Name: Analizy ilościowe wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusa grypy typu A przy użyciu uniwersalnych przeciwciał w prostych testach slot (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Poznaj metodę slot blot do ilościowej analizy hemaglutyniny i neuraminidazy wirusa grypy przy użyciu uniwersalnych przeciwciał. Technika ta umożliwia szybką i wrażliwą detekcję bez konieczności stosowania przeciwciał specyficznych dla szczepu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować pani Monice Tocchi za redakcyjną recenzję manuskryptu. AMH otrzymał wsparcie w formie stypendium z King Abdulaziz University za pośrednictwem Biura Kultury Arabii Saudyjskiej w Kanadzie.

<ol><li>Webster, R. G., Bean, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of influenza virus.</a> Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).</li>
<li>Skehel, J. J., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+binding+and+membrane+fusion+in+virus+entry%3A+the+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin.</a> Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).</li>
<li>Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+the+host+cell+on+standardisation+of+influenza+vaccine+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol+Stand%22%5BJournal%5D)">The influence of the host cell on standardisation of influenza vaccine potency.</a> Dev Biol Stand. 98, 183-188 (1999).</li>
<li>Sylte, M. J., Suarez, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+neuraminidase+as+a+vaccine+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Influenza neuraminidase as a vaccine antigen.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 333, 227-241 (2009).</li>
<li>Bright, R. A., Neuzil, K. M., Pervikov, Y., Palkonyay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+meeting+on+the+role+of+neuraminidase+in+inducing+protective+immunity+against+influenza+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">WHO meeting on the role of neuraminidase in inducing protective immunity against influenza infection.</a> Vaccine. 27, 6366-6369 (2008).</li>
<li>Chun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+antibodies+and+their+applications+to+the+quantitative+determination+of+virtually+all+subtypes+of+the+influenza+A+viral+hemagglutinins%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Universal antibodies and their applications to the quantitative determination of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins.</a> Vaccine. 26, 6068-6076 (2008).</li>
<li>Gravel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+analyses+of+virtually+all+subtypes+of+influenza+A+and+B+viral+neuraminidases+using+antibodies+targeting+the+universally+conserved+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative analyses of virtually all subtypes of influenza A and B viral neuraminidases using antibodies targeting the universally conserved sequences.</a> Vaccine. 28, 5774-5784 (2010).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slot+blot+for+the+detection+of+virtually+all+subtypes+of+the+influenza+A+viral+hemagglutinins+using+universal+antibodies+targeting+the+fusion+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A simple slot blot for the detection of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins using universal antibodies targeting the fusion peptide.</a> Nat Protoc. 5, 14-19 (2010).</li>
<li>Harvey, R., Wheeler, J. X., Wallis, C. L., Robertson, J. S., Engelhardt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+haemagglutinin+in+H5N1+influenza+viruses+reveals+low+haemagglutinin+content+of+vaccine+virus+NIBRG-14+%28H5N1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Quantitation of haemagglutinin in H5N1 influenza viruses reveals low haemagglutinin content of vaccine virus NIBRG-14 (H5N1).</a> Vaccine. 26, 6550-6554 (2008).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+deglycosylation+and+electrophoresis+to+the+quantification+of+influenza+viral+hemagglutinins+facilitating+the+production+of+2009+pandemic+influenza+%28H1N1%29+vaccines+at+multiple+manufacturing+sites+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China.</a> Biologicals. 38, 284-289 (2010).</li>
<li>Johansson, B. E., Pokorny, B. A., Tiso, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supplementation+of+conventional+trivalent+influenza+vaccine+with+purified+viral+N1+and+N2+neuraminidases+induces+a+balanced+immune+response+without+antigenic+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Supplementation of conventional trivalent influenza vaccine with purified viral N1 and N2 neuraminidases induces a balanced immune response without antigenic competition.</a> Vaccine. 20, 1670-1674 (2002).</li>
<li>Hashem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+antibodies+against+the+highly+conserved+influenza+fusion+peptide+cross-neutralize+several+subtypes+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">Universal antibodies against the highly conserved influenza fusion peptide cross-neutralize several subtypes of influenza A virus.</a> Biochem Biophys Res Comm. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Ilościowe oznaczenie wirusowej HA i NA grypy jest kluczowe dla badań i opracowywania szczepionek, ponieważ te dwa białka powierzchniowe są najważniejszymi komponentami wirusa indukującymi odpowiedzi immunologiczne6-11. Wcześniej opisane metody immunologiczne służące do wykrywania tych białek wymagają przeciwciał specyficznych dla danego szczepu. Prosta, powtarzalna i szybka metoda slot blot do ilościowego oznaczenia antygenów HA i NA opisana w niniejszej pracy jest odpowiednia dla wszystkich białek HA i NA wir...

