Name: Nieinwazyjna technika pobierania próbek włosów w celu uzyskania wysokiej jakości DNA od nieuchwytnych małych ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-13T09:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę pobierania próbek włosów od amerykańskiego pika w celu analizy genetycznej bez zakłócania zwierząt. Technika ta umożliwia badania ekologii dzikiej przyrody i ochrony gatunków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować L. Evansowi, B. Grangerowi, D. Risslingowi, Z. Simowi, A. Goodwinowi, K. Hayhurstowi oraz D. Kuchowi za pomoc w terenie. K. Galbreath uprzejmie udostępnił próbki wątroby piki z doliny Bella Coola. Dziękujemy A. Gonçalves da Silvie oraz K. Larsenowi za interesujące dyskusje, które przyczyniły się do opracowania tej nieinwazyjnej metody pobierania próbek genetycznych. Praca ta była finansowana z grantów Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery oraz UBC Okanagan Individual Research przyznanych MAR. PH otrzymał wsparcie w ramach stypendium doktorskiego Swiss National Science Foundation PBSKP3_128523. Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z protokołem opieki nad zwierzętami Uniwersytetu Kolumbijskiego w Brytyjskiej Kolumbii (numer certyfikatu: A07-0126).

1. Pułapka na włosy
Przed rozstawieniem pułapki należy wyznaczyć optymalną lokalizację w obrębie siedliska piki lub na zboczu piargowym. Obejmuje to kopce siana, będące zgromadzeniami roślinności zbieranymi przez zwierzęta pod koniec lata, a także świeże odchody znalezione w miejscach latryn. Paski taśmy pakowej (o długości 10-50cm) zwija się tak, aby uzyskać klejącą powierzchnię 360°, a następnie rozmieszcza w formie sieci, aby otoczyć wejście do kopca siana (Rys. 1) lub miejsca latryny piki. W zależności od układu skał, do wsparcia struktury pułapki na włosy można użyć żyłki wędkarskiej, choć często nie jest to konieczne, gdy wejścia są bardzo małe (&lt;30cm średnicy); szczegółowy opis zastosowania żyłki wędkarskiej znajduje się w pracy Henry i Russello (2010)3. Pułapki na włosy są sprawdzane tak często, jak to możliwe, a osadzone na taśmie próbki włosów (Rys. 2) są następnie zbierane i etykietowane. Po transporcie do laboratorium włosy są usuwane z klejącej taśmy za pomocą sterylnej pincety, przenoszone do probówek kriogenicznych i przechowywane w temperaturze -20°C do czasu dalszej obróbki. Próbki włosów zgrupowane razem w obrębie jednej pułapki uznaje się za należące do jednego osobnika, natomiast próbki zgrupowane oddzielnie uznaje się za należące do różnych osobników. W tym drugim przypadku włosy umieszcza się w osobnych probówkach. Założenia te mogą zostać później zweryfikowane za pomocą odcisków DNA oraz obliczeń prawdopodobieństwa tożsamości w oparciu o genotypowe dane mikrosatelitarne.
2. Izolacja DNA
Ponieważ włosy piki są bardzo cienkie i posiadają niewielką cebulkę korzenia, wykazaliśmy wcześniej, że do uzyskania wystarczającej ilości DNA dla wysokiej jakości późniejszej amplifikacji PCR wymagane jest minimum 25 włosów3. Użyliśmy systemu DNA IQ (Promega, Madison, WI, USA) oraz nieco zmodyfikowanej wersji instrukcji producenta dotyczącej izolacji DNA z próbek włosów. Najpierw próbkę włosów wirowano w mikrocentry fudze, aby uniknąć utraty włosów podczas otwierania probówki. Następnie przygotowano roztwór inkubacyjny, mieszając 80 μl roztworu inkubacyjnego z 10 μl DTT (1M) i 10 μl Proteinazy K (18ng/ml), aby uzyskać końcowe stężenie 0.1 M DTT i 1.8ng/ml Proteinazy K. Do próbki dodano roztwór inkubacyjny (100 μl) i inkubowano w temperaturze 56°C przez 1 godzinę. W międzyczasie przygotowano roztwór lizujący, dodając 1 μl DTT (1M) na każde 100 μl buforu lizującego, co