Name: Aseptyczne techniki laboratoryjne: przenoszenie objętości za pomocą pipet serologicznych i mikropipetorów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Naucz się aseptycznych technik laboratoryjnych do precyzyjnego przenoszenia objętości za pomocą pipet serologicznych i mikropipetorów. Poznaj metody zapobiegania zakażeniom w pracy z kulturami mikroorganizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Szczególne podziękowania kierujemy do Cori Sanders z Iroc Designs za przygotowanie ilustracji oraz do Kris Reddi z UCLA za przygotowanie kultur próbek do rycin. Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez HHMI (grant HHMI nr 52006944).

<ol><li>Barker, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarker%2C+K+%22At+the+Bench%3A+A+Laboratory+Navigator%22">At the Bench: A Laboratory Navigator</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. (1998).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biosafety+in+Microbiological+And+Biomedical+Laboratories+%28BMBL%29%22">Biosafety in Microbiological And Biomedical Laboratories (BMBL)</a>. , 5th Ed, US Department of Health and Human Services (DHHS), Centers for Disease Control and Prevention (CDC) and National Institutes of Health (NIH), U.S. Government Printing Office. Washington DC. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> (2009).</li>
<li>Bykowski, T., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aseptic Technique.</a> Current Protocols in Microbiology. Appendix 4, Appendix 4D(2008).</li>
<li>Coté, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Technique+for+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aseptic Technique for Cell Culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 1, Unit 1.3(2001).</li>
<li>Grimes, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+basic+laboratory+manual+for+the+small-scale+production+and+testing+of+I-2+Newcastle+disease+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22RAP+Publication%22%5BJournal%5D)">A basic laboratory manual for the small-scale production and testing of I-2 Newcastle disease vaccine.</a> RAP Publication. AC802/E, 12-13 (2002).</li>
<li>Guzman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pipetting%3A+A+Practical+Guide%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Biology+Teacher%22%5BJournal%5D)">Pipetting: A Practical Guide.</a> The American Biology Teacher. 63 (2), 128-131 (2001).</li>
<li>Jordan, T., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJordan%2C+T+%22RESEARCH%3A+National+Genomics+Research+Initiative+Phage+Resource+Laboratory+Manual%22">RESEARCH: National Genomics Research Initiative Phage Resource Laboratory Manual</a>. , Howard Hughes Medical Institute. (2008).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning+-+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning - A Laboratory Manual</a>. , 3rd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 978-087969576 (2001).</li>
<li>Seidman, L. A., Moore, C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSeidman%2C+LA+%22Basic+Laboratory+Methods+for+Biotechnology%3A+Textbook+and+Laboratory+Reference%22">Basic Laboratory Methods for Biotechnology: Textbook and Laboratory Reference</a>. , Prentice Hall, Inc. Upper Saddle River, New Jersey. (2000).</li>
<li>Pipettes, Calibration & Repair Service - Pipette.com [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://pipette.com/public/staticpages/guidetopipetting.aspx">http://pipette.com/public/staticpages/guidetopipetting.aspx</a> (2012).</li>
<li>On-Line Resources for Biology: Table of Contents [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://abacus.bates.edu/~ganderso/biology/resources/index.html">http://abacus.bates.edu/~ganderso/biology/resources/index.html</a> (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PIPETMAN+P+User%27s+Guide%22">PIPETMAN P User's Guide</a>. , Gilson Inc. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.gilson.com/Resources/LT801120_a_eng_030209%20BD.pdf">http://www.gilson.com/Resources/LT801120_a_eng_030209%20BD.pdf</a> (2012).</li>
<li>Sterile Technique - Laboratory Wiki [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://lab.wikia.com/wiki/Sterile_Technique">http://lab.wikia.com/wiki/Sterile_Technique</a> (2012).</li>
<li>Air displacement pipette - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Air_displacement_pipette">http://en.wikipedia.org/wiki/Air_displacement_pipette</a> (2012).</li>
<li>Disinfectant - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Disinfectant">http://en.wikipedia.org/wiki/Disinfectant</a> (2012).</li>
</ol>

Nie mam nic do ujawnienia.