An author's affiliation was omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/2784">Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays</a>.

Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

<table><tbody><tr><td>Aparat do mikrofiltracji Bio-Dot SF</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6542</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny Bio-Dot SF</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0161</td><td></td></tr><tr><td>Membrana transferowa Immobilon-FL (PVDF)</td><td>EMD Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>EMD Millipore</td><td>WP6111560</td><td></td></tr><tr><td>Film do chemiluminescencji BioMax Light</td><td>Kodak</td><td>178 8207</td><td></td></tr><tr><td>System dokumentacji żeli FluorChem</td><td>Alpha Innotech</td><td>29-008-1896X</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalne przeciwciała królicze przeciwko antygenom HA i NA</td><td></td><td>Uni-1 (HA)HCA-2, HCA-3 (NA)</td><td>Przeciwciała są dostępne poprzez MTA lub mogą zostać wytworzone przez zainteresowanych badaczy zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami&lt;sup&gt;6,7&lt;/sup&gt;. </td></tr><tr><td>Antygen referencyjny szczepionki przeciw grypie</td><td>CBER/FDA lub NIBSC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Próbki szczepionki przeciw grypie</td><td></td><td></td><td>Powszechnie dostępne w większości krajów</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U1250</td><td></td></tr><tr><td>Detergent Zwittergent 3-14</td><td>Calbiochem</td><td>693017</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Bloker do blotowania w postaci beztłuszczowego mleka w proszku</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoPure przeciwciała kozie anty-królicze IgG, (H+L), sprzężone z peroksydazą</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>Substrat SuperSignal West Dura Extended Duration</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>34075</td><td></td></tr></tbody></table>

analizy ilościowe wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusa grypy typu a z wykorzystaniem uniwersalnych przeciwciał w prostych testach slot blot

