Aseptyczne techniki laboratoryjne: przenoszenie objętości za pomocą pipet serologicznych i mikropipet

Niniejsza demonstracja przedstawia aseptyczne techniki laboratoryjne w zakresie przenoszenia objętości za pomocą pipet serologicznych i mikropipet przy stole laboratoryjnym. Praca powinna odbywać się w polu sterylnym stworzonym przez płomień palnika Bunsena. Należy dobrać odpowiednie urządzenie do przenoszenia objętości w zależności od zastosowania.

Następnie należy z nich korzystać w sposób prawidłowy, nie naruszając ich sterylności, jednocześnie dbając o sterylność odczynników i materiałów hodowlanych oraz precyzyjne odsysanie cieczy. Procedury te są niezbędne do zminimalizowania źródeł kontaminacji i zapewnienia precyzji w podstawowych eksperymentach. Na początku wyzwaniem może być precyzyjne ustawienie i dokładny odczyt z instrumentów, a także koordynacja ruchów z użyciem przyrządów i materiałów laboratoryjnych bez naruszania sterylności przenoszonych cieczy.

Stosowanie techniki aseptycznej w laboratorium jest niezbędne dla sukcesu eksperymentalnego podczas pracy z żywymi okazami, dlatego warto poświęcić czas na opanowanie tych procedur, aby stały się one nawykowe. Podczas pracy przy stole laboratoryjnym dr Chris Reddy, koordynator mojego laboratorium, zademonstruje odpowiednie protokoły. Zawsze dokładnie myj ręce mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą przed rozpoczęciem jakichkolwiek procedur laboratoryjnych. Najpierw zmocz ręce pod bieżącą, ciepłą wodą.

Następnie nanieś mydło i rozetrzyj je energicznie. Pocieraj dłonie, wytwarzając tarcie na wszystkich powierzchniach, w tym kciukach, grzbietach palców, grzbietach dłoni oraz pod paznokciami. Następnie dokładnie opłucz ręce, aby usunąć resztki mydła, i osusz je ręcznikami papierowymi z dozownika.

Na koniec, używając czystego ręcznika papierowego, zakręć kran i uprzątnij obszar roboczy na blacie laboratoryjnym. Następnie wyjmij z pojemnika nawilżoną chusteczkę dezynfekującą i przetrzyj całą powierzchnię. Pozostaw środek dezynfekujący do odparowania, korzystając z lampy do utwardzania.

Palnik Bunsena. Dostosuj płomień tak, aby w środku pojawił się niebieski stożek. Ułóż wszystkie materiały niezbędne do przeprowadzenia procedury w pobliżu sterylnego pola na blacie laboratoryjnym.

Należy również upewnić się, że wszystkie materiały są odpowiednio oznakowane. Dostępnych jest wiele rodzajów pipet serologicznych: plastikowych lub szklanych, jednorazowych lub wielorazowych, z zatworkiem lub bez. Różne rozmiary są kalibrowane za pomocą zatworków, które pełnią funkcję bariery zapobiegającej przepełnieniu pipety.

Należy pamiętać, że pipety serologiczne są również kalibrowane na dwa sposoby. Pipety TD, oznaczone podwójnymi pierścieniami u góry, są kalibrowane tak, aby objętość pozostająca w końcówce nie była dostarczana. Nie pokazano tego tutaj, ale pipety TC muszą być wydmuchiwane, ponieważ są kalibrowane do dostarczenia całej objętości. Stosując technikę aseptyczną z pojedynczo zapakowaną sterylną plastikową pipetą serologiczną, należy zacząć od zapasteuryzowanego końca i ostrożnie odklejać papier.

Nie usuwaj całej osłonki. Zabeziecz jedynie końcówkę uchwytu pipety – tylko górną część pipety powyżej znaczników graduacji – a następnie przymocuj pomocnik do pipety, taki jak gruszka lub pistolet, do górnego końca pipety serologicznej. Trzymając pomocnik w jednej ręce, usuń papierową osłonkę z plastikowej pipety drugą ręką.

