Analizy ilościowe wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusa grypy typu A przy użyciu uniwersalnych przeciwciał w prostych testach slot

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie zawartości hemaglutyniny i neuraminidazy wirusa grypy w szczepionkach przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko konserwatywnym epitopom. Osiąga się to poprzez pierwszą identyfikację konserwatywnych epitopów. Drugim etapem procedury jest rozcieńczenie próbki referencyjnej i próbki szczepionki w celu poprawy czułości wykrywania.

Trzecim krokiem jest zmontowanie aparatu do szczelinowania i załadowanie próbek do szczelin. Czwartym etapem procedury jest wykrycie kwasu hialuronowego lub na/na na membranie przy użyciu odpowiednich uniwersalnych przeciwciał. Ostatnim etapem procedury jest ilościowe określenie ilości kwasu hialuronowego lub nana za pomocą densytometrii.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują kwas hialuronowy lub azot określony ilościowo w stosunku do odpowiednich antygenów referencyjnych. Cześć, nazywam się Anwar Hashem. Jestem doktorantem w laboratorium dr Seana Lee.

Cześć, nazywam się Caroline Grab i jestem technikiem w laboratorium dr Seana Lee w Centrum Oceny Szczepionek w Health Canada. Dzisiaj zademonstrujemy procedurę bota szczelinowego używaną do ilościowego oznaczania antygenów HA i NA wirusów grypy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pojedynczy radialny immunodyfuzja SRID lub metody fizykochemiczne, jest to, że nie wymaga ona przeciwciał specyficznych dla szczepu lub podtypu, w przeciwieństwie do SRID lub wyrafinowanych instrumentów, takich jak metody fizykochemiczne.

Ponadto, ponieważ przeciwciała te są ukierunkowane na jedyne powszechnie zachowane epitopy RZS, są one przydatne jako podstawowe narzędzia badawcze dla zainteresowanych badaczy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ mogą napotkać problemy techniczne, takie jak trudności w blokowaniu wytrąconych próbek szczepionki, wyciek próbek między szczelinami i utrata próżni podczas etapu blottingu, a także wysokie tło w rozproszonych pasmach obserwowane po wykryciu immunologicznym. Jednak zwrócenie uwagi na kilka kluczowych kroków może pomóc w rozwiązaniu tych problemów.

Dzisiaj zademonstrujemy Ci tę procedurę. Więc zacznijmy. Aby zidentyfikować konserwatywne regiony, użyliśmy wyrównań klastra W do analizy łącznie ponad 6 000 sekwencji HA grypy A z NCBI i znaleźliśmy koniec N podjednostki HA two jako wysoce konserwatywny region.

Obliczono entropię Shannona i współczynnik zachowania dla każdej pozycji aminokwasu zidentyfikowanych sekwencji konsensusu. Jeden epitop UNI pokazany na czerwono został wybrany do opracowania uniwersalnego przeciwciała przeciwko HA do testu slot blot. Stosując podobne podejście, we wszystkich influenzie zidentyfikowano dwie uniwersalnie konserwatywne sekwencje, A NA, jedna w pobliżu enzymatycznie aktywnego miejsca, a druga na końcu peptydy końcowe z tymi sekwencjami aminokwasów zostały użyte jako antygeny do wytworzenia uniwersalnych przeciwciał przeciwko NA do testu slot blot.

Przed rozpoczęciem procedury krzepnięcia szczelinowego należy przygotować 20 mililitrów roztworu mocznika czterech MO w TBS dla hemaglutyniny lub blota HA lub 20 mililitrów 0,01% roztworu ergenu w TBS dla neuraminidazy lub blota szczelinowego NA, a następnie przygotować dwa litry buforu do przemywania przez dodanie od 20 do roztworu TBS do końcowego stężenia 0,1%Następnie, Przygotować 80 mililitrów buforu blokującego, rozpuszczając odtłuszczone mleko w proszku do końcowego stężenia 5% wagowo-objętościowo w buforze myjącym. Aktywuj membranę PDF i metanol na 15 sekund, a następnie spłucz przez dwie minuty w wodzie podwójnie destylowanej. Namocz membranę w TBS do czasu użycia, wstępnie zwilżyć trzy arkusze bibuły filtracyjnej SF T blot w TBS, aż użyte wzorce referencyjne szczepionki przeciw grypie o z góry określonej zawartości kwasu hialuronowego będą odpowiadały szczepom szczepionki, które mają być badane.

Zostały uzyskane z Center for Biologics Evaluation and Research w USA lub National Institute for Biological Standard and Control w Wielkiej Brytanii i zostały wykorzystane do ilościowego oznaczania HA lub NA za pomocą slot blot dla antygenów referencyjnych HA i próbek testowych szczepionek. Przygotować 650 mikrolitrów rozcieńczonego zapasu antygenu odniesienia HA w czterech molo mocznikach TBS o podanych stężeniach. Następnie przygotuj 650 mikrolitrów próbek szczepionki testowej w czterech TBS mo mocznika w trzech różnych rozcieńczeniach, takich jak 10 x, 20 x i 40 x, aby uzyskać dwukrotną różnicę i pozwolić, aby stężenia próbki mieściły się w standardowej krzywej dla antygenów referencyjnych NA i próbek szczepionek testowych.