Technika aseptyczna odnosi się do zestawu rutynowych procedur stosowanych w celu zapobiegania zanieczyszczeniu sterylnych roztworów i kultur niepożądanymi mikroorganizmami w laboratorium. Techniki te są niezbędne w eksperymentach wymagających hodowli komórek. Choć nie jest możliwe osiągnięcie całkowicie sterylnych warunków pracy, procedury takie jak dezynfekcja powierzchni laboratoryjnych, tworzenie strefy sterylnej za pomocą palnika Bunsena, ograniczanie ekspozycji niezakorkowanych kultur i mediów na powietrze, sterylizacja materiałów, takich jak butelki, probówki i pipety szklane, oraz unikanie kontaktu sterylnych narzędzi z niesterylnymi powierzchniami, zmniejszają ryzyko zanieczyszczenia roztworów i kultur podczas eksperymentu. Celem jest, aby te środki ostrożności stały się odruchowe, co osiąga się poprzez szkolenie i praktykę podczas pracy w laboratorium.
Przenoszenie objętości sterylnych roztworów i kultur przy użyciu takich instrumentów jak pipety serologiczne i mikropipety jest jednym z wielu rodzajów rutynowych technik wykonywanych w laboratorium. Różne zastosowania eksperymentalne wymagają instrumentów zdolnych do przenoszenia odmiennych, a jednocześnie precyzyjnych i dokładnych objętości. Pipety serologiczne są stosowane w laboratoriach mikrobiologicznych do przygotowywania kultur komórkowych wymagających sporządzenia pożywek w objętościach wyrażonych w mililitrach, podczas gdy mikropipety są niezbędne w eksperymentach biologii molekularnej, w których potrzebne są jedynie mikrolitrowe ilości roztworów. Stosowanie technik aseptycznych przy użyciu tych instrumentów minimalizuje kontaminację podczas przenoszenia objętości, niezależnie od ilości cieczy czy rodzaju eksperymentu.
Choć nie omówiono tego w niniejszym protokole, innym powszechnie stosowanym sposobem zapobiegania kontaminacji jest praca wdymającej powietrze laminarnej komorze z nawiewem (Rysunek 10). Sprzęt ten jest niezbędny w hodowlach tkankowych oraz w eksperymentach przeprowadzanych z mikroorganizmami sklasyfikowanymi jako BLS-2 lub wyższymi. Komora z nawiewem laminarnym posiada filtr HEPA (wysokowydajny filtr cząsteczkowy), który usuwa z powietrza zanieczyszczenia przed jego wpłynięciem do komory, zapobiegając jednocześnie przedostawaniu się nieprzefiltrowanego powietrza z pomieszczenia do przestrzeni roboczej. Należy zauważyć, że wewnątrz komory z nawiewem laminarnym nie można używać palnika Bunsena, ponieważ ciepło generowane przez płomień zaburza przepływ powietrza, który jest kluczowy dla prawidłowego funkcjonowania urządzenia.
Podczas przeprowadzania eksperymentów często pomocne jest sprawdzenie jakości zastosowanej techniki aseptycznej. Aby potwierdzić, że roztwory i pożywki nie uległy zanieczyszczeniu podczas manipulacji eksperymentalnych, należy zawsze przygotować kontrolę negatywną. Na przykład, przygotowując probówki z pożywką płynną do hodowli bakterii, jednej probówki nie należy szczepić, pozostawiając w niej jedynie sterylną pożywkę. Inkubuje się ją razem ze zaszczepionymi probówkami, a następnie sprawdza, czy w niezaszczepionej probówce kontrolnej nie pojawiły się oznaki kontaminacji, takie jak zmętnienie wynikające z wzrostu niepożądanych komórek nieumyślnie wprowadzonych do naczynia. Jeśli probówka kontrolna jest zanieczyszczona, prawdopodobnie zanieczyszczone są również probówki eksperymentalne, a eksperyment będzie wymagał powtórzenia. Te środki ostrożności powinny być stosowane przy każdym doświadczeniu.