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemaglutynina (HA) i neuraminidaza (NA) to dwa białka powierzchniowe wirusów grypy, o których wiadomo, że odgrywają one istotną rolę w cyklu życiowym wirusa oraz w indukowaniu ochronnych odpowiedzi immunologicznych1,2. Jako główny cel dla przeciwciał neutralizujących, HA jest obecnie wykorzystywana jako marker mocy szczepionek przeciw grypie i jest mierzona za pomocą pojedynczej radialnej immunodyfuzji (SRID)3. Jednak zależność metody SRID od dostępności odpowiednich surowic specyficznych dla danego podtypu powoduje co najmniej 2-3 miesięczne opóźnienie w dopuszczeniu każdej nowej szczepionki do obrotu. Co więcej, mimo dowodów na to, że NA również indukuje odporność ochronną4, ilość NA w szczepionkach przeciw grypie nie jest jeszcze standaryzowana ze względu na brak odpowiednich odczynników lub metody analitycznej5. Zatem pożądane są proste, alternatywne metody zdolne do ilościowego oznaczania antygenów HA i NA, które umożliwiłyby szybsze dopuszczenie do obrotu oraz lepszą kontrolę jakości szczepionek przeciw grypie.
Uniwersalnie konserwowane regiony we wszystkich dostępnych sekwencjach HA i NA wirusa grypy typu A zidentyfikowano za pomocą analiz bioinformatycznych6-7. Jedna sekwencja (oznaczona jako Uni-1) została zidentyfikowana w jedynym uniwersalnie konserwowanym epitopie HA, czyli w peptydzie fuzyjnym6, natomiast dwie konserwowane sekwencje zidentyfikowano w neuraminidazach: jedną w pobliżu centrum aktywnego enzymu (oznaczoną jako HCA-2) i drugą w pobliżu N-końca (oznaczoną jako HCA-3)7. Peptydy o tych sekwencjach aminokwasowych zostały zsyntetyzowane i wykorzystane do immunizacji królików w celu produkcji przeciwciał. Przeciwciało przeciwko epitopowi Uni-1 HA było w stanie wiązać się z 13 podtypami HA grypy typu A (H1-H13), podczas gdy przeciwciała przeciwko regionom HCA-2 i HCA-3 NA były zdolne do wiązania wszystkich 9 podtypów NA. Wszystkie przeciwciała wykazały wyjątkową swoistość względem sekwencji wirusowych, co potwierdzono brakiem wykrytej reaktywności krzyżowej z białkami allantoicznymi. Te uniwersalne przeciwciała wykorzystano następnie do opracowania testów slot blot w celu ilościowego oznaczenia HA i NA w szczepionkach przeciwko grypie typu A bez konieczności stosowania specyficznych antyserów7,8. Próbki szczepionek naniesiono na membranę PVDF za pomocą aparatu do slot blotu wraz ze standardami referencyjnymi rozcieńczonymi do różnych stężeń. Do detekcji HA próbki i standard rozcieńczano najpierw w soli buforowanej trisem (TBS) zawierającej 4M mocznika, natomiast do pomiaru NA rozcieczano je w TBS zawierającym 0,01% Zwittergentu, ponieważ warunki te znacząco poprawiły czułość detekcji. Po wykryciu antygenów HA i NA metodą immunoblottingu z zastosowaniem odpowiednich przeciwciał uniwersalnych, intensywność sygnału określono za pomocą densytometrii. Ilości HA i NA w szczepionkach obliczono następnie przy użyciu krzywej wzorcowej sporządzonej na podstawie intensywności sygnałów dla różnych stężeń wykorzystanych referencji.
Biorąc pod uwagę, że przeciwciała te wiążą się z uniwersalnymi epitopami HA lub NA, zainteresowani badacze mogą wykorzystać je jako narzędzia badawcze w innych analizach immunoenzymatycznych niż tylko slot blot.

Opracowano prostą metodę slot blot do ilościowego oznaczania hemaglutyniny i neuraminidazy wirusa grypy przy użyciu uniwersalnych przeciwciał skierowanych przeciwko ich najbardziej konserwatywnym sekwencjom, zidentyfikowanym za pomocą analiz bioinformatycznych. To innowacyjne podejście może stanowić przydatną alternatywę dla ilościowego określania wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusowych.

Analizy ilościowe wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusa grypy typu A z wykorzystaniem uniwersalnych przeciwciał w prostych testach slot blot

