Name: Określanie profili ekspresji genetycznej u C. elegans za pomocą mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj analizę profili ekspresji genów u C. elegans za pomocą mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym. Metoda obejmuje izolację mRNA, syntezę cDNA, hybrydyzację oraz walidację wyników bioinformatycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta została wykonana przez studentów studiów licencjackich na Southwestern Oklahoma State University w Weatherford, OK. Praca została wsparta przez NSF RUI-0963258, NIH OK-INBRE 2P20RR016478, GCAT oraz OCAST HR09-137S.
Mutant vsm1(ok1468) został wyizolowany przez Oklahoma Gene Knockout Consortium. 
Autorzy dziękują Danowi Stefanovicowi i Tannerowi Wheelerowi za cenną pomoc podczas realizacji projektu.

<ol><li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hVAPB%2C+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans%2C+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li>
<li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved%2C+secreted%2C+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li>
<li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li>
<li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li>
<li>Viñuela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li>
<li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li>
<li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF%2C+a+conserved+stem+cell+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li>
<li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym badaniu opracowano prosty i intuicyjny protokół, który może być wykorzystywany do określania profili ekspresji genów leżących u podłoża różnych zjawisk biologicznych. W ramach tego protokołu w pierwszej kolejności wyizolowano całkowite RNA, a następnie poddano je działaniu DNazy I. Nasza metoda izolacji RNA została znacząco uproszczona poprzez pominięcie ekstrakcji fenolem i zastosowanie żywic powinowactwa do oczyszczania 5,6. W skrócie, kutykula i błony komórkowe C. elegans zostały rozbite poprzez zamrożenie nicieni w ciekłym azocie i rozcieranie z żywicą molekularną. Następnie, przed syntezą cDNA, wyekstrahowane RNA poddano działaniu DNazy I. Ten ostatni etap dodano w celu zminimalizowania nieswoistych hybrydyzacji; próbki RNA zanieczyszczone DNA genomowym mogłyby wprowadzić zakłócenia i spowodować liczne wyniki fałszywie dodatnie. Następnie cDNA typu dzikiego oraz mutanta vsm-1(ok1468) oznakowano sekwencjami przechwytującymi Cy3 i Cy5, a następnie zhybrydyzowano na mikroarrays C. elegans otrzymanych w ramach programu GCAT. System ten jest bardziej czuły niż podobne produkty, a jego dwukolorowa konstrukcja zmniejsza liczbę potrzebnych macierzy, co przekłada się na większą oszczędność czasu i kosztów 7,8. Ponadto system ten nie wymaga specjalistycznego sprzętu charakterystycznego dla innych podobnych układów; w związku z tym procedurę tę można przeprowadzić w każdych standardowych warunkach laboratoryjnych 7. Po trzecie, obrazy fluorescencyjnych zhybrydyzowanych macierzy przeanalizowano przy użyciu oprogramowania open source MAGICTool, na podstawie czego stworzono profile ekspresji genów. MAGICTool to intuicyjny program, z którego mogą z łatwością korzystać osoby na każdym poziomie doświadczenia, od studentów studiów licencjackich po stażystów podoktorskich. Optymalna wydajność wymaga jednak dużej dostępnej pamięci operacyjnej. Na koniec, geny kandydackie wyłonione w analizie mikroarrays zwalidowano za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. 
Chociaż podejście genomowe jest wydajną metodą badania zjawisk biologicznych, istnieją pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę. Po pierwsze, pomimo swoistości tego protokołu mikromacierzy, transkrypty w obrębie jednej rodziny są od siebie nieodróżnialne, jeśli wydrukowany oligonukleotyd pochodzi z sekwencji konserwowanych. PCR w czasie rzeczywistym kompensuje podobieństwa w obrębie rodziny genów, a nawet może rozróżniać konkretne izoformy tego samego genu. Jednakże w przypadku PCR w czasie rzeczywistym wyzwaniem jest znalezienie rzeczywistych kontroli, które są wyrażane równomiernie przez cały okres życia organizmu. Z tego powodu wyniki będą miały charakter relatywny. Alternatywą dla naszej techniki jest podejście proteomiczne. Poszczególne białka można wyizolować za pomocą elektroforezy żelowej 2D i zidentyfikować przy użyciu spektrometrii mas.
Nasze badania wykazują w szczególności, że wiele białek z rodziny Major Sperm Protein (MSP) ulega indukcji u mutantów nicieni vsm-1 o zwiększonej gęstości synaptycznej. Białka MSP występują wyłącznie u C. elegans i odpowiadają za dojrzewanie oocytów oraz owulację. Chai 1 wykazał, że regulacja liczby i wielkości wypustek presynaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych u muszek owocówek jest prawdopodobnie kontrolowana przez cząsteczki zawierające domeny Major Sperm Protein. Badania przeprowadzone przez Tsudę i współpracowników 2 wykazały, że domeny Major Sperm Protein mogą służyć jako ligandy dla receptorów efryny, wyzwalając kaskady sygnalizacyjne kinaz tyrozynowych. Ponadto analiza czasu rzeczywistego PCR potwierdziła i zawęziła wyniki mikroarray do jednego członka rodziny msp, mianowicie msp-32. Podsumowując, zaprezentowana tutaj praca stanowi analizę całego genomu w odniesieniu do kluczowego dylematu neuronauki, a także dowód na potencjał badań prowadzonych przez studentów w wysiłkach naukowych.