<table><tbody><tr><td>Pożywka LB</td><td>Difco Laboratories</td><td>244620</td><td>Przepis dostępny również w referencji 6</td></tr><tr><td colspan="4">Bufor TE:</td></tr><tr><td>EDTA sól disodowa dwuwodna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3253</td><td></td></tr><tr><td>CiDecon</td><td>Decon Laboratories</td><td>8504</td><td>Środek dezynfekcyjny</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406</td><td>Do użytku jako środek dezynfekcyjny, przygotować roztwór 70%(v/v) w wodzie destylowanej</td></tr></tbody></table>

aseptyczne techniki laboratoryjne: przenoszenie objętości za pomocą pipet serologicznych i mikropipet

Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors

Drobnoustroje znajdują się wszędzie – w powietrzu, glebie i ludzkim organizmie, a także na nieożywionych powierzchniach, takich jak blaty laboratoryjne i klawiatury komputerowe. Powszechność mikrobów sprawia, że w laboratorium istnieje ogromna liczba potencjalnych zanieczyszczeń. Aby zapewnić sukces eksperymentalny, należy zminimalizować liczbę zanieczyszczeń na sprzęcie i powierzchniach roboczych. Powszechnymi technikami w wielu badaniach z zakresu mikrobiologii są metody obejmujące pomiar i przenoszenie kultur zawierających komórki bakteryjne lub cząsteczki wirusowe. Aby wykonać te czynności bez kontaktu z niesterylnymi powierzchniami lub zanieczyszczenia sterylnych pożywek, wymagane jest: (1) przygotowanie sterylnej przestrzeni roboczej, (2) precyzyjne ustawienie i dokładny odczyt urządzeń do aseptycznego przenoszenia cieczy oraz (3) prawidłowe operowanie instrumentami, kolbami z kulturami, butelkami i probówkami w obrębie pola sterylnego. Opanowanie tych procedur wymaga szkolenia i praktyki. Początkowo czynności powinny być wykonywane powoli, świadomie i w sposób kontrolowany, tak aby technika aseptyki stała się naturalnym nawykiem podczas pracy przy stole laboratoryjnym. W niniejszym materiale przedstawiamy kroki pomiaru objętości przy użyciu pipet serologicznych i mikropipet w obrębie pola sterylnego stworzonego przez palnik Bunsena. Pomiarowane objętości wahają się od mikrolitrów (μl) do mililitrów (ml) w zależności od zastosowanego instrumentu. Przenoszone ciecze obejmują zazwyczaj sterylne buliony lub roztwory chemiczne, a także kultury bakterii i zawiesiny fagowe. Postępując zgodnie z tymi procedurami, studenci powinni być w stanie: •Pracować w polu sterylnym stworzonym przez płomień palnika Bunsena. •Używać pipet serologicznych bez naruszania sterylności instrumentu. •Pobierać ciecze za pomocą pipet serologicznych, precyzyjnie odczytując skalibrowane objętości poprzez dopasowanie menisku cieczy do kresek graduacyjnych na pipecie. •Zachować sterylność butelek z kulturami, kolb, probówek i odpowiadających im nakrętek podczas przenoszenia cieczy. •Zidentyfikować różne zastosowania plastikowych i szklanych pipet serologicznych. •Określić ograniczenia dokładności mikropipet. •Precyzyjnie i dokładnie ustawiać objętości na mikropipetach. •Wiedzieć, jak prawidłowo korzystać z pierwszego i drugiego stopnia zatrzymania tłoka w mikropipecie w celu pobrania i przeniesienia prawidłowych objętości.

Podczas pracy w laboratorium niezbędne jest zminimalizowanie źródeł kontaminacji. Technika aseptyczna odnosi się do procedur umożliwiających przenoszenie kultur i odczynników przy jednoczesnym unikaniu kontaktu z powierzchniami nieszterylnymi. Pipety serologiczne i mikropipety są wykorzystywane do odmierzania precyzyjnych objętości bez naruszania sterylności roztworów stosowanych w eksperymentach.

Aseptyczne techniki laboratoryjne: przenoszenie objętości za pomocą pipet serologicznych i mikropipet

Mikroorganizmy występują wszędzie – w powietrzu, glebie i ludzkim organizmie, a także na nieożywionych powierzchniach, takich jak blaty laboratoryjne i klawiatury komputerowe. ...