Hemaglutynina (HA) i neuraminidaza (NA) to dwa białka powierzchniowe wirusów grypy, o których wiadomo, że odgrywają one istotne role w cyklu życiowym wirusa...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe oznaczenie zawartości hemaglutyniny i neuraminidazy wirusa grypy w szczepionkach przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom konserwatywnym. Jest to realizowane poprzez wstępną identyfikację epitopów konserwatywnych. Drugim krokiem procedury jest rozcieńczenie próbek referencyjnych i szczepionek w celu zwiększenia czułości detekcji.Trzecim krokiem jest złożenie aparatury do analizy slot blot oraz naniesienie próbek do slotów. Czwartym krokiem procedury jest detekcja HA lub NA na membranie przy użyciu odpowiednich przeciwciał uniwersalnych. Ostatnim krokiem procedury jest ilościowe określenie zawartości HA lub NA za pomocą densytometrii.W końcowym etapie można uzyskać wyniki wykazujące ilość HA lub NA wyznaczoną względem ich odpowiednich antygenów referencyjnych. Cześć, nazywam się Anwar Hashem. Jestem doktorantem w laboratorium dr. Seana Lee.Witajcie, nazywam się Caroline Grab i jestem technikiem w laboratorium dr. Seana Lee w Centrum Ewaluacji Szczepionek w Health Canada. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę z wykorzystaniem robota do slotów (slot bot), służącą do ilościowego oznaczania antygenów HA i NA wirusów grypy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pojedyncza dyfuzja immunoradialna (SRID) czy metody fizykochemiczne, jest fakt, że nie wymaga ona przeciwciał specyficznych dla szczepu lub podtypu, w przeciwieństwie do SRID, ani zaawansowanej aparatury, jak w przypadku metod fizykochemicznych.Ponadto, ponieważ przeciwciała te są skierowane przeciwko jedynym uniwersalnie konserwowanym epitopom RA, stanowią one przydatne narzędzia badawcze dla zainteresowanych naukowców. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności wynikające z problemów technicznych, takich jak trudności z blokowaniem wytrąconych próbek szczepionki, wycieki próbek między slotami i utrata próżni podczas etapu transferu (blottingu), a także wysokie tło w rozproszonych prążkach obserwowanych po detekcji immunologicznej. Jednakże zachowanie szczególnej uwagi na niektórych kluczowych etapach może pomóc w rozwiązaniu tych problemów.Dzisiaj zaprezentujemy Państwu tę procedurę. Zacznijmy zatem. Aby zidentyfikować regiony konserwatywne, wykorzystaliśmy dopasowania ClustalW do analizy łącznie ponad 6 000 sekwencji HA wirusa grypy A z bazy NCBI i ustaliliśmy, że wysoko konserwatywnym regionem jest koniec N podjednostki HA2.Obliczono entropię Shannona oraz stopień konserwacji dla każdej pozycji aminokwasowej zidentyfikowanych sekwencji konsensus. Epitop UNI jeden, zaznaczony na czerwono, został wybrany do opracowania uniwersalnego przeciwciała przeciwko HA na potrzeby analizy slot blot. Stosując podobne podejście, w obrębie wszystkich NA grypy A zidentyfikowano dwie uniwersalnie konserwowane sekwencje: jedną w pobliżu miejsca aktywnego enzymatycznie, a drugą na końcowym terminusie; peptydy o tych sekwencjach aminokwasowych zostały wykorzystane jako antygeny do generowania uniwersalnych przeciwciał przeciwko NA na potrzeby analizy slot blot.Przed rozpoczęciem procedury slot blot należy przygotować 20 mililitrów roztworu mocznika 4 M w TBS do analizy slot blot dla hemaglutyniny (HA) lub 20 mililitrów 