Name: Protokół zbierania i barwienia hemocytów z komara żółtej febry Aedes aegypti (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Naucz się zbierać i barwić hemocyty z komara Aedes aegypti metodą perfuzji z wysokim wstrzyknięciem. Technika ta umożliwia izolację czystych preparatów komórek krwi i badanie odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Johnowi Freyowi i Benowi Petersonowi za hodowlę komarów. Dziękujemy również Christine Davis i Gary'emu Radice za pomoc w przygotowaniu mikrografii hemocytów. Badania te były finansowane ze stypendium letniego University of Richmond Arts &amp; Science przyznanego A. A. Qayumowi oraz grantu wydziałowego dla A. Telanga.

1. Przygotowanie przed pobraniem hemocytów
<ol>
 <li>Przygotować roztwór rozcieńczający hemolimfę, składający się z 60% pożywki Schneidera, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 30% buforu cytrynianowego (przeciwzakrzepowy; 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 41 mM kwasu cytrynowego, pH 4.5) 11. Przygotować alikwoty o objętości 1.0 mL, które można przechowywać w temperaturze -20°C. Każdą alikwot należy wykorzystać tylko raz (patrz Materials).</li>
 <li>Przygotować szklane lamie (75 x 25 x 1 mm), nacinając na jednym końcu okrąg o średnicy 1 cm za pomocą narzędzia do trawienia szkła. Alternatywnie można zakupić lamie z dwoma wstępnie wytrawionymi okręgami (np. z oferty Fisher Scientific lub EMS). Niezbędna będzie jedna lamelka na każdego komara.</li>
 <li>Przygotować zestaw szklanych igieł (patrz Materials), wyciągając je zgodnie z następującymi sugerowanymi ustawieniami (Sutter Instruments, Model P-87): 
<table border="1"><tbody>
 <tr>
 <td>Heat Ramp+5 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pull: 45</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vel: 75</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Time: 175</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pressure 580</td>
 </tr>
</tbody></table> 
Stosując sugerowane ustawienia tego wyciągacza, otrzymujemy igły o całkowitej długości około 500 mm z długością trzonia około 3 mm. Można również zakupić igły wstępnie wyciągnięte (np. Tritech Research).</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikroinjektora przed pobraniem hemocytów
<ol>
 <li>Wprowadzić dociągniętą igłę do uchwytu igły mikroinjektora zgodnie z instrukcjami producenta. Wypełnić wstecznie przewody mikroinjektora (patrz Materiały), strzykawkę oraz dociągniętą szklaną igłę olejem mineralnym zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
3. Przygotowanie samic komarów przed pobraniem hemocytów
<ol>
 <li>Przenieś 15 dorosłych samic do małych, sztywnych pojemników-klatek, które można stykać z lodem. Zanurz klatkę z komarami w lodzie na taką głębokość, aby cała wysokość klatki i wszystkie jej boki miały kontakt z lodem. Zapewni to ekspozycję wszystkich komarów na zimno. 
 Znieczul komary zimnem przez około 8 minut lub do momentu, gdy przestaną być mobilne.</li>
 <li>Umieść jednego komara na szkiełku z wgłębieniem. Szkiełko to będzie służyło jako miejsce do wykonywania wstrzyknięć.</li>
</ol>
4. Pobieranie hemocytów
<ol>
 <li>Ustaw mikrowstrzykiwacz tak, aby pobrać 12 μl rozcieńczalnika hemolimfy do wyciągniętej szklanej igły, a następnie wstrzyknąć roztwór do komara pomiędzy siódmy a ósmy segment odwłoka. Z całkowitej pobranej objętości 12 μl można wstrzyknąć 3-3,5 μl do około 3 komarów. Podczas wstrzykiwania komara należy delikatnie przytrzymać pęsetą. Na końcówce igły powinna pozostać niewielka ilość rozcieńczalnika, aby zapobiec wstrzyknięciu oleju mineralnego. Po wstrzyknięciu odwłok powinien wyglądać na „pełny” lub nabrzmiały.</li>
 <li>Umieść wstrzyknięte komary w osobnym, czystym pojemniku na lodzie na 5 min w celu regeneracji. Inkubacja roztworu rozcieńczalnika przeciwkrzepliwego wewnątrz komara pomoże oderwać hemocyty przylegające do tkanek wewnętrznych. Średnio podczas każdego 5-minutowego okresu regeneracji można wstrzyknąć 3 do 5 świeżych komarów.</li>
