Name: Izolacja leukocytów naciekających mózg (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Poznaj metodę izolacji leukocytów naciekających mózg myszy zakażonych wirusem TMEV. Technika obejmuje gradientową wirówkę Percoll i Ficoll oraz analizę cytometryczną do badania odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant NS64571 z NINDS (CLH), stypendium rozwojowe dla młodych naukowców z Mayo Clinic (CLH) oraz hojną darowiznę od Donalda i Frances Herdrich (CLH). Chcielibyśmy podziękować Mayo Clinic Flow Cytometry Core za pomoc.

1. Wewnątrzczaszkowa injekcja wirusa:
Poniższa technika została zmodyfikowana i szeroko wykorzystywana przez nasze laboratorium oraz współpracowników. W skrócie, u młodych myszy (preferencyjnie w wieku 5-6 tygodni) przeprowadza się wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie wirusa zapalenia mózgu i rdzenia myszy (TMEV) szczepu Daniel's lub infekcję pozorowaną (1, 10), aby wywołać naciek leukocytów do mózgu (BILs). Należy zauważyć, że wyniki będą się różnić w zależności od zastosowania szczepu Daniel's, szczepu BeAN oraz szczepu GDVII. W celu pozyskania BILs myszy otrzymują 2x105 PFU TMEV i są infekowane przez 24 godziny.
<ol>
<li>Przymocuj igłę do wstrzykiwania (27 gauge, ¼ in, Kendall) do automatycznej strzykawki Hamiltona o pojemności 1 ml i ustaw ją na podanie 10 μl wirusa.</li> 
<li>Naciągnij TMEV w 10 μL DMEM do strzykawki, zwracając szczególną uwagę na pęcherzyki powietrza. W odpowiednich przypadkach myszy w grupie pozorowanej otrzymują 10 μl DMEM bez wirusa.</li> 
<li>Tuż przed wstrzyknięciem wlej około 1 mL izofluranu do klosza zawierającego drucianą kratkę z podłożem z bawełny.</li>
<li>Umieść myszy bezpośrednio na drucianej kratce w kloszu, aż zostaną lekko znieczulone, staną się niewrażliwe na uciśnięcie palca i zostaną unieruchomione przez anestetyk wziewny, co trwa około 10-15 sekund. Myszy nie powinny mieć bezpośredniego kontaktu z izofluranem, ponieważ substancja ta może działać drażniąco i żrąco.</li>
<li>Podczas znieczulenia przygotuj myszy do wstrzyknięcia, szybko lokalizując odpowiednie współrzędne w regionie kory przedczołowej na czaszce za pomocą golenia i znakowania tuszem. Ogólna lokalizacja wstrzyknięcia znajduje się 1 mm przed bregma i 1 mm bocznie od szwu strzałkowego po prawej stronie (Rysunek 1). Chociaż wstrzykiwanie stereotaktyczne może być odpowiednie w niektórych sytuacjach eksperymentalnych, ustaliliśmy, że wstrzykiwanie ręczne bez golenia lub znakowania jest odpowiednie dla większości eksperymentów. Do wstrzyknięcia wystarczające jest rozdzielenie futra końcem igły wzdłuż obu osi.</li> 
<li>Aby wykonać wstrzyknięcie, skieruj igłę prostopadle do czaszki i przebij kość do głębokości około 3 mm.</li> 
<li>Wprowadź wirusa do mózgu, naciskając przycisk strzykawki Hamiltona i odczekując 2 sekundy przed wycofaniem igły, aby wirus mógł przeniknąć do mózgu.</li>
<li>Ostrożnie wyjmij igłę i umieść mysz w czystej, suchej klatce. Myszy szybko budzą się z znieczulenia i w ciągu kilku minut wracają do normalnego funkcjonowania. Zwróć szczególną uwagę na myszy wykazujące nieprawidłowe objawy, takie jak nadmierne krwawienie z miejsca wstrzyknięcia, w których przypadku może być konieczna eutanazja zwierzęcia. Należy przestrzegać zasad prawidłowego obchodzenia się ze zwierzętami 6 oraz wytycznych National Institutes of Health i Institutional Animal Care and Use Committee.</li>
</ol>
2. Przygotowanie leukocytów naciekających mózg:
<ol>
<li>Przygotować okrągłodennych probówki wirówkowe Oak Ridge o pojemności 30 ml, wypełniając je 10 ml RPMI 1640, 9 ml Percoll oraz 1 ml 10X PBS; probówki powinny stać w temperaturze pokojowej (RT) na blacie podczas procesu usuwania mózgu.</li>