dało końcowe stężenie DTT 0.01M. Następnie do próbki dodano przygotowany roztwór lizujący (200 μl) wraz z 7 μl żywicy DNA IQ, mieszano w wortexie przez 3 sekundy z dużą prędkością i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Próbkę wortexowano przez 2 sekundy i umieszczono w statywie magnetycznym, gdzie nastąpiło oddzielenie kulek magnetycznych od roztworu. Pozostały roztwór odessano i usunięto, uważając, aby nie naruszyć osadu żywicy magnetycznej. Próbkę potraktowano następnie 100 μl przygotowanego roztworu lizującego, wortexowano i ponownie umieszczono w statywie magnetycznym do oddzielenia. Bufor lizujący odessano i usunięto, a ten krok powtórzono trzykrotnie, używając buforu płuczącego (100 μl). Następnie próbkę pozostawiono do wyschnięcia w statywie magnetycznym na 15 minut. Po wyschnięciu do próbki dodano 100 μl buforu elucyjnego i inkubowano w temperaturze 65 °C przez 5 minut. Próbkę wortexowano i umieszczono w statywie magnetycznym. Roztwór zawierający wyeluowane DNA przeniesiono następnie do probówki Eppendorf 1.5 ml i przechowywano w temperaturze -20°C do czasu dalszych manipulacji. DNA z próbek wątroby również wyekstrahowano za pomocą systemu DNA IQ i wykorzystano jako kontrolę pozytywną dla amplifikacji PCR.
3. Amplifikacja PCR
DNA otrzymany z nieinwazyjnych pułapek na włosy oraz z próbek wątroby wykorzystano następnie do amplifikacji zestawu powszechnie stosowanych markerów molekularnych (mikrosatelitów, AFLP, mitochondrialnego cytochromu B oraz markerów określania płci ZFX/ZFY). Reakcje PCR przeprowadzono przy użyciu termocyklera Veriti (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) w objętości 25 μL zawierającej: 10 - 20 ng DNA, 0,5 μM każdego z primerów, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTPs, 10 μ albuminy surowicy bydlęcej (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) oraz 0,5 U polimerazy DNA AmpliTaq Gold (Applied Biosystems). Parametry cyklowania dla loci mikrosatelitarnych zoptymalizowano za pomocą programu touchdown PCR (10 min w 95°C, 35 cykli: 95°C przez 30 s, 30 s przyłączania, 45 s w 72°C, a następnie etap końcowy w 72°C przez 10 min). Temperatura przyłączania malała o 1°C w każdym cyklu od 60 do 55°C aż do szóstego cyklu, po którym pozostałe 29 cykli odbywało się w temperaturze 55°C. Parametry cyklowania dla fragmentów mitochondrialnych były takie same jak opisane powyżej, jednak składały się z 35 cykli z temperaturą przyłączania 50°C. Analizę polimorfizmu długości fragmentów amplifikowanych (AFLP) przeprowadzono zgodnie z protokołem dla genomów kręgowców opisanym przez Bonina4. Na koniec określono płeć molekularnie, wykorzystując metodę PCR-RFLP loci ZFX/ZFY z trawieniem enzymem restrykcyjnym HinfI5. Produkty PCR z sekwencji mikrosatelitarnych, AFLP i cytochromu B analizowano na analizatorze genetycznym ABI 3130XL (Applied Biosystems), natomiast strawione fragmenty ZFX/ZFY rozdzielono wraz z markerem 100 bp (New England Biolabs) na 3% żelu agarozowym zawierającym 2,5% barwnika do żeli DNA SYBR Safe (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i wizualizowano za pomocą osobistego systemu obrazowania żeli RED (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA). Mikrosatelity i AFLP wizualizowano przy użyciu oprogramowania Genemapper v3.7 (Applied Biosystems), a chromatogramy DNA mitochondrialnego analizowano za pomocą Sequencher v4.7 (Gene Code Corporation, Ann Harbour, MI, USA).
4. Reprezentatywne wyniki
