Nieinwazyjna technika pobierania próbek włosów w celu uzyskania wysokiej jakości DNA od nieuchwytnych małych ssaków

Prezentujemy nieinwazyjne podejście do pobierania próbek włosów od nieuchwytnych małych ssaków, jak pokazano w przypadku szczupaka amerykańskiego. Pokazujemy użyteczność tej metody, ekstrahując DNA z próbek włosów i amplifikując kilka rodzajów markerów molekularnych powszechnie stosowanych w badaniach ekologii i ochrony dzikiej przyrody.

Genetycy zajmujący się populacją dzikich zwierząt coraz częściej stosują nieinwazyjne metody pobierania próbek w celu uzyskania danych od interesujących ich gatunków. Takie podejścia okazały się przydatne do badania kwestii związanych z zachowaniem, populacją, demografią i genetyką zwierząt, zwłaszcza u rzadkich i nieuchwytnych zwierząt, ale zdalne zbieranie materiałów biologicznych, takich jak włosy, naukowcy mogą badać zwierzęta bez przeszkadzania, krzywdzenia, a nawet obserwowania ich interesujących gatunków. Podczas gdy techniki te były stosowane głównie w przypadku średnich i dużych drapieżników, takich jak niedźwiedzie grizzly, mniej wysiłku skupiono na mniejszych ssakach roślinożernych, aby wypełnić tę lukę.

Opracowywane są nowe, innowacyjne metody pobierania próbek od małych ssaków. Ten artykuł wideo opisuje nowy i innowacyjny sposób dyskretnego pozyskiwania próbek włosów od małych zajęczaków zwanych American Pika. Te małe ssaki występują w pasmach górskich Ameryki Północnej, od Nowego Meksyku i Kalifornii po środkową Kolumbię Brytyjską.

Zamieszkują skaliste zsuwnie zwane Tala Slopes, które zapewniają schronienie przed drapieżnikami, a także ochronę przed ekstremalnymi warunkami środowiskowymi. Zwykle można je znaleźć na wysokościach przekraczających 2 500 metrów nad poziomem morza w południowej części ich zasięgu, ale można je również znaleźć na poziomie morza w najbardziej wysuniętej na północ części ich występowania. Piki nie hibernują.

Latem są aktywne przez cały dzień, ale koncentrują swoją aktywność na porankach i wieczorach. Gdy temperatury są niższe, zapuszczają się na łąki przylegające do zbocza Tali, aby wykuwać na sąsiedniej roślinności. Jedną ze szczególnych cech PIKA jest to, że nie je jedzenia na otwartej przestrzeni.

Zabiera go z powrotem na swoje terytorium w Tallis i przechowuje w stertach siana. Chociaż gatunek ten jest łatwy do wykrycia, jest z natury płochliwy i często unika żywych pułapek zastawionych przez badaczy. Co więcej, stwierdzono, że szczupaki są wrażliwe na obchodzenie się z nimi, co może skutkować śmiercią zwierzęcia w celu zbadania szeregu pytań ekologicznych, behawioralnych i ewolucyjnych.

W przypadku tego nieuchwytnego małego ssaka, jednocześnie minimalizując wpływ, doktorant Philippe Henry z kampusu Okanagan Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej opracował nieinwazyjną technikę pobierania próbek, która jest dobrze dopasowana do tego gatunku. Zanim zastawi pułapkę, szuka dowodów na istnienie aktywnych terytoriów PIKA na zboczu Tallis. Obejmuje to sterty siana, które są skrytkami roślinności, które zwierzę zbiera późnym latem, aby przetrwać wiedźmina i świeże odchody.

Zwykle znajduje się to w określonych miejscach lare. Po zidentyfikowaniu potencjalnego szczytu siedliska w obrębie tlu, nad jego wejściem strategicznie umieszcza się sidło do włosów. Za pomocą rolki taśmy pakowej Philippe umiejętnie zwija paski taśmy i układa je w sposób przypominający pajęczynę, aby je otoczyć.

Wejścia do pułapek kryjówek są wykonane w skomplikowanych projektach, które zapewniają otwór, który nie jest ani za duży, ani za mały, aby zwierzę mogło się przez nie zmieścić. Hipotetycznie szczupak przejdzie następnie przez sidła, pozostawiając próbkę włosów, kontynuując swoje codzienne zadania. Niezakłócony. Same włosy są bardzo cienkie z maleńką cebulką korzeniową.

Aby uzyskać przyzwoitą próbkę do analizy, pożądane jest co najmniej 25 włosów należących do tej samej osoby. Miejsca uderzenia muszą być również wyraźne wzdłuż taśmy. Zakłada się, że wszystkie, które są zgrupowane niezależnie, są odrębnymi osobami.