<li>Doprowadzić Ficoll-Paque Plus do temperatury pokojowej (RT).</li>
<li>Uśmiercić zwierzę poprzez zmodyfikowaną przedawkowną dawkę izofluranu 5, następnie szybko usunąć mózg za pomocą stalowej szpatułki do tkanek i umieścić go w probówce stożkowej 15 ml zawierającej 5 ml RPMI na lodzie. W niektórych przypadkach może być wskazana perfuzja PBS w celu usunięcia krążących obwodowych komórek krwi z preparatu BILs. Myszy powinny być w pełni i prawidłowo znieczulone przed perfuzją PBS.</li>
<li>Przenieść mózg i roztwór RPMI do szklanego homogenizatora do tkanek Tenbroeck marki Pyrex o pojemności 7 ml i delikatnie zhomogenizować, wykonując 10-15 ruchów.</li>
<li>Dodać pipetą kolejne 5 ml RPMI do homogenizatora i dwukrotnie pipetować w górę i w dół. Przenieść homogenizat mózgu (ok. 10 ml) do wcześniej przygotowanej okrągłodennej probówki i delikatnie odwrócić 2-3 razy w celu wymieszania.</li>
<li>Wirować homogenizat mózgu przy 7800gave przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT) w rotorze stałokątnym F0360 w wirówce klinicznej Beckman Allegra X-22R.</li>
<li>Po wirowaniu usunąć resztki mieliny, które wypłynęły na górę gradientu. Zebrać warstwę leukocytów unoszącą się nad osadem erytrocytów (Rysunek 2).</li>
<li>Przefiltrować warstwę leukocytów przez sito komórkowe 40 μm do probówki stożkowej 50 ml. Uzupełnić objętość roztworu do 50 ml za pomocą RPMI.</li>
<li>Wirować probówki zawierające rozcieńczoną zawiesinę komórkową w wirówce klinicznej przy 1500 rpm (600gave) przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).</li>
<li>Odssać nadsącz i zebrać osad komórkowy. Resuspendować osad w 1 ml buforu FACS (1% albuminy surowicy bydlęcej, 0,02% azotku sodu w PBS bez wapnia i magnezu) i przenieść zawiesinę komórkową do okrągłodennych probówek FACS 5 ml.</li> 
<li>Ostrożnie podłożyć pod zawiesinę 1 ml Ficoll-Paque Plus.</li> 
<li>Wirować probówkę przy 2500 rpm (1400 gave) w wirówce klinicznej przez 25 min w temperaturze pokojowej (RT) bez hamowania.</li>
<li>Usunąć białą, puszystą warstwę na granicy faz (Rysunek 2) za pomocą pipety 1 ml i przenieść do nowej probówki FACS 5 ml. Przemyć komórki 4 ml buforu FACS.</li>
<li>Wirować probówkę przy 1500 rpm (600gave) przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT) w wirówce klinicznej, aby wytrącić komórki w osad.</li>
<li>Odssać nadsącz i zebrać osad komórkowy. Resuspendować osad leukocytów w odpowiednim buforze i przechowywać na lodzie w nowej probówce FACS.</li>
<li>Policzyć komórki, ocenić żywotność komórek metodą wykluczania błękitu trypanu i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej. Generalnie badacze mogą spodziewać się uzyskania około 5 x 105 komórek/zwierzę.</li>
</ol>
3. Immunofenotypowanie metodą cytometrii przepływowej
<ol>
<li>Po wyizolowaniu i policzeniu leukocytów, wirować komórki przez 3 minuty przy 1500 rpm (600 gave) w wirówce klinicznej.</li>
<li>Resuspendować osad w buforze blokującym zawierającym: bufor FACS, nadsącz z hybridomy 2.4G2 (blokada Fc; anty-CD16/32) oraz płodową surowicę bydlęcą w stosunku 10:5:1 i inkubować przez 30 minut w 4°C.</li> 
<li>Przygotować i dodać przeciwciała koniugowane przeciwko antygenom zewnątrzkomórkowym do zblokowanych komórek w stężeniu 1:200 i inkubować przez 30 minut w 4°C w ciemności. Barwić i inkubować komórki w objętości 200 μl w płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V. Odpowiednie kontrole obejmują niebarwione komórki oraz próbki do kompensacji fluorochromów, w zależności od potrzeb.</li>
<li>Wirować zabarwione komórki w temperaturze pokojowej przez 3 minuty przy 1500 rpm (600gave) w wirówce klinicznej, używając rotora odpowiedniego dla płytek 96-dołkowych.</li>
<li>Odssać nadsącz i przemyć komórki 200 μl buforu FACS, delikatnie pipetując w górę i w dół 3 razy.</li>