<table><tbody><tr><td>RNA Later</td><td>Ambion</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>Żywica do rozcierania molekularnego</td><td>G-Biosciences</td><td>786-138</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza LE wolna od RNaz</td><td>Ambion</td><td>AM9040</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do przygotowania i prowadzenia żelu NorthernMax Gly 10X</td><td>Ambion</td><td>8678</td><td></td></tr><tr><td>Marker RNA Millenium</td><td>Ambion</td><td>AM7150</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik do nakładania próbek z gliksalem</td><td>Ambion</td><td>8551</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNaza</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Enzym RT i 5X bufor reakcyjny</td><td>Genisphere</td><td>RT300320</td><td></td></tr><tr><td>Array 350</td><td>Genisphere</td><td>W300180</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>VWR international</td><td>82021-4846</td><td></td></tr><tr><td>Fragmentowane DNA sperm łososia</td><td>Ambion</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór SDS</td><td>Promega Corp.</td><td>V6551</td><td></td></tr><tr><td>DTT EM</td><td>VWR international</td><td>3860</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA iScript</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8880</td><td></td></tr></tbody></table>

wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w c. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i pcr w czasie rzeczywistym

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapsy składają się z presynaptycznej strefy aktywnej w komórce sygnałowej oraz terminala postsynaptycznego w komórce docelowej. W przypadku synaps chemicznych sygnały są przenoszone przez neuroprzekaźniki uwalniane z terminali presynaptycznych i odbierane przez receptory w komórkach postsynaptycznych. Nasze poprzednie badania na Caenorhabditis elegans wykazały, że VSM-1 negatywnie reguluje egzocytozę. Ponadto analiza synaps u mutantów vsm-1 wykazała, że zwierzęta pozbawione w pełni funkcjonalnego VSM-1 wykazują zwiększoną łączność synaptyczną. Na podstawie tych wstępnych wyników wysunęliśmy hipotezę, że VSM-1 u C. elegans może odgrywać kluczową rolę w synaptogenezie. Aby sprawdzić tę hipotezę, przeprowadzono analizę mikromacierzy z podwójnym znakowaniem i określono profile ekspresji genów. Najpierw wyizolowano całkowite RNA, poddano je odwrotnej transkrypcji do cDNA, a następnie zhybrydyzowano z mikromacierzami DNA. Następnie analiza in-silico hybrydyzacji sond fluorescencyjnych ujawniła istotną indukcję wielu genów kodujących białka z rodziny głównych białek plemników (MSP) u mutantów ze wzmocnioną synaptogenezą. Białka MSP są głównym składnikiem plemników u C. elegans i wydają się sygnalizować dojrzewanie oocytów oraz owulację u nicieni. U muszek owocówek Chai i współpracownicy 1 wykazali, że cząsteczki podobne do MSP regulują liczbę i rozmiar wypustek (boutonów) presynaptycznych w złączu nerwowomięśniowym. Co więcej, analiza przeprowadzona przez Tsudę i współpracowników 2 zasugerowała, że białka MSP mogą działać jako ligandy dla receptorów Eph i uruchamiać kaskady sygnalizacyjne kinaz tyrozynowych receptorowych. Na koniec analiza PCR w czasie rzeczywistym potwierdziła, że gen kodujący MSP-32 jest indukowany u mutantów vsm-1(ok1468). Podsumowując, badania przeprowadzone w naszym laboratorium wykazały, że mutanty vsm-1 wykazują znaczny wzrost gęstości synaptycznej, co może być pośredniczone przez sygnalizację MSP-32.