DNA wyizolowane z próbek włosów pobranych za pomocą naszej nieinwazyjnej pułapki z włosowłapem wykorzystano do amplifikacji PCR różnych typów markerów molekularnych. Jako podstawę do porównania, równolegle z próbkami włosów amplifikowano DNA wyizolowane z próbek wątroby. Loci mikrosatelitarne jądrowe zostały pomyślnie amplifikowane zarówno dla próbek włosów, jak i wątroby (Rys. 3). Choć intensywność sygnału była większa w przypadku próbek wątroby, nie miało to negatywnego wpływu na ocenę genotypów (Rys. 3). Podobne wyniki uzyskano przy użyciu AFLP (Rys. 4), sekwencji mtDNA (Rys. 5) oraz molekularnego markera określania płci ZFX/ZFY (Rys. 6).
<img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig1.jpg" alt="Technika kamuflażu w naturze; kamienie, rośliny, żyłka wędkarska, taśma pakowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przykład nieinwazyjnej pułapki na sierść ustawionej przy stosie siana. Paski zwiniętej przezroczystej taśmy pakowej są rozmieszczone w formie sieci, aby otoczyć wejście do stosu siana. Fragment żyłki wędkarskiej został tutaj użyty w celu zapewnienia dodatkowego wsparcia dla pułapki na sierść.
<img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig2.jpg" alt="Identyfikacja sierści zwierzęcej, sierść z ciała i łap na skałach, badanie środowiskowe, badania terenowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Skuteczna pułapka na sierść zawierająca dużą liczbę włosów przyklejonych do taśmy pakowej.
<img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig3.jpg" alt="Wykres analizy mikrosatelitów jądrowych; porównanie wątroby i włosa przedstawiające wyniki danych szczytowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Reprezentatywny chromatogram mikrosatelitów jądrowych (Ocp6)8 wyświetlony w programie Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Górny chromatogram uzyskano poprzez amplifikację DNA z tkanki wątroby; w tym locus jest on heterozygotyczny (354/358). Dolny chromatogram reprezentuje innego osobnika wykazującego genotyp heterozygotyczny (358/362) na podstawie DNA wyekstrahowanego z włosa. Mimo że sygnał chromatogramu z próbki włosa ma niższą intensywność niż w próbce z wątroby, ocena genotypu nie jest negatywnie wpływana przez tę różnicę w sygnale.
<img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig4.jpg" alt="Wyniki analizy AFLP; porównanie DNA z wątroby i włosa, wykres elektroforezy, badanie zmienności genetycznej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Reprezentatywny chromatogram AFLP (E31T32) wyświetlony w programie Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Górny chromatogram uzyskano poprzez amplifikację DNA z tkanki wątroby, natomiast dolny chromatogram przedstawia DNA wyekstrahowane z włosa. 
<img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig5.jpg" alt="Schemat sekwencji mitochondrialnego DNA, analiza cytochromu B dla porównania wątroby i włosa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Reprezentatywny chromatogram sekwencji mitochondrialnego DNA (cytochrom B) wyświetlony w programie Sequencher v4.7 (Gene Code Corporation). Górny chromatogram uzyskano poprzez amplifikację DNA z tkanki wątroby, dolny chromatogram przedstawia DNA wyekstrahowane z włosa.
<img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig6.jpg" alt="Wynik elektroforezy żelu markerów molekularnego do oznaczania płci, pokazujący prążki DNA do determinacji płci (ZFX/ZFY)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Reprezentatywny marker molekularny do oznaczania płci (ZFX/ZFY) amplifikowany dla próbek wątroby i włosa. Podejście to opiera się na obserwacji, że chromosom Y posiada w tym regionie miejsce restrykcyjne dla enzymu HinfI, którego brakuje w chromosomie X. W związku z tym u samic powstają dwa współmigrujące fragmenty o wielkości 432 bp, natomiast u samców powstają fragmenty o wielkości 432 bp, 261 bp i 171 bp.