<li>Powtórzyć powyższą technikę przemywania dwukrotnie.</li>
<li>Po przemyciu resuspendować komórki w 2% paraformaldehydzie i przenieść do probówek FACS. Fixacja jest wymagana do analizy cytometrycznej komórek zakażonych odczynnikami poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (Biosafety Level 2).</li>
<li>Uruchomić analizę ufiksowanych komórek na BD FACS Calibur zgodnie z zmodyfikowaną metodą cytometrii przepływowej 8 i analizować pliki offline przy użyciu FlowJo, WinMDI lub innego dostępnego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.</li>
<li>Do odpowiedniego immunofenotypowania zazwyczaj wymagana jest analiza 50-100 000 zdarzeń na próbkę.</li>
</ol>
Przeciwciała bezpośrednio koniugowane użyte w tym eksperymencie:
CD45 wykryto za pomocą klonu 30-F11. Ly6C/G wykryto za pomocą klonów Gr1 i RB6-8C5. CD11b wykryto za pomocą klonu M1/70. F4/80 wykryto za pomocą klonu BM8.
4. Reprezentatywne wyniki:
Przedstawiamy wyniki fenotypowania komórek z BIL myszy 24 godziny po zakażeniu (Rysunek 3). Leukocyty barwiono przeciwciałem anty-mysim CD45 sprzężonym z PerCP w celu wykrycia komórek odpornościowych, przeciwciałem anty-mysim Ly6C/G sprzężonym z PE w celu wykrycia monocytów zapalnych oraz przeciwciałami anty-mysimi CD11b sprzężonym z APC i F4/80 sprzężonym z APC w celu wykrycia komórek linii monocytarnej. Analizę przeprowadzono przy użyciu urządzenia BD FACS Calibur.
<img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig1.jpg" alt="Schemat szwów czaszki z zaznaczeniem szwu strzałkowego, Bregma i pomiarów; do celów edukacji anatomicznej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Lokalizacja anatomiczna miejsca iniekcji. Miejsce iniekcji znajduje się 1 mm przed Bregma i 1 mm bocznie od szwu strzałkowego po prawej stronie.
<img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig2.jpg" alt="Schemat gradientu Percoll i Ficoll pokazujący separację leukocytów i BIL za pomocą wirowania w gradiencie gęstości." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Ilustracja separacji gradientowej leukocytów i BIL.** Leukocyty są początkowo zbierane bezpośrednio poniżej warstwy szczątków mieliny i powyżej osadu RBC w gradiencie Percoll. Biała, puszysta warstwa (BIL) na granicy faz jest zbierana z gradientu Ficoll.
<img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig3.jpg" alt="Schemat cytometrii przepływowej przedstawiający różnicowanie leukocytów; etykiety kluczowe obejmują CD45, Ly6C i F4/80." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Immunofenotyp leukocytów infiltrujących mózg 24 h po infekcji. Leukocyty mysie wyizolowano z mózgu poprzez centryfugację gradientową homogenatów tkanek przygotowanych od zwierząt 24 h po infekcji wewnątrzczaszkowej. Komórki barwiono przeciwciałami koniugowanymi z fluorochromami przeciwko mysim CD45, Ly6C/G, CD11b i F4/80. Wstępne bramkowanie wykonano poprzez zestawienie CD45, markera komórek odpornościowych, z rozproszeniem przednim (FSC), będącym wskaźnikiem wielkości komórek (C). Następnie populacje CD45hi (A, D), CD45lo (B, E) i CD45neg (F, G) analizowano pod kątem względnych poziomów ekspresji markerów monocytów i makrofagów: Ly6C/G, F4/80 (A, B, F) oraz CD11b (D, E, G). Zapalne monocyty Ly6C/G+F4/80+CD11b+ stwierdzono niemal wyłącznie w populacji CD45hi (A, D), co jest zgodne z infiltracją tych komórek z obwodu. W przeciwieństwie do tego, makrofagi Ly6C/G-F4/80loCD11b+ stwierdzono niemal wyłącznie w populacjach CD45lo (B, E) i CD45neg (G), co odpowiada fenotypowi rezydentnemu. W licznych eksperymentach nigdy nie zaobserwowano komórek CD45hi ani zapalnych monocytów Ly6C/G+F4/80+CD11b+ w mózgach myszy niezakażonych lub poddanych infekcji pozorowanej (dane nie przedstawiono).