 <li>Po 5 minutach regeneracji, odetnij nogi, skrzydła i koniec odwłoka (na poziomie ósmego segmentu) każdego komara, jeden po drugim, używając mikronozyczek. Należy to zrobić w kubku regeneracyjnym umieszczonym na lodzie. Odcięcie nóg i skrzydeł zmniejsza prawdopodobieństwo przeniesienia łusek na szkiełka do zbierania próbek. Uwaga: nie odcinaj nóg i skrzydeł zbyt blisko miejsc przyczepu do klatki piersiowej, aby uniknąć powstania innych otworów, przez które mogłaby wyciec hemolimfa. Hemolimfę należy zbierać wyłącznie przez otwór utworzony na końcówce odwłoka.</li>
 <li>Umyj jedno trawione szklane szkiełko mikroskopowe 70% Ethanolem i osusz je chusteczką kimwipe. Umieść jednego wstrzykniętego i zregenerowanego komara na szkiełku, na zewnętrznej krawędzi trawionego okręgu. Ustaw mikrowstrzykiwacz, aby pobrać 12 μl świeżego rozcieńczalnika hemolimfy i wstrzyknąć tę objętość do komara w boczną stronę jego mezotoraksu. Podaj większość, ale nie całą objętość rozcieńczalnika (około 8 – 10 μl), aby zapobiec wstrzyknięciu oleju mineralnego. Na końcówce igły powinna pozostać niewielka ilość rozcieńczalnika.</li>
 <li>Ustaw komara tak, aby odcięty otwór odwłoka znajdował się na krawędzi okręgu o średnicy 1 cm. Po wstrzyknięciu rozcieńczona hemolimfa powinna zostać zebrana wewnątrz zaznaczonego obszaru. Po wyjęciu igły z miejsca wstrzyknięcia w mezotoraksie, ponownie przytrzymaj komara ramionami pęsety i delikatnie ściśnij odwłok, aby skierować hemolimfę na obszar trawionego okręgu.</li>
 <li>Pozostaw rozcieńczoną hemolimfę do wyschnięcia na szkiełku przez około 10 minut lub do momentu, aż będzie widocznie sucha.</li>
</ol>
5. Fixacja i barwienie hemocytów
 <ol>
 <li>Każny preparat należy barwić oddzielnie za pomocą HEMA3 7 (patrz Materiały): zanurzyć preparat w utrwalaczu 5 razy po 1 sekundzie; zanurzyć preparat w roztworze I 3 razy po 1 sekundzie; i na koniec zanurzyć preparat w roztworze II 3 razy po 1 sekundzie. Przepłukać tył preparatu wodą DI. Frontu preparatu nie należy płukać. Osuszyć za pomocą papieru filtracyjnego front preparatu poza wytrawionym okręgiem zawierającym zabarwioną tkankę.
 </li>
 <li>Nanieść medium montażowe (np. Shur/Mount lub Polymount) wokół wytrawionego centrum i nałożyć na nie szkiełko nakrywkowe. Lekko docisnąć szkiełko nakrywkowe (25 x 25 mm), aby medium montażowe rozprowadziło się na całej powierzchni objętej szkiełkiem (w tym w wytrawionym okręgu zawierającym zabarwioną tkankę). Pozostawić preparaty do wyschnięcia na minimum 3 godziny lub na całą noc. Hemocyty należy oglądać w ciągu 2 tygodni od momentu pobrania w celu uzyskania optymalnej wizualizacji i obrazowania.</li>
 </ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Przykłady utrwalonych i barwionych HEMA3 hemocytów pobranych od dorosłej samicy Aedes aegypti przedstawiono na rysunku 1A-C. Rysunek 1A przedstawia hemocyt, który zidentyfikowano jako prohemocyt na podstawie jego małego rozmiaru, kształtu kulistego lub sferoidalnego oraz wysokiego stosunku jądra do cytoplazmy (powiększenie 550x) 11. Rysunek 1B przedstawia hemocyt sklasyfikowany jako oenocytoid na podstawie jego sferoidalnego kształtu i wysokiego stosunku cytoplazmy do jądra (powiększenie 550x). Na koniec, rysunek 1C przedstawia hemocyt typu granulocyt (powiększenie 550x). Granulocyty charakteryzują się większą ziarnistością i wykazują tendencję do przyjmowania kształtu oraz zachowania ameboidalnego podczas przylegania do szklanych powierzchni. Stosując wcześniej opublikowane kryteria typowania i odzyskiwania hemocytów 11, nasza metoda pobierania pozwoliła uzyskać podobną całkowitą liczbę hemocytów; podobnie stwierdzono, że granulocyty stanowią największy odsetek wszystkich hemocytów 11 (Rys. 2).
<img src="/files/ftp_upload/2772/2772fig1.jpg" alt="Etapy podziału komórki pod mikroskopem; cytoplazma, jądro, ziarnistości; skala 10 μm; badanie biologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Obrazy z mikroskopu świetlnego reprezentatywnego prohemocytu (A), oenocytu (B) oraz granulocytu (C) utrwalonego i barwionego metodą HEMA3, pobranych od dorosłej samicy Ae. aegypti. C = cytoplazma, N = jądro, G = ziarnistości.
<img src="/files/ftp_upload/2772/2772fig2.jpg" alt="Wykres słupkowy porównujący liczbę hemocytów i granulocytów na komara; analiza danych odpowiedzi immunologicznej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Całkowita liczba ± SE wszystkich hemocytów i granulocytów uzyskanych z jednej samicy komara za pomocą naszej metody rozcieńczania i pobierania hemolimfy.