Niniejsza demonstracja przedstawia aseptyczne techniki laboratoryjne w zakresie przenoszenia objętości za pomocą pipet serologicznych i mikropipet przy stole laboratoryjnym. Praca powinna odbywać się w polu sterylnym stworzonym przez płomień palnika Bunsena. Należy dobrać odpowiednie urządzenie do przenoszenia objętości w zależności od zastosowania.Następnie należy z nich korzystać w sposób prawidłowy, nie naruszając ich sterylności, jednocześnie dbając o sterylność odczynników i materiałów hodowlanych oraz precyzyjne odsysanie cieczy. Procedury te są niezbędne do zminimalizowania źródeł kontaminacji i zapewnienia precyzji w podstawowych eksperymentach. Na początku wyzwaniem może być precyzyjne ustawienie i dokładny odczyt z instrumentów, a także koordynacja ruchów z użyciem przyrządów i materiałów laboratoryjnych bez naruszania sterylności przenoszonych cieczy.Stosowanie techniki aseptycznej w laboratorium jest niezbędne dla sukcesu eksperymentalnego podczas pracy z żywymi okazami, dlatego warto poświęcić czas na opanowanie tych procedur, aby stały się one nawykowe. Podczas pracy przy stole laboratoryjnym dr Chris Reddy, koordynator mojego laboratorium, zademonstruje odpowiednie protokoły. Zawsze dokładnie myj ręce mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą przed rozpoczęciem jakichkolwiek procedur laboratoryjnych. Najpierw zmocz ręce pod bieżącą, ciepłą wodą.Następnie nanieś mydło i rozetrzyj je energicznie. Pocieraj dłonie, wytwarzając tarcie na wszystkich powierzchniach, w tym kciukach, grzbietach palców, grzbietach dłoni oraz pod paznokciami. Następnie dokładnie opłucz ręce, aby usunąć resztki mydła, i osusz je ręcznikami papierowymi z dozownika.Na koniec, używając czystego ręcznika papierowego, zakręć kran i uprzątnij obszar roboczy na blacie laboratoryjnym. Następnie wyjmij z pojemnika nawilżoną chusteczkę dezynfekującą i przetrzyj całą powierzchnię. Pozostaw środek dezynfekujący do odparowania, korzystając z lampy do utwardzania.Palnik Bunsena. Dostosuj płomień tak, aby w środku pojawił się niebieski stożek. Ułóż wszystkie materiały niezbędne do przeprowadzenia procedury w pobliżu sterylnego pola na blacie laboratoryjnym.Należy również upewnić się, że wszystkie materiały są odpowiednio oznakowane. Dostępnych jest wiele rodzajów pipet serologicznych: plastikowych lub szklanych, jednorazowych lub wielorazowych, z zatworkiem lub bez. Różne rozmiary są kalibrowane za pomocą zatworków, które pełnią funkcję bariery zapobiegającej przepełnieniu pipety.Należy pamiętać, że pipety serologiczne są również kalibrowane na dwa sposoby. Pipety TD, oznaczone podwójnymi pierścieniami u góry, są kalibrowane tak, aby objętość pozostająca w końcówce nie była dostarczana. Nie pokazano tego tutaj, ale pipety TC muszą być wydmuchiwane, ponieważ są kalibrowane do dostarczenia całej objętości. Stosując technikę aseptyczną z pojedynczo zapakowaną sterylną plastikową pipetą serologiczną, należy zacząć od zapasteuryzowanego końca i ostrożnie odklejać papier.Nie usuwaj całej osłonki. Zabeziecz jedynie końcówkę uchwytu pipety – tylko górną część pipety powyżej znaczników graduacji – a następnie przymocuj pomocnik do pipety, taki jak gruszka lub pistolet, do górnego końca pipety serologicznej. Trzymając pomocnik w jednej ręce, usuń papierową osłonkę z plastikowej pipety drugą ręką.W przypadku