<ol><li>Buenz, E. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picornaviruses+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Picornaviruses and cell death.</a> Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).</li>
<li>Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+3-parameter+flow+cytometry-based+cell+death+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay.</a> Cytometry A. 71, 170-173 (2007).</li>
<li>Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelinated+axons+and+motor+function+are+protected+by+genetic+deletion+of+perforin+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropath.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis.</a> J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).</li>
<li>Deb, C., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+contributes+to+efficient+clearance+of+picornavirus+from+the+acutely+infected+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain.</a> J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).</li>
<li>Donovan, J., &amp, P. B. rown, , P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Euthanasia.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+%26+restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Handling & restraint.</a> Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenteral+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parenteral injections.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).</li>
<li>Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+using+Becton+Dickinson+FACS+Calibur%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur.</a> Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+directed+against+a+viral+peptide+contribute+to+loss+of+motor+function+by+disrupting+axonal+transport+in+a+viral+model+of+fulminant+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination.</a> J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).</li>
<li>Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theiler%27s+virus+infection+in+mice%3A+An+unusual+biphasic+disease+process+leading+to+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination.</a> Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Rutynowo wykorzystujemy cytometrię przepływową w celu określenia zarówno jakości preparatu komórek naciekających mózg, jak i rozróżnienia różnych populacji komórek odpornościowych 2, 9. W ostrych punktach czasowych nasza metoda BILs pozwala na uzyskanie wysokich odsetków monocytów zapalnych w populacji CD45hi, a także wysokich odsetków makrofagów w populacji CD45lo. Wskazuje to, że powtarzalna odpowiedź immunologiczna w obrębie mózgu może być w sposób wiarygodny charakteryzowana za pomocą naszej metody.
<p...