<ol><li>Enayati, A., Hemingway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+management%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Malaria management: past, present, and future.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).</li>
<li>Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+transgenic+mosquitoes+on+dengue+virulence+to+humans+and+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Naturalist%22%5BJournal%5D)">The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes.</a> The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).</li>
<li>Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+studies+on+the+innate+immunity+of+disease+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors.</a> Insect Sci. 15, 15-15 (2008).</li>
<li>Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midgut+basal+lamina+thickness+and+dengue-1+virus+dissemination+rates+in+laboratory+strains+of+Aedes+albopictus+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae).</a> J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).</li>
<li>Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+infection+responses+in+the+haemocytes+of+the+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).</li>
<li>Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect+cellular+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">The insect cellular immune response.</a> Insect Sci. 15, 1-1 (2008).</li>
<li>Hillyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+mortality+in+immune+challenged+mosquitoes+%28Aedes+aegypti%29+correlates+with+a+decrease+in+haemocyte+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers.</a> Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).</li>
<li>Chen, C. C., Laurence, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+on+humoral+encapsulation+of+microfilariae%3A+establishment+of+technique+and+description+of+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction.</a> International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).</li>
<li>Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dirofilaria+immitis%3A+effects+on+hemolymph+polypeptide+synthesis+in+Aedes+aegypti+during+melanotic+encapsulation+reactions+against+Microfilariae%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae.</a> Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).</li>
<li>Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibacterial+innate+immune+response+by+the+mosquito+Aedes+aegypti+is+mediated+by+hemocytes+and+independent+of+Gram+type+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Infect%22%5BJournal%5D)">The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity.</a> Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).</li>
<li>Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hemocytes+from+the+mosquitoes+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Opisana tutaj metoda pobierania hemocytów stanowi modyfikację wcześniej opublikowanych metod i pozwala na wyizolowanie czystych preparatów hemocytów z komarów z rodzaju Aedes przy mniejszej liczbie etapów. Choć naszym głównym celem jest charakterystyka populacji hemocytów u komarów Aedes, uważamy, że technikę tę można zastosować do innych grup komarów po przeprowadzeniu wstępnych prób w celu ustalenia odpowiednich objętości iniekcji. Nasz protokół wykorzystuje bufory przeciwzakrzepowe zamiast roztworu s...