szklanych pipet serologicznych przechowywanych w metalowych pojemnikach, należy poluzować górną część pojemnika i zdjąć nasadkę, a następnie wysterylizować płomieniem otwarte końce zarówno nasadki, jak i pojemnika. Następnie należy położyć nasadkę bokiem na zdezynfekowanym blacie. Trzymając pojemnik poziomo, należy nim potrząsnąć, aby wysunęły się górne części jednej lub dwóch pipet.Wystaw około cala. Połóż kanister na boku i wyjmij jedną pipetę, nie dotykając pozostałych pipet. Dopilnuj, aby dolna końcówka pipety nie miała kontaktu z dłońmi ani niesterylnymi powierzchniami.Następnie należy zamocować asystenta pipetującego. Potem dolną jedną trzecią pipety szklanej należy przeprowadzić przez niebieski stożek płomienia palnika Bunsena przez okres od jednej do trzech sekund. Teraz należy zdjąć zakrętkę z butelki zawierającej sterylne podłoże.Przytrzymaj go między palcem serdecznym a dłonią jednej ręki, obsługując pomocnik do pipety kciukiem, palcem wskazującym i środkowym tej samej ręki; drugą ręką trzymaj butelkę pod kątem 45 stopni i przeprowadź krawędź butelki przez płomień palnika Bunsena. Umieść sterylną końcówkę pipety w medium. Następnie odessij ciecz, używając pomocnika do pipety, kontrolując przepływ zgodnie z oznaczeniami skali.Monitoruj objętość pobraną do pipety, aby precyzyjnie odczytać wartość. Trzymaj pipetę pionowo i obserwuj menisk cieczy dokładnie na wysokości wzroku. Ponownie przeprowadź krawędź butelki przez płomień palnika Bunsena.Następnie zakręć butelkę. Odstaw butelkę z pożywką. Następnie weź sterylną probówkę i w warunkach aseptycznych.Zdejmij zakrętkę zgodnie z wcześniejszym opisem. Stwórz pole sterylne, opalając krawędź probówki. Przenieś medium pipetą do probówki, kontrolując przepływ próbki tak, aby nie dopuścić do rozpryskiwania.Wypal krawędź. Ponownie załóż zakrętkę i odstaw probówkę na bok. Teraz zdejmij pomocnik do pipet, wyrzuć plastikowe pipety do odpowiedniego pojemnika na odpady ostre, a pipety szklane zanurz w 10% roztworze wybielacza.Mikropipeta umożliwia precyzyjne pomiary i dozowanie niewielkich objętości przy użyciu końcówek o różnych rozmiarach, przeznaczonych do konkretnych zakresów objętości. Należy używać sterylnie zapakowanych probówek i plastikowych końcówek. Należy również przetrzeć mikropipety nasączoną chusteczką dezynfekującą. Uwaga.Volter wyświetla trzy cyfry, które należy interpretować w zależności od rodzaju mikropipety, a dokładność jest odzwierciedlona przez najmniejszą skalę. Na przykład P 20 jest używana do objętości od 2.0 do 20.0 µL. Górna liczba w kolorze czarnym oznacza dziesiątki µL.Druga czarna cyfra oznacza objętość w mikrolitrach. Czerwona cyfra oznacza dziesiąte części mikrolitra, zatem każda kreska podziałki odpowiada przyrostowi 0,02 mikrolitra. Najpierw przekręć pokrętło regulacyjne, aby ustawić objętość dozownika zgodnie ze wskazaniem na liczniku objętości.Zmniejszając ustawienie objętości w mikropipecie, powoli obracaj pokrętłem kciukowym w dół aż do osiągnięcia odpowiedniej kreski podziałki. Przy zwiększaniu objętości obróć pokrętło w górę tak, aby przekroczyć pożądaną kreskę podziałki o jedną trzecią obrotu. Następnie powoli obracaj pokrętło kciukowe w dół, aby precyzyjnie ustawić docelową objętość.Przez cały czas należy używać sterylnych jednorazowych plastikowych końcówek. Mocno nałożyć końcówkę na koniec trzonu