<table><tbody><tr><td>TMEV</td><td>Howe Lab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>szczep Daniel&amp;rsquo;a</td><td>Invitrogen</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>izofluran</td><td>Novaplus</td><td>NDC 0409-3292-49</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe Oak Ridge z okrągłym dnem</td><td>Nalge Nunc international</td><td>3118-0030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Roche Group</td><td>11666789001</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>błękit trypanu 0.4% (w/v)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>probówki stożkowe 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>szklany homogenizator tkanek Tenbr&amp;#8211;ck marki Pyrex 7 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-414-10B</td><td></td></tr><tr><td>sito do komórek 40 &amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>probówki stożkowe 50 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy wołowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>azotek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>CMF-PBS</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>probówki do FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica wołowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>hybridoma 2.4G2</td><td>ATCC</td><td>HB-197</td><td></td></tr><tr><td>płytka Costar z dnem w kształcie litery V</td><td>Corning</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>wirówka Allegra X-22R lub równoważna</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>koszyk i rotor do płytek 96-dołkowych</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>S2096</td><td></td></tr><tr><td>rotor z kątem stałym</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>F0360</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Calibur</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 7.5</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>klon: 30-F11</td></tr><tr><td>Gr1 (Ly6C/G)</td><td>BD Biosciences</td><td>553128</td><td>klon: RB6-8C5</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience</td><td>17-0112-83</td><td>klon: M1/70</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>eBioscience</td><td>17-4801-82</td><td>klon: BM8</td></tr></tbody></table>

