Technika oparta na pomiarze impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do pomiaru inwazji monowarstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe

W niniejszym filmie zaprezentowano metodę monitorowania inwazji warstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe z wykorzystaniem techniki opartej na pomiarze impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym. Najpierw ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej, określane jako VE, osadza się w 16-dołkowych płytkach EPL z elektrodami złota na dnie dołków. Aby wytworzyć konfluencyjną monowarstwę, dodaje się komórki nowotworowe, które przywierają do VE i wnikają w monowarstwę HVAC, rozrywając połączenia między komórkami śródbłonka. Następnie rejestruje się odczyty impedancji, które zależą od całkowitej powierzchni dna dołka pokrytej komórkami.

Zakres inwazji można następnie określić na podstawie zmian impedancji elektrycznej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy z komorą próżniową i METROGEL, jest to, że oddziaływania komórek śródbłonka z komórkami nowotworowymi ściślej naśladują proces przerzutowania in vivo, a dane są pozyskiwane w czasie rzeczywistym i są łatwiejsze do ilościowego określenia w przeciwieństwie do analizy końcowej stosowanej w innych metodach. Metoda ta pozwala zatem na uzyskanie wglądu w inwazję komórek rakowych.

Metodę tę można zastosować również w innych układach, na przykład do badania oddziaływań międzykomórkowych w układzie odpornościowym. Ponadto wstępna faza eksperymentu, podczas której obserwujemy wzrost komórek UX, może służyć do oceny proliferacji dowolnej linii komórkowej bez konieczności przeprowadzania dalszych etapów inwazji; procedurę tę zaprezentuje Rahim, doktorant z mojego laboratorium. Wszystkie etapy niniejszego protokołu powinny być wykonywane w warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

System Xcel wykorzystany w tym doświadczeniu jest przechowywany na stałe w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, który przy pierwszym użyciu tego urządzenia jest przeznaczony wyłącznie dla niego. Instrument należy pozostawić w inkubatorze przez co najmniej 16 godzin w celu wyrównania temperatury i wilgotności do warunków otoczenia. Następnie należy przygotować Thence EPL 16, pokrywając go 0,1% żelatyną przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.

Po pokryciu płytki należy ją raz przemyć PBS. Następnie dodać 100 µL zrekonstytuowanego medium e gm two w celu wykonania pomiaru tła, aby zmierzyć impedancję w nieobecności komórek.

Umieść płytkę EPL w systemie Excel agent na komputerze. Otwórz oprogramowanie Excel agent, klikając ikonę oprogramowania RTCA na pulpicie w oknie programu. Kliknij kartę układu (layout) i zaznacz dołki zawierające próbki.

Aby zaprogramować częstotliwość akwizycji danych w czasie rzeczywistym, należy kliknąć kartę schedule, a następnie ikonę add a step. Parametr sweeps określa liczbę odczytów, a intervals wskazuje odstęp czasu między odczytami. Wartości te są automatycznie ustawione odpowiednio na 1 oraz 1.00 minute.

Ta czynność programuje system do wykonania odczytu tła. Kliknij „add a step”, a następnie wprowadź 300 w polu „sweeps” i 10 minutes w polu „intervals”. Zaprogramuje to urządzenie do wykonywania pomiarów impedancji przez maksymalnie 50 hours.

Aby rozpocząć eksperyment, należy kliknąć ikonę rozpoczęcia kroku. Po przeprowadzeniu pomiaru tła zostanie zmierzona impedancja tła dla każdej studzienki. W oknie wyświetli się komunikat.

Aby przejść do następnego kroku, należy kliknąć przycisk. Kliknij, aby rozpocząć następny krok. W tym momencie można dodać komórki i monitorować tworzenie się monowarstwy zgodnie z opisem.

W następnej sekcji komórki endotelialne żyły pępowinowej człowieka lub VE wykorzystane w tym badaniu są hodowane w pożywce EGM two zrekonstytuowanej za pomocą zestawu EGM two bullet kit zawierającego suplementy czynników wzrostu oraz 5% FBS. Komórki należy utrzymywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide. W dniu eksperymentu należy sprawdzić konfluencję HUVEC pod mikroskopem. Komórki powinny być o niskim numerze pasażu, najlepiej nie więcej niż sześć, i wykazywać konfluencję poniżej 75%. Aby uzyskać monowarstwę HUVEC, komórki należy zebrać za pomocą trypsyny. Po odklejeniu się komórek od kolby, wszystkie ślady trypsyny należy usunąć poprzez wirowanie przy 200 G. Po wirowaniu komórki należy raz przemyć PBS.

Następnie resuspender komórki i zrekonstytuowane medium E GM two do stężenia 2,5 × 10⁵ komórek na mililitr. Po resuspensji komórek wyjąć skalibrowaną płytkę EPL z systemu EXOGEN i dodać 100 µL zawiesiny HX do 100 µL medium E GM two znajdującego się już w płytce. Natychmiast umieścić płytkę EPL w analizatorze komórek systemu Excel.

Rozpocznij pomiar impedancji, klikając przycisk start kroku w oknie oprogramowania. Pozostaw komórki śródbłonka do wzrostu. System będzie kontynuował pomiary impedancji co 10 minut.

Komórki Uve wykazują charakterystyczne przejściowe spłaszczenie indeksu komórkowego od czterech do sześciu godzin po wysianiu, po czym następuje kolejna stabilizacja po 16–18 godzinach. Dlatego ważne jest, aby pozwolić komórkom na utworzenie konfluentnej warstwy jednowarstwowej przez co najmniej 18 godzin. Po uformowaniu się monowarstwy można dodać komórki naciekające w ramach przygotowania do testu inwazji.

Przygotuj naciekające komórki nowotworowe. W tym przypadku zastosowano komórki osteosarkoma. Rozpocznij od zebrania komórek za pomocą trypsyny.

Usuń wszystkie ślady trypsyny, wirując komórki przy 200 G i płucząc je raz za pomocą PPS. Po zakończeniu płukania resuspenduj komórki do końcowej gęstości 1 × 10⁵ komórek/ml w medium użytym do hodowli komórek nowotworowych, np. w medium RPMI lub DMEM zawierającym 10% FBS. Wstrzymaj eksperyment, klikając ikonę pauzy w oknie oprogramowania.

Usunąć EPL i odessać pożywkę EGM two z monowarstwy VAC. Dodać 100 µL zawiesiny komórek nowotworowych zawierającej 1×10⁴ komórek. Zazwyczaj dla tego testu najlepiej sprawdza się stosunek komórek nowotworowych do komórek śródbłonka wynoszący 1:2,5.

Można jednak zoptymalizować ten stosunek dla poszczególnych linii komórkowych. Umieść EPL z powrotem w systemie Excel agent w inkubatorze. Kliknij krok kontynuacji, aby kontynuować pomiary impedancji w odstępach 10 minutowych.

Monitoruj inwazję w czasie rzeczywistym przez następne 6 do 12 godzin. Spadek indeksu komórkowego będzie wynikał z rozszczelnienia połączeń śródbłonkowych i penetracji przez naciekające komórki nowotworowe. Po zakończeniu eksperymentu użyj oprogramowania Exergen, aby znormalizować wyniki do momentu dodania naciekających komórek nowotworowych.

Oprogramowanie exergen umożliwia normalizację do dowolnego punktu czasowego, w którym VEX były hodowane w systemie exergen, co pokazano w tym filmie; po utworzeniu monowarstwy dodano komórki K seven M two lub K 12. Jak widać tutaj, w ciągu kilku godzin od wprowadzenia komórek K seven M two następuje gwałtowny spadek indeksu komórkowego. K seven M two to wysoce metastatyczna linia komórkowa osteosarkoma.

Komórki te wykazują wysoki poziom ekspresji białka łączącego cytoszkielet ene, co odpowiada za właściwości inwazyjne tej linii komórkowej. Z kolei komórki K 12 wykazują mniejszy potencjał przerzutowy i nie są w stanie przenikać przez monowarstwę śródbłonka tak efektywnie, jak komórki K seven M two. Przejawia się to mniej głębokim spadkiem indeksu komórkowego, co przedstawiono tutaj.

Przedstawiona tutaj kontrola reprezentuje impedancję monowarstwy komórek śródbłonka naczyniówki. W przypadku braku komórek nowotworowych eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat pomiaru inwazji w czasie rzeczywistym poprzez wytworzenie monowarstwy komórek śródbłonka i poddanie jej działaniu komórek nowotworowych.

Wstępne etapy eksperymentu obejmujące tworzenie monowarstwy HU XL mogą być wykorzystane do oceny proliferacji komórek za pomocą impedancji. Dwa.