<ol><li>Kendall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demography+and+Genetic+Structure+of+a+Recovering+Grizzly+Bear+Population%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wildlife+Manage%22%5BJournal%5D)">Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population.</a> J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).</li>
<li>Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+genetic+evaluation+of+population+size%2C+natal+philopatry%2C+and+roosting+behavior+of+non-breeding+eastern+imperial+eagles+%28Aquila+heliaca%29+in+central+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Conserv.+Genet%22%5BJournal%5D)">A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia.</a> Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).</li>
<li>Henry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+population+structure+and+ex+situ+representation+of+the+endangered+Amur+tiger%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger.</a> Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).</li>
<li>Henry, P., Russello, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+high+quality+DNA+from+elusive+small+mammals+using+low-tech+hair+snares%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Wildlife+Res%22%5BJournal%5D)">Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares.</a> Eur J Wildlife Res. , (2010).</li>
<li>Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+amplified+fragment+length+polymorphism+%28AFLP%29+markers+in+surveys+of+vertebrate+diversity.+Method+Enzymol+395%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395.</a> , 145-145 (2005).</li>
<li>Fontanesi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexing+European+rabbits+%28Oryctolagus+cuniculus%29%2C+European+brown+hares+%28Lepus+europaeus%29+and+mountain+hares+%28Lepus+timidus%29+with+ZFX+and+ZFY+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci.</a> Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).</li>
<li>Piggott, M. P., Taylor, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+collection+of+animal+DNA+and+its+applications+in+conservation+management+and+understanding+the+population+biology+of+rare+and+cryptic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Wildl.+Res%22%5BJournal%5D)">Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species.</a> Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).</li>
<li>Banks, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demographic+monitoring+of+an+entire+species+%28the+northern+hairy-nosed+wombat%2C+Lasiorhinus+krefftii%29+by+genetic+analysis+of+non-invasively+collected+material%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Conserv%22%5BJournal%5D)">Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material.</a> Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).</li>
<li>Litvaitis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+range-wide+survey+to+determine+the+current+distribution+of+New+England+cottontails%5BTitle%5D)+AND+%22Wildlife+Soc+B%22%5BJournal%5D)">A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails.</a> Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).</li>
<li>Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+nine+polymorphic+microsatellite+loci+in+the+North+American+pika%2C+Ochotona+princeps%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Notes%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps.</a> Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Nieinwazyjne pobieranie próbek genetycznych stało się atrakcyjną alternatywą dla tradycyjnych metod odłowu żywych zwierząt z kilku powodów. Po pierwsze, dzięki dyskretnemu gromadzeniu materiału biologicznego (np. kału, włosów, piór, śliny i śluzu) z dzikich populacji, badacze mogą studiować te gatunki bez ich płoszenia, chwytania, a nawet obserwowania, co zmniejsza ryzyko zarówno dla zwierząt, jak i badaczy. Po drugie, nieinwazyjne pobieranie próbek genetycznych umożliwia biologom badanie populacji gatunków rzadkich i trudnych do wykrycia, co może okazać się problematyczne przy zastosowaniu bardziej tradycyjnych metod odłowu 6. Po trzecie, NGS może potencjalnie zwiększyć wielkość prób poprzez ograniczenie stresu zwierząt, nakładów pracy przy pobieraniu próbek oraz kosztów, co pomaga minimalizować błędy w szacowaniu parametrów populacyjnych 7. Ten ostatni punkt może okazać się kluczowy w przypadku gatunków zagrożonych, ponieważ błędne szacunki parametrów populacyjnych mogą prowadzić do niewłaściwego zarządzania ochroną.
W niniejszym artykule wideo opisujemy prostą, nową, niedrogą i nieinwazyjną metodę pobierania próbek od trudnych do uchwycenia małych ssaków, posługując się przykładem piki amerykańskiej. Wykazujemy, że DNA wyekstrahowane z sierści wykazuje podobną wydajność co DNA wyekstrahowane z próbek wątroby w odniesieniu do markerów mikrosatelitarnych, AFLP, mitochondrialnych oraz markerów określania płci, co czyni tę nieinwazyjną metodę pobierania próbek atrakcyjną alternatywą dla odłowu żywych osobników lub pobierania próbek metodą letalną. Przewidujemy, że metoda ta będzie użyteczna na etapie gromadzenia danych w badaniach genetyki populacyjnej i behawioralnej rzadkich lub trudnych do uchwycenia gatunków małych ssaków, minimalizując jednocześnie wpływ na badane organizmy.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Pułapka na włosy:&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Rolki przezroczystej taśmy pakowej (3M, St. Paul, MN, USA)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Żyłka wędkarska (10 lb)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Probówka kriogeniczna (2 ml)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Sterylna pęseta&lt;/li&gt;&lt;li&gt;naczynie Dewara z ciekłym azotem (opcjonalnie)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Ekstrakcja DNA:&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;System DNA IQ (kat. nr DC6701; Promega) z zestawem do ekstrakcji z tkanek i włosów (kat. nr DC6740; Promega).&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Stojak do separacji magnetycznej MagneSphere Technology (Kat. nr Z5342; Promega)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Mikrowirówka&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Piec do hybrydyzacji lub łaźnia wodna&lt;/li&gt;&lt;li&gt;probówki Eppendorf 1,5 ml&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