<table><tbody><tr><td>Nazwa odczynnika</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi (opcjonalnie)</td></tr><tr><td>Pożywka Schneidera&amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Płódkowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0643</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw barwiący Hema3</td><td>Fisher Scientific</td><td>123-869</td><td></td></tr><tr><td>Igły szklane (borokrzemowe z włóknem)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF100-78-10</td><td>1.0mm O.D. i 0.78mm I.D.</td></tr><tr><td>Wytciągacz do igieł</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-87</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinkubator</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-PD</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do igieł</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-4</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół pobierania i barwienia hemocytów z komarów żółtej febry aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Komary są wektorami wielu patogenów wywołujących choroby, takich jak wirus żółtej febry, pasożyty malarii i nicienie filariozy. Laboratoria badają antypatogenne komponenty wrodzonego układu odpornościowego u gatunków wektorów chorób w nadziei na stworzenie transgenicznych komarów opornych na takie patogeny1, 2. Wrodzony układ odpornościowy komarów składa się z kilku linii obrony 3. Patogeny, którym udaje się pokonać barierę tworzoną przez wyścielone nabłonkiem jelito środkowe komara 4, przedostają się do hemolimfy i napotykają krążące hemocyty – istotne komponenty komórkowe, które otaczają i pochłaniają patogeny 5, 6. Badacze nie znaleźli dowodów na istnienie tkanek krwiotwórczych u komarów, a obecne dane sugerują, że liczba hemocytów jest stała w momencie pojawienia się postaci dorosłej i może wręcz spadać wraz z wiekiem komara 7. Zdolność do prawidłowego pobierania i identyfikacji hemocytów z owadów o znaczeniu medycznym jest kluczowym etapem badań nad odpornością komórkową. Jednak niewielki rozmiar komarów i ograniczona objętość hemolimfy stanowią wyzwanie w procesie pozyskiwania komórek odpornościowych. 
Dwie uznane metody pobierania hemocytów komarów obejmują wypychanie hemolimfy z przeciętego proboscis 8 oraz przemieszczanie objętościowe (perfuzję), w której roztwór soli fizjologicznej wstrzykuje się w błoniasty obszar szyjny między głową a klatką piersiową (tj. cervix), a perfundowaną hemolimfę zbiera się z nacięcia w dystalnym regionie odwłoka 9, 10. Techniki te są jednak ograniczone odpowiednio przez niską wydajność odzysku hemocytów oraz możliwe zanieczyszczenie komórkami ciała tłuszczowego 11. W ostatnim czasie metoda określana jako high injection/recovery poprawiła odzysk immunocytów dzięki zastosowaniu buforów przeciwzakrzepowych, przy jednoczesnym zmniejszeniu poziomu zanieczyszczeń w postaci łusek i tkanek wewnętrznych 11. Choć metoda ta pozwala na lepsze pobieranie i utrzymywanie hemocytów do hodowli pierwotnych, wiąże się z szeregiem etapów wstrzykiwania i zbierania, które nie są konieczne, jeśli celem końcowym jest pobranie, utrwalenie i barwienie hemocytów do celów diagnostycznych. W niniejszej pracy prezentujemy naszą metodę pobierania hemolimfy komarów, która łączy prostotę perfuzji, z wykorzystaniem buforów przeciwzakrzepowych zamiast roztworu soli fizjologicznej, z dokładnością technik high injection w celu izolacji czystych preparatów hemocytów u komarów z rodzaju Aedes.

Opisano uproszczoną, a zarazem dokładną metodę pobierania i barwienia hemocytów komarów. Nasza metoda łączy prostotę perfuzji z precyzją technik wysokociśnieniowych w celu wyizolowania czystych preparatów hemocytów u komarów z rodzaju Aedes. Metoda ta ułatwia badania wymagające wiedzy na temat typów hemocytów oraz ich liczebności.

