Name: Technika oparta na impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do pomiaru inwazji monowarstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj technikę impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do monitorowania inwazji komórek nowotworowych przez warstwę komórek śródbłonka HUVEC. Metoda umożliwia ilościową analizę interakcji komórkowych naśladujących procesy przerzutowe in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została hojnie wsparta funduszami z Children's Cancer Foundation (Baltimore, MD), Brandon Carrington Lee Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) oraz NIH (R01CA108641). 
Pragniemy podziękować dr. Antona Wellsteina oraz członkom jego laboratorium za podzielenie się doświadczeniem i pomoc w optymalizacji przedstawionych metod.

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Wszystkie etapy należy przeprowadzić w warunkach sterylnych w komorze do hodowli tkanek.</li>
 <li>Stację xCELLigence umieszcza się w inkubatorze w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. </li>
 <li>Należy użyć komórek HUVEC o niskim numerze pasażu, najlepiej nieprzekraczającym pasażu 6. Należy również upewnić się, że w momencie zbioru konfluencja komórek nie przekracza 75%. </li>
 <li>Komórki HUVEC hodowane są w pożywce EGM-2 przygotowanej z zestawu EGM-2 bullet kit (Lonza Biosciences) zawierającego czynniki wzrostu, suplementy oraz 5% płodowej surowicy bydlęcej. </li>
 <li>Wszelkie ślady trypsyny należy usunąć z zawiesin komórkowych poprzez wirowanie komórek z prędkością 200xg, jednorazowe przemycie PBS i ponowne zawieszenie ich do wskazanych gęstości komórkowych. </li>
 <li>Płytkę xCELLigence E-plate 16 pokrywa się 0,1% żelatyną przez 1 godzinę w 37°C lub przez noc w 4°C. Płytkę przemywa się PBS i dodaje 100μL przygotowanej pożywki EGM-2. W systemie xCELLigence wykonuje się pomiar tła w celu zmierzenia impedancji bazowej w nieobecności komórek. </li>
 
</ol>
2. Tworzenie monowarstwy HUVEC

<ol>
	<li>Zbiór subkonfluentnych komórek HUVEC z kolby za pomocą trypsynizacji. Komórki zawiesić ponownie w zrekonstytuowanym medium EGM-2 do końcowego zagęszczenia 2.5 x 105 komórek/ml. </li>
 <li>Do każdego dołka skalibrowanej płyty E-plate zawierającej 100μL medium EGM-2 dodać 100μL zawiesiny komórek HUVEC (2.5 x 104 komórek HUVEC).</li>
 <li>Bezzwłocznie umieścić płytę E-Plate w urządzeniu xCELLigence.</li>
 <li>Zaprogramować oprogramowanie xCELLigence tak, aby pomiary impedancji były wykonywane w odstępach 10-minutowych. </li>
 <li>Inkubować komórki śródbłonka przez 18-21 godzin, aż utworzą monowarstwę, co objawi się spłaszczeniem indeksu komórkowego (Rysunek 2).</li>
</ol>