W przypadku szklanych pipet serologicznych przechowywanych w metalowych pojemnikach, należy poluzować górną część pojemnika i zdjąć nasadkę, a następnie wysterylizować płomieniem otwarte końce zarówno nasadki, jak i pojemnika. Następnie należy położyć nasadkę bokiem na zdezynfekowanym blacie. Trzymając pojemnik poziomo, należy nim potrząsnąć, aby wysunęły się górne części jednej lub dwóch pipet.

Wystaw około cala. Połóż kanister na boku i wyjmij jedną pipetę, nie dotykając pozostałych pipet. Dopilnuj, aby dolna końcówka pipety nie miała kontaktu z dłońmi ani niesterylnymi powierzchniami.

Następnie należy zamocować asystenta pipetującego. Potem dolną jedną trzecią pipety szklanej należy przeprowadzić przez niebieski stożek płomienia palnika Bunsena przez okres od jednej do trzech sekund. Teraz należy zdjąć zakrętkę z butelki zawierającej sterylne podłoże.

Przytrzymaj go między palcem serdecznym a dłonią jednej ręki, obsługując pomocnik do pipety kciukiem, palcem wskazującym i środkowym tej samej ręki; drugą ręką trzymaj butelkę pod kątem 45 stopni i przeprowadź krawędź butelki przez płomień palnika Bunsena. Umieść sterylną końcówkę pipety w medium. Następnie odessij ciecz, używając pomocnika do pipety, kontrolując przepływ zgodnie z oznaczeniami skali.

Monitoruj objętość pobraną do pipety, aby precyzyjnie odczytać wartość. Trzymaj pipetę pionowo i obserwuj menisk cieczy dokładnie na wysokości wzroku. Ponownie przeprowadź krawędź butelki przez płomień palnika Bunsena.

Następnie zakręć butelkę. Odstaw butelkę z pożywką. Następnie weź sterylną probówkę i w warunkach aseptycznych.

Zdejmij zakrętkę zgodnie z wcześniejszym opisem. Stwórz pole sterylne, opalając krawędź probówki. Przenieś medium pipetą do probówki, kontrolując przepływ próbki tak, aby nie dopuścić do rozpryskiwania.

Wypal krawędź. Ponownie załóż zakrętkę i odstaw probówkę na bok. Teraz zdejmij pomocnik do pipet, wyrzuć plastikowe pipety do odpowiedniego pojemnika na odpady ostre, a pipety szklane zanurz w 10% roztworze wybielacza.

Mikropipeta umożliwia precyzyjne pomiary i dozowanie niewielkich objętości przy użyciu końcówek o różnych rozmiarach, przeznaczonych do konkretnych zakresów objętości. Należy używać sterylnie zapakowanych probówek i plastikowych końcówek. Należy również przetrzeć mikropipety nasączoną chusteczką dezynfekującą. Uwaga.

Volter wyświetla trzy cyfry, które należy interpretować w zależności od rodzaju mikropipety, a dokładność jest odzwierciedlona przez najmniejszą skalę. Na przykład P 20 jest używana do objętości od 2.0 do 20.0 µL. Górna liczba w kolorze czarnym oznacza dziesiątki µL.

Druga czarna cyfra oznacza objętość w mikrolitrach. Czerwona cyfra oznacza dziesiąte części mikrolitra, zatem każda kreska podziałki odpowiada przyrostowi 0,02 mikrolitra. Najpierw przekręć pokrętło regulacyjne, aby ustawić objętość dozownika zgodnie ze wskazaniem na liczniku objętości.

Zmniejszając ustawienie objętości w mikropipecie, powoli obracaj pokrętłem kciukowym w dół aż do osiągnięcia odpowiedniej kreski podziałki. Przy zwiększaniu objętości obróć pokrętło w górę tak, aby przekroczyć pożądaną kreskę podziałki o jedną trzecią obrotu. Następnie powoli obracaj pokrętło kciukowe w dół, aby precyzyjnie ustawić docelową objętość.

Przez cały czas należy używać sterylnych jednorazowych plastikowych końcówek. Mocno nałożyć końcówkę na koniec trzonu mikropipety. Mocno docisnąć i lekko przekręcić, aby zapewnić szczelność.

Trzymaj mikropipetę w pozycji pionowej. Zwróć uwagę, że mikropipeta posiada trzy położenia: spoczynkowe, pierwszy stop oraz drugi stop.

Naciśnij przycisk tłoka z pozycji spoczynkowej do pierwszego zatrzymania, aby wypchnąć powietrze o objętości odpowiadającej ustawionej wartości. Następnie zanurz końcówkę w cieczy, trzymając przycisk wciśnięty do pierwszego zatrzymania. Powoli zwolnij przycisk, aby zasysać ciecz do końcówki.

Po powrocie przycisku do pozycji spoczynkowej należy odczekać chwilę, aż ciecz zostanie zaciągnięta do końcówki. Następnie należy wyjąć końcówkę z cieczy. Należy wizualnie sprawdzić ilość pobranej cieczy, upewniając się, że w końcówce nie ma pęcherzyków powietrza.

Umieść końcówkę pod kątem od 10 do 45 stopni przy ściance probówki, do której dozowana jest ciecz. Następnie powoli naciśnij przycisk tłoka do pierwszego stopnia. Wypuść ciecz.

Po chwili naciśnij przycisk do drugiego stopnia, aby usunąć pozostałą ciecz. Następnie wyjmij końcówkę z cieczy i zwolnij tłok do pozycji spoczynkowej. Na koniec wyrzuć końcówki do wyznaczonego pojemnika na odpady ostre, naciskając przycisk wyrzutu w mikropipecie.

Najpierw wyłącz palnik Bunsena. Po odłożeniu wszystkich materiałów i odczynników, przetrzyj zewnętrzne powierzchnie naczyń laboratoryjnych chusteczką dezynfekującą przed przeniesieniem ich w miejsce przechowywania. Następnie umieść zanieczyszczoną szklarnię oraz materiały stanowiące odpady niebezpieczne w odpowiednich pojemnikach do utylizacji.

Należy ponownie przetrzeć cały obszar roboczy, pozwalając środkowi dezynfekującemu odparować. Na koniec dokładnie umyj ręce mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą. Brak techniki aseptycznej może doprowadzić do kontaminacji kultur i opóźnić przeprowadzenie eksperymentów.

Aseptyczne przenoszenie cieczy za pomocą pipet serologicznych jest niezbędne przy namnażaniu czystych kultur bakteryjnych, takich jak ta 25 mililitrowa preparacja e coli. Ponadto pipety serologiczne ułatwiają aseptyczne przenoszenie cieczy do sterylnych probówek. Ten przykład przedstawia różnicę między kulturą czystą a zanieczyszczoną e coli podczas punktowego dozowania pożywki do probówek.

Czasami wymagane jest precyzyjne odmierzanie objętości. W tym przypadku widać niedokładne przeniesienie medium. Ten przykład pokazuje przeniesienie nieprawidłowej objętości buforu.

Zamiast odmierzyć 12,5 µL, student odmierzył 125 µL. Mimo że wartości na pokrętle były ustawione identycznie, do wykonania zadania wybrano niewłaściwą mikropipetę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiąść praktyczną wiedzę na temat stosowania technik aseptycznych w rutynowych procedurach laboratoryjnych, takich jak przenoszenie roztworów i kultur za pomocą pipet serologicznych oraz mikropipet, bez naruszania ich sterylności.

Celem jest doprowadzenie do sytuacji, w której procedury zapobiegawcze, takie jak opalanie szkła, końcówek do pipet, probówek do hodowli i kolb, a także praca w obrębie sterylnego pola na blacie laboratoryjnym, staną się nawykiem podczas każdego eksperymentu. Niezbędne jest również, aby podczas przeprowadzania doświadczeń mierzyć i dozować objętości w sposób precyzyjny i dokładny. Nauka prawidłowej obsługi tych instrumentów do przenoszenia objętości poprawi wiarygodność wyników eksperymentalnych.