Przygotuj 650 mikrolitrów każdego z wzorców antygenu NA w 0,01% sugen TBS o podanych stężeniach, a wzorce antygenowe zostały wykonane we własnym zakresie przy użyciu strony SDS w połączeniu z analizami gęstej cytometrii. Następnie przygotuj 650 mikrolitrów próbek szczepionki testowej w 0,01% sugen TBS w trzech różnych rozcieńczeniach, takich jak 10 x, 20 x i 40 x, aby uzyskać dwukrotną różnicę i pozwolić, aby stężenie próbki mieściło się w krzywej standardowej. Zamontuj wcześniej oczyszczony i wysuszony aparat do mikrofiltracji bio SF, umieszczając płytę nośną uszczelki w kolektorze próżniowym, a uszczelkę sufitową na górze.

Umieść trzy wilgotne i arkusze bibuły filtracyjnej BIO SF na uszczelce. Następnie wstępnie nasączona membrana PVDF. Następnie umieść szablon próbki na membranie i dokręć palcami cztery, używając ukośnego wzoru krzyżowania, aby zapewnić równomierne wywieranie nacisku na powierzchnię membrany Przed podłączeniem urządzenia sprawdź, czy zawór trójdrogowy jest ustawiony tak, aby wystawić kolektor próżniowy na źródło podciśnienia.

Włącz pompę i podłącz aparat bio dot. Upewnij się, że zawór przepływowy jest umieszczony na poziomie poniżej studzienek na próbki, aby zapewnić szybki i prawidłowy drenaż próbek w kolejnych krokach. Powtórz krok dokręcania, używając wzoru krzyżowania po przekątnej.

Dokręcanie podczas stosowania próżni zapewnia szczelniejsze uszczelnienie i zapobiega zanieczyszczeniu krzyżowemu między studzienkami. Następnie zmień zawór przepływowy, aby wystawić kolektor podciśnieniowy na działanie powietrza i wyłączyć pompę. Następnie nałóż 100 mikrolitrów TBS na wszystkie studzienki za pomocą pipetera wielokanałowego w celu ponownego nawodnienia membrany.

Nałóż roztwór na środek studzienki jak najbliżej dna, aby równomiernie pokryć szczelinę. Użyj czystej końcówki pipetera, aby usunąć wszelkie wprowadzone pęcherzyki powietrza. Zmień zawór przepływowy, aby wystawić kolektor zarówno na działanie powietrza, jak i podciśnienia.

Włącz pompę i delikatnie opróżnij bufor ze studzienek, kładąc palec na porach wystawionych na działanie powietrza, aby regulować ilość podciśnienia. Następnie zmień zawór przepływowy, aby wystawić kolektor na działanie powietrza. Gdy tylko bufor zostanie całkowicie opróżniony ze wszystkich studzienek.

Wyłącz pompę lub odłącz podciśnienie. Zastosować 200 mikrolitrów każdego roztworu wzorcowego lub próbki szczepionki na studzienkę. Próbki należy pipetować, pojedynczo w środku każdej studzienki, jak najbliżej dna.

Uważano, aby uniknąć i usunąć powietrze. Umieść 200 mikrolitrów buforu do rozcieńczania próbki w nieużywanych studzienkach, aby zapewnić odpowiednią próżnię w używanych studzienkach. Wyreguluj zawór przepływowy, aby wystawić kolektor zarówno na działanie powietrza, jak i podciśnienia.

Włącz pompę próżniową i delikatnie pozwól próbkom całkowicie spłynąć ze studzienek, kontrolując ilość próżni jednym palcem nad porami wystawionymi na działanie powietrza. Zdejmij palec z portu, aby zwolnić podciśnienie. Jak tylko wszystkie próbki natychmiast odsączą.

Dodaj 200 mikrolitrów TBS do każdej studzienki. Za pomocą pipetera wielokanałowego zastosuj delikatne podciśnienie, aby opróżnić i umyć studzienki, kontrolując ilość podciśnienia jednym palcem nad portem wystawionym na działanie powietrza. Powtórz krok mycia raz, gdy tylko studzienki całkowicie opróżnią, poluzuj szablonu próbki i wyłącz próżnię, aby uniknąć nadmiernego wysuszenia.

Studzienki natychmiast przystępują do usuwania membrany i umieszczania w buforze blokującym. Użycie wystarczającej ilości buforu, aby całkowicie pokryć membranę. Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym kołysaniem.

Po całonocnej inkubacji i buforze blokującym. Umyj membranę dwa razy, jak podano, a następnie kołysz we wszystkich popłuczynach i inkubacjach. Upewnij się, że membrana jest całkowicie pokryta roztworem.