3. Dodanie komórek naciekających i normalizacja danych.
<ol>
	<li>Po uformowaniu stabilnej monowarstwy HUVEC, zebrać komórki nowotworowe poprzez trypsynizację i resuspender do końcowego zagęszczenia 1 x 105 cells/ml w pożywce stosowanej do hodowli komórek nowotworowych (takiej jak RPMI lub DMEM zawierającej 10% FBS)</li>
 <li>Wstrzymać odczyty impedancji w oprogramowaniu xCELLigence i wyjąć E-Plate ze stacji.</li>
 <li>Usunąć pożywkę EGM-2 poprzez aspirację. Dodać 100μL zawiesiny komórek nowotworowych zawierającej 1 x 104 cells. Zazwyczaj dla tego testu najlepiej sprawdza się stosunek wysianych komórek nowotworowych do komórek śródbłonka wynoszący 1:2.5. Stosunek ten można jednak zoptymalizować dla poszczególnych linii komórkowych.</li>
 <li>Umieścić E-plate w systemie xCELLigence w inkubatorze i kontynuować odczyty impedancji w odstępach 10-minutowych.</li>
 <li>Inwazję można monitorować w czasie rzeczywistym przez kolejne 6-12 godzin jako spadek indeksu komórkowego wynikający z retrakcji połączeń śródbłonkowych i penetracji przez naciekające komórki nowotworowe.</li>
 <li>Znormalizować wyniki do momentu dodania naciekających komórek nowotworowych. Oprogramowanie xCELLigence umożliwia normalizację do dowolnego punktu czasowego, a wyniki można bezpośrednio wyświetlić w oknie programu.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki: 
Przykład inwazji monowarstwy HUVEC przez komórki przerzutowe i nieprzerzutowe przedstawiono na rysunku 3. K7M2 to przerzutowa linia komórkowa osteosarcoma. Komórki te wykazują wysoką ekspresję białka łączącego cytoszkielet – ezryny, co odpowiada za właściwości inwazyjne tej linii komórkowej13,14. Po wprowadzeniu komórek K7M2 do hodowli HUVEC, w ciągu 6 godzin następuje spadek oporu elektrycznego. Spadek ten reprezentuje inwazję monowarstwy HUVEC przez naciekające komórki nowotworowe. Z kolei linia komórkowa K12 wykazuje znacznie niższą ekspresję ezryny i w konsekwencji jest mniej przerzutowa13. Wprowadzenie komórek K12 do monowarstwy HUVEC skutkuje mniej gwałtownym spadkiem oporu, ponieważ komórki te nie są w stanie przylegać do monowarstwy HUVEC ani przez nią przenikać (rysunek 3).

<img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig1.jpg" alt="Test inwazji monowarstwy HUVEC: schemat przedstawiający analizę komórek nowotworowych z wykorzystaniem systemu xCELLigence RTCA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat przebiegu procesu inwazji komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe. Komórki HUVEC są wysiewane na płytki E pokryte żelatyną i pozostawione do utworzenia konfluentnej monowarstwy. Po uformowaniu się monowarstwy dodawane są komórki złośliwe, a inwazja jest monitorowana w czasie rzeczywistym poprzez zmiany indeksu komórkowego wynikające z inwazji w monowarstwę śródbłonka.

<img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig2.jpg" alt="Wykres tworzenia monowarstwy HUVEC; indeks komórkowy w funkcji czasu, analiza wzorca wzrostu komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Tworzenie monowarstwy HUVEC. Zmiany indeksu komórkowego podczas przylegania i rozprzestrzeniania się komórek HUVEC na pokrytych żelatyną złotych elektrodach. Utworzenie zlewnej monowarstwy jest reprezentowane przez stabilizację indeksu komórkowego po 18 godzinach. 

<img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig3.jpg" alt="Wykres dynamiki inwazji; K7M2, K12 w komórkach HUVEC; indeks komórkowy w funkcji czasu, analiza danych porównawczych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Inwazja komórek HUVEC przez komórki osteosarcoma K7M2 i K12. Gwałtowny spadek indeksu komórkowego następuje w ciągu kilku godzin od wprowadzenia wysoko metastatycznych komórek K7M2. Z kolei komórki K12 wykazują mniejszy potencjał metastatyczny i nie są w stanie przenikać przez monowarstwę śródbłonka tak efektywnie jak komórki K7M2. Przejawia się to mniej gwałtownym spadkiem indeksu komórkowego w przypadku wystawienia monowarstwy HUVEC na działanie komórek K12. Kontrola reprezentuje impedancję monowarstwy HUVEC w obecności komórek nowotworowych. Doświadczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach.