mikropipety. Mocno docisnąć i lekko przekręcić, aby zapewnić szczelność.Trzymaj mikropipetę w pozycji pionowej. Zwróć uwagę, że mikropipeta posiada trzy położenia: spoczynkowe, pierwszy stop oraz drugi stop.Naciśnij przycisk tłoka z pozycji spoczynkowej do pierwszego zatrzymania, aby wypchnąć powietrze o objętości odpowiadającej ustawionej wartości. Następnie zanurz końcówkę w cieczy, trzymając przycisk wciśnięty do pierwszego zatrzymania. Powoli zwolnij przycisk, aby zasysać ciecz do końcówki.Po powrocie przycisku do pozycji spoczynkowej należy odczekać chwilę, aż ciecz zostanie zaciągnięta do końcówki. Następnie należy wyjąć końcówkę z cieczy. Należy wizualnie sprawdzić ilość pobranej cieczy, upewniając się, że w końcówce nie ma pęcherzyków powietrza.Umieść końcówkę pod kątem od 10 do 45 stopni przy ściance probówki, do której dozowana jest ciecz. Następnie powoli naciśnij przycisk tłoka do pierwszego stopnia. Wypuść ciecz.Po chwili naciśnij przycisk do drugiego stopnia, aby usunąć pozostałą ciecz. Następnie wyjmij końcówkę z cieczy i zwolnij tłok do pozycji spoczynkowej. Na koniec wyrzuć końcówki do wyznaczonego pojemnika na odpady ostre, naciskając przycisk wyrzutu w mikropipecie.Najpierw wyłącz palnik Bunsena. Po odłożeniu wszystkich materiałów i odczynników, przetrzyj zewnętrzne powierzchnie naczyń laboratoryjnych chusteczką dezynfekującą przed przeniesieniem ich w miejsce przechowywania. Następnie umieść zanieczyszczoną szklarnię oraz materiały stanowiące odpady niebezpieczne w odpowiednich pojemnikach do utylizacji.Należy ponownie przetrzeć cały obszar roboczy, pozwalając środkowi dezynfekującemu odparować. Na koniec dokładnie umyj ręce mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą. Brak techniki aseptycznej może doprowadzić do kontaminacji kultur i opóźnić przeprowadzenie eksperymentów.Aseptyczne przenoszenie cieczy za pomocą pipet serologicznych jest niezbędne przy namnażaniu czystych kultur bakteryjnych, takich jak ta 25 mililitrowa preparacja e coli. Ponadto pipety serologiczne ułatwiają aseptyczne przenoszenie cieczy do sterylnych probówek. Ten przykład przedstawia różnicę między kulturą czystą a zanieczyszczoną e coli podczas punktowego dozowania pożywki do probówek.Czasami wymagane jest precyzyjne odmierzanie objętości. W tym przypadku widać niedokładne przeniesienie medium. Ten przykład pokazuje przeniesienie nieprawidłowej objętości buforu.Zamiast odmierzyć 12,5 µL, student odmierzył 125 µL. Mimo że wartości na pokrętle były ustawione identycznie, do wykonania zadania wybrano niewłaściwą mikropipetę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiąść praktyczną wiedzę na temat stosowania technik aseptycznych w rutynowych procedurach laboratoryjnych, takich jak przenoszenie roztworów i kultur za pomocą pipet serologicznych oraz mikropipet, bez naruszania ich sterylności.Celem jest doprowadzenie do sytuacji, w której procedury zapobiegawcze, takie jak opalanie szkła, końcówek do pipet, probówek do hodowli i kolb, a także praca w obrębie sterylnego pola na blacie laboratoryjnym, staną się nawykiem podczas każdego eksperymentu. Niezbędne jest również, aby podczas przeprowadzania doświadczeń mierzyć i dozować objętości w sposób precyzyjny i dokładny. Nauka prawidłowej obsługi tych instrumentów do przenoszenia objętości poprawi wiarygodność wyników eksperymentalnych.