Przeprowadzono analizę mikromacierzy w celu określenia profili ekspresji genów u C. elegans, a w celu walidacji i kwantyfikacji danych z mikromacierzy zastosowano reakcję PCR w czasie rzeczywistym.

Wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w C. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

Synapsy składają się z presynaptycznej strefy aktywnej w komórce sygnałowej oraz terminala postsynaptycznego w komórce docelowej. W przypadku synaps chemicznych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie profili ekspresji genów leżących u podstaw licznych fenotypów lub szlaków metabolicznych. Osiąga się to poprzez uprzednią izolację mRNA z dwóch kontrastujących szczepów nicieni. Drugim krokiem procedury jest synteza cDNA zawierającego sekwencje przechwytujące S S I three lub SFI i ich hybrydyzacja z mikromacierzą.Trzecim krokiem procedury jest hybrydyzacja mikromacierzy z sekwencjami anty-wychwytującymi zawierającymi S SI three oraz fluorofory SCIFI. Ostatnim etapem procedury jest skanowanie mikromacierzy i analiza danych przy użyciu narzędzi bioinformatycznych, takich jak oprogramowanie magic tool. W końcowej fazie identyfikuje się geny kandydackie pośredniczące w badanym zjawisku biologicznym, które mogą zostać zwalidowane i ilościowo określone za pomocą alternatywnych technik, takich jak real-time PCR.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ naniesione nukleotydy są niewidoczne dla użytkownika, co utrudnia nałożenie jednorodnej mieszaniny hybrydyzacyjnej na ponad 23 000 unikalnie wydrukowanych nukleotydów. Należy rozpocząć od wyizolowania RNA z zdrowych, zsynchronizowanych nicieni. Najpierw są one przemywane, zawieszone w probówkach o pojemności 15 ml i odwirowane; osady z nicieni są następnie resuspendowane w 7 ml 0,1 M NaCl oraz 7 ml lodowatej, 60% (m/v) sacharozy.Po 15 minutowej inkubacji w lodzie robaki są ponownie wirowane w celu uzyskania osadu. Obecnie wolne od bakterii nicienie wypłyną na powierzchnię, zostaną zebrane, przemyte wodą wolną od RNaz i ponownie ocenione. Następnie czysty, luźno zbity osad przenosi się do probówki do mikrocentryfugi i wiruje z maksymalną prędkością przez 30 sekund.Odessać i przechowywać w 10 objętościach odczynnika RNA later w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu rozpoczęcia dalszych prac. Aby przygotować próbki całkowitego RNA, odwirować przygotowane osady z maksymalną prędkością, odrzucić supernat i dodać do osadu szczyptę molekularnej żywicy rozcierającej. Następnie zamrozić mieszaninę ciekłym azotem i rozetrzeć za pomocą tłuczka.Rozetrzeć zamrożoną zawiesinę nicieni na drobny proszek, dodając w razie potrzeby ciekły azot, aby utrzymać niską temperaturę proszku po rozcieraniu. Umieścić ekstrakt na lodzie na pięć minut. Po pięciu minutach zmieszać ekstrakt z 700 µL R-L-T-B-M-E oraz 472 µL 100% ethanol.RNA można obecnie izolować za pomocą dostępnego komercyjnie zestawu do końcowej objętości 60 µL izolowanego RNA na próbkę biologiczną. Przed przejściem do kolejnych etapów należy usunąć potencjalne zanieczyszczenie genomicznym DNA poprzez traktowanie próbek DNase I, a następnie zastosowanie dostępnego komercyjnie zestawu do oczyszczania RNA. Procedurę z zestawu należy zakończyć, dążąc do uzyskania objętości 60 µL.Na koniec należy oznaczyć stężenie RNA oraz ocenić jego integralność poprzez obróbkę