<ol><li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+The+metastasis+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer. The metastasis cascade.</a> Science. 321, 1785-1787 (2008).</li>
<li>Chiang, A. C., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of metastasis.</a> N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).</li>
<li>Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+cancer+cells+and+the+endothelium+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis.</a> J Pathol. 190, 310-329 (2000).</li>
<li>Bacac, M., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+cancer+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Metastatic cancer cell.</a> Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).</li>
<li>Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+signals+from+the+invasive+front%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">New signals from the invasive front.</a> Nature. 441, 444-450 (2006).</li>
<li>Kramer, R. H., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+tumor+cells+with+vascular+endothelial+cell+monolayers%3A+a+model+for+metastatic+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromotion+of+mammalian+cells+measured+electrically%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Micromotion of mammalian cells measured electrically.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).</li>
<li>Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+method+for+detection+of+endothelial+cell+shape+change+in+real+time%3A+assessment+of+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).</li>
<li>Whipple, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+promotes+tubulin+Detyrosination+and+Microtentacles+that+enhance+endothelial+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement.</a> Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).</li>
<li>Boyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-microelectronic+sensing+technique+for+profiling+cytotoxicity+of+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals.</a> Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).</li>
<li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li>
<li>Ren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin-cytoskeleton+linker+protein+ezrin+is+regulated+during+osteosarcoma+metastasis+by+PKC%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC.</a> Oncogene. 28, 792-802 (2009).</li>
</ol>

Koszty publikacji niniejszego manuskryptu zostały uprzejmie sfinansowane przez Roche Applied Science.

Test inwazji komórek HUVEC w czasie rzeczywistym to prosta, a zarazem potężna metoda monitorowania inwazji. Dostarcza ona wyników w czasie rzeczywistym, co stanowi istotną przewagę nad innymi tradycyjnymi technikami opierającymi się na analizie punktu końcowego. Test ten można modyfikować w celu badania leków, przeciwciał, ligandów i białek jako inhibitorów lub stymulatorów przerzutowania. Można również ocenić wpływ różnych czynników na interakcje typu cross-talk między komórkami śródbłonka a komórkami nowotworowymi. Podczas wprowadzania egzogennych czynników, takich jak czynniki wzrostu i leki, do pożywki hodowlanej, należy upewnić się, że nie wpływają one na integralność monowarstwy HUVEC. Przerwanie ciągłości monowarstwy HUVEC można sprawdzić, wprowadzając czynnik egzogenny w obecności samych komórek HUVEC (bez komórek inwazyjnych) i upewniając się, że indeks komórkowy nie uległ zmianie. W związku z tym w projekcie doświadczalnym należy uwzględnić odpowiednie kontrole.
Różne linie komórkowe wykazują odmienne krzywe indeksu komórkowego podczas tworzenia zgodnej warstwy jednowarstwowej. Kształt krzywej, jak również osiągnięty maksymalny indeks komórkowy, są specyficzne dla danego typu komórek. Komórki HUVEC wykazują charakterystyczne przejściowe spłaszczenie indeksu komórkowego 4–6 godzin po wysianiu, po czym następuje ponowna stabilizacja przy wyższym indeksie komórkowym po 16–18 godzinach. Dlatego istotne jest, aby pozwolić komórkom na utworzenie zgodnej warstwy jednowarstwowej przez co najmniej 18 godzin przed dodaniem komórek nowotworowych.
Ponieważ indeks komórkowy zależy od środowiska jonowego na styku elektroda/komórka, na jego wartość – oprócz powierzchni dna studzienki zajętej przez komórki – wpływają różne czynniki, takie jak morfologia komórek oraz jakość adhezji międzykomórkowych. Zatem spadek indeksu komórkowego, który następuje podczas inwazji komórek nowotworowych, jest funkcją kilku czynników, w tym retrakcji połączeń śródbłonkowych i następującej po niej inwazji komórek nowotworowych.
Instrument xCELLigence jest produkowany w trzech różnych konfiguracjach: real time cell analyzer (RTCA) SP, RTCA MP oraz RTCA DP. Instrument RTCA SP mieści jedną płytkę E-plate z 96 dołkami, natomiast instrument RTCA MP może pomieścić do sześciu płytek E-plate z 96 dołkami jednocześnie. Umożliwia to wysokoprzepustowy screening leków i związków chemicznych. Eksperymenty w niniejszym artykule zostały wykonane przy użyciu instrumentu RTCA DP, który może pomieścić trzy płytki E-plate z 16 dołkami. Każda stacja trzymająca płytkę E-plate może być obsługiwana niezależnie, co pozwala wielu użytkownikom na jednoczesne przeprowadzanie eksperymentów. Instrument RTCA DP może być również wykorzystywany do badania migracji z użyciem płytek CIM. Są to płytki z 16 dołkami z komorami górną i dolną, oddzielonymi membraną z politereftalanu etylenu (PET) o średnicy porów 8um. Czujniki elektroniczne znajdują się pod porowatą membraną komory górnej. Komora dolna służy jako rezerwuar chemoatraktanta dla komórek znajdujących się w komorze górnej. Jednak istotną zaletą testu inwazji HUVEC w porównaniu z płytkami CIM jest to, że inwazja komórek nowotworowych w pierwszym przypadku nie jest ograniczona rozmiarem porów, ponieważ inwazja komórek śródbłonka zależy od interakcji (cross-talk) między komórkami nowotworowymi a śródbłonka.
Test inwazji HUVEC można przeprowadzić również na urządzeniu ECIS Z, produkowanym przez Applied Biophysics (Troy, NY). Urządzenie ECIS Z wykorzystuje technologię podobną do urządzenia xCELLigence, z różnicami w konfiguracji macierzy i elektrod. Z sukcesem przeprowadziliśmy testy inwazji HUVEC przy użyciu 8-dołkowych macierzy ECIS. Należy zauważyć, że powierzchnia dna dołka w macierzach ECIS jest większa, co wymaga wysiania większej liczby komórek śródbłonka i komórek nowotworowych: odpowiednio 2.5 x 105 oraz 1 x 105 komórek.

