Protokół pobierania i barwienia hemocytów z komarów żółtej febry Aedes aegypti

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pobranie i barwienie hemocytów z komarów. Jest to realizowane poprzez wstrzyknięcie niewielkiej objętości rozcieńczalnika przeciwzakrzepowego do schłodzonych komarów, aby poluzować przyczepienie hemocytów i wprowadzić wszystkie hemocyty do roztworu.

Drugim krokiem procedury jest usunięcie odnóży, skrzydeł oraz końca odwłoka komara. W trzeciej kolejności, w oddzielnym miejscu na ciele komara, wstrzykuje się świeży rozcieńczalnik, aby rozpocząć proces perfuzji. Ostatnim krokiem jest skierowanie rozcieńczonej hemolimfy na przygotowany szkiełko przedmiotowe, aby zebrane hemocyty można było utrwalić i zabarwić.

W rezultacie, dzięki podstawowej mikroskopii poślizgowej, można uzyskać wyniki wskazujące główne rodzaje i liczbę miejsc hemocytów występujących u badanego gatunku komarów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak profuzja, jest połączenie prostoty profuzji z dokładnością uzyskiwaną dzięki metodom wysokociśnieniowego wtryskiwania, przy jednoczesnym zmniejszeniu liczby etapów prowadzących do celu końcowego. Naszym celem jest zidentyfikowanie typów hemocytów oraz ich liczebności w odpowiedzi na wyzwania immunologiczne.

Technikę tę demonstruje Amina Abdul Kum, studentka studiów licencjackich z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem protokołu należy przygotować roztwór rozcieńczający hemolimfę w aliquotach o objętości 1 ml. Przechowywać je w temperaturze -20 °C i nie zamrażać ponownie żadnej niewykorzystanej części aliquoty.

Następnie na szkiełkach przedmiotowych o grubości 1 mm wyznaczyć okręgi o średnicy 1 cm. Należy przygotować jedno szkiełko na każdego komara. Przygotować wyciągnięte igły.

Odłam końcówkę każdej wyciągniętej igły, aby stworzyć otwór. Zamocuj jedną igłę w uchwycie, który jest połączony z przewodami i elementami strzykawki mikroinjektora. Następnie usuń pęcherzyki powietrza z zespołu przewodów i uchwytu igły, używając oleju mineralnego.

Należy pobrać olej mineralny do tej strzykawki ręcznej, upewniając się, że nie powstały w niej pęcherzyki powietrza. Pod igłą należy umieścić naczynie, aby zebrać ściekający olej. Otwórz tę część mikroinjektora, a następnie wprowadź do niej olej, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.

Element ten przypina się do ręcznego strzykawki w taki sam sposób, jak do drugiej końcówki. Powoli wstrzyknij olej mineralny tak, aby przepłynął przez plastikową rurkę i usunął wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogą się w niej znajdować. Następnie ponownie napełnij górną część olejem mineralnym, aż zacznie on kapać.

Następnie należy ponownie podłączyć to do szklanej strzykawki, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Potem należy wypełnić zmontowane elementy olejem mineralnym, aż wszystkie rurki igłowe i strzykawka zostaną całkowicie wypełnione. Mikroinżektor jest teraz gotowy do podawania rozcieńczalnika.

Następnie należy przygotować zwierzęta, zaczynając od odessania 15 dorosłych samic do małego, litego pojemnika-klatki, który zostanie całkowicie zanurzony w lodzie. Komary zostają znieczulone w wyniku unieruchomienia przez zimno, co zazwyczaj trwa osiem minut lub krócej. Pojedynczego znieczulonego komara umieszcza się na szkiełku z wgłębieniem, w którym przeprowadzona zostanie mikroiniekcja.

Pod mikroskopem nabierz 12 µL rozcieńczalnika hemolimfy do mikroinjektora. Delikatnie unieruchom komara pod mikroskopem za pomocą pęsety i wstrzyknij od 3 do 3,5 µL rozcieńczalnika. Brzuch napuchnie pomiędzy siódmym a ósmym segmentem odwłoka.