izolacja leukocytów naciekających mózg

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Opisujemy metodę przygotowania leukocytów naciekających mózg (BILs) u myszy. Demonstrujemy, jak zinfekować myszy wirusem encephalomyelitis mysiej Theilera (TMEV) za pomocą techniki szybkiego wstrzyknięcia doczaszkowego oraz jak oczyścić populację komórek naciekających wzbogaconą w leukocyty z całego mózgu. W skrócie, myszy są znieczulane izofluranem w zamkniętej komorze, a następnie wykonuje się wolnoręczne wstrzyknięcie do kory czołowej za pomocą strzykawki Hamiltona. Myszy są następnie uśmiercane w różnych odstępach czasu po infekcji poprzez przedawkowanie izofluranu, a całe mózgi są pobierane i homogenizowane w medium RPMI przy użyciu homogenizatora tkankowego Tenbroeck. Homogenaty mózgowe są wirowane przez ciągły gradient 30% Percoll w celu usunięcia mieliny i innych odłamków komórkowych. Zawiesina komórkowa jest następnie filtrowana przez sito 40 μm, płukana i wirowana na nieciągłym gradiencie Ficoll-Paque Plus w celu wyselekcjonowania i oczyszczenia leukocytów. Następnie leukocyty są płukane i resuspenderowane w odpowiednich buforach do immunofenotypowania metodą cytometrii przepływowej. Cytometria przepływowa wykazuje obecność populacji wrodzonych komórek odpornościowych we wczesnych stadiach infekcji u myszy C57BL/6. 24 godziny po infekcji w BILs obecnych jest wiele podzbiorów komórek odpornościowych, z wzbogaconą populacją komórek Gr1+, CD11b+ i F4/80+. Zatem metoda ta jest użyteczna w charakteryzacji odpowiedzi odpornościowej na ostrą infekcję w mózgu.

Opisano szybką metodę pozyskiwania leukocytów naciekających mózg myszy. Metoda ta wykorzystuje ciągły gradient Percoll oraz nieciągły gradient Ficoll w celu wyselekcjonowania i oczyszczenia warstwy wzbogaconej w leukocyty. Wyizolowane leukocyty mogą być następnie scharakteryzowane za pomocą pomiarów cytometrycznych.

