Name: Hybrydyzacja in situ zarodków myszy E8,5 do E11,5 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Poznaj hybrydyzację in situ całych zarodków myszy E8,5-E11,5 do wizualizacji ekspresji genów. Ta metoda pozwala badać wzorce ekspresji w biologii rozwoju z wysoką powtarzalnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty NIH R21MH082360 (BGC) i R01HD056315 (NRM) a także przez University of Georgia.

<ol><li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues%3A+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li>
<li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li>
<li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li>
<li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pax%5Bzf-a%5D%3A+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis%2FTWis+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li>
<li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li>
<li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li>
<li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo%3A+gene+expression+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li>
<li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis%2C+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Metody opisane w niniejszym protokole zostały zaadaptowane z kilku różnych źródeł i zoptymalizowane dla całych zarodków myszy w wieku od E8.5 do E11.5. Metody hybrydyzacji in situ w całych zarodkach kręgowców pojawiły się po raz pierwszy na początku lat 90. 2,5-12. Niniejszy protokół został opracowany głównie na podstawie metod stworzonych dla zarodków Xenopus 7,8, a także myszy 2,11. W naszym protokole położono duży nacisk na staranną ocenę jakości sondy. Przywiązanie uwagi do w...

<table><tbody><tr><td>Digoksigenina-11-urydyna-5&amp;rsquo;-trifosforan</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw rybonukleozydów trifosforanowych</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11277057001</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny do szybkiego wirowania do oczyszczania RNA znakowanego promieniotwórczo</td><td>Materiały</td><td>Roche Group</td><td>11274015001</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T7</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA SP6</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>10810274001</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T3</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11031163001</td><td></td></tr><tr><td>CTP, [&amp;#945;-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 &amp;mu;Ci</td><td>Odczynnik</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008X250UC</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana DNaza I, wolna od RNaz</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik, bezbarwne lub białe kryształy lub proszek krystaliczny</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP169-500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do nakładania żelu</td><td>Odczynnik</td><td>Ambion