<table><tbody><tr><td>stacja xCELLigence RTCA DP</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Group</a></td><td>05469759001</td><td></td></tr><tr><td>jednostka sterująca RTCA</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Group</a></td><td>05454417001</td><td>Laptop z preinstalowanym oprogramowaniem RTCA</td></tr><tr><td>E-Plate 16</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Group</a></td><td>05469830001</td><td></td></tr><tr><td>komórki HUVEC</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>pożywka EGM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>zestaw EGM-2 bullet kit</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>0.1% żelatyna w sterylnym H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>EMD Millipore</td><td>MCPROTO045</td><td></td></tr></tbody></table>

technika oparta na pomiarze impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do pomiaru inwazji monowarstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Przerzuty złośliwych komórek wymagają degradacji błony podstawnej, przytwierdzenia komórek nowotworowych do śródbłonka naczyniowego, cofnięcia połączeń śródbłonkowe oraz wreszcie inwazji i migracji komórek nowotworowych przez warstwę śródbłonka, aby przedostać się do krwiobiegu, który służy jako środek transportu do odległych miejsc w organizmie gospodarza1-3. Po dostaniu się do układu krwionośnego komórki nowotworowe przylegają do ścian naczyń kapilarnych i przenikają do otaczających tkanek, tworząc guzy przerzutowe4,5. Różne komponenty interakcji między komórkami nowotworowymi a komórkami śródbłonka można odtworzyć in vitro, poddając monowarstwę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępnej (HUVEC) działaniu komórek nowotworowych. Badania przeprowadzone za pomocą mikroskopii elektronowej i fazokontrastowej sugerują, że in vitro sekwencja zdarzeń dość wiernie oddaje proces przerzutowania in vivo6. W niniejszej pracy opisujemy technikę opartą na impedancji elektrycznej, która monitoruje i kwantyfikuje w czasie rzeczywistym inwazję komórek śródbłonka przez złośliwe komórki nowotworowe.
Giaever i Keese jako pierwsi opisali technikę pomiaru fluktuacji impedancji podczas wzrostu populacji komórek na powierzchni elektrod7,8. Instrument xCELLigence, produkowany przez firmę Roche, wykorzystuje podobną technikę do pomiaru zmian impedancji elektrycznej w miarze, gdy komórki przywierają i rozprzestrzeniają się w naczyniu hodowlanym pokrytym złotą matrycą mikroelektrod, która zajmuje około 80% powierzchni dna dołka. Przywieranie i rozprzestrzenianie się komórek na powierzchni elektrod prowadzi do wzrostu impedancji elektrycznej9-12. Impedancję przedstawia się jako bezwymiarowy parametr zwany indeksem komórkowym (cell-index), który jest wprost proporcjonalny do całkowitej powierzchni dołka hodowlanego pokrytej komórkami. W związku z tym indeks komórkowy może być wykorzystany do monitorowania adhezji, rozprzestrzeniania się, morfologii oraz gęstości komórek.
Test inwazyjności opisany w niniejszym artykule opiera się na zmianach impedancji elektrycznej na interfazie elektroda/komórka, gdy populacja komórek złośliwych nacieka monowarstwę HUVEC (Rysunek 1). Rozpad połączeń śródbłonkowych, retrakcja monowarstwy śródbłonka i zastąpienie jej komórkami nowotworowymi prowadzą do znacznych zmian impedancji. Zmiany te korelują bezpośrednio z potencjałem inwazyjnym komórek nowotworowych, tzn. inwazja komórek o wysokiej agresywności prowadzi do dużych zmian impedancji komórkowej i odwrotnie. Technika ta zapewnia dwukrotną przewagę nad istniejącymi metodami pomiaru inwazyjności, takimi jak testy w komorze Boydena czy testy z Matrigel: 1) oddziaływanie między komórkami śródbłonka a komórkami nowotworowymi dokładniej odwzorowuje proces in vivo, a 2) dane są pozyskiwane w czasie rzeczywistym i są łatwiejsze do kwantyfikacji, w przeciwieństwie do analizy punktu końcowego stosowanej w innych metodach.

Niniejszy artykuł opisuje technikę in vitro służącą do monitorowania naciekania komórek nowotworowych przez monowarstwę komórek śródbłonka. Dane są pozyskiwane w czasie rzeczywistym jako funkcja zmian impedancji na powierzchni elektrod znajdujących się na dnie studzienki.

Technika oparta na pomiarze impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do pomiaru inwazji monowarstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe

Przerzutnicza dysseminacja komórek nowotworowych wymaga degradacji błony podstawnej, przylegania komórek nowotworowych do śródbłonka naczyniowego, retrakcji...

W niniejszym filmie zaprezentowano metodę monitorowania inwazji warstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe z wykorzystaniem techniki opartej na pomiarze impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym. Najpierw ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej, określane jako VE, osadza się w 16-dołkowych płytkach EPL z elektrodami złota na dnie dołków. Aby wytworzyć konfluencyjną monowarstwę, dodaje się komórki nowotworowe, które przywierają do VE i wnikają w monowarstwę HVAC, rozrywając połączenia między komórkami śródbłonka. Następnie rejestruje się odczyty impedancji, które zależą od całkowitej powierzchni dna dołka pokrytej komórkami.Zakres inwazji można następnie określić na podstawie zmian impedancji elektrycznej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy z komorą próżniową i METROGEL, jest to, że oddziaływania komórek śródbłonka z komórkami nowotworowymi ściślej naśladują proces przerzutowania in vivo, a dane są pozyskiwane w czasie rzeczywistym i są łatwiejsze do ilościowego określenia w przeciwieństwie do analizy końcowej stosowanej w innych metodach. Metoda ta pozwala zatem na uzyskanie wglądu w inwazję komórek rakowych.Metodę tę można zastosować również w innych układach, na przykład do badania oddziaływań międzykomórkowych w układzie odpornościowym. Ponadto wstępna faza eksperymentu, podczas której obserwujemy wzrost komórek UX, może służyć do oceny proliferacji dowolnej linii komórkowej bez konieczności przeprowadzania dalszych etapów inwazji; procedurę tę zaprezentuje Rahim, doktorant z mojego laboratorium. Wszystkie etapy niniejszego protokołu powinny być wykonywane w warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza.System Xcel wykorzystany w tym doświadczeniu jest przechowywany na stałe w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, który przy pierwszym użyciu tego urządzenia jest przeznaczony wyłącznie dla niego. Instrument należy pozostawić w inkubatorze przez co najmniej 16 godzin w celu wyrównania temperatury i wilgotności do warunków otoczenia. Następnie należy przygotować Thence EPL 16, pokrywając go 0,1% żelatyną przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.Po pokryciu płytki należy ją raz przemyć PBS. Następnie dodać 100 µL zrekonstytuowanego medium e gm two w celu wykonania pomiaru tła, aby zmierzyć impedancję w nieobecności komórek.Umieść płytkę EPL w systemie Excel agent na komputerze. Otwórz oprogramowanie Excel agent, klikając ikonę oprogramowania RTCA na pulpicie w oknie programu. Kliknij kartę układu (layout) i zaznacz dołki zawierające próbki.Aby zaprogramować częstotliwość akwizycji danych w czasie rzeczywistym, należy kliknąć kartę schedule, a następnie ikonę add a step. Parametr sweeps określa liczbę odczytów, a intervals wskazuje odstęp czasu między odczytami. Wartości te są automatycznie ustawione odpowiednio na 1 oraz 1.00 minute.Ta czynność programuje system do wykonania odczytu tła. Kliknij „add a step”, a następnie wprowadź 300 w polu „sweeps” i 10 minutes w polu „intervals”. Zaprogramuje to urządzenie do wykonywania pomiarów impedancji przez maksymalnie 50 hours.Aby rozpocząć eksperyment, należy kliknąć ikonę rozpoczęcia kroku. Po przeprowadzeniu pomiaru tła zostanie zmierzona impedancja tła dla każdej studzienki. W oknie wyświetli się komunikat.Aby przejść do następnego kroku, należy kliknąć przycisk. Kliknij, aby rozpocząć następny krok. W tym momencie można dodać komórki i monitorować tworzenie się monowarstwy zgodnie z opisem.W następnej sekcji komórki endotelialne żyły pępowinowej człowieka lub VE wykorzystane w tym badaniu są hodowane w pożywce EGM two zrekonstytuowanej za pomocą zestawu EGM two bullet kit zawierającego suplementy czynników wzrostu oraz 5% FBS. Komórki należy utrzymywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide. W dniu eksperymentu należy sprawdzić konfluencję HUVEC pod mikroskopem. Komórki powinny być o niskim numerze pasażu, najlepiej nie więcej niż sześć, i wykazywać konfluencję poniżej 75%. Aby uzyskać monowarstwę HUVEC, komórki należy zebrać za pomocą trypsyny. Po odklejeniu się komórek od kolby, wszystkie ślady trypsyny należy usunąć poprzez wirowanie przy 200 G. Po wirowaniu komórki należy raz przemyć PBS.Następnie resuspender komórki i zrekonstytuowane medium E GM two do stężenia 2,5 × 10⁵ komórek na mililitr. Po resuspensji komórek wyjąć skalibrowaną płytkę EPL z systemu EXOGEN i dodać 100 µL zawiesiny HX do 100 µL medium E GM two znajdującego się już w płytce. Natychmiast umieścić płytkę EPL w analizatorze komórek systemu Excel.Rozpocznij pomiar impedancji, klikając przycisk start kroku w oknie oprogramowania. Pozostaw komórki śródbłonka do wzrostu. System będzie kontynuował pomiary impedancji co 10 minut.Komórki Uve wykazują charakterystyczne przejściowe spłaszczenie indeksu komórkowego od czterech do sześciu godzin po wysianiu, po czym następuje kolejna stabilizacja po 16–18 godzinach. Dlatego ważne jest, aby pozwolić komórkom na utworzenie konfluentnej warstwy jednowarstwowej przez co najmniej 18 godzin. Po uformowaniu się monowarstwy można dodać komórki naciekające w ramach przygotowania do testu inwazji.Przygotuj naciekające komórki nowotworowe. W tym przypadku zastosowano komórki osteosarkoma. Rozpocznij od zebrania komórek za pomocą trypsyny.Usuń wszystkie ślady trypsyny, wirując komórki przy 200 G i płucząc je raz za pomocą PPS. Po zakończeniu płukania resuspenduj komórki do końcowej gęstości 1 × 10⁵ komórek/ml w medium użytym do hodowli komórek nowotworowych, np. w medium RPMI lub DMEM zawierającym 10% FBS. Wstrzymaj eksperyment, klikając ikonę pauzy w oknie oprogramowania.Usunąć EPL i odessać pożywkę EGM two z monowarstwy VAC. Dodać 100 µL zawiesiny komórek nowotworowych zawierającej 1×10⁴ komórek. Zazwyczaj dla tego testu najlepiej sprawdza się stosunek komórek nowotworowych do komórek śródbłonka wynoszący 1:2,5.Można jednak zoptymalizować ten stosunek dla poszczególnych linii komórkowych. Umieść EPL z powrotem w systemie Excel agent w inkubatorze. Kliknij krok kontynuacji, aby kontynuować pomiary impedancji w odstępach 10 minutowych.Monitoruj inwazję w czasie rzeczywistym przez następne 6 do 12 godzin. Spadek indeksu komórkowego będzie wynikał z rozszczelnienia połączeń śródbłonkowych i penetracji przez naciekające komórki nowotworowe. Po zakończeniu eksperymentu użyj oprogramowania Exergen, aby znormalizować wyniki do momentu dodania naciekających komórek nowotworowych.Oprogramowanie exergen umożliwia normalizację do dowolnego punktu czasowego, w którym VEX były hodowane w systemie exergen, co pokazano w tym filmie; po utworzeniu monowarstwy dodano komórki K seven M two lub K 12. Jak widać tutaj, w ciągu kilku godzin od wprowadzenia komórek K seven M two następuje gwałtowny spadek indeksu komórkowego. K seven M two to wysoce metastatyczna linia komórkowa osteosarkoma.Komórki te wykazują wysoki poziom ekspresji białka łączącego cytoszkielet ene, co odpowiada za właściwości inwazyjne tej linii komórkowej. Z kolei komórki K 12 wykazują mniejszy potencjał przerzutowy i nie są w stanie przenikać przez monowarstwę śródbłonka tak efektywnie, jak komórki K seven M two. Przejawia się to mniej głębokim spadkiem indeksu komórkowego, co przedstawiono tutaj.Przedstawiona tutaj kontrola reprezentuje impedancję monowarstwy komórek śródbłonka naczyniówki. W przypadku braku komórek nowotworowych eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat pomiaru inwazji w czasie rzeczywistym poprzez wytworzenie monowarstwy komórek śródbłonka i poddanie jej działaniu komórek nowotworowych.Wstępne etapy eksperymentu obejmujące tworzenie monowarstwy HU XL mogą być wykorzystane do oceny proliferacji komórek za pomocą impedancji. Dwa.

a-real-time-electrical-impedance-based-technique-to-measure-invasion

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Technika oparta na impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do pomiaru inwazji komórek rakowych na monowarstwę komórek śródbłonka

Ten film opisuje test inwazji przy użyciu trzykomorowej matrycy opartej na impedancji elektrycznej. Technika ta mierzy potencjał inwazyjny komórek nowotworowych pod wpływem rozpuszczalnych czynników wydzielanych przez rezydentne komórki zrębu w mikrośrodowiskach guza.

Trójkomorowy test impedancji oparty na układzie: technika analizy w czasie rzeczywistym do oceny potencjału inwazyjnego komórek rakowych poprzez pomiar impedancji elektrycznej

Źródło: Mudduluru, G.,  et. al. Oparty na impedancji pomiar migracji i inwazji komórek rakowych w czasie rzeczywistym. J. Vis. Exp. (2020)Ten film przedstawia test oparty na impedancji do pomiaru inwazji i migracji komórek glejaka. Komórki degradują macierz zewnątrzkomórkową, przemieszczają się przez mikroporowate błony i przylegają do elektrod, generując impedancję. Ta analiza w czasie rzeczywistym odzwierciedla ich potencjał inwazyjny w zastosowaniach badawczych nad rakiem.

Pomiary inwazji komórek raka mózgu oparte na impedancji

Ten protokół omawia Wykrywanie Impedancji Elektrycznej Komórki, metodę rejestrowania i analizy widma impedancji przylegających komórek do ilościowego określenia przyczepienia, proliferacji, ruchliwości i reakcji komórkowych na bodźce farmakologiczne i toksyczne. Położono nacisk na wykrywanie przepuszczalności śródbłonka oraz ocenę kontaktów komórka-komórka i komórka-substrat.

Wykrywanie impedancji substratu elektrycznego podłoża komórkowego w celu ilościowego określenia proliferacji śródbłonka, funkcji bariery i ruchliwości

Rak jest chorobą śmiertelną ze względu na jego zdolność do dawania przerzutów do różnych narządów. Określenie zdolności komórek nowotworowych do migracji i inwazji w różnych warunkach leczenia ma kluczowe znaczenie dla oceny strategii terapeutycznych. Protokół ten przedstawia metodę oceny zdolności przerzutowych linii komórkowej raka glejaka w czasie rzeczywistym.

Oparty na impedancji pomiar migracji i inwazji komórek rakowych w czasie rzeczywistym

Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.

Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Wiele genów o podwyższonej regulacji stymuluje migrację i inwazję komórek nowotworowych, co prowadzi do złych rokowań. Określenie, które geny regulują migrację i inwazję komórek nowotworowych, ma kluczowe znaczenie. Protokół ten przedstawia metodę badania wpływu zwiększonej ekspresji genu na migrację i inwazję komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym.

Ilościowy pomiar migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mRNA

Tutaj demonstrujemy technikę korzystania z biosensorów opartych na impedancji: ECIS i cellZscope, do pomiaru siły bariery śródbłonka mózgu. Szczegółowo opisujemy przygotowanie i technikę dodawania różnych bodźców do modelu śródbłonka mózgu in vitro. Mierzymy, rejestrujemy i przedstawiamy reprezentatywną analizę wyników.

Pomiar zmian w integralności bariery śródbłonka mózgu za pomocą dwóch bioczujników opartych na impedancji w odpowiedzi na komórki nowotworowe i cytokiny

Przedstawiamy nowatorskie podejście do ilościowego określania lokalizacji nanocząsteczek w naczyniach krwionośnych ludzkich guzów ksenoprzeszczepionych z wykorzystaniem dynamicznego obrazowania intravitalnego w czasie rzeczywistym w modelu zarodka ptaka.

Ocena wychwytu nanocząsteczek w guzach w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem obrazowania intravitalnego

Przedstawiono kompleksowy przegląd technik wykorzystywanych w tworzeniu mysiego modelu raka jamy ustnej oraz ilościowego monitorowania inwazji nowotworowej w obrębie języka za pomocą mikroskopii wielofotonowej komórek znakowanych. System ten może służyć jako użyteczna platforma do oceny molekularnej oraz skuteczności leków w przypadku związków przeciwinwazyjnych.

Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Poznaj technikę impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do monitorowania inwazji komórek nowotworowych przez warstwę komórek śródbłonka HUVEC. Metoda umożliwia ilościową analizę interakcji komórkowych naśladujących procesy przerzutowe in vivo.

Technika oparta na impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do pomiaru inwazji monowarstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe (Wideo) | JoVE Journal

Technika oparta na pomiarze impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do pomiaru inwazji monowarstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe

Przeglądaj więcej filmów