Podczas wstrzykiwania rozcieńczalnika można zaszczepić trzy komary. Przed ponownym napełnieniem mikroinjektora należy umieścić wszystkie zaszczepione komary w czystym plastikowym kubku na lodzie, gdzie będą regenerować się przez około pięć minut. Podczas inkubacji przeciwzakrzepowy rozcieńczalnik usuwa hemocyty przylegające do tkanek wewnętrznych.

Podczas gdy pierwsza partia zwierząt regeneruje się podczas inkubacji, zazwyczaj można wstrzyknąć kolejne trzy do pięciu komarów. Po upływie pięciu minut, gdy owady wciąż znajdują się w kubku, przygotuj wstrzyknięte komary, odcinając im kończyny, skrzydła oraz końce odwłoków na wysokości ósmego segmentu za pomocą mikronurzyczek. Należy uważać, aby nie odciąć kończyn i skrzydeł zbyt blisko klatki piersiowej lub hemo.

Limp może uciec. Teraz należy umyć szkiełko z trawionym kręgiem w 70% etanolu i osuszyć je za pomocą chusteczki Kimwipe pod mikroskopem. Umieść jeden zdisekowany komar na zewnętrznej krawędzi wytrawionego kręgu.

Napełnij mikroinkubator 12 µL świeżego rozcieńczalnika. Przytrzymaj komara pęsetą i wstrzyknij od 8 do 10 µL w boczną stronę mezotoraksu. Należy uważać, aby po tej iniekcji nie wstrzyknąć oleju mineralnego.

Hemolimfa będzie zbierać się z odwłoka w obrębie narysowanego okręgu; delikatnie uciskaj odwłok pęsetą, aby skierować i wspomóc przepływ hemolimfy. Następnie pozostaw zebraną hemolimfę do wyschnięcia na szkiełku. Powinno to zająć około 10 minut.

Następnie preparat jest gotowy do barwienia. Każny szkiełko należy zabarwić osobno za pomocą Hema three. Zanurz każde szkiełko w utrwalaczu pięć razy, na zaledwie jedną sekundę przy każdym zanurzeniu.

Następnie wykonaj trzy jednosekundowe zanurzenia w roztworze pierwszym, a następnie w roztworze drugim. Teraz wypłucz samą tylną stronę szkiełka wodą dejonizowaną, nie wypłukując strony przedniej. Osusz przednią stronę i nałóż szkiełko nakrywką za pomocą medium montażowego, delikatnie dociskając szkiełko nakrywkę, aby medium całkowicie wypełniło przestrzeń nad barwioną tkanką.

Teraz należy pozostawić preparat do wyschnięcia na minimum trzy godziny w celu uzyskania optymalnych wyników. Barwione hejocyty powinny zostać poddane obserwacji i obrazowaniu w ciągu dwóch tygodni od przygotowania. Komórki te, pobrane od dorosłych samic, zostały zidentyfikowane zgodnie z niniejszym protokołem.

Pierwszy obraz przedstawia komórkę krwi typu prohemo, co wynika z jej kształtu oraz wysokiego stosunku jądra do cytoplazmy. Ten obraz przedstawia komórkę ENO, co wynika z jej kształtu i stosunku cytoplazmy do jądra. Na koniec, jest to komórka krwi typu granulocytarnego.

Ma bardziej ziarnistą teksturę i kształt bardziej zbliżony do OID w porównaniu z poprzednimi metodami wysokiego wstrzykiwania. Protokół ten pozwolił na uzyskanie podobnej całkowitej liczby hemoocytów, a podobnie zidentyfikowano miejsca ziarniste jako najczęstszy typ komórek. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu jednej godziny dla około 15 do 20 komarów, jeśli jest prowadzona prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak prawidłowo wstrzyknąć komarom barwnik dent, jak pobrać ich hemosomal oraz jak przygotować hemosomal do wizualizacji i obrazowania.