0,01% roztworu ergenu w TBS do analizy slot blot dla neuraminidazy (NA). Następnie należy przygotować dwa litry buforu płukania, dodając roztwór TBS do uzyskania końcowego stężenia 0,1%. W kolejnym kroku należy przygotować 80 mililitrów buforu blokującego poprzez rozpuszczenie odtłuszczonego mleka w proszku do końcowego stężenia 5% w/v w buforze płukania. Aktywować membranę PDF i metanol przez 15 sekund, a następnie płukać przez dwie minuty w wodzie dwukrotnie destylowanej. Moczyć membranę w TBS do momentu użycia; wcześniej zwilżyć trzy arkusze papieru filtracyjnego T blot SF w TBS. Przygotować wzorce odniesienia szczepionki przeciw grypie o określonej zawartości HA, odpowiadające testowanym szczepom szczepionkowym.Pozyskano je z Center for Biologics Evaluation and Research w USA lub z National Institute for Biological Standard and Control w Wielkiej Brytanii i wykorzystano do ilościowego oznaczania HA lub NA metodą slot blot w przypadku referencyjnych antygenów HA oraz próbek badanych szczepionek. Należy przygotować 650 µl rozcieńczonego roztworu zapasowego referencyjnego antygenu HA w buforze TBS z 4 M mocznikiem w wymienionych stężeniach. Następnie przygotowuje się 650 µl próbek badanych szczepionek w buforze TBS z 4 M mocznikiem w trzech różnych rozcieńczeniach, takich jak 10x, 20x i 40x, aby uzyskać dwukrotną różnicę i sprawić, by stężenia próbek mieściły się w zakresie krzywej wzorcowej dla referencyjnych antygenów NA oraz próbek badanych szczepionek.Przygotować po 650 µL zapasów standardów antygenu NA w 0,01% suger TBS w wymienionych stężeniach; standardy antygenu zostały przygotowane wewnętrznie przy użyciu elektroforezy SDS-PAGE w połączeniu z analizami cytometrii gęstościowej. Następnie przygotować 650 µL próbek szczepionki testowej w 0,01% suger TBS w trzech różnych rozcieńczeniach: 10x, 20x i 40x, aby uzyskać dwukrotną różnicę i dopasować stężenie próbek do krzywej wzorcowej. Złożyć uprzednio oczyszczony i wysuszony aparat do mikrofiltracji bio SF, umieszczając płytkę wspierającą uszczelkę w kolektorze próżniowym, a na niej uszczelkę górną.Umieść trzy wilgotne arkusze papieru filtracyjnego BIO SF na uszczelce. Następnie połóż wcześniej namoczoną membranę PVDF. Na membranie umieść szablon do próbek, a następnie dokręć palcami cztery śruby, stosując wzór krzyżowy, aby zapewnić równomierny nacisk na powierzchnię membrany. Przed podłączeniem aparatury upewnij się, że zawór trójdrożny jest ustawiony tak, aby kolektor próżniowy był połączony ze źródłem próżni.Włącz pompę i podłącz aparat bio dot. Upewnij się, że zawór przepływowy znajduje się na poziomie poniżej dołków na próbki, aby zapewnić szybki i prawidłowy drenaż próbek w kolejnych krokach. Powtórz etap dokręcania śrub, stosując schemat krzyżowy.Dokręcenie śrub podczas przykładania próżni zapewnia szczelniejsze zamknięcie i zapobiega kontaminacji krzyżowej między dołkami. Następnie należy przestawić zawór przepływowy, aby wystawić kolektor próżniowy na działanie powietrza, i wyłączyć pompę. W kolejnym kroku, za pomocą pipety wielokanałowej, nanieść 100 µL TBS do wszystkich dołków w celu rehydratacji membrany.Nanieś roztwór na środek dołka, jak najbliżej dna, aby równomiernie pokryć szczelinę. Użyj czystego końcówki pipety, aby usunąć wprowadzone pęcherzyki powietrza. Przełącz zawór przepływu, aby wystawić kolektor zarówno na działanie powietrza, jak i próżni.Włącz pompę i ostrożnie odessij bufor z dołków, zakrywając palcem otwór wystawiony na działanie powietrza, aby regulować siłę próżni. Następnie przełącz zawór przepływu, aby wystawić kolektor na działanie powietrza, gdy tylko bufor zostanie całkowicie odessany ze wszystkich dołków.Wyłącz pompę lub odłącz próżnię. Nanieś 200 µL każdego standardu lub rozcieńczenia próbki szczepionki do każdego dołka. Pipetuj próbki pojedynczo w centrum każdego dołka, jak najbliżej dna.Należy zadbać o uniknięcie i usunięcie pęcherzyków powietrza. Do nieużywanych dołków należy wlać 200 µL buforu do rozcieńczania próbek, aby zapewnić odpowiednią próżnię w dołkach wykorzystywanych. Należy ustawić zawór przepływowy tak, aby rozdzielacz był wystawiony zarówno na działanie powietrza, jak i próżni.Włącz pompę próżniową i ostrożnie pozwól próbkom całkowicie spłynąć z dołków, kontrolując siłę próżni za pomocą palca przyłożonego do otworu wystawionego na działanie powietrza. Zabierz palec z otworu, aby zwolnić próżnię. Wykonaj kolejny krok niezwłocznie po spłynięciu wszystkich próbek.Do każdego dołka dodaj 200 µL TBS. Używając pipety wielokanałowej, zastosuj delikatne podciśnienie, aby opróżnić i przemyć dołki, kontrolując siłę ssania jednym palcem nad otworem wystawionym na działanie powietrza. Powtórz etap płukania raz, gdy tylko dołki zostaną całkowicie opróżnione, poluzuj śruby szablonu do próbek i wyłącz podciśnienie, aby uniknąć nadmiernego wysuszenia.Z dołków należy niezwłocznie wyjąć membranę i umieścić ją w buforze blokującym. Należy użyć wystarczającej ilości buforu, aby całkowicie przykryć membranę. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C przy delikatnym kołysaniu.Po inkubacji nocnej i zastosowaniu buforu blokującego, należy dwukrotnie przemyć membranę zgodnie z instrukcją, a następnie poddać ją kołysaniu podczas wszystkich etapów przemywania i inkubacji. Należy upewnić się, że membrana jest całkowicie przykryta roztworem.Następnie inkubować membranę z uniwersalnym przeciwciałem króliczym Uni-One przeciwko HA lub uniwersalnymi przeciwciałami HCA-2 lub HCA-3 przeciwko NA, rozcieńczonymi w 5% w/v BSA w buforze do płukania, przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej; w przypadku tych przeciwciał optymalne wyniki uzyskano przy rozcieńczeniu anty serum króliczego 1:4 000. Po tym etapie płukać membranę trzy razy w temperaturze pokojowej przy łagodnym kołysaniu, po 15 minut każdego razu. Następnie inkubować membranę z rozcieńczeniem 1:50 000 koziego przeciwciała anty-IgG sprzężonego z peroksydazą IgG w buforze blokującym przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym kołysaniu; po inkubacji płukać membranę w buforze do płukania trzy razy w temperaturze pokojowej, kołysząc przez 15 minut każdego razu.Następnie przemyć membranę buforem TBS przez pięć minut, delikatnie kołysząc, aby usunąć pozostałości detergentu Tween 20 z powierzchni membrany. Następnie przygotować substrat wywoływujący, używając trzech mililitrów każdego z odczynników z zestawu substratu o przedłużonym działaniu Super Signal West Dura, i dokładnie wymieszać. Umieścić membranę na suchym ręczniku papierowym, aby delikatnie usunąć nadmiar buforu TBS, przed przeniesieniem do suchego pojemnika i naniesieniem substratu. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc, a następnie usunąć nadmiar substratu poprzez odsączanie.Po zakończeniu naświetl membranę na film do chemiluminescencji. Czas naświetlania należy zoptymalizować, aby uniknąć nasycenia sygnału, jednak zazwyczaj wynosi on od 10 sekund do 10 minut. Analizę densytometryczną wywołanego filmu przeprowadzono za pomocą systemu dokumentacji flora chem gel zgodnie z instrukcjami producenta.Oblicz średnie wartości gęstości dla każdego zestawu powtórzeń antygenu referencyjnego oraz próbek szczepionki testowej. Do testów istotności i oceny błędu eksperymentalnego wymagane są zestawy potrójne. Przedstaw na wykresie średnie wartości gęstości w funkcji ilości antygenu HA lub NA w każdym gnieździe.Pobrane ze standardu referencyjnego. Przedstawiono tutaj czteroparametryczny model logistyczny dla testów immunoenzymatycznych, który wykorzystuje referencyjne stężenie i gęstość szczepionki do ekstrapolacji stężenia próbki na podstawie gęstości szczepionek w próbkach testowych, stosując podejście oparte na nieliniowej regresji krzywej ze zmiennym nachyleniem. Program Graph PRISM służy do wykreślania krzywych wzorcowych i wyznaczania stężeń z uzyskanych danych gęstości, zgodnie z powyższą ilustracją.Uniwersalne przeciwciało HA UNI one wykazało niezwykłą swoistość względem sekwencji wirusowych i jest zdolne do wiązania się z 13 różnymi podtypami grypy. HA wyekstrahowano z płynów z okolic nosogardzieli zarodkowych jaj kurzych zainfekowanych wirusem. Białko NP służy jako kontrola załadunku.Kontrolą negatywną jest płyn allantoiczny z niezinfekowanych jaj, a kontrolą pozytywną jest standard referencyjny H1 z NIBSC. Różnice zaobserwowane w mobilności białek HA wynikają prawdopodobnie ze zmienności ich wielkości i/lub etapu procesowania. Jak pokazano tutaj, przeciwciała HCA-2 i HCA-3 skierowane przeciwko obu konserwowanym epitopom NA były zdolne do wiązania się ze wszystkimi dziewięcioma podtypami NA i wykazywały bardzo niską reaktywność krzyżową z białkami allantoicznymi lub komórkowymi; kontrola białka P jest przedstawiona w panelu C. Kontrolą pozytywną jest płyn allantoiczny wzbogacony o RNA1 A/New Caledonia/20/99 i analizowany z użyciem odpowiadających mu antyser; kontrola białka NP jest przedstawiona na dole.Na tym obrazie przedstawiono reprezentatywne wyniki ilościowego oznaczania antygenu NA w standardzie referencyjnym szczepionki przeciw grypie oraz w próbkach szczepionki, analogiczne do wyników dla HA. Analiza gęstości wykazała, że intensywność sygnału uzyskanego podczas wykrywania antygenu NA w różnych rozcieńczeniach standardu referencyjnego szczepionki metodą slot blot jest proporcjonalna do stężenia na. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o wstępnym przygotowaniu próbek szczepionki w celu rozpuszczenia osadów i zapewnienia właściwego odpływu z otworu slotu.Należy również zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec wyciekowi próbek między dołkami. W przypadku każdego nowego przeciwciała użytego do detekcji może być konieczna optymalizacja rozcieńczeń przeciwciał oraz czasów inkubacji, aby uzyskać wyraźne sygnały o optymalnym natężeniu przy jednoczesnym zminimalizowaniu tła po jego wywołaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad szczepionkami przeciwko grypie.Dalsza przyszła analiza ilościowa antygenów HA i NA. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak oznaczają ilościowo ważne białka powierzchniowe wirusów grypy w prostych testach bez użycia przeciwciał specyficznych dla konkretnego szczepu.