barwnikiem do nakładania próbek z gliksalem i analizę w żelu przed hybrydyzacją mikromacierzy. Przy użyciu konwencjonalnych metod oczyszczone RNA poddaje się odwrotnej transkrypcji do komplementarnego DNA, które następnie oczyszcza się z zdegradowanej matrycy za pomocą dostępnego komercyjnie zestawu i doprowadza do objętości 60 µL. Hybrydyzację mikromacierzy należy rozpocząć od blokowania szkiełek mikromacierzy za pomocą sonikowanego DNA z plemników łososia. Po godzinie zablokowane szkiełka należy zanurzyć w wodzie dwukrotnie destylowanej i zakręcić w wirówce.Osusz preparaty w probówkach stożkowych o pojemności 50 ml, wyłożonych chusteczką typu Kimwipe. Następnie przygotuj dwukrotny (2x) bufor do hybrydyzacji na bazie formamidu. Najpierw podgrzej go do 55 °C przez 10 minut, aby całkowicie rozpuścić kryształy.Następnie odwiruj próbkę przez jedną minutę przy 10 000 gs. Dalej wymieszaj 25 µL CD NA z 25 µL buforu do hybrydyzacji, a następnie delikatnie potrząśnij mieszaniną. Teraz wykonaj krótkie wirowanie mieszaniny i inkubuj ją w temperaturze 80 °C przez 10 minut.Po inkubacji ostrożnie nanieś całą próbkę cDNA na szkiełko do mikromacierzy za pomocą pipety, uważając, aby nie dotknąć powierzchni szkiełka. W celu równomiernego rozprowadzenia próbki na szkiełku do mikromacierzy, delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe, używając do tego igły strzykawki; zanim nakrywka całkowicie opadnie, unieś ją ponownie i ponownie opuść za pomocą igły, pozwalając szkiełku nakrywkowemu delikatnie osiąść na miejscu.Technika ta minimalizuje powstawanie pęcherzyków powietrza. Teraz należy umieścić preparat poziomo w probówce stożkowej o pojemności 50 ml, dodać 50 µl wody dwukrotnie destylowanej i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia, po krótkim przemyciu preparatu, przeprowadza się drugą hybrydyzację.W badaniu SSC drugi bufor, zawierający światłoczułe odczynniki przechwytujące oraz odczynnik Antifa, jest aplikowany wielokrotnie przy użyciu tej samej techniki, po czym następuje krótka inkubacja, kolejne etapy płukania oraz suszenie. Następnie preparat może zostać zeskanowany. Obrazy można analizować przy użyciu bezpłatnego oprogramowania z narzędziem open source magic tool.W zakładce projektu (project tab) utwórz i zapisz nowy projekt. W zakładce budowania profilu ekspresji (build expression profile tab) wybierz opcję załaduj parę obrazów (load image pair), a następnie przypisz plik obrazu czerwonego jako red i plik obrazu zielonego jako green. Następnie przejdź do zakładki budowania profilu ekspresji (build expression profile tab). Wybierz opcję załaduj listę genów (load gene list), aby przesłać plik z listą genów C. elegans pobrany ze strony internetowej GCAT w celu przypisania adresów i siatkowania obrazu mikromacierzy.Wybierz kartę „build expression profile” (buduj profil ekspresji) oraz opcję „create edit grid” (utwórz siatkę edycyjną). Następnie edytuj siatkę. W oknie dialogowym ustaw liczbę siatek na 48, 22 wiersze i 22 kolumny dla każdej siatki oraz wybierz numerację punktów od lewej do prawej i od góry do dołu.Zwiększ procentową zmianę kontrastu i powiększ widok siatki, aż poszczególne plamki staną się łatwo rozróżnialne. Utwórz siatki, wybierając opcję „set top left spot” (ustaw plamkę w lewym górnym rogu) w panelu po lewej stronie, a następnie klikając w środek plamki w lewym