nieinwazyjna technika pobierania próbek sierści w celu pozyskania wysokiej jakości dna od trudnych do uchwycenia małych ssaków

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Nieinwazyjne podejścia do pobierania próbek genetycznych stają się coraz ważniejsze w badaniu populacji dzikich zwierząt. W wielu badaniach zgłoszono wykorzystanie nieinwazyjnych technik pobierania próbek do analizy genetyki populacyjnej i demografii dzikich populacji1. Podejście to okazało się szczególnie przydatne w przypadku gatunków rzadkich lub trudnych do uchwycenia2. Chociaż opracowano szereg metod pobierania sierści, odchodów i innych materiałów biologicznych od mięsożerców i ssaków średniej wielkości, w dużej mierze pozostały one nietestowane w odniesieniu do trudnych do uchwycenia małych ssaków. W tym filmie prezentujemy nową, niedrogą i nieinwazyjną pułapkę na sierść skierowaną przeciwko trudnemu do uchwycenia małemu ssakowi – pikasowi amerykańskiemu (Ochotona princeps). Opisujemy ogólną konstrukcję pułapki, która składa się z pasków taśmy pakowej rozmieszczonych w formie sieci i umieszczonych wzdłuż szlaków przemieszczania się w siedlisku pikasów. Ilustrujemy skuteczność pułapki w gromadzeniu dużej ilości sierści, która może być następnie zebrana i dostarczona do laboratorium. Następnie demonstrujemy zastosowanie systemu DNA IQ (Promega) do izolacji DNA i pokazujemy użyteczność tej metody w amplifikacji powszechnie stosowanych markerów molekularnych, w tym mikrosatelitów jądrowych, polimorfizmów długości fragmentów amplifikowanych (AFLPs), sekwencji mitochondrialnych (800bp), a także markera do określania płci metodą molekularną. Ogólnie rzecz biorąc, wykazujemy użyteczność tej nowej, nieinwazyjnej pułapki na sierść jako techniki pobierania próbek dla biologów populacyjnych dzikich zwierząt. Przewidujemy, że podejście to będzie możliwe do zastosowania u wielu gatunków małych ssaków, otwierając nowe obszary badań w obrębie populacji naturalnych przy jednoczesnym zminimalizowaniu wpływu na badane organizmy.

Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do pobierania próbek, umożliwiające efektywne gromadzenie próbek sierści od płochliwych małych ssaków, co zaprezentowano na przykładzie piki amerykańskiej. Wykazujemy użyteczność tej metody poprzez ekstrakcję DNA z pobranej sierści oraz amplifikację kilku typów markerów molekularnych powszechnie stosowanych w badaniach nad ekologią i ochroną dzikiej przyrody.

Nieinwazyjna technika pobierania próbek sierści w celu pozyskania wysokiej jakości DNA od trudnych do uchwycenia małych ssaków

Nieinwazyjne metody pobierania próbek genetycznych stają się coraz ważniejsze w badaniach populacji dzikich zwierząt. W wielu badaniach zgłoszono zastosowanie...