quantitative-analyses-all-influenza-type-viral-hemagglutinins

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ilościowe analizy wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusa grypy typu A za pomocą uniwersalnych przeciwciał w prostych testach slot blot

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Ten film demonstruje technikę generowania wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy. Zawiesina wirusa zneutralizowanego przez przeciwciała jest wstrzykiwana do zarodków jaj kurzych w celu selektywnego rozmnażania wariantów ucieczki. W ten sposób powstaje populacja wirusa składająca się głównie z wariantów ucieczki, potwierdzonych za pomocą testu hemaglutynacji.

Wytwarzanie wariantów ucieczki wirusa grypy przeciwko przeciwciałom neutralizującym

Ten film pokazuje test mierzący miano przeciwciał influenza neuraminidazy (NA) w próbce surowicy. Próbkę surowicy zawierającą przeciwciała przeciwko NA dodaje się do płytki mikrodołkowej pokrytej fetuiną. Po dodaniu wirusa przeciwciała zapobiegają rozszczepianiu przez wirusa NA fetuiny i odsłanianiu jej ugrupowania galaktozy. Następnie dodaje się lektynę sprzężoną z peroksydazą, która wiąże się z odsłoniętą galaktozą. Miano przeciwciał hamujących NA określa się za pomocą testu...

Test do pomiaru miana przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy

Korzystając z drukowanej strategii mikromacierzy glikanowej, konwencjonalny test na 96-dołkowej płytce został zminiaturyzowany do analizy awidności hemaglutyniny wirusa grypy A i swoistości dla receptorów zawierających kwas sjalowy.

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Opisujemy test lektyny sprzężony z enzymem (ELLA) do pomiaru miana przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy (NA) w surowicach. Test wykorzystuje aglutyninę z orzeszków ziemnych do ilościowego określenia reszt galaktozy, które stają się dostępne, gdy NA usuwa kwas sjalowy z 96-dołkowych płytek pokrytych fetuiną.

Pomiar mian przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy za pomocą testu lektyny sprzężonej z enzymem

To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.

Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

Opisujemy użycie fenotypowego testu hamowania neuraminidazy opartego na fluorescencji do oceny podatności wirusów grypy A i B na inhibitory neuraminidazy klasy leków przeciwwirusowych.

Test hamowania neuraminidazy oparty na fluorescencji w celu oceny wrażliwości wirusów grypy na grupę inhibitorów neuraminidazy leków przeciwwirusowych

Przedstawione protokoły opisują, jak przeprowadzić test hamowania hemaglutynacji w celu ilościowego określenia miana przeciwciał specyficznych dla grypy z próbek surowicy biorców szczepionki przeciw grypie. Pierwszy test określa optymalne stężenia antygenu wirusowego za pomocą hemaglutynacji. Drugi test określa ilościowo miana przeciwciał swoistych dla grypy poprzez hamowanie hemaglutynacji.

Zoptymalizowany test hamowania hemaglutynacji (HI) do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy

Opisujemy metodę, za pomocą której identyfikujemy krytyczne pozostałości wymagane do wiązania ludzkich lub mysich przeciwciał monoklonalnych, które celują w wirusową hemaglutyninę wirusów grypy A. Protokół można dostosować do innych glikoprotein powierzchniowych wirusa i odpowiadających im przeciwciał neutralizujących.

Wytwarzanie wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy

Przeciwciała neutralizujące grypę korelują z ochroną przed infekcjami grypowymi. Testy mikroneutralizacji mierzą przeciwciała neutralizujące w surowicach ludzkich i są często stosowane w serologii grypy u ludzi. Opisujemy test mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1 do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących wobec współczesnych wirusów 3C.2a i 3C.3a A(H3N2) po szczepieniu lub zakażeniu grypą.

Pomiar odpowiedzi przeciwciał neutralizujących grypę na wirusy A(H3N2) w surowicach ludzkich za pomocą testów mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1

Przedstawiamy protokół użycia mikromatrycy białkowej zbudowanej przez drukowanie antygenów grypy na szkiełkach pokrytych nitrocelulozą do jednoczesnego sondowania surowicy pod kątem wielu izotypów przeciwciał przeciwko ponad 250 antygenom z różnych szczepów wirusa, umożliwiając w ten sposób pomiar szerokości przeciwciał w surowicy dla różnych podtypów wirusa.

Wykorzystanie mikromacierzy antygenu grypy do pomiaru szerokości przeciwciał w surowicy w różnych podtypach wirusa

Poznaj metodę slot blot do ilościowej analizy hemaglutyniny i neuraminidazy wirusa grypy przy użyciu uniwersalnych przeciwciał. Technika ta umożliwia szybką i wrażliwą detekcję bez konieczności stosowania przeciwciał specyficznych dla szczepu.

Analizy ilościowe wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusa grypy typu A przy użyciu uniwersalnych przeciwciał w prostych testach slot (Wideo) | JoVE Journal

Analizy ilościowe wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusa grypy typu A z wykorzystaniem uniwersalnych przeciwciał w prostych testach slot blot

Przeglądaj więcej filmów