Izolacja leukocytów naciekających mózg

Opisujemy metodę przygotowania leukocytów infiltrujących mózg (BILs) u myszy. Demonstrujemy sposób zakażania myszy mysim wirusem Theilera...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie populacji komórek odporności wrodzonej wzbogaconej o leukocyty z mózgu myszy w stanie ostrego zakażenia wirusem encephalomyelitis T Them mirror lub TMEV. Osiąga się to poprzez wstępne zakażenie wewnątrzczaszkowe myszy wirusem TMEV. Następnie, 24 godziny po zakażeniu, pobiera się mózg i poddaje go delikatnej homogenizacji.Trzecim krokiem procedury jest wykorzystanie gradientu ciągłego perca i nieciągłego fol w celu selektywnego oczyszczenia warstwy komórek wzbogaconej w leukocyty. Ostatecznie fenotyp populacji leukocytów naciekających mózg, biorących udział w odpowiedzi immunologicznej na ostrą infekcję mózgu, można scharakteryzować za pomocą analizy cytometrycznej. Dzień dobry, nazywam się dr Charles Howe.Metoda, którą zaprezentujemy dzisiaj, może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuroimmunologii. Na przykład: jakie komórki odpornościowe infiltrują mózg podczas ostrej infekcji? Metodę tę zaprezentuje Reagan la France.Corey, starszy technolog badawczy w moim laboratorium, w celu wyizolowania leukocytów infiltrujących mózg. Do automatycznej strzykawki Hamiltona o pojemności 1 ml przymocuj igłę o rozmiarze 27 G i ustaw strzykawkę na 10 µL. Pobierz do strzykawki 10 µL DMEM zakażonego dawką 2×10⁵ PFU szczepu Daniel TMEV lub 10 µL DMEM zakażonego pozornie (sham infected), zwracając szczególną uwagę na pęcherzyki powietrza.Zanurz mysz w wieku od pięciu do sześciu tygodni w znieczuleniu i potwierdź sedację poprzez uciśnięcie palca u stopy podczas znieczulenia. Przygotuj mysz do iniekcji, szybko lokalizując odpowiednie współrzędne w obszarze kory czołowej na czaszce, odsuń futro myszy z igłą skierowaną wzdłuż obu AE zgodnie z wymogami iniekcji, aby wprowadzić igłę prostopadle do czaszki i przebić ją przez kość do głębokości około 3 mm. Aby wprowadzić DMEM z zainfekowanym wirusem lub DMEM pozorowany do mózgu, naciśnij tłok strzykawki Hamiltona i odczekaj dwie sekundy, aż medium przedostanie się do mózgu, a następnie wycofaj igłę.Ostrożnie wyjmij igłę i umieść mysz w czystej, suchej klatce. Myszy szybko obudzą się z anestezji i odzyskają sprawność w ciągu jednej minuty, 24 godziny po wewnątrzczaszkowej infekcji wirusowej lub pozorowanej. Przed izolacją leukocytów naciekających mózg, napełnij probówkę wirówkową Oakridge z okrągłym dnem 10 mililitrami RPMI 1640, 9 mililitrami Percoll oraz jednym mililitrem 10×PBS i przechowuj probówkę w temperaturze pokojowej.Doprowadzić zestaw FI call pack plus do temperatury pokojowej, a probówkę stożkową o pojemności 15 ml napełnić pięcioma ml pożywki RPMI i w tym samym czasie umieścić ją w lodzie. Po uśmierceniu zwierzęcia poprzez zmodyfikowaną przedawkowanie izofluranu, szybko usunąć mózg i umieścić go w probówce stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej pięć ml RPMI, następnie przenieść mózg wraz z roztworem RPMI do szklanego homogenizatora do tkanek marki Pyrex o pojemności 7 ml i delikatnie zhomogenizować mózg, wykonując 10 do 15 pociągnięć.Następnie pipetuj dodatkowe pięć mililitrów RPMI do homogenizatora i dwukrotnie pipetuj roztwór w górę i w dół. Przenieś około 10 mililitrów homogenatu mózgu do wcześniej przygotowanej okrągłodنnej probówki do wirówki z rowkami i delikatnie odwróć probówkę dwa lub trzy razy, aby wymieszać zawartość. Teraz wirować homogenat mózgu przy 7 800 Gs przez 30 minut w temperaturze pokojowej w wirówce z rotorem stałokątowym.Po wirowaniu usuń resztki mieliny, które wypłynęły na górę gradientu. Warstwa leukocytów unosi się nad osadem erytrocytów. Przelej warstwę leukocytów przez sito komórkowe o oczkach 40 µm do probówki stożkowej o pojemności 50 mL.Dopełnić roztwór do objętości 50 ml. Za pomocą naszego PMI wirować probówkę zawierającą rozcieńczoną zawiesinę komórek w wirówce klinicznej przy 600 Gs przez pięć minut. W temperaturze pokojowej odessać nadsącz i zebrać osad komórkowy.Resuspenduj osad w 1 mL buforu FACS i przelej zawiesinę komórkową do 5 mL probówki FACS z okrągłym dnem. Ostrożnie nałóż na wierzch zawiesiny 1 mL FiCell Pack Plus o temperaturze pokojowej. Wiruj probówki FACS przy 800 ×g w wirówce klinicznej przez 25 minut.W temperaturze pokojowej, bez przerwy, usunąć białą puszystą warstwę na granicy faz za pomocą pipety 1 ml i przenieść ją do nowej probówki typu FACS o pojemności 5 ml. Przemyć komórki 4 ml buforu FACS. Następnie ponownie wirować probówkę w wirówce klinicznej w celu osadzenia komórek.Następnie odessaj nadsącz i zbierz osad komórkowy. Resuspenduj osad leukocytów w buforze blokującym i przechowuj w lodzie. Następnie policz komórki.Po wyizolowaniu i policzeniu leukocytów naciekających mózg, nanieś komórki na płytkę z dnem w kształcie litery V w celu przygotowania do immunofenotypowania metodą cytometrii przepływowej. Następnie odwiruj komórki w wirówce klinicznej.Resuspenduj osad w 200 µL buforu blokującego i inkubuj komórki przez 30 minut w lodzie. Następnie dodaj przeciwciała w rozcieńczeniu 1:200 i inkubuj komórki przez kolejne 30 minut w lodzie, tym razem w ciemności. Potem odwiruj zabarwione komórki w wirówce klinicznej, a następnie odessij nadsącz.Dodaj 200 µL buforu FACS do osadu i delikatnie pipetuj w górę i w dół trzy razy. Następnie przemyj komórki w wirówce jeszcze dwa razy w ten sam sposób; po ostatnim przemyciu ponownie zawieś komórki w końcowym stężeniu 2% paraformaldehydu i przenieś zbarwione komórki do probówek do FACS. Na koniec poddaj utrwalone komórki analizie cytometrycznej i przeanalizuj pliki offline za pomocą programu do analizy FACS.Leukocyty mysie wyizolowano z mózgu metodą centryfugacji w gradiencie gęstości z homogenatu tkankowego przygotowanego z zwierząt 24 godziny po infekcji wewnątrzczaszkowej. Jak widać na tych dwóch wykresach kropkowych, zapalne monocyty Ly6C+, F4/80+ oraz CD11b+ występowały niemal wyłącznie w populacji CD45high, co jest zgodne z naciekaniem tych komórek z obwodu. W przeciwieństwie do nich, makrofagi Ly6C-, F4/80low oraz CD11b+ występowały niemal wyłącznie w populacjach CD45low (lewe dwa panele) oraz CD45- (panel skrajnie prawy), co jest zgodne z fenotypem rezydentnym.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przygotować leukocyty z mózgu zwierząt w stanie ostrej infekcji.