Genetycy populacyjni zajmujący się dziką przyrodą coraz częściej stosują nieinwazyjne metody pobierania prób w celu pozyskania danych na temat badanych gatunków. Podejścia te okazały się użyteczne w badaniu kwestii związanych z zachowaniem zwierząt, populacją, demografią i genetyką, szczególnie w przypadku zwierząt rzadkich i płochliwych; dzięki zdalnemu zbieraniu materiałów biologicznych, takich jak sierść, badacze mogą studiować zwierzęta bez zakłócania ich spokoju, wyrządzania im szkód, a nawet bez konieczności obserwacji badanych gatunków. Podczas gdy techniki te były stosowane głównie w odniesieniu do średnich i dużych drapieżników, takich jak niedźwiedzie grizzly, mniej uwagi poświęcono mniejszym ssakom roślinożernym, co tworzy lukę badawczą, którą należy uzupełnić.Opracowywane są nowe, innowacyjne podejścia do pobierania próbek od małych ssaków. Niniejszy artykuł wideo opisuje nową i innowacyjną metodę dyskretnego pozyskiwania próbek sierści od małych zajęczakowatych zwanych pika amerykańską. Małe ssaki te występują w pasmach górskich Ameryki Północnej, od Nowego Meksyku i Kalifornii po centralną Kolumbię Brytyjską.Zasiedlają one skaliste zbocza nazywane stoku Tala, które zapewniają schronienie przed drapieżnikami oraz ochronę przed ekstremalnymi warunkami środowiskowymi. Zazwyczaj występują na wysokościach przekraczających 2 500 metrów nad poziomem morza w południowej części swojego zasięgu, lecz mogą być spotykane również na poziomie morza w najbardziej wysuniętej na północ części swojego rozprzestrzenienia. Piki nie zapadają w hibernację.Są aktywne przez cały dzień w okresie letnim, jednak koncentrują swoją aktywność w godzinach porannych i wieczornych. Gdy temperatury są niższe, udają się na łąki sąsiadujące ze zboczem Tali, aby żerować na okolicznej roślinności. Jedną z osobliwości PIKA jest to, że nie spożywa pokarmu wyłącznie na otwartej przestrzeni.Zabiera go na swoje terytorium w Tallis i przechowuje w stogach siana. Chociaż gatunek ten jest łatwo wykrywalny, z natury jest płochliwy i często unika pułapek żywołownych rozstawianych przez badaczy. Ponadto stwierdzono, że piki są wrażliwe na manipulacje, co może prowadzić do śmierci zwierzęcia podczas badań nad szeregiem kwestii ekologicznych, behawioralnych i ewolucyjnych.Aby badać tego nieuchwytnego małego ssaka przy jednoczesnym zminimalizowaniu wpływu na niego, doktorant Philippe Henry z kampusu Okanagan Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej opracował nieinwazyjną technikę pobierania próbek, która jest dobrze dostosowana do tego gatunku. Przed ustawieniem pułapki poszukuje on dowodów na istnienie aktywnych terytoriów pika na zboczu Tallis. Obejmuje to sterty siana, czyli zapasy roślinności gromadzone przez zwierzę późnym latem w celu przetrwania zimy, oraz świeże odchody.Zjawisko to występuje zazwyczaj w konkretnych miejscach legowisk. Po zidentyfikowaniu potencjalnego szczytu siedliska w obrębie tlu, u wejścia strategicznie rozmieszcza się pułapkę na sierść. Używając rolki taśmy pakowej, Philippe zręcznie zwija paski taśmy i układa je w formie sieci, aby otoczyć wejście.Wejścia do pułapek typu „hideaway” są wykonane według skomplikowanych projektów, które zapewniają otwór o rozmiarze odpowiednim dla zwierzęcia – nie zbyt dużym ani nie zbyt małym. Hipotetycznie pika przejdzie następnie przez wylapkę, pozostawiając próbkę swojego włosa, podczas gdy będzie niezakłócona kontynuować swoje codzienne czynności. Sam włos jest bardzo cienki z niewielką cebulką korzenia.Aby uzyskać odpowiednią próbkę do analizy, pożądane jest zgromadzenie co najmniej 25 włosów należących do tej samej osoby. Miejsca ich znalezienia na taśmie muszą być również wyraźnie od siebie oddalone. Wszelkie skupiska włosów uznaje się za pochodzące od osobnych osób.Zakładając, że skupione razem włosy pochodzą z jednego źródła, można je następnie