Name: Bioluminescencyjny reporterowy do wykrywania patogenów bakteryjnych kategorii A (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj metodę wykrywania Yersinia pestis za pomocą bioluminescencyjnego faga reporterowego. Technika umożliwia szybką identyfikację patogenu w ciągu minut zamiast dni, co ma kluczowe znaczenie dla bezpieczeństwa biologicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie zostało sfinansowane przez program Small Business Innovation Research Narodowych Instytutów Zdrowia (NIAID, 1R43AI082698-01) oraz Narodowy Instytut Żywności i Rolnictwa USDA (NIFA, 2009-33610-20028).

1. Inokulacja płytek Y. pestis
<ol>
	<li>Wysiać kultury stokowe Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) na agar Luria-Bertani (LB) (Miller). Należy stosować techniki sterylne, a wszystkie manipulacje z Y. pestis wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II typu A. Y. pestis A1122 jest szczepem wykluczonym z listy czynników selektywnych o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 2. Brakuje w nim zarówno plazmidu wirulencji Lcr (low-calcium response) o wielkości 75 kb, jak i locus pgm, które są niezbędne do wywołania choroby. Hodować Y. pestis w temperaturze 28°C przez 48 h w statycznym inkubatorze z kontrolowaną temperaturą powietrza. Tempo wzrostu Y. pestis jest powolne, a czas generacji wynosi 1,25 h 9.</li>
</ol>
2. Inokulacja Y. pestis w pożywkach płynnych
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnej metalowej pętli szczepiającej przenieś pojedynczą kolonię Y. pestis do sterylnej probówki do hodowli o wymiarach 17 x 100 mm zawierającej 2 mL bulionu LB. Wybierz kolonię o jednolitym rozmiarze, reprezentatywną dla pozostałych kolonii i wyraźnie oddzieloną od innych kolonii na płytce. Krótko wymieszaj probówkę w wirówce laboratoryjnej (vortex) i inkubuj kulturę w temperaturze 28°C przez około 20 h w inkubatorze z wytrząsaniem (225 rpm).</li>
</ol>
3. Namnażanie Y. pestis, dodanie faga reporterowego i detekcja bioluminescencyjna
<ol>
<li>Rozcieńczyć nocną kulturę Y. pestis w stosunku 1:20 w świeżej pożywce LB w probówce typu Falcon 50 mL (np. 500 μL komórek w 9,5 mL pożywki) i hodować w temperaturze 28°C z wytrząsaniem (225 rpm). Hodować do momentu osiągnięcia gęstości optycznej przy 600 nm (A600) wynoszącej 0,2 (około 5 h). Do detekcji preferowane są komórki w fazie aktywnego wzrostu, ponieważ zdolność faga do transdukcji odpowiedzi bioluminescencyjnej jest skorelowana z żywotnością i kondycją bakterii gospodarza. Niemniej jednak wykazano, że system detekcji jest kompatybilny z komórkami pobranymi na wszystkich etapach cyklu wzrostu 7.</li>
<li>Przygotować substrat niezbędny do reakcji bioluminescencyjnej, sporządzając 2% roztwór n-dekanalu. Wymieszać 200 μL n-dekanalu z 9,8 mL pożywki LB. Wigorystycznie wierzgać na vortexie przez 5 s. Napełnić wtryskiwacz luminometru do mikropłytek 2 mL 2% roztworu n-dekanalu. Zaprogramować luminometr tak, aby automatycznie wstrzykiwał 67 μL roztworu dekanalu do każdej studzienki mikropłytki, a następnie natychmiast odczytać próbkę przez 10 s.</li>
<li>Rozdzielić aliquoty 1 mL pożywki LB do 3 probówek hodowlanych. Do każdej probówki dodać 20 μL roztworu zapasu faga reporterowego (zapas o stężeniu 5 x 109 jednostek tworzących plaki [PFU]/mL); próbki zawierające sam faga i samą pożywkę służą jako kontrola negatywna. W przypadku braku komórek Y. pestis , dodanie faga reporterowego nie powinno wywołać odpowiedzi bioluminescencyjnej.</li> 
<li>Rozdzielić aliquoty 1 mL kultury Y. pestis (z kroku 3.1) do 6 probówek hodowlanych. Do 3 z kultur dodać 20 μL zapasu faga reporterowego (kultury testowe). Pozostałe 3 kultury służą jako kontrola negatywna „same komórki” (autobioluminescencja tła). Wymieszać kultury, krótko wierzgając na vortexie, pobrać 200 μL z każdej próbki (do odczytu w czasie 0) i rozdzielić do białej mikropłytki 96-dołkowej. Inkubować pozostałą kulturę w temperaturze 28°C z wytrząsaniem (225 rpm).</li>
<li>Zmierzyć bioluminescencję próbek z czasu 0 (relatywne jednostki światła, RLU) przy użyciu luminometru do mikropłytek.</li>
<li>Pobrać 200 μL z każdej próbki po 10, 20, 30, 40, 50 i 60 min od dodania faga reporterowego i zmierzyć bioluminescencję próbki. Jeśli komórki Y. pestis są obecne, fag reporterowy specyficznie zwiąże się z komórką, wstrzyknie swoje DNA i wykorzysta aparat transkrypcyjny i translacyjny gospodarza do transkrypcji i translacji genów reporterowych luxAB (Rysunek 1).</li>
<li>Siła sygnału i czas odpowiedzi sygnałowej są proporcjonalne do liczby obecnych komórek. Przy wysokich stężeniach komórek (105-108 CFU/mL) znaczny wzrost RLU w porównaniu z kontrolami powinien być widoczny w ciągu 20 min. Przy niższych stężeniach komórek (102-104 CFU/mL) znaczny wzrost RLU powinien być widoczny w ciągu 40-60 min.</li>
<li>Alternatywnie, aby przyspieszyć proces detekcji bez konieczności namnażania Y. pestis, kolonię ze świeżo wyhodowanej płytki można wymieszać (na vortexie) bezpośrednio w probówce eppendorf 1,5 mL z 200 μL pożywki LB zawierającej faga reporterowego. Przenieść mieszaninę komórek i faga do studzienki mikropłytki. Inkubować mikropłytkę w temperaturze 28°C i odczytać bioluminescencję próbki po 60 min (tylko jeden punkt czasowy).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Reprezentatywny przebieg czasowy eksperymentu z wykorzystaniem detekcji Y. pestis za pomocą fagów reporterowych przedstawiono na Rysunku 2. Kontrole negatywne obejmujące 1) same fagi (brak komórek) lub 2) same komórki (brak fagów) wykazują podstawowe poziomy bioluminescencji wynoszące około 20 RLU przez cały 60 min okres inkubacji (poziomy podstawowe są zależne od luminometru). W przeciwieństwie do nich, w próbkach testowych (fagi reporterowe i komórki) wzrost bioluminescencji jest widoczny 15 min po dodaniu fagów. Natężenie sygnału powinno stale rosnąć przez 60 min. Inkubacja przez dłuższy czas (powyżej 80 min) spowoduje spadek sygnału względem wartości szczytowej z powodu lizy komórek gospodarza indukowanej przez fagi. Podobne wyniki uzyskuje się w temperaturze inkubacji 37°C, mimo że optymalna temperatura wzrostu Y. pestis wynosi 28°C 9.
<img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig2.jpg" alt="Kinetyka infekcji bakteryjnej; wykres słupkowy; pomiar oddziaływania fag-komórka; względne jednostki światła (RLU)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Bioluminescencyjna detekcja Y. pestis za pośrednictwem fagów. W czasie 0 zmieszano fagi reporterowe z komórkami, inkubowano w 28°C i monitorowano bioluminescencję (RLU) w czasie. Znaczący wzrost RLU (* test t Studenta, p&lt;0.05) jest widoczny w ciągu 15 min.

<ol><li>Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threats+in+bioterrorism.+I%3A+CDC+category+A+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Med+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents.</a> Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).</li>
<li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChu%2C+MC+%22Laboratory+manual+of+plague+diagnostic+tests.%22">Laboratory manual of plague diagnostic tests.</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. (2000).</li>
<li>, (1999).</li>
<li>Inglesby, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthrax+as+a+biological+weapon%2C+2002%3A+updated+recommendations+for+management%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management.</a> JAMA. 287, 2236-2252 (2002).</li>
<li>Schuch, R., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+genomic+analysis+of+the+Wbeta+and+gamma+phages+infecting+Bacillus+anthracis%3A+implications+for+evolution+of+environmental+fitness+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance.</a> J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).</li>
<li>Garcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+Yersinia+pestis+bacteriophage+phiA1122+reveals+an+intimate+history+with+the+coliphage+T3+and+T7+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes.</a> J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).</li>
<li>Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+bioluminescent+phage+for+detection+of+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).</li>
<li>Schofield, D. A., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-mediated+bioluminescent+detection+of+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis.</a> Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).</li>
<li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChu%2C+MC+%22CDC%3A+Basic+laboratory+protocols+for+the+presumptive+identification+of+Yersinia+pestis%22">CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. 1-19 (2001).</li>
<li>Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+differentiation+between+Pasteurella+pestis+and+Pasteurella+pseudotuberculosis+by+action+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage.</a> J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).</li>
<li>Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Action+of+Pasteurella+pestis+Bacteriophage+on+Strains+of+Pasteurella%2C+Salmonella%2C+and+Shigella%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella.</a> J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).</li>
<li>Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+Yersinia+pestis+using+amplification+of+plague+diagnostic+bacteriophages+monitored+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR.</a> PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Metoda ta demonstruje zdolność faga reporterowego do szybkiego wykrywania Y. pestis, ponieważ fag reporterowy może transdukować odpowiedź w postaci sygnału bioluminescencyjnego w hodowlach komórek Y. pestis w ciągu 20 min od dodania faga. Fag reporterowy jest również zdolny do bezpośredniego wykrywania Y. pestis w matrycach klinicznych, bez konieczności uprzedniej izolacji i późniejszej hodowli 7. W porównaniu do standardowych testów lizy fagowej, które zazwyczaj wymagają 48 h do zak...

<table><tbody><tr><td>Agar LB Difco, Miller</td><td>VWR international</td><td>90003-346</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka LB Difco, Miller</td><td>VWR international</td><td>90003-350</td><td></td></tr><tr><td>Probówki hodowlane 17 x 100 mm</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1485-0810</td><td></td></tr><tr><td>n-Decanal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7384</td><td></td></tr><tr><td>Luminometr do mikropłytek Veritas</td><td>Turner Biosystems</td><td>9100-001</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka Microlite z 96 dołkami</td><td>VWR international</td><td>62402-984</td><td></td></tr></tbody></table>

„bioluminescencyjny” fagi raportujący do detekcji bakteryjnych patogenów kategorii a

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis i Bacillus anthracis to bakteryjne patogeny kategorii A, które są odpowiednio czynnikami etiologicznymi dżumy i wąglika 1. Choć naturalne występowanie obu tych chorób jest obecnie stosunkowo rzadkie, realna jest możliwość wykorzystania tych patogenów jako broni biologicznej przez grupy terrorystyczne. Ze względu na immanentną zakaźność chorób, gwałtowny przebieg kliniczny oraz wysoką śmiertelność, kluczowe jest szybkie wykrycie ogniska epidemicznego. W związku z tym niezbędne są metodologie zapewniające szybką detekcję i diagnostykę, aby zagwarantować natychmiastowe wdrożenie środków zdrowia publicznego oraz aktywację zarządzania kryzysowego.
Rekombinowane fagi reporterowe mogą stanowić szybką i specyficzną metodę wykrywania Y. pestis oraz B. anthracis. Centers for Disease Control and Prevention obecnie stosują klasyczne testy lizy fagowej w celu potwierdzonej identyfikacji tych patogenów bakteryjnych 2-4. Testy te wykorzystują naturalnie występujące fagi, które są specyficzne i lityczne dla swoich gospodarzy bakteryjnych. Po nocnym wzrostu hodowli bakterii w obecności specyficznego faga, powstanie placków (liza bakterii) stanowi pozytywną identyfikację celu bakteryjnego. Choć testy te są wiarygodne, obarczone są trzema wadami: 1) są one prowadzone w warunkach laboratoryjnych; 2) wymagają izolacji i hodowli bakterii z podejrzanej próbki oraz 3) ich wykonanie zajmuje od 24 do 36 h. Aby rozwiązać te problemy, zaprojektowano genetycznie rekombinowane fagi reporterowe z „znacznikiem świetlnym” poprzez integrację genów Vibrio harveyi luxAB z genomem fagów specyficznych dla Y. pestis i B. anthracis 5-8. Powstałe fagi reporterowe luxAB były w stanie wykryć swój specyficzny cel poprzez szybkie (w ciągu kilku minut) i czułe nadanie fenotypu bioluminescencyjnego komórkom biorcy. Co ważne, detekcję uzyskano zarówno w przypadku hodowlanych komórek biorcy, jak i w pozorowanych zakażonych próbkach klinicznych 7.
W celach demonstracyjnych opisujemy tutaj metodę detekcji znanego izolatu Y. pestis za pomocą fagów, z wykorzystaniem faga reporterowego luxAB skonstruowanego na bazie diagnostycznego faga dżumy CDC ΦA1122 6,7 (Rysunek 1). Podobną metodę, z niewielkimi modyfikacjami (np. zmiana temperatury hodowli i pożywek), można zastosować do detekcji izolatów B. anthracis przy użyciu faga reporterowego B. anthracis Wβ::luxAB 8. Metoda ta polega na transdukcji fenotypu bioluminescencyjnego za pośrednictwem fagów do hodowanych komórek Y. pestis, które następnie są mierzone za pomocą luminometru do mikropłytek. Głównymi zaletami tej metody w porównaniu do tradycyjnych testów lizy fagowej są łatwość użycia, szybkie uzyskanie wyników oraz możliwość jednoczesnego badania wielu próbek w formacie 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej.
<img alt="Schemat edycji genów Y. pestis z integracją faga luxAB, ilustrujący proces luminescencji." src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat detekcji. Fagidmieszane są z próbką, fagi infekują komórkę, dochodzi do ekspresji luxAB, a komórka emituje bioluminescencję. Obróbka próbki nie jest konieczna; fagi i komórki są mieszane, a następnie mierzy się emitowane przez nie światło.

Prostą metodą identyfikacji priorytetowych patogenów bakteryjnych jest zastosowanie genetycznie zmodyfikowanych fagów reporterowych. Fagi reporterowe te, specyficzne dla konkretnych gatunków gospodarzy, są zdolne do szybkiej transdukcji sygnału bioluminescencyjnego w komórkach gospodarza. W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie fagów reporterowych do detekcji Yersinia pestis.

„Bioluminescencyjny” fagi raportujący do detekcji bakteryjnych patogenów kategorii A

*Yersinia pestis* i *Bacillus anthracis* to bakteryjne patogeny kategorii A, które są odpowiednio czynnikami etiologicznymi dżumy i wąglika 1. ...

Yesinia pestis i Bacillus anthracis to bakteryjne patogeny kategorii A, które są odpowiednio czynnikami etiologicznymi dżumy oraz wąglika. Chociaż naturalne występowanie obu tych chorób jest obecnie stosunkowo rzadkie, realna jest możliwość wykorzystania tych patogenów jako broni biologicznej przez grupy terrorystyczne. W niniejszym filmie zaprezentowano metodę wykrywania i identyfikacji Yesinia pestis.W pierwszej kolejności mikroorganizm jest hodowany na płytkach rolniczych oraz w podłożach płynnych. Następnie do kultury dodaje się specyficzny dla y pesti reporter pH. Reporter pH posiada w swoim genomie geny kodujące bakteryjną lucyferazę, luxe AB.Jeśli obecne są komórki Y. pestis, fag reporterowy swoiście zwiąże się z komórką, wstrzyknie swój rekombinowany DNA zawierający geny luxe AB i wykorzysta aparat transkrypcyjny oraz translacyjny gospodarza do transkrypcji i translacji reporterowych genów luxe AB. Wyniki wykazują, że próbki nabyły fenotyp bioluminescencyjny, co wskazuje na pozytywną identyfikację nieznanego mikroorganizmu jako Y. pestis. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjny test lizy fagowej, jest fakt, że czas wymagany do wykrycia i identyfikacji Y. pestis wynosi minuty, a nie dni. Metoda ta może pomóc w szybkiej identyfikacji i wykrywaniu obecności Y. pestis z wykorzystaniem kultur izolowanych lub bezpośrednio z złożonych próbek klinicznych bądź środowiskowych.Zastosowania tej techniki rozciągają się na diagnostykę dżumy, ponieważ choroba ta jest zazwyczaj śmiertelna, jeśli nie zostanie podjęte leczenie w ciągu pierwszych 24 godzin od wystąpienia objawów. Zatem szybka identyfikacja Yersinia pestis jest niezbędna dla pomyślnego rokowania. Ponieważ fagi istnieją dla niemal wszystkich gatunków bakteryjnych, metodologia ta może potencjalnie zostać dostosowana do każdego gatunku, który jest istotny medycznie, środowiskowo lub rolniczo, podobnie jak Y. pestis.Szczep A 1122 jest wykluczonym z kategorii czynników selekcyjnych agentem o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Brakuje w nim zarówno plazmidu wirulencji LCR (odpowiedzi wapniowej Perlo) o wielkości 75 Kilobase, jak i locus PGM, które są niezbędne do wywołania wirulencji. Rozpocznij tę procedurę w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II typu A, stosując technikę sterylną przy posiewie Y pestis, A 1122.Wysiej kultury macierzyste na agar LB zgodnie z instrukcją przedstawioną tutaj. Płytki umieść odwrócone dnem do góry w statycznym inkubatorze z kontrolowaną temperaturą powietrza w 28 °C przez 48 godzin. Tempo wzrostu Y pestis jest powolne, z czasem generacji wynoszącym 1,25 godziny po dwóch dniach.Używając sterylnej metalowej pętli do szczepień, pobierz pojedynczą kolonię y pestis. Wybierz kolonię o jednolitym rozmiarze, reprezentatywną dla pozostałych kolonii i wyraźnie oddzieloną od innych kolonii na szalce. Przenieś kolonię do sterylnej probówki o wymiarach 17 by 100 milimetrów zawierającej dwa mililitry pożywki LB.Zamknij probówkę zakrętką i krótko wymieszaj w wortexie, a następnie umieścisz ją w inkubatorze wytrząsowym przy 225 RPM w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez około 20 godzin. W przypadku tego testu do detekcji preferowane są komórki w fazie aktywnego wzrostu. Ponieważ zdolność faga do transdukcji, odpowiedź bioluminescencyjna jest skorelowana z żywotnością i kondycją bakterii gospodarza.Niemniej jednak wykazano, że system detekcji jest kompatybilny z komórkami pobranymi na wszystkich etapach cyklu wzrostu. Po 20 godzinach wzrostu rozcieńczyć kulturę Y pestis w stosunku 1:20 w probówce stożkowej o pojemności 50 ml, dodając 500 µl komórek do 10 ml pożywki LB. Umieścić kulturę z powrotem w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 28 °C.Należy pozwolić kulturze rosnąć do momentu osiągnięcia gęstości optycznej przy 600 nanometrach wynoszącej 0.2. Powinno to zająć około pięciu godzin, aby wygenerować substrat reakcji bioluminescencyjnej. Przygotować 2% roztwór N-dekanalu, łącząc 200 µL N-dekanalu z 9.8 mL pożywki LB.Wigoruj intensywnie przez pięć sekund. Następnie przygotuj wtryskiwacz luminometru do mikropłytek. Umieść jeden koniec przewodu wtryskiwacza w probówce o pojemności 13 ml zawierającej 2% roztwór odcinający (end decal solution), a drugi koniec przewodu w pojemniku na odpady.Za pomocą oprogramowania urządzenia zaprogramuj maszynę tak, aby przepłukała linię wtryskiwacza dwiema mililitrami roztworu decanalu. Po zakończeniu procesu linia powinna zostać wypełniona substratem; należy następnie umieścić końcówkę linii wtryskiwacza w pozycji wyjściowej, gotowej do podawania próbki do dołków. Następnie zaprogramuj lumnometr, aby automatycznie wstrzyknął 67 µL roztworu deel do każdego dołka mikropłytki.Następnie niezwłocznie zmierz poziom emitowanej bioluminescencji przez 10 sekund. Dalej, aby przygotować każdą próbkę, oznakuj w trzech kopiach probówki hodowlane dla każdego stanu. W tym przypadku, oprócz próbki testowej, zostaną przygotowane kontrole zawierające tylko fazę oraz kontrole zawierające tylko komórki.Do przygotowania próbek kontrolnych zawierających wyłącznie fagi potrzebnych jest dziewięć probówek; do trzech probówek hodowlanych odmierza się aliquoty po 1 ml bulionu LB. Do każdej probówki dodaje się 20 µL roztworu zapasowego faga reporterowego o stężeniu 5×10⁹ jednostek tworzących plaki (PFU) na ml.W przypadku braku komórek Y pesti dodanie faga reporterowego nie powinno wywołać odpowiedzi bioluminescencyjnej. Następnie, aby przygotować próbki testowe, odmieierz aliquoty po 1 mL kultury Y pesti do trzech probówek kulturowych. Do trzech z kultur dodaj 20 µL zapasu faga reporterowego.Wymieszaj kultury, krótko wstrząsając je na wirówce typu vortex, aby przygotować same komórki. W przypadku kontroli negatywnych, służących do określenia tła autobioluminescencji, odmień aliquoty o objętości 1 ml kultury Y pestis do trzech dodatkowych probówek z kulturą. Po przygotowaniu próbek przenieś 200 µL z każdej kultury do dołków białej płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej w celu wykonania pomiaru dla czasu zero.Pozostałą część każdej hodowli umieść w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 28 °C, używając luminometru do mikropłytek. Zmierz czas. Wyzeruj próbki pod kątem bioluminescencji lub względnych jednostek światła.Wykonaj pomiary bioluminescencji, pobierając 200 µL z każdej hodowli i dokonując odczytów w luminometrze do mikropłytek w 20, 30, 40 i 60 minucie. Aby przyspieszyć proces detekcji bez konieczności namnażania y pestis, po dodaniu faga reporterowego przenieś kolonię z nowo wyhodowanej płytki do probówki do mikrowirówki zawierającej 200 µL LB z fagi reporterowym. Wymieszaj próbkę za pomocą wortexa, a następnie przenieś mieszaninę komórek i fagów do dołka płytki mikrotitracyjnej.Inkubuj płytkę mikrotitracyjną w temperaturze 28°C przez 60 minut. Następnie odczytaj bioluminescencję próbki. Analiza przedstawiona w tym filmie wykrywa obecność komórek Y. pestis, zgodnie z opisem w części wstępnej.W obecności y pestis fag reporterowy wiąże się ze specyficznym receptorem na komórce, wstrzykuje swoje DNA i wykorzystuje aparat transkrypcyjny oraz translacyjny gospodarza do transkrypcji i translacji genów luxe. Siła sygnału oraz czas odpowiedzi sygnałowej są proporcjonalne do liczby obecnych komórek przy wysokich stężeniach komórek, od 10⁵ do 10⁸ CFU na mililitr.Znaczący wzrost RLU w porównaniu z kontrolami powinien być widoczny w ciągu 20 minut przy niższych stężeniach komórek, od 10² do 10⁴ CFU na mililitr. Znaczący wzrost RLU powinien być widoczny w ciągu 40 do 60 minut. Przedstawiono tutaj reprezentatywny przebieg czasowy eksperymentu wykrywania Y pestis z wykorzystaniem reportera i fagów w czasie zero.Fagi reporterowe i komórki zmieszano i inkubowano w temperaturze 28 °C, monitorując w czasie bioluminescencję w jednostkach RLU. Wzrost RLU był widoczny w ciągu 12 minut i był istotny statystycznie przy wartości P mniejszej niż 0,05; kontrole negatywne zawierające wyłącznie fagi lub wyłącznie komórki wykazały bazowe poziomy bioluminescencji wynoszące około 20 RLU przez cały 60-minutowy czas inkubacji. Należy zauważyć, że poziomy bazowe są zależne od konkretnego luminometru.W przeciwieństwie do tego, w przypadku komórek reporterowych phant z próbek testowych widoczny jest wzrost bioluminescencji w 12. minucie po dodaniu faga. Natężenie sygnału powinno stale rosnąć przez 50 minut; chociaż nie pokazano tego tutaj, inkubacja przez okres przekraczający 80 minut spowoduje spadek sygnału poniżej wartości szczytowej z powodu lizy komórek gospodarza indukowanej przez fagi. Podobne wyniki uzyskuje się w temperaturach inkubacji 37 stopni Celsjusza, mimo że optymalna temperatura wzrostu Y pestis wynosi 28 stopni Celsjusza.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób wykorzystania rekombinacyjnego raportowania w detekcji. Po opanowaniu metody identyfikacji Yesenia Pestis, technikę tę można przeprowadzić w 30 minut, wykorzystując złociste kolonie jako inokulum początkowe. Podczas wykonywania tej procedury i korzystania z fagów w laboratorium należy pamiętać, że bardzo łatwo jest zanieczyścić hodowle bakteryjne fagami; aby zminimalizować ryzyko kontaminacji, należy zachować szczególną ostrożność.Należy używać jednorazowych plastikowych naczyń oraz końcówek do pipet i regularnie zmieniać rękawiczki. Zdolność reporteru do wywołania odpowiedzi Blum jest skorelowana z kondycją komórki. W związku z tym, po identyfikacji Yesenia Pesta, reporter może zostać wykorzystany do określenia wrażliwości izolatu na antybiotyki.Na przykład komórki Yesenia pesta inkubowane z inhibitorem w postaci stężenia antybiotyku będą albo niezdolne do wygenerowania sygnału bioluminescencyjnego, albo ich zdolność do jego produkcji zostanie znacznie ograniczona. W przeciwieństwie do nich komórki Yesenia pesta oporne na antybiotyki nie zostaną negatywnie dotknięte obecnością antybiotyku i będą zdolne do wywołania odpowiedzi bioluminescencyjnej analogicznej do odpowiedzi komórek nieinhibowanych. W ten sposób można szybko określić profil wrażliwości patogenu na antybiotyki.W celach ilustracyjnych wykorzystano atenuowany szczep Yesenia pestis. W tym eksperymencie Yesenia pestis reprezentuje kategorię patogenu bakteryjnego. Podczas wykonywania tej techniki z próbkami, w których podejrzewa się obecność Yesenia pestis, należy przestrzegać odpowiednich zasad bezpieczeństwa biologicznego i środków ostrożności w zakresie zagrożeń biologicznych.