Następnie inkubować błonę z jednolitym uniwersalnym przeciwciałem królika przeciwko HA lub uniwersalnymi przeciwciałami HCA kreska druga lub HCA kreska trzy dla NA rozcieńczone w 5% wagowo do objętości BSA w buforze myjącym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, rozcieńczenia od jednego do 4 000 surowicy króliczej dały optymalne wyniki dla tych przeciwciał. Następnie umyj membranę trzy razy w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc przez 15 minut za każdym razem. Następnie inkubować błonę z rozcieńczeniem od jednego do 50 000 koziego przeciwciała sprzężonego z peroksydazą IgG, buforem blokującym i inkubowanym buforem pokojowym przez 30 minut z delikatnym kołysaniem po inkubacji, po inkubacji przemyć membranę i bufor myjący trzy razy w temperaturze pokojowej, kołysząc przez 15 minut każde.

Następnie umyj membranę TBS przez pięć minut, delikatnie kołysząc, aby usunąć resztki detergentu tween 20 z powierzchni membrany. Następnie przygotuj substrat do wywoływania, używając trzech mililitrów każdego odczynnika z zestawu super signal West Dura extended duration substrate i wymieszaj. Dobrze umieść membranę na suchej bibułce, aby delikatnie usunąć nadmiar buforu TBS przed przeniesieniem do suchego pojemnika i nałożeniem substratu, inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem i usuń nadmiar substratu przez bibułę.

Po zakończeniu wystaw membranę na działanie filmu chemiluminescencyjnego. Długość ekspozycji będzie musiała zostać zoptymalizowana, aby uniknąć nasycenia sygnału, ale zazwyczaj będzie wynosić od 10 sekund do 10 minut. Analizę gęstej cytometrii na wywołanym filmie wykonano przy użyciu systemu dokumentacji żelu chemicznego flora zgodnie z instrukcjami producenta.

Uśrednić wartości gęstości dla każdego zestawu powtórzeń antygenu referencyjnego i próbek szczepionki do testów. Potrójne zestawy są potrzebne do testowania istotności i oceny błędu eksperymentalnego. Wykreślić uśrednione wartości gęstości w funkcji ilości antygenu HA lub NA w każdym gnieździe.

Zaczerpnięte z wzorca odniesienia. Poniżej przedstawiono czteroparametrowy model logistyczny dla testów immunologicznych, który wykorzystuje referencyjne stężenie i gęstość szczepionki do ekstrapolacji stężenia próbki na podstawie gęstości szczepionek próbek testowych przy użyciu podejścia o zmiennym nachyleniu i dopasowania krzywej regresji nieliniowej. Wykres PRISM służy do wykreślania krzywych standardowych i uzyskiwania stężeń z danych o gęstości uzyskanych w sposób pokazany poniżej.

Uniwersalne przeciwciało HA UNI One wykazało niezwykłą specyficzność dla sekwencji wirusowych i jest zdolne do wiązania się z 13 różnymi podtypami grypy. Kwas hialuronowy ekstrahowany z laryngologicznych płynów toikowych zakażonych wirusem zarodków kurzych. Białko NP jest kontrolą obciążenia.

Kontrolą ujemną jest płyn laryngologiczny z niezakażonych jaj, a kontrolą dodatnią jest wzorzec odniesienia H one z N-I-B-S-C. Różnice obserwowane w ruchliwości białek HA są prawdopodobnie spowodowane różnicami w ich wielkości i/lub etapie przetwarzania. Jak pokazano tutaj, przeciwciała HCA kreska druga i HCA kreska trzy przeciwko obu konserwatywnym epitopom NA były zdolne do wiązania się ze wszystkimi dziewięcioma podtypami NA i wykazywały bardzo małą reaktywność krzyżową z białkami Alan Toic lub białkami komórkowymi, a kontrola białka P jest pokazana w panelu C. Kontrolą pozytywną jest płyn Alan Toic wzbogacony R NA, jeden z ukośnika New Kaledonia slash 20 slash 99 i sondowany za pomocą odpowiedniego kontrola białka surowicy odpornościowej NP jest pokazana na dole.

Obraz ten przedstawia reprezentatywne wyniki podobne do HA oznaczania ilościowego, antygenu NA w wzorcu referencyjnym szczepionki przeciw grypie oraz w próbkach szczepionki. Analiza gęstości wykazała, że intensywność sygnału uzyskanego przez wykrycie antygenu NA w różnych rozcieńczeniach wzorca referencyjnego szczepionki za pomocą slot blot jest proporcjonalna do stężenia na. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wstępnej obróbce próbek szczepionki w celu rozpuszczenia osadów i zapewnienia prawidłowego drenażu z gniazda.

Należy również zachować ostrożność, aby zapobiec wyciekom próbek między studzienkami. Optymalizacja rozcieńczeń przeciwciał i czasów inkubacji może być konieczna, aby każde nowe przeciwciało używane do wykrywania otrzymywało ostre sygnały o idealnej intensywności przy jednoczesnej minimalizacji tła po jego rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie badań nad szczepionkami przeciw grypie.

Dalsza analiza ilościowa antygenów HA i NA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo ważne białka powierzchniowe wirusów grypy w prostych testach bez użycia przeciwciał specyficznych dla szczepu.