zastąpieniem. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobre zrozumienie procesu ekspresji A-G-P-C-R oraz otrzymywania klonalnych linii komórkowych w celu analizy relacji struktura-aktywność ligandów w receptorach za pomocą testu bioluminescencyjnego wapnia.