ostrożnie usunąć z taśmy za pomocą sterylnej pincety, nie naruszając struktury próbki, a w szczególności cebulki włosa, która zawiera najwyższe stężenie jądrowego DNA. Następnie włos jest ostrożnie umieszczany w dwumililitrowej probówce kriogenicznej i przechowywany w zbiorniku z ciekłym azotem do momentu dostarczenia próbki do laboratorium w celu dalszej analizy. Po dotarciu do laboratorium próbkę włosa wiruje się w mikrowirówce, aby uniknąć utraty materiału przy otwieraniu probówki. DNA jest ekstrahowane z próbek włosów przy użyciu systemu Promega DNA IQ; pierwszy krok obejmuje przygotowanie roztworu zawierającego 100 µL buforu inkubacyjnego, 1,8 mg/mL proteinazy K oraz 0,1 M DTT.Następnie do włosa dodaje się 100 µL roztworu inkubacyjnego i inkubuje w temperaturze 56 °C przez jedną godzinę. Próbkę poddaje się następnie obróbce z użyciem 200 µL buforu lizującego zawierającego 0,01 M DTT oraz siedmiu µL resuspensowanej żywicy DNA IQ. Następnie próbkę miesza się w wirówce typu vortex z dużą prędkością przez trzy sekundy i inkubuje w temperaturze pokojowej od 5 do 10 minut.Następnie próbkę po trawieniu mieszamy w wortexie przez dwie sekundy z dużą prędkością i umieszczamy w statywie do separacji magnetycznej. W tym momencie żywica magnetyczna zawierająca fragmenty DNA zostaje natychmiast oddzielona od roztworu i formuje osad na dnie probówki. Pozostały roztwór zostaje następnie usunięty i wylany.Następnie próbkę ponownie traktuje się 100 µL buforu lizującego, miesza w wstrząsarku wortex i przenosi na statyw magnetyczny w celu przeprowadzenia separacji. Ten sam krok powtarza się następnie trzy razy, stosując bufor piorący. Po ostatnim przemyciu próbkę pozostawia się do wyschnięcia na statywie magnetycznym przez 15 minut.Następnie do próbki dodaje się 100 µL buforu elucyjnego i inkubuje w temperaturze 65 °C przez pięć minut. Na koniec próbkę miesza się w wirówce vortex przez dwie sekundy i umieszcza na statywie magnetycznym. Roztwór DNA przenosi się następnie do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml i przechowuje w temperaturze -20 °C.Zanim przejdziemy do dalszych analiz, przedstawię się – nazywam się Peter Bohi. Jestem doktorantem w laboratorium genomiki ekologicznej i konserwatorskiej dr. Michaela Rosso na kampusie Okanagan Uniwersytetu Kolumbijskiego. DNA wyizolowane z włosów pobranych podczas tegorocznych letnich badań zostało następnie wykorzystane do amplifikacji różnych typów markerów molekularnych metodą PCR.Jako kontrolę pozytywną oraz punkt odniesienia wykorzystaliśmy również próbki wątroby. W celu porównania naszej metody przeprowadziliśmy amplifikację jądrowych loci mikrosatelitarnych, które posłużą do badania populacji i struktury genetycznej badanych zwierząt, a także genomowe skany FLP, które zostaną wykorzystane do analizy genetycznych podstaw adaptacji wzdłuż gradientu wysokościowego. Amplifikowaliśmy również sekwencje mitochondrialnego DNA o długości do 800 par zasad, które mogą być użyte do badania filogeografii gatunku, a w celu określenia płci osobników w naszych populacjach zastosowaliśmy narzędzia do molekularnego oznaczania płci w oparciu o sekwencje białek z motywem palca cynkowego oraz analizę PCR-RFLP.We wszystkich badanych markerach DNA wyekstrahowane z próbek włosa i wątroby wykazało porównywalny poziom sekwencji DNA oraz jakość genotypu. W tym filmie zademonstrowaliśmy, że ta nieinwazyjna metoda pobierania próbek, w połączeniu z protokołem ekstrakcji DNA IQ, jest skuteczna w pozyskiwaniu odpowiedniej ilości włosa, która dostarcza DNA o jakości i ilości wystarczającej do amplifikacji PCR. Ogólnie przewidujemy, że metoda ta będzie przydatna w ułatwianiu gromadzenia danych na potrzeby badań populacyjnych, genetycznych i behawioralnych rzadkich lub trudnych do zaobserwowania małych ssaków, przy jednoczesnym minimalizowaniu wpływu na badane gatunki.