aseptic-laboratory-techniques-volume-transfers-with-serological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Techniki laboratoryjne bez zakażeń: Przenoszenie objętości za pomocą pipet serologicznych i mikropipet

Podczas pracy z pożywkami i odczynnikami używanymi do hodowli mikroorganizmów, należy stosować technikę aseptyczną, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Do izolacji, namnażania lub oznaczania liczby bakterii i fagów rutynowo stosuje się różne metody posiewu, z których wszystkie obejmują procedury utrzymujące sterylność materiałów eksperymentalnych.

Aseptyczne techniki laboratoryjne: metody galwanizacji

Listeria monocytogenes jest organizmem modelowym do badania odpowiedzi immunologicznych i genetycznej podatności myszy na bakterie wewnątrzkomórkowe. Metoda ta umożliwia pomiar ładunku bakteryjnego oraz przygotowanie jednokomórkowych zawiesin wątroby i śledziony myszy do analizy FACS w celu określenia zmian w komórkach odpornościowych wywołanych zakażeniem Listeria.

Pomiar ładunku bakteryjnego i odpowiedzi immunologicznych u myszy zainfekowanych Listeria monocytogenes

Transfer agregatów białkowych, czyli nasion proteopatycznych z komórki do komórki, może leżeć u podstaw postępu patologii w chorobach neurodegeneracyjnych. W tym miejscu opisano nowatorski test cytometrii przepływowej FRET, który umożliwia specyficzne i czułe wykrywanie aktywności wysiewu z próbek rekombinowanych lub biologicznych.

Czułe wykrywanie proteopatycznej aktywności wysiewu za pomocą cytometrii przepływowej FRET

Ten protokół opisuje, jak zaszczepić myszy C57BL/6J szczepem EGD Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) i zmierzyć odpowiedzi interferonu γ (IFN-γ) przez komórki NK (natural killer), limfocyty T (NKT) i adaptacyjne limfocyty T po zakażeniu. Protokół ten opisuje również, w jaki sposób przeprowadzać badania przeżycia u myszy po zakażeniu zmodyfikowaną dawką LD50 patogenu.

Eksperymentalne zakażenie Listeria monocytogenes jako model do badania odpowiedzi na interferon-γ gospodarza

Celem tego protokołu jest identyfikacja populacji komórek śródbłonka limfatycznego w wątrobie za pomocą opisanych markerów. Wykorzystujemy kolagenazę IV i DNazę oraz delikatne mielenie tkanki w połączeniu z cytometrią przepływową, aby zidentyfikować odrębną populację komórek śródbłonka limfatycznego.

Trawienie mysiej wątroby do analizy cytometrycznej przepływowej komórek śródbłonka limfatycznego

Pokazujemy użycie nieciągłych gradientów gęstości do rozdzielania populacji bakterii na podstawie produkcji kapsułek. Metoda ta służy do porównywania ilości kapsułek między kulturami, izolowania mutantów o określonym fenotypie kapsułki lub do identyfikacji regulatorów kapsułki. Opisano tutaj optymalizację i przebieg testu.

Oddzielanie bakterii według ilości kapsułek za pomocą nieciągłego gradientu gęstości

Hodowla in vitro to bezpośrednia metoda wykrywania obecności żywych bakterii. Protokół ten opisuje metody hodowli różnych krętków Borrelia, w tym tych z kompleksu Borrelia burgdorferi sensu lato, gatunków Borrelia z nawracającą gorączką i Borrelia miyamotoi. Gatunki te są wybredne i wolno rosnące, ale można je hodować.

Metody uprawy krętków z kompleksu Borrelia burgdorferi Sensu Lato i nawracającej gorączki Borrelia

Obecny protokół opisuje rozprzestrzenianie się wirusa Zika (ZIKV) w komórkach nerkowych afrykańskiej zielonej małpy Vero oraz kwantyfikację ZIKV za pomocą komórkowych metod immunodetekcji kolorymetrycznej w formatach 24-dołkowych i 96-dołkowych (o wysokiej przepustowości).

Namnażanie wirusa i kwantyfikacja kolorymetryczna na podstawie komórek

Społeczności mikrobiologiczne w naturze i w laboratorium – Wywiad

W tym filmie pokazano, jak używać programowalnej wyciągarki do wykonywania pipet do patch-clampu oraz ostrych elektrod do elektrofizjologii. Tę samą procedurę można zastosować do wykonania różnych narzędzi szklanych, w tym igieł do iniekcji.

Wytwarzanie pipet do patch-clamp oraz mikroelektrod za pomocą programowalnej wyciągarki

Naucz się aseptycznych technik laboratoryjnych do precyzyjnego przenoszenia objętości za pomocą pipet serologicznych i mikropipetorów. Poznaj metody zapobiegania zakażeniom w pracy z kulturami mikroorganizmów.

Aseptyczne techniki laboratoryjne: przenoszenie objętości za pomocą pipet serologicznych i mikropipet

Przeglądaj więcej filmów