górnym rogu, następnie w plamkę w prawym górnym rogu i w dolny rząd w pierwszej siatce. Powtórz tę procedurę tworzenia siatek dla każdej z 48 siatek, postępując od lewej do prawej i od góry do dołu.Następnie zapisz dane, wybierając kartę pliku i opcję zapisz aktualną siatkę (save current grid as). Wybierz kartę ukończone (finished), aby wyeliminować z analizy wszelkie niepowiązane plamy. Otwórz kartę buduj profil ekspresji (build expression profile) i w opcjach adresowania siatki wybierz flagowanie plam (spot flagging).Następnie należy oznaczyć wszelkie smugi lub fluorescencję tła i zapisać zmiany, wybierając opcję save current flags. W zakładce file należy dokonać segmentacji plików z naniesionymi oznaczeniami. Na koniec, aby przeanalizować geny indukowane lub represowane przez określony czynnik, należy wybrać opcję explore w zakładce expression.W oknie dialogowym eksploracji ustaw kryteria dopasowania genów. Liczba dwukrotnych wzrostów lub spadków ekspresji. Intensywność jest określana jako x, a wartość X stanowi kryterium zmiany ekspresji.Wartość X jest wprowadzana jako wartość maksymalna większa niż X dla genów indukowanych oraz wartość minimalna mniejsza niż X dla genów represjonowanych. W tym doświadczeniu przeprowadzono kontrolę z zamianą barwnika (dye swap); dwie niezależne izolacje całkowitego RNA z larw w stadium trzecim i czwartym są hybrydyzowane jako zielony mutant kontra czerwony typ dziki, natomiast w drugiej próbie jako czerwony mutant kontra zielony typ dziki, aby potwierdzić zmiany w ekspresji genów. Wykonaj trzy niezależne izolacje całkowitego RNA stosując tę samą procedurę, zsyntetyzuj cDNA za pomocą dostępnego komercyjnie zestawu, a dla każdej próbki cDNA przeprowadź reakcję real-time PCR w trzech powtórzeniach, wykorzystując trzy geny housekeepingowe jako kontrole. W ramach demonstracji w poniższych wynikach analizowano indukcję ekspresji genów w VSM one.Mutanty AK 1468 to szczep nicieni charakteryzujący się zwiększoną liczbą synaps; przed przeprowadzeniem analizy mikromacierzy sprawdzana jest jakość wyekstrahowanego RNA za pomocą elektroforezy żelowej. Obecność dwóch nienaruszonych podjednostek rybosomalnych przed i po traktowaniu DNK-azą I świadczy o dobrej jakości próbki RNA w mikromacierzy; cDNA typu dzikiego jest znakowane na czerwono, a cDNA mutanta VSM 1 na zielono. W jednej z 48 siatek analizowanych w ramach jednej mikromacierzy każdy mały kwadrat reprezentuje pojedynczy naniesiony oligonukleotyd; w każdej macierzy reprezentowany jest każdy unikalny oligonukleotyd.Po tym, jak analiza mikromacierzy transkryptów wyizolowanych z larw w stadium czwartym wykazała, że geny kodujące główne białka plemników (MSP) są indukowane u mutantów VSM one, analiza mikromacierzy larw w stadium trzecim również ujawniła zmiany w ekspresji w obrębie tej samej rodziny genów u mutanta. Weryfikacja przewidywań z mikromacierzy za pomocą analizy real-time PCR wykazała, że jeden z członków rodziny genów MSP, MS P 32, jest indukowany u mutantów VSM one. Dane reprezentują średnią z trzech powtórzeń real-time PCR z tej samej kolekcji RNA.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat obsługi narzędzi bioinformatycznych do analizy w skali całego genomu, szczególnie biorąc pod uwagę liczne programy bioinformatyczne o otwartym kodzie źródłowym dostępne dla społeczności naukowej.

