„Bioluminescencyjny” fagi raportujący do detekcji bakteryjnych patogenów kategorii A

Yesinia pestis i Bacillus anthracis to bakteryjne patogeny kategorii A, które są odpowiednio czynnikami etiologicznymi dżumy oraz wąglika. Chociaż naturalne występowanie obu tych chorób jest obecnie stosunkowo rzadkie, realna jest możliwość wykorzystania tych patogenów jako broni biologicznej przez grupy terrorystyczne. W niniejszym filmie zaprezentowano metodę wykrywania i identyfikacji Yesinia pestis.

W pierwszej kolejności mikroorganizm jest hodowany na płytkach rolniczych oraz w podłożach płynnych. Następnie do kultury dodaje się specyficzny dla y pesti reporter pH. Reporter pH posiada w swoim genomie geny kodujące bakteryjną lucyferazę, luxe AB.

Jeśli obecne są komórki Y. pestis, fag reporterowy swoiście zwiąże się z komórką, wstrzyknie swój rekombinowany DNA zawierający geny luxe AB i wykorzysta aparat transkrypcyjny oraz translacyjny gospodarza do transkrypcji i translacji reporterowych genów luxe AB. Wyniki wykazują, że próbki nabyły fenotyp bioluminescencyjny, co wskazuje na pozytywną identyfikację nieznanego mikroorganizmu jako Y. pestis. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjny test lizy fagowej, jest fakt, że czas wymagany do wykrycia i identyfikacji Y. pestis wynosi minuty, a nie dni. Metoda ta może pomóc w szybkiej identyfikacji i wykrywaniu obecności Y. pestis z wykorzystaniem kultur izolowanych lub bezpośrednio z złożonych próbek klinicznych bądź środowiskowych.

Zastosowania tej techniki rozciągają się na diagnostykę dżumy, ponieważ choroba ta jest zazwyczaj śmiertelna, jeśli nie zostanie podjęte leczenie w ciągu pierwszych 24 godzin od wystąpienia objawów. Zatem szybka identyfikacja Yersinia pestis jest niezbędna dla pomyślnego rokowania. Ponieważ fagi istnieją dla niemal wszystkich gatunków bakteryjnych, metodologia ta może potencjalnie zostać dostosowana do każdego gatunku, który jest istotny medycznie, środowiskowo lub rolniczo, podobnie jak Y. pestis.

Szczep A 1122 jest wykluczonym z kategorii czynników selekcyjnych agentem o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Brakuje w nim zarówno plazmidu wirulencji LCR (odpowiedzi wapniowej Perlo) o wielkości 75 Kilobase, jak i locus PGM, które są niezbędne do wywołania wirulencji. Rozpocznij tę procedurę w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II typu A, stosując technikę sterylną przy posiewie Y pestis, A 1122.

Wysiej kultury macierzyste na agar LB zgodnie z instrukcją przedstawioną tutaj. Płytki umieść odwrócone dnem do góry w statycznym inkubatorze z kontrolowaną temperaturą powietrza w 28 °C przez 48 godzin. Tempo wzrostu Y pestis jest powolne, z czasem generacji wynoszącym 1,25 godziny po dwóch dniach.

Używając sterylnej metalowej pętli do szczepień, pobierz pojedynczą kolonię y pestis. Wybierz kolonię o jednolitym rozmiarze, reprezentatywną dla pozostałych kolonii i wyraźnie oddzieloną od innych kolonii na szalce. Przenieś kolonię do sterylnej probówki o wymiarach 17 by 100 milimetrów zawierającej dwa mililitry pożywki LB.

Zamknij probówkę zakrętką i krótko wymieszaj w wortexie, a następnie umieścisz ją w inkubatorze wytrząsowym przy 225 RPM w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez około 20 godzin. W przypadku tego testu do detekcji preferowane są komórki w fazie aktywnego wzrostu. Ponieważ zdolność faga do transdukcji, odpowiedź bioluminescencyjna jest skorelowana z żywotnością i kondycją bakterii gospodarza.

Niemniej jednak wykazano, że system detekcji jest kompatybilny z komórkami pobranymi na wszystkich etapach cyklu wzrostu. Po 20 godzinach wzrostu rozcieńczyć kulturę Y pestis w stosunku 1:20 w probówce stożkowej o pojemności 50 ml, dodając 500 µl komórek do 10 ml pożywki LB. Umieścić kulturę z powrotem w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 28 °C.

Należy pozwolić kulturze rosnąć do momentu osiągnięcia gęstości optycznej przy 600 nanometrach wynoszącej 0.2. Powinno to zająć około pięciu godzin, aby wygenerować substrat reakcji bioluminescencyjnej. Przygotować 2% roztwór N-dekanalu, łącząc 200 µL N-dekanalu z 9.8 mL pożywki LB.

Wigoruj intensywnie przez pięć sekund. Następnie przygotuj wtryskiwacz luminometru do mikropłytek. Umieść jeden koniec przewodu wtryskiwacza w probówce o pojemności 13 ml zawierającej 2% roztwór odcinający (end decal solution), a drugi koniec przewodu w pojemniku na odpady.

Za pomocą oprogramowania urządzenia zaprogramuj maszynę tak, aby przepłukała linię wtryskiwacza dwiema mililitrami roztworu decanalu. Po zakończeniu procesu linia powinna zostać wypełniona substratem; należy następnie umieścić końcówkę linii wtryskiwacza w pozycji wyjściowej, gotowej do podawania próbki do dołków. Następnie zaprogramuj lumnometr, aby automatycznie wstrzyknął 67 µL roztworu deel do każdego dołka mikropłytki.

Następnie niezwłocznie zmierz poziom emitowanej bioluminescencji przez 10 sekund. Dalej, aby przygotować każdą próbkę, oznakuj w trzech kopiach probówki hodowlane dla każdego stanu. W tym przypadku, oprócz próbki testowej, zostaną przygotowane kontrole zawierające tylko fazę oraz kontrole zawierające tylko komórki.

Do przygotowania próbek kontrolnych zawierających wyłącznie fagi potrzebnych jest dziewięć probówek; do trzech probówek hodowlanych odmierza się aliquoty po 1 ml bulionu LB. Do każdej probówki dodaje się 20 µL roztworu zapasowego faga reporterowego o stężeniu 5×10⁹ jednostek tworzących plaki (PFU) na ml.

W przypadku braku komórek Y pesti dodanie faga reporterowego nie powinno wywołać odpowiedzi bioluminescencyjnej. Następnie, aby przygotować próbki testowe, odmieierz aliquoty po 1 mL kultury Y pesti do trzech probówek kulturowych. Do trzech z kultur dodaj 20 µL zapasu faga reporterowego.

Wymieszaj kultury, krótko wstrząsając je na wirówce typu vortex, aby przygotować same komórki. W przypadku kontroli negatywnych, służących do określenia tła autobioluminescencji, odmień aliquoty o objętości 1 ml kultury Y pestis do trzech dodatkowych probówek z kulturą. Po przygotowaniu próbek przenieś 200 µL z każdej kultury do dołków białej płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej w celu wykonania pomiaru dla czasu zero.

Pozostałą część każdej hodowli umieść w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 28 °C, używając luminometru do mikropłytek. Zmierz czas. Wyzeruj próbki pod kątem bioluminescencji lub względnych jednostek światła.

Wykonaj pomiary bioluminescencji, pobierając 200 µL z każdej hodowli i dokonując odczytów w luminometrze do mikropłytek w 20, 30, 40 i 60 minucie. Aby przyspieszyć proces detekcji bez konieczności namnażania y pestis, po dodaniu faga reporterowego przenieś kolonię z nowo wyhodowanej płytki do probówki do mikrowirówki zawierającej 200 µL LB z fagi reporterowym. Wymieszaj próbkę za pomocą wortexa, a następnie przenieś mieszaninę komórek i fagów do dołka płytki mikrotitracyjnej.

Inkubuj płytkę mikrotitracyjną w temperaturze 28°C przez 60 minut. Następnie odczytaj bioluminescencję próbki. Analiza przedstawiona w tym filmie wykrywa obecność komórek Y. pestis, zgodnie z opisem w części wstępnej.