Protokół pobierania i barwienia hemocytów z komarów żółtej febry Aedes aegypti

Komary są wektorami wielu patogenów wywołujących choroby, takich jak wirus żółtej febry, pasożyty malarii i nicienie filariozy. Laboratoria są ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pobranie i barwienie hemocytów z komarów. Jest to realizowane poprzez wstrzyknięcie niewielkiej objętości rozcieńczalnika przeciwzakrzepowego do schłodzonych komarów, aby poluzować przyczepienie hemocytów i wprowadzić wszystkie hemocyty do roztworu.Drugim krokiem procedury jest usunięcie odnóży, skrzydeł oraz końca odwłoka komara. W trzeciej kolejności, w oddzielnym miejscu na ciele komara, wstrzykuje się świeży rozcieńczalnik, aby rozpocząć proces perfuzji. Ostatnim krokiem jest skierowanie rozcieńczonej hemolimfy na przygotowany szkiełko przedmiotowe, aby zebrane hemocyty można było utrwalić i zabarwić.W rezultacie, dzięki podstawowej mikroskopii poślizgowej, można uzyskać wyniki wskazujące główne rodzaje i liczbę miejsc hemocytów występujących u badanego gatunku komarów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak profuzja, jest połączenie prostoty profuzji z dokładnością uzyskiwaną dzięki metodom wysokociśnieniowego wtryskiwania, przy jednoczesnym zmniejszeniu liczby etapów prowadzących do celu końcowego. Naszym celem jest zidentyfikowanie typów hemocytów oraz ich liczebności w odpowiedzi na wyzwania immunologiczne.Technikę tę demonstruje Amina Abdul Kum, studentka studiów licencjackich z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem protokołu należy przygotować roztwór rozcieńczający hemolimfę w aliquotach o objętości 1 ml. Przechowywać je w temperaturze -20 °C i nie zamrażać ponownie żadnej niewykorzystanej części aliquoty.Następnie na szkiełkach przedmiotowych o grubości 1 mm wyznaczyć okręgi o średnicy 1 cm. Należy przygotować jedno szkiełko na każdego komara. Przygotować wyciągnięte igły.Odłam końcówkę każdej wyciągniętej igły, aby stworzyć otwór. Zamocuj jedną igłę w uchwycie, który jest połączony z przewodami i elementami strzykawki mikroinjektora. Następnie usuń pęcherzyki powietrza z zespołu przewodów i uchwytu igły, używając oleju mineralnego.Należy pobrać olej mineralny do tej strzykawki ręcznej, upewniając się, że nie powstały w niej pęcherzyki powietrza. Pod igłą należy umieścić naczynie, aby zebrać ściekający olej. Otwórz tę część mikroinjektora, a następnie wprowadź do niej olej, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.Element ten przypina się do ręcznego strzykawki w taki sam sposób, jak do drugiej końcówki. Powoli wstrzyknij olej mineralny tak, aby przepłynął przez plastikową rurkę i usunął wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogą się w niej znajdować. Następnie ponownie napełnij górną część olejem mineralnym, aż zacznie on kapać.Następnie należy ponownie podłączyć to do szklanej strzykawki, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Potem należy wypełnić zmontowane elementy olejem mineralnym, aż wszystkie rurki igłowe i strzykawka zostaną całkowicie wypełnione. Mikroinżektor jest teraz gotowy do podawania rozcieńczalnika.Następnie należy przygotować zwierzęta, zaczynając od odessania 15 dorosłych samic do małego, litego pojemnika-klatki, który zostanie całkowicie zanurzony w lodzie. Komary zostają znieczulone w wyniku unieruchomienia przez zimno, co zazwyczaj trwa osiem minut lub krócej. Pojedynczego znieczulonego komara umieszcza się na szkiełku z wgłębieniem, w którym przeprowadzona zostanie mikroiniekcja.Pod mikroskopem nabierz 12 µL rozcieńczalnika hemolimfy do mikroinjektora. Delikatnie unieruchom komara pod mikroskopem za pomocą pęsety i wstrzyknij od 3 do 3,5 µL rozcieńczalnika. Brzuch napuchnie pomiędzy siódmym a ósmym segmentem odwłoka.Podczas wstrzykiwania rozcieńczalnika można zaszczepić trzy komary. Przed ponownym napełnieniem mikroinjektora należy umieścić wszystkie zaszczepione komary w czystym plastikowym kubku na lodzie, gdzie będą regenerować się przez około pięć minut. Podczas inkubacji przeciwzakrzepowy rozcieńczalnik usuwa hemocyty przylegające do tkanek wewnętrznych.Podczas gdy pierwsza partia zwierząt regeneruje się podczas inkubacji, zazwyczaj można wstrzyknąć kolejne trzy do pięciu komarów. Po upływie pięciu minut, gdy owady wciąż znajdują się w kubku, przygotuj wstrzyknięte komary, odcinając im kończyny, skrzydła oraz końce odwłoków na wysokości ósmego segmentu za pomocą mikronurzyczek. Należy uważać, aby nie odciąć kończyn i skrzydeł zbyt blisko klatki piersiowej lub hemo.Limp może uciec. Teraz należy umyć szkiełko z trawionym kręgiem w 70% etanolu i osuszyć je za pomocą chusteczki Kimwipe pod mikroskopem. Umieść jeden zdisekowany komar na zewnętrznej krawędzi wytrawionego kręgu.Napełnij mikroinkubator 12 µL świeżego rozcieńczalnika. Przytrzymaj komara pęsetą i wstrzyknij od 8 do 10 µL w boczną stronę mezotoraksu. Należy uważać, aby po tej iniekcji nie wstrzyknąć oleju mineralnego.Hemolimfa będzie zbierać się z odwłoka w obrębie narysowanego okręgu; delikatnie uciskaj odwłok pęsetą, aby skierować i wspomóc przepływ hemolimfy. Następnie pozostaw zebraną hemolimfę do wyschnięcia na szkiełku. Powinno to zająć około 10 minut.Następnie preparat jest gotowy do barwienia. Każny szkiełko należy zabarwić osobno za pomocą Hema three. Zanurz każde szkiełko w utrwalaczu pięć razy, na zaledwie jedną sekundę przy każdym zanurzeniu.Następnie wykonaj trzy jednosekundowe zanurzenia w roztworze pierwszym, a następnie w roztworze drugim. Teraz wypłucz samą tylną stronę szkiełka wodą dejonizowaną, nie wypłukując strony przedniej. Osusz przednią stronę i nałóż szkiełko nakrywką za pomocą medium montażowego, delikatnie dociskając szkiełko nakrywkę, aby medium całkowicie wypełniło przestrzeń nad barwioną tkanką.Teraz należy pozostawić preparat do wyschnięcia na minimum trzy godziny w celu uzyskania optymalnych wyników. Barwione hejocyty powinny zostać poddane obserwacji i obrazowaniu w ciągu dwóch tygodni od przygotowania. Komórki te, pobrane od dorosłych samic, zostały zidentyfikowane zgodnie z niniejszym protokołem.Pierwszy obraz przedstawia komórkę krwi typu prohemo, co wynika z jej kształtu oraz wysokiego stosunku jądra do cytoplazmy. Ten obraz przedstawia komórkę ENO, co wynika z jej kształtu i stosunku cytoplazmy do jądra. Na koniec, jest to komórka krwi typu granulocytarnego.Ma bardziej ziarnistą teksturę i kształt bardziej zbliżony do OID w porównaniu z poprzednimi metodami wysokiego wstrzykiwania. Protokół ten pozwolił na uzyskanie podobnej całkowitej liczby hemoocytów, a podobnie zidentyfikowano miejsca ziarniste jako najczęstszy typ komórek. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu jednej godziny dla około 15 do 20 komarów, jeśli jest prowadzona prawidłowo.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak prawidłowo wstrzyknąć komarom barwnik dent, jak pobrać ich hemosomal oraz jak przygotować hemosomal do wizualizacji i obrazowania.

a-protocol-for-collecting-staining-hemocytes-from-yellow-fever

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Protokół pobierania i barwienia hemocytów z komara żółtej febry Aedes aegypti

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie opornego na wirusa dengue, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom wirusowym u komarów. Niniejszy protokół ilustruje sposób badania stopnia zakażenia komarów wirusem dengue. Przedstawiono techniki namnażania wirusa w kulturze, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania miana wirusa w jelicie środkowym komara.

Protokół infekcji denga w komarach (A. aegypti) i określanie fenotypu infekcji

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie odpornego na malarię, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom Plasmodium w organizmie komara. Niniejszy protokół ilustruje sposób przeprowadzania analizy stopnia infekcji komarów przez Plasmodium. Przedstawiono techniki przygotowania hodowli gametocytów, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania mian wirusów w jelicie środkowym komara.

Protokół zakażania komarów *Plasmodium falciparum* i określania fenotypu zakażenia

Analizy czasowej i przestrzennej ekspresji genów odgrywają kluczową rolę w genomice funkcjonalnej. Hybrydyzacja in situ całego preparatu jest przydatna do określania lokalizacji transkryptów w obrębie tkanek i przedziałów subkomórkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół hybrydyzacji in situ z modyfikacjami dla konkretnych tkanek docelowych u komarów.

Hybrydyzacja in situ gruczołów ślinowych, jajników i embrionów komarów wektorowych

Hemocyty owadów pełnią wiele istotnych funkcji, zarówno immunologicznych, jak i nieimmunologicznych, na wszystkich etapach rozwoju owada. Nasza obecna wiedza na temat typów i funkcji hemocytów pochodzi z badań nad genetycznymi modelami owadów. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę izolacji, kwantyfikacji i wizualizacji hemocytów z dzikich gąsienic.

Prosty protokół ekstrakcji hemocytów z dzikich gąsienic

Wśród trzech rodzajów komarów, mianowicie Anopheles, Aedes oraz Culex, techniki fizycznego mapowania genomu opracowano jedynie dla Anopheles, którego przedstawiciele posiadają czytelne chromosomy politeniczne. W przypadku rodzajów Aedes i Culex mapowanie cytogenetyczne pozostaje jednak wyzwaniem ze względu na niską jakość chromosomów politenicznych. Przedstawiamy tutaj uniwersalny protokół otrzymywania wysokiej jakości preparatów chromosomów mitotycznych oraz zoptymalizowany protokół FISH dla...

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ na chromosomach mitotycznych komarów

Korzystając z dwóch metod do oszacowania ekspresji genów w głównych wyrostkach smakowych Aedes aegypti, zidentyfikowaliśmy zestaw genów przypuszczalnie leżących u podstaw reakcji neuronalnych na gorzkie i odpychające związki, zgodnie z badaniem elektrofizjologicznym.

Zapisy fizjologiczne i sekwencjonowanie RNA wyrostków smakowych komara Aedes aegypti wywołującego żółtą febrę

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

Opisana to oszczędzająca czas i miejsce metoda liczenia jaj i określania szybkości wylęgu poszczególnych komarów za pomocą 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych, co może znacznie zwiększyć skalę i szybkość testów płodności i płodności.

Ulepszony test płodności i płodności dla Aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (płytki EAgaL)

Celem tego protokołu jest dostarczanie komarom Aedes aegypti pokarmów pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków z krwi za pomocą sztucznego karmnika membranowego i precyzyjne określenie ilościowe ilości spożytego posiłku.

Karmienie i ilościowe oznaczanie krwi pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków u komarów Aedes aegypti

Tutaj prezentujemy protokół badania konkurencyjności godowej samców Aedes aegypti przy użyciu barwnika fluorescencyjnego jako markera. Samice komarów są narażone na kontakt zarówno z oznaczonymi, jak i nieoznaczonymi samcami w celu kopulacji. Po kryciu ich plemniki są badane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu określenia ich partnera godowego.

Wykorzystanie barwnika fluorescencyjnego, rodaminy B, do badania konkurencyjności godowej samców komarów Aedes aegypti

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół edycji genomu poprzez mikroiniekcję embrionalną u komara A. aegypti przy użyciu technologii CRISPR-Cas9.

Edycja genomu u komara Aedes aegypti z żółtą febrą przy użyciu CRISPR-Cas9

Naucz się zbierać i barwić hemocyty z komara Aedes aegypti metodą perfuzji z wysokim wstrzyknięciem. Technika ta umożliwia izolację czystych preparatów komórek krwi i badanie odpowiedzi immunologicznej.

Protokół pobierania i barwienia hemocytów z komarów żółtej febry Aedes aegypti

Przeglądaj więcej filmów