a-noninvasive-hair-sampling-technique-to-obtain-high-quality-dna-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nieinwazyjna technika pobierania próbek włosów w celu uzyskania wysokiej jakości DNA od małych, trudnych do uchwycenia ssaków

Izolacja genomowego DNA z ogonów myszy

Przedstawiona tutaj metoda Direct PCR umożliwia amplifikację PCR bezpośrednio z niewielkich ilości nieoczyszczonych tkanek roślinnych i zwierzęcych.

Genotypowanie próbek roślinnych i zwierzęcych bez uprzedniego oczyszczania DNA

Analiza specyficzna dla tkanki w modelu regeneracji mieszka włosowego z wykorzystaniem lentiwirusów do mediacji funkcji wzmocnionej (gain-of-function) lub utraconej (loss-of-function).

Szybka analiza genetyczna sygnalizacji nabłonkowo-mezenchymalnej podczas regeneracji włosa

Opisujemy procedury znakowania i genotypowania nowonarodzonych myszy oraz generowania z nich pierwotnych kultur neuronalnych. Genotypowanie jest szybkie, wydajne i niezawodne oraz pozwala na automatyczną ekstrakcję kwasów nukleinowych. Jest to szczególnie przydatne w przypadku myszy ze śmiertelnością noworodków i ich hodowli, które wymagają wcześniejszego zakończenia genotypowania.

Szybkie genotypowanie zwierząt, a następnie tworzenie pierwotnych kultur neuronów mózgowych

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną i efektywną strategię usuwania bio-cząsteczek obecnych w próbkach 'touch DNA', wraz z ulepszonym protokołem amplifikacji obejmującym jednoetapową 5 μl mikroobjętościową lizę/amplifikację STR, aby umożliwić odzyskanie krótkich profili powtórzeń tandemowych (STR) dawcy (dawców) biocząstek.

Ulepszona analiza genetyczna pojedynczych ludzkich biocząstek odzyskanych za pomocą uproszczonej mikromanipulacji z dowodów kryminalistycznych "dotykowego DNA"

W tym artykule pokazujemy, jak przeprowadzana jest technika mikrobiopsji absorpcyjnej i jak próbka może być wykorzystana do ekstrakcji RNA w celu prostego i jednoczesnego pobierania próbek skóry i krwi w minimalnie inwazyjny sposób.

Chłonne pobieranie próbek mikrobiopsji i ekstrakcja RNA do minimalnie inwazyjnej, jednoczesnej analizy krwi i skóry

To jest protokół optymalnego przygotowania tkanek do analiz genomicznych, transkryptomicznych i proteomicznych nietoperzy złapanych na wolności. Obejmuje protokoły chwytania i preparacji nietoperzy, konserwacji tkanek i hodowli komórek tkanek nietoperzy.

Pobieranie tkanek od nietoperzy do analiz -omicznych i pierwotnej hodowli komórkowej

Obecny protokół przedstawia szybką, efektywną i delikatną metodę izolowania pojedynczych komórek odpowiednich do analizy sekwencyjnego RNA pojedynczej komórki z ciągle rosnących siekaczy, mysich zębów trzonowych i ludzkich zębów.

Szybka izolacja pojedynczych komórek z zębów myszy i ludzi

Protokół przedstawia serię najlepszych praktyk w zakresie pobierania proszku kostnego z ośmiu zalecanych miejsc pobierania próbek anatomicznych (konkretne miejsca na danym elemencie szkieletu) na pięciu różnych elementach szkieletu od średniowiecznych osobników (radiowęgiel datowany na okres ok. 1040-1400 CE, kalibrowany zakres 2-sigma).

Zoptymalizowane protokoły pobierania próbek kości w celu odzyskania starożytnego DNA ze szczątków archeologicznych

Tutaj prezentujemy prosty protokół nieinwazyjnego pobierania próbek genetycznych populacji motyli na podstawie zbierania w terenie resztek jaj. Może być używany do potwierdzania tożsamości gatunku i ilościowego określania zmienności genetycznej. Protokół ten można łatwo dostosować do szerszych grup w celu zaangażowania społeczności w naukę.

Rozmieszczenie naukowców w celu przeprowadzenia nieniszczących próbek genetycznych rzadkich populacji motyli

Poznaj nieinwazyjną metodę pobierania próbek włosów od amerykańskiego pika w celu analizy genetycznej bez zakłócania zwierząt. Technika ta umożliwia badania ekologii dzikiej przyrody i ochrony gatunków.

Nieinwazyjna technika pobierania próbek sierści w celu pozyskania wysokiej jakości DNA od trudnych do uchwycenia małych ssaków

Przeglądaj więcej filmów