W obecności y pestis fag reporterowy wiąże się ze specyficznym receptorem na komórce, wstrzykuje swoje DNA i wykorzystuje aparat transkrypcyjny oraz translacyjny gospodarza do transkrypcji i translacji genów luxe. Siła sygnału oraz czas odpowiedzi sygnałowej są proporcjonalne do liczby obecnych komórek przy wysokich stężeniach komórek, od 10⁵ do 10⁸ CFU na mililitr.

Znaczący wzrost RLU w porównaniu z kontrolami powinien być widoczny w ciągu 20 minut przy niższych stężeniach komórek, od 10² do 10⁴ CFU na mililitr. Znaczący wzrost RLU powinien być widoczny w ciągu 40 do 60 minut. Przedstawiono tutaj reprezentatywny przebieg czasowy eksperymentu wykrywania Y pestis z wykorzystaniem reportera i fagów w czasie zero.

Fagi reporterowe i komórki zmieszano i inkubowano w temperaturze 28 °C, monitorując w czasie bioluminescencję w jednostkach RLU. Wzrost RLU był widoczny w ciągu 12 minut i był istotny statystycznie przy wartości P mniejszej niż 0,05; kontrole negatywne zawierające wyłącznie fagi lub wyłącznie komórki wykazały bazowe poziomy bioluminescencji wynoszące około 20 RLU przez cały 60-minutowy czas inkubacji. Należy zauważyć, że poziomy bazowe są zależne od konkretnego luminometru.

W przeciwieństwie do tego, w przypadku komórek reporterowych phant z próbek testowych widoczny jest wzrost bioluminescencji w 12. minucie po dodaniu faga. Natężenie sygnału powinno stale rosnąć przez 50 minut; chociaż nie pokazano tego tutaj, inkubacja przez okres przekraczający 80 minut spowoduje spadek sygnału poniżej wartości szczytowej z powodu lizy komórek gospodarza indukowanej przez fagi. Podobne wyniki uzyskuje się w temperaturach inkubacji 37 stopni Celsjusza, mimo że optymalna temperatura wzrostu Y pestis wynosi 28 stopni Celsjusza.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób wykorzystania rekombinacyjnego raportowania w detekcji. Po opanowaniu metody identyfikacji Yesenia Pestis, technikę tę można przeprowadzić w 30 minut, wykorzystując złociste kolonie jako inokulum początkowe. Podczas wykonywania tej procedury i korzystania z fagów w laboratorium należy pamiętać, że bardzo łatwo jest zanieczyścić hodowle bakteryjne fagami; aby zminimalizować ryzyko kontaminacji, należy zachować szczególną ostrożność.

Należy używać jednorazowych plastikowych naczyń oraz końcówek do pipet i regularnie zmieniać rękawiczki. Zdolność reporteru do wywołania odpowiedzi Blum jest skorelowana z kondycją komórki. W związku z tym, po identyfikacji Yesenia Pesta, reporter może zostać wykorzystany do określenia wrażliwości izolatu na antybiotyki.

Na przykład komórki Yesenia pesta inkubowane z inhibitorem w postaci stężenia antybiotyku będą albo niezdolne do wygenerowania sygnału bioluminescencyjnego, albo ich zdolność do jego produkcji zostanie znacznie ograniczona. W przeciwieństwie do nich komórki Yesenia pesta oporne na antybiotyki nie zostaną negatywnie dotknięte obecnością antybiotyku i będą zdolne do wywołania odpowiedzi bioluminescencyjnej analogicznej do odpowiedzi komórek nieinhibowanych. W ten sposób można szybko określić profil wrażliwości patogenu na antybiotyki.

W celach ilustracyjnych wykorzystano atenuowany szczep Yesenia pestis. W tym eksperymencie Yesenia pestis reprezentuje kategorię patogenu bakteryjnego. Podczas wykonywania tej techniki z próbkami, w których podejrzewa się obecność Yesenia pestis, należy przestrzegać odpowiednich zasad bezpieczeństwa biologicznego i środków ostrożności w zakresie zagrożeń biologicznych.