bioluminescent-reporter-phage-for-detection-category-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Bakteryofagi 'bioluminescencyjne' do wykrywania bakterii patogennych kategorii A

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Niniejszy artykuł opisuje podawanie myszom bakterii z markerem lux oraz późniejszą analizę in vivo z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego IVIS.

Obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych In vivo

Źródło: de Vries, C. R. i in., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje bioluminescencyjną technikę obrazowania monitorującego postęp infekcji bakteryjnej na żywym modelu myszy. Bakterie patogenne opracowane z systemem raportu luxABCDE emitują światło w miejscu zakażenia, umożliwiając wizualizację bakterii aktywnych przemianownie. Obrazując mysz w czasie, naukowcy mogą nieinwazyjnie śledzić dynamikę infekcji i...

Bioluminescencja zakażeń bakteryjnych u myszy

Ten film demonstruje obrazowanie fluorescencji enzymu reporterowego (REF) do wykrywania in vivo infekcji Mycobacterium tuberculosis. Zakażonym myszom wstrzykuje się dootrzewnowo substrat do obrazowania REF. Po hydrolizie przez bakteryjny enzym β-laktamazę substrat wydziela fluorescencję, której wykrycie pomaga w ocenie infekcji.

Obrazowanie fluorescencyjne enzymów reporterowych do śledzenia infekcji bakteryjnych in vivo

Bakterie wytwarzają wydzielane związki, które mogą wpływać na fizjologię swoich mikrobiologicznych sąsiadów. W tym miejscu opisujemy badanie przesiewowe kokultury, które umożliwia wykrywanie takich chemicznie zapośredniczonych interakcji międzygatunkowych poprzez mieszanie mikroorganizmów glebowych z fluorescencyjnymi transkrypcyjnymi szczepami reporterowymi Bacillus subtilis na podłożach stałych.

Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

Rozszerzanie podstaw i możliwości zastosowania Fluorescencji przez Niezwiązane Wzbudzenie z Luminescencji (FUEL) poprzez badanie odpowiednich zasad i wykazanie jej zgodności z wieloma fluoroforami i warunkami ukierunkowanymi na przeciwciała.

Krok dalej niż BRET: Fluorescencja przez niezwiązane wzbudzenie z luminescencji (FUEL)

Przedstawiono szczegółowy protokół mysiego modelu kolonizacji enterokwotocznej E. coli (EHEC) przy użyciu bakterii znakowanych bioluminescencyjnie. Wykrycie tych bioluminescencyjnych bakterii za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo u żywych zwierząt może poszerzyć naszą obecną wiedzę na temat kolonizacji EHEC.

Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo

Bakterie bioluminescencyjne regulują produkcję światła za pomocą różnych mechanizmów, takich jak quorum sensing. Ta nowatorska metoda pozwala na badanie in situ bioluminescencji i korelacji emisji światła z gęstością komórek. Sztuczny bioluminescencyjny system Escherichia coli pozwala na scharakteryzowanie operonów luksów, białek Lux i ich wzajemnych oddziaływań.

In Situ Pomiar i korelacja gęstości komórek i emisji światła bakterii bioluminescencyjnych

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Tutaj opisujemy procedurę, która umożliwia wykrywanie bakterii chorobotwórczych w całym narządzie podczas infekcji i ilościowe określanie aktywności fluorescencyjnego reportera.

Trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych

Poznaj metodę wykrywania Yersinia pestis za pomocą bioluminescencyjnego faga reporterowego. Technika umożliwia szybką identyfikację patogenu w ciągu minut zamiast dni, co ma kluczowe znaczenie dla bezpieczeństwa biologicznego.

„Bioluminescencyjny” fagi raportujący do detekcji bakteryjnych patogenów kategorii A

Przeglądaj więcej filmów