isolation-of-brain-infiltrating-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja leukocytów infiltrujących mózg

W tym filmie demonstrujemy, jak izolować komórki mononuklearne z ośrodkowego układu nerwowego szczurów z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego.

Izolacja komórek mononuklearnych z ośrodkowego układu nerwowego szczurów z EAE

Niniejszy artykuł opisuje szybki protokół wydajnej izolacji komórek mononuklearnych z tkanek mózgu i rdzenia kręgowego, które mogą być skutecznie wykorzystane w analizach cytometrycznych.

Izolacja mononuklearnych komórek mózgu i rdzenia kręgowego z wykorzystaniem gradientów Percollu

W tym filmie przeprowadzamy izolację komórek jednojądrzastych z mózgu myszy za pomocą wirowania gradientu gęstości. Wyizolowaną zawiesinę komórek jednojądrzastych można wykorzystać do dalszej analizy.

Izolacja komórek jednojądrzastych z mózgu myszy: technika wirowania w gradimencie gęstości do izolowania komórek jednojądrzastych rezydujących w mózgu

Film pokazuje izolację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z mózgu myszy za pomocą mechanicznej dysocjacji i trawienia enzymatycznego. Następnie następuje wirowanie w gradiencie gęstości w celu zebrania komórek odpornościowych do dalszej analizy.

Izolowanie komórek odpornościowych naciekających nowotwór z mysiego mózgu

Opisano metodę izolacji przylegających leukocytów zapalnych z naczyń krwionośnych mózgu myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA. Metoda umożliwia kwantyfikację oraz charakterystykę fenotypową wyizolowanych leukocytów po barwieniu przeciwciałami fluorescencyjnymi, a następnie analizie za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA

Charakterystyka komórek szpikowych mózgu po udarze może być przeprowadzona za pomocą metody frakcjonowania optycznego lub za pomocą analizy cytometrycznej zawiesin leukocytów mózgu. Obie są użytecznymi technikami do przeprowadzenia dokładnego fenotypowego rozróżnienia głównych podzbiorów komórek szpikowych znajdujących się w niedokrwionym mózgu.

Charakterystyka stereologiczna i cytometrii przepływowej subpopulacji leukocytów w modelach przejściowego lub trwałego niedokrwienia mózgu

Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w patogenezie udaru niedokrwiennego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że działa jak miecz obosieczny, który zaostrza wczesne uszkodzenie mózgu, ale także przyczynia się do późniejszej naprawy. Protokół ten opisuje izolację komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu i ich późniejsze fenotypowanie metodą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza cytometrii przepływowej komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Ten artykuł przedstawia dwa zoptymalizowane protokoły badania rezydentnych i obwodowo pochodzących komórek odpornościowych w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym mózgu, rdzeniu kręgowym i oponach mózgowych. Każdy z tych protokołów pomaga ustalić funkcję i skład komórek zajmujących te przedziały w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych.

Izolowanie tkanek ośrodkowego układu nerwowego i związanych z nimi opon mózgowych w celu dalszej analizy komórek odpornościowych

To badanie wykorzystuje cytometrię przepływową i dwie różne strategie bramkowania na izolowanych perfundowanych splotach naczyniówkowych mózgu myszy; ten protokół identyfikuje główne podzbiory komórek odpornościowych, które wypełniają tę strukturę mózgu.

Izolacja i charakterystyka komórek odpornościowych z mikropreparowanych splotów naczyniówkowych myszy

Aby zbadać odpowiedź immunologiczną na zaburzenia mózgu, jednym z powszechnych podejść jest analiza zmian w komórkach odpornościowych. Oto dwa proste i skuteczne protokoły do izolacji komórek odpornościowych z tkanki mózgu mysiego i rdzenia kostnego z czaszki.

Izolowanie komórek odpornościowych z mózgu i czaszki myszy

Poznaj metodę izolacji leukocytów naciekających mózg myszy zakażonych wirusem TMEV. Technika obejmuje gradientową wirówkę Percoll i Ficoll oraz analizę cytometryczną do badania odpowiedzi immunologicznej.

Izolacja leukocytów naciekających mózg

Przeglądaj więcej filmów