Podczas gdy zakłada się, że te zgrupowane razem są jednym i tym samym, zebrane włosy można następnie ostrożnie usunąć z taśmy za pomocą sterylnych kleszczy, nie naruszając struktury próbki, zwłaszcza cebulki korzeniowej, która zawiera najwyższe stężenie jądrowego DNA. Następnie włosy są ostrożnie umieszczane w dwumililitrowej probówce kriogenicznej i przechowywane w ciekłym nawozie azotowym, dopóki próbka nie dotrze do laboratorium w celu dalszej analizy. Po dotarciu do laboratorium próbka włosów jest odwirowywana w mikrowirówce, aby uniknąć utraty otworu włosowego DNA probówki jest ekstrahowane z próbek włosów za pomocą systemu Promega DNA IQ, pierwszym krokiem jest przygotowanie roztworu zawierającego 100 mikrolitrów buforu inkubacyjnego, 1,8 miligrama na mililitr proteinazy K i 0,1 mola DTT.

Następnie 100 mikrolitrów roztworu inkubacyjnego dodaje się do włosów i inkubuje w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez godzinę. Próbka jest następnie przetwarzana z 200 mikrolitrami buforu do lizy zawierającego 0,01 mola DTT i siedem mikrolitrów zawieszonej żywicy DNA IQ. Próbka jest następnie wirowana z dużą prędkością przez trzy sekundy i inkubowana w temperaturze pokojowej przez pięć do 10 minut.

Strawioną próbkę jest następnie wirowana przez dwie sekundy z dużą prędkością i umieszczana w stencie do separacji magnetycznej. W tym momencie żywica magnetyczna zawierająca fragmenty DNA jest natychmiast oddzielana od roztworu i formowana w osad na dnie probówki. Pozostały roztwór jest następnie usuwany i wyrzucany.

Następnie próbka jest ponownie traktowana 100 mikrolitrami wiru buforu do lizy i zawracana do stanowiska magnetycznego, gdzie następuje separacja. Ponownie ten sam krok jest następnie powtarzany trzy razy za pomocą bufora do mycia. Po ostatnim myciu próbkę pozostawia się do wyschnięcia w piasku magnetycznym na 15 minut.

Następnie do próbki dodano 100 mikrolitrów elucyjnych i inkubowano w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. Na koniec próbka jest wirowana przez dwie sekundy i umieszczana w stojaku magnetycznym. Roztwór DNA jest następnie przenoszony do 1,5-mililitrowej probówki einor i przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Do czasu dalszej analizy, nazywam się Peter Bohi. Jestem doktorantem w laboratorium Genomiki Ekologicznej i Konserwatorskiej dr Michaela Rosso na kampusie University of British Columbia Okanagan. DNA wyekstrahowane z włosów, od których pobraliśmy próbki tego lata, zostało następnie wykorzystane do PCR, czyli amplifikacji różnych typów markerów molekularnych.

Wykorzystaliśmy również próbki wątroby jako pozytywną kontrolę i podstawę. Dla porównania naszej metody amplifikowaliśmy jądrowe loci mikrosatelitarne, które zostaną wykorzystane do badania populacji, struktury genetycznej naszego zwierzęcia, a także skany genomowe A FLP, które zostaną wykorzystane do zbadania adaptacji podłoża genetycznego wzdłuż gradientu wysokościowego. Amplifikowaliśmy również sekwencje mitochondrialnego DNA do 800 podstawowych niedźwiedzi, które można wykorzystać do badania filogeografii gatunku, a także stosujemy molekularne narzędzie do określania płci oparte na sekwencjach palców cynkowych i P-C-R-R-F-L-P w celu identyfikacji płci osobników w naszych populacjach.

We wszystkich badanych markerach DNA wyekstrahowane z próbek włosów i wątroby uzyskało porównywalne poziomy sekwencji DNA i jakości genotypu. W tym filmie wykazaliśmy, że ta nieinwazyjna metoda pobierania próbek, w połączeniu z protokołem ekstrakcji DNA IQ, jest skuteczna, uzyskując odpowiednią ilość włosów, które dają DNA o wystarczającej jakości i ilości do amplifikacji PCR. Ogólnie rzecz biorąc, przewidujemy, że metoda ta będzie przydatna w ułatwianiu gromadzenia danych wspierających badania populacyjne, genetyczne i behawioralne rzadkich lub nieuchwytnych małych ssaków, przy jednoczesnym zminimalizowaniu wpływu na badane gatunki.