determining-genetic-expression-profiles-c-elegans-using-microarray

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oznaczanie profili ekspresji genów w C. elegans przy użyciu mikroarray i qPCR

Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) jest skutecznym narzędziem do diagnostyki poziomów mRNA w różnych tkankach i stadiach rozwojowych owadów. W niniejszym raporcie prezentujemy zastosowanie qRT-PCR do oznaczenia poziomów mRNA w różnych tkankach larwalnych oraz stadiach rozwojowych inwazyjnego gatunku owada – opiętka jesionowego.

Analiza ekspresji genów u opiętka jesionowego (Agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Opisujemy protokół z wykorzystaniem C. elegans oraz bibliotek RNAi dostarczanych drogą pokarmową, który umożliwia zautomatyzowany pomiar wielu parametrów, takich jak fluorescencja, rozmiar i nieprzezroczystość poszczególnych nicieni w populacji. Przedstawiamy przykład screeningu służącego do identyfikacji genów zaangażowanych w wrodzoną odporność przeciwgrzybiczą u C. elegans.

Ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe przesiewy RNAi w całym genomie u C. elegans

Ten film opisuje technikę szybkiego badania pojedynczego nicienia pod kątem markera genetycznego za pomocą badania przesiewowego PCR. W przykładowym protokole przeprowadzamy badania przesiewowe pod kątem edycji genomu opartej na CRISPR.

PCR z pojedynczym robakiem: metoda ekstrakcji i amplifikacji genomowego DNA

Ten protokół opisuje szybką i mało materiałochłonną procedurę integracji transgenicznych układów pozachromosomalnych z genomem Caenorhabditis elegans za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV). Co więcej, protokół ten jest szczególnie odpowiedni dla linii transgenicznych, które przesyłają macierze pozachromosomalne z dużą szybkością.

Szybki protokół integracji macierzy pozachromosomalnych o wysokiej szybkości transmisji z genomem C. elegans

Tutaj prezentujemy ramy do powiązania szeroko pojętych ograniczeń dietetycznych z ekspresją genów i długością życia. Opisujemy protokoły dotyczące szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych i ilościowego obrazowania ekspresji genów w ramach tego paradygmatu. Następnie przedstawiamy analizy obliczeniowe, aby ujawnić podstawowe cechy przetwarzania informacji w obwodach genetycznych zaangażowanych w wykrywanie żywności.

Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

W tym artykule opisany jest protokół o wysokiej przepustowości do szybkiego i niezawodnego określania poziomów ekspresji genów w pojedynczych lub zbiorczych próbkach C. elegans. Protokół ten nie wymaga izolacji RNA i wytwarza cDNA bezpośrednio z próbek. Może być używany razem z wysokoprzepustowymi, multipleksowanymi, nanofluidycznymi platformami qPCR w czasie rzeczywistym.

Wysokoprzepustowy ilościowy RT-PCR w pojedynczych i masowych próbkach C. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej

Ten protokół opisuje interferencję RNA i test ChIP w celu zbadania epigenetycznego dziedziczenia indukowanego przez RNAi wyciszania i związanych z nim modyfikacji chromatyny u C. elegans.

Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Protokół ten zapewnia metodę pomiaru częstotliwości i dystrybucji krzyżowania podczas mejozy u Caenorhabditis elegans. Do określenia pochodzenia chromosomów wykorzystano genotypowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Mapowanie 4-punktowe pozwoliło określić rozkłady krzyżowe regionów lewego, środkowego i prawego ramienia każdego chromosomu. ...

Częstotliwość i dystrybucja krzyżowania się w mejozie Caenorhabditis elegans za pomocą genotypowania SNP przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym

Poznaj analizę profili ekspresji genów u C. elegans za pomocą mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym. Metoda obejmuje izolację mRNA, syntezę cDNA, hybrydyzację oraz walidację wyników bioinformatycznych.

Wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w C. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów