Technika oparta na impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do pomiaru inwazji monowarstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe

Ten artykuł opisuje technikę in vitro do monitorowania komórek rakowych atakujących przez monowarstwę komórek śródbłonka. Dane są pozyskiwane w czasie rzeczywistym w funkcji zmian impedancji na powierzchni elektrod na dnie odwiertu.

Ten film przedstawia metodę monitorowania inwazji monowarstwy komórek śródbłonka przez komórki rakowe przy użyciu techniki opartej na impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym. Po pierwsze, ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej określane jako VE są umieszczone w 16 dołkach EPL pokrytych złotymi elektrodami na dnie studzienki. Aby wygenerować zlewającą się monowarstwę, dodaje się komórki rakowe, które przyczepiają się do VE i atakują monowarstwę HVAC, przerywając połączenia komórek śródbłonka Następnie uzyskuje się odczyty impedancji, które zależą od całkowitej powierzchni dna studni pokrytej komórkami.

Zakres inwazji można następnie określić na podstawie zmian impedancji elektrycznej. Główną zaletą tej techniki lub istniejących metod, takich jak komora pustki i testy METROGEL, jest to, że interakcje komórek nowotworowych śródbłonka bardziej naśladują proces przerzutowy in vivo, a dane są uzyskiwane w czasie rzeczywistym i są łatwiejsze do oszacowania w przeciwieństwie do analizy końcowej w przypadku innych metod. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w inwazję komórek rakowych.

Może być również stosowany w innych systemach, takich jak badanie interakcji komórek komórkowych w układzie odpornościowym. Co więcej, początkowa faza eksperymentu, w której obserwujemy wzrost komórek UX, może być wykorzystana do oceny proliferacji komórek dowolnej linii komórkowej bez dalszych etapów inwazji demonstrujących procedurę, którą ośrodek Rahim będzie miał doktorant z mojego laboratorium. Wszystkie etapy tego protokołu powinny być wykonywane w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli tkankowej.

System Xcel użyty w tym eksperymencie jest stale przechowywany w inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%, przeznaczonym wyłącznie dla tego instrumentu przy pierwszym użyciu. Przyrząd należy pozostawić w inkubatorze na co najmniej 16 godzin, aby zrównoważyć się z nowym środowiskiem temperatury i wilgotności. Następnie przygotuj stamtąd EPL 16, pokrywając go 0,1% żelatyną przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po pokryciu płytki umyj ją raz PBS. Następnie dodać 100 mikrolitrów odtworzonego e gm dwa podłoża, aby wykonać ślepy odczyt. Do pomiaru impedancji tła przy braku komórek.

Umieść EPL w systemie agenta Excel na komputerze. Otwórz oprogramowanie agenta Excel, klikając ikonę oprogramowania RTCA na pulpicie w oknie oprogramowania. Kliknij zakładkę układu i wybierz studzienki zawierające próbki.

Aby zaprogramować częstotliwość pozyskiwania danych w czasie rzeczywistym. Kliknij zakładkę harmonogramu, a następnie kliknij ikonę dodawania kroku, która omiata wskazuje liczbę odczytów, a interwały wskazują odstęp czasu między odczytami. Są one automatycznie ustawiane odpowiednio na jedną i 1,00 minuty.

Spowoduje to zaprogramowanie systemu do wykonywania odczytu w tle. Kliknij dodaj krok i wprowadź 300 w polu zamiatania i 10 minut w polu interwałów. Spowoduje to zaprogramowanie przyrządu do wykonywania pomiarów impedancji przez okres do 50 godzin.

Aby rozpocząć eksperyment, kliknij ikonę rozpoczęcia kroku. Impedancja tła każdej studni zostanie zmierzona po wykonaniu pomiaru tła. W oknie zostanie wyświetlony komunikat.

Gotowy do następnego kroku, kliknij. Następny krok, aby rozpocząć. W tym czasie można dodawać komórki i monitorować tworzenie się monowarstwy zgodnie z opisem.

W następnej sekcji ludzka żyła pępowinowa, komórki śródbłonka lub VE są hodowane w pożywce EGM dwie odtworzone za pomocą zestawu EGM two bullet kit zawierającego suplementy czynników wzrostu, a 5% komórek FBS należy utrzymywać w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności 5% dwutlenku węgla. W dniu eksperymentu sprawdź płynność HUB E Pod mikroskopem komórki powinny mieć niską liczbę przejścia, najlepiej nie większą niż sześć i mniej niż 75% płynności, aby wytworzyć odcień, jednowarstwowe zbieranie komórek za pomocą trypsyny. Po odłączeniu komórek od kolby, wszystkie ślady trypsyny powinny zostać usunięte przez odwirowanie w stężeniu 200 G. Po odwirowaniu przemyć komórki raz PBS.

Następnie ponownie zawiesić komórki i rozpuszczono je GM dwa podłoża do stężenia 2,5 razy 10 do piątej komórki na mililitr. Po ponownym zawieszeniu komórek należy usunąć skalibrowany w tle EPL z systemu EXOGEN i dodać 100 mikrolitrów zawiesiny HX do 100 mikrolitrów E GM dwóch pożywek znajdujących się już w płytce. Natychmiast umieść EPL w analizatorze komórek systemu Excel.

Rozpocznij pobieranie odczytów impedancji, klikając przycisk kroku startu w oknie oprogramowania. Pozwól komórkom śródbłonka rosnąć. System będzie kontynuował odczytywanie impedancji co 10 minut.

Uve wykazują charakterystyczne przejściowe spłaszczenie indeksu komórkowego od czterech do sześciu godzin po wysiewie, po którym następuje kolejna stabilizacja po 16 do 18 godzinach. Dlatego ważne jest, aby pozwolić komórkom uformować zlewającą się monowarstwę przez co najmniej 18 godzin. Po utworzeniu monowarstwy nadszedł czas, aby dodać inwazyjne komórki w ramach przygotowań do testu inwazji.

Przygotuj atakujące komórki nowotworowe. Tutaj stosuje się komórki kostniakomięsaka. Zacznij od zebrania komórek za pomocą trypsyny.

Usuń wszelkie ślady trypsyny, obracając komórki pod ciśnieniem 200 G i przemywając raz PPS. Po przepłukaniu ponownie zawiesić komórki, podczas gdy końcowa gęstość wynosi od jednego razy 10 do piątej komórki na mililitr w pożywce używanej do wzrostu komórek nowotworowych, takiej jak pożywka RPMI lub DMEA zawierająca 10% FBS. Wstrzymaj eksperyment, klikając ikonę kroku pauzy w oknie oprogramowania.

Usuń EPL i zassaj pożywkę EGM two z monowarstwy próżniowej. Dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek nowotworowych zawierającej jeden razy 10 do czwartej komórki. Ogólnie rzecz biorąc, stosunek od jednej do 2,5 komórek nowotworowych do komórek śródbłonka najlepiej sprawdza się w teście.

Jednak stosunek ten można zoptymalizować dla poszczególnych linii komórkowych. Umieść EPL z powrotem w systemie agentów Excel w inkubatorze. Kliknij krok kontynuacji, aby kontynuować odczytywanie impedancji w odstępach 10-minutowych.

Monitoruj inwazję w czasie rzeczywistym przez następne sześć do 12 godzin. Spadek indeksu komórkowego będzie wynikał z cofnięcia się połączeń śródbłonka i penetracji przez atakujące komórki nowotworowe. Po zakończeniu eksperymentu użyj oprogramowania exergen, aby znormalizować wyniki do czasu dodania inwazyjnych komórek nowotworowych.

Oprogramowanie exergen pozwala na normalizację do dowolnego punktu czasowego, w którym VEX były hodowane w systemie exergen, jak pokazano na tym filmie, a po utworzeniu monowarstwy dodano komórki K seven M two lub K 12. Jak pokazano tutaj, gwałtowny spadek indeksu komórkowego następuje w ciągu kilku godzin od wprowadzenia K siedem M dwie komórki. K seven M two to linia komórkowa kostniakomięsaka z silnymi przerzutami.

Komórki te wyrażają wysoki poziom białka łącznikowego cytoszkieletu ene, które odpowiada za inwazyjne właściwości linii komórkowej. Z drugiej strony komórki K 12 są mniej przerzutowe i nie są w stanie przeniknąć do monowarstwy śródbłonka tak skutecznie, jak komórki K 7 M dwa. Jest to reprezentowane przez mniej głęboki spadek indeksu komórki, jak pokazano tutaj.

Pokazany tutaj element sterujący reprezentuje impedancję monowarstwy uve. Wobec braku komórek nowotworowych eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć inwazję w czasie rzeczywistym, generując monowarstwę komórek śródbłonka i kwestionując monowarstwę komórkami rakowymi.

Wstępne etapy eksperymentu polegającego na tworzeniu monowarstwy HU XL można wykorzystać do oceny proliferacji komórek za pomocą impedancji. Dwa.