Określanie profili ekspresji genetycznej u C. elegans za pomocą mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie profili ekspresji genów leżących u podstaw licznych fenotypów lub szlaków metabolicznych. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie mRNA z dwóch kontrastujących szczepów nicieni. Drugim krokiem procedury jest synteza CD NA zawierającej sekwencje wychwytywania S SI trzy lub SFI i hybrydyzacja ich do mikromacierzy.

Trzecim krokiem procedury jest hybrydyzacja mikromacierzy z sekwencjami anty wychwytywania zawierającymi trójkę S SI i czwórki fluorowe SCIFI. Ostatnim krokiem procedury jest zeskanowanie mikromacierzy i przeanalizowanie danych za pomocą narzędzi bioinformatycznych, takich jak oprogramowanie magic tool. Ostatecznie identyfikowane są geny kandydujące pośredniczące w badanym zjawisku biologicznym, które można zweryfikować i określić ilościowo za pomocą alternatywnych technik, takich jak PCR w czasie rzeczywistym.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały problemy, ponieważ zauważone nukleotydy nie są widoczne dla użytkownika, więc trudno jest nałożyć jednorodną mieszaninę hybrydyzacyjną na ponad 23 000. Unikalnie wydrukowane nukleotydy Zacznij od zebrania RNA ze zdrowych zsynchronizowanych nicieni. Najpierw są myte i ponownie zawieszane w 15-mililitrowych probówkach, a granulowane granulki robaków są ponownie zawieszane w siedmiu mililitrach 0,1-molowego chlorku sodu i siedmiu mililitrach lodowatej sacharozy o wadze 60% na objętość.

Po 15 minutach inkubacji na lodzie robaki są ponownie granulowane. Teraz robaki wolne od bakterii będą pływać, są zbierane, myte w RNA, wolnej wodzie i granulowane. Ponownie, czysty, luźno zagęszczony granulat jest przenoszony do mikroprobówki wirówkowej obracanej z maksymalną prędkością przez 30 sekund.

Odessany i przechowywany w 10 tomach RNA później w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do kontynuowania. Aby przygotować całkowite próbki RNA, odwiruj przygotowane osadki z maksymalną prędkością, odrzuć supernat i dodaj szczyptę molekularnej żywicy mielącej do osadu. Następnie zamroź mieszankę za pomocą ciekłego azotu za pomocą tłuczka.

Zmiel zawiesinę zamrożonych robaków na drobny proszek z dodatkiem ciekłego azotu w razie potrzeby, aby proszek był zimny po zmieleniu. Połóż ekstrakt na lodzie na pięć minut. Po pięciu minutach wymieszaj ekstrakt z 700 mikrolitrami R-L-T-B-M-E i 472 mikrolitrami 100% etanolu ogółem.

RNA można teraz wyizolować za pomocą dostępnego na rynku zestawu do końcowej objętości 60 mikrolitrów izolowanego RNA na próbkę biologiczną. Przed kontynuowaniem należy usunąć potencjalne zanieczyszczenie genomowego DNA, traktując je DNAS, a następnie użyć dostępnego na rynku zestawu do czyszczenia RNA. Uzupełnij zestaw, nawiązując do objętości 60 mikrolitrów.

Na koniec określ stężenie RNA i oceń integralność RNA poprzez traktowanie obciążeniem próbki glioksalu, analizą barwnika i żelu przed hybrydyzacją mikromacierzy Przy użyciu konwencjonalnych metod oczyszczony RNA jest odwrócony transkrybowany na uzupełniające DNA, które jest oczyszczane ze zdegradowanej matrycy za pomocą dostępnego na rynku zestawu i przypisywane do objętości 60 mikrolitrów. Rozpocznij hybrydyzację mikromacierzy od zablokowania morskiej elegancji. Szkiełka mikromacierzy z sonikowanym DNA plemników łososia Po godzinie przechyl zablokowane szkiełka do podwójnie destylowanej wody i odwiruj.

Wysuszyć szkiełka w 50-mililitrowych stożkowych rurkach wyściełanych chusteczką kim. Teraz przygotuj bufor hybrydyzacyjny na bazie dwóch form amidów. Najpierw podgrzej go do 55 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby całkowicie rozpuścić jego kryształy.

Następnie odwiruj go przez minutę w temperaturze 10 000 g. Następnie wymieszaj 25 mikrolitrów CD NA z 25 mikrolitrami buforu hybrydyzacyjnego i delikatnie strzepnij mieszaninę. Teraz szybko zakręć mieszanką i inkubuj ją w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Po inkubacji ostrożnie odpipetować całą próbkę CDNA na szkiełko do mikromatrycy, nie dotykając szkiełka. Aby równomiernie rozprowadzić próbkę na szkiełku mikromacierzy. Delikatnie opuścić szkiełko nakrywkowe na szkiełko za pomocą igły strzykawkowej, zanim szkiełko nakrywkowe zostanie całkowicie opuszczone, pociągnąć z powrotem do góry i ponownie opuścić igłę, pozwalając, aby szkiełko nakrywkowe delikatnie opadło na miejsce.

Ta technika minimalizuje tworzenie się pęcherzyków powietrza. Teraz umieść szkiełko poziomo w stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów poniżej szkiełka na 50 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody i pozostaw do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia. Drugą hybrydyzację przeprowadza się krótko po umyciu szkiełka.

Wielokrotnie w SSC, drugi bufor, który zawiera światłoczułe odczynniki wychwytujące i odczynnik Antify, jest nakładany przy użyciu tej samej techniki, po czym następuje krótka inkubacja, kolejne płukanie i suszenie. Slajd można następnie zeskanować. Obrazy można analizować za pomocą bezpłatnego oprogramowania z magicznym narzędziem typu open source.

Krótko na karcie projektu utwórz i zapisz nowy projekt na karcie profilu wyrażenia kompilacji, wybierz pozycję Załaduj parę obrazów i wybierz czerwony plik obrazu jako czerwony i zielony plik obrazu jako zielony. Następnie wybierz kartę profilu wyrażenia kompilacji. Wybierz opcję załaduj listę genów, aby przesłać plik z listą genów elegancji C uzyskany ze strony internetowej GCAT w celu zaadresowania i umieszczenia w siatce obrazu mikromacierzy.

Wybierz kartę profilu wyrażenia kompilacji i utwórz opcję edycji siatki. Teraz edytuj siatkę. Skonfiguruj okno dialogowe, używając 48 dla liczby siatek, 22 wierszy i 22 kolumn dla każdej siatki i wybierając numerację miejsc od lewej do prawej i od góry do dołu.

Zwiększ procentową zmianę kontrastu i powiększ siatkę, aż poszczególne punkty będą łatwe do odróżnienia. Utwórz siatki, wybierając opcję ustaw lewy górny punkt na lewym panelu, a następnie klikając środek lewego górnego miejsca, a następnie prawe górne miejsce i dolny wiersz na pierwszej siatce. Powtórz tę procedurę siatkowania dla każdej z 48 siatek, przechodząc od lewej do prawej i od góry do dołu.

Następnie zapisz, wybierając zakładkę Plik i zapisz bieżącą siatkę jako raz zapisaną. Wybierz zakładkę Gotowe, aby wyeliminować wszystkie niepowiązane miejsca z analizy. Otwórz kartę profilu wyrażenia kompilacji i w obszarze opcji siatki adresowania wybierz pozycję flagowanie punktowe.

Teraz oznacz wszystkie smugi lub fluorescencję tła i zapisz, wybierając opcję Zapisz bieżące flagi. Podobnie jak w zakładce plik, oznaczone pliki powinny zostać podzielone na segmenty. Na koniec przeanalizuj geny indukowane lub tłumione przez określony czynnik, wybierając opcję Eksploruj na karcie wyrażenia.

W oknie dialogowym eksploracji ustaw kryteria dopasowania drobnych genów. Liczba dwukrotnych wzrostów lub spadków ekspresji. Intensywność jest znana jako x, a wartość X jest kryterium zmiany ekspresji.

X jest danymi wejściowymi poniżej maksymalnej wartości większej niż X dla genów indukowanych i wartości minimalnej mniejszej niż x dla genów stłumionych. W tym eksperymencie przeprowadza się kontrolę zamiany barwnika, dwie niezależne izolacje całkowitego RNA z larw etapu trzeciego i czwartego są hybrydyzowane jako zielony mutant kontra czerwony typ dziki, podczas gdy czerwony mutant kontra zielony typ dziki w celu potwierdzenia zmian ekspresji genów tworzą trzy niezależne izolacje całkowitego RNA przy użyciu tej samej procedury syntetyzują CDNA za pomocą komercyjnie dostępnego zestawu, i dla każdej próbki CD NA przeprowadzić PCR w czasie rzeczywistym i trzykrotnie, używając trzech genów porządkowych jako kontroli. W celu demonstracji, poniższe wyniki badają ekspresję genów indukowaną w VSM jeden.

AK 1468 mutuje szczep nicieni charakteryzujący się wzmocnioną synaptyką Przed wykonaniem analizy mikromacierzy jakość wyekstrahowanego RNA jest sprawdzana za pomocą elektroforezy żelowej. Obecność dwóch nienaruszonych podjednostek rybosomalnych przed i po jednym zabiegu DAZA wskazuje na dobrą próbkę RNA w mikromacierzy, CDNA typu dzikiego jest oznaczona na czerwono, a VSM jedna zmutowana CDNA jest oznaczona na zielono. W tej jednej z 48 siatek analizowanych na mikromacierz każdy mały kwadrat reprezentuje pojedynczy wydrukowany oligonukleotyd w każdej tablicy, każdy unikalny oligonukleotyd jest reprezentowany.

Gdy analiza mikromacierzy transkryptów wyizolowanych z larw czwartego stadium wykaże, że geny kodujące główne białka plemników lub MSP są indukowane w VSM jeden mutant, analiza mikromacierzy larw trzeciego stadium również ujawnia zmiany ekspresji w tej samej rodzinie genów w mutancie. Testowanie. Przewidywania z mikromacierzy za pomocą analizy PCR w czasie rzeczywistym ujawniają, że jeden członek rodziny genów M ms P, MS P 32, jest indukowany w mutantach VSM one. Dane reprezentują średnią z trzech powtórzeń PCR w czasie rzeczywistym z tej samej kolekcji RNA.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obchodzić się z narzędziami bioinformatycznymi do analizy całego genomu, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że istnieje wiele programów bioinformatycznych typu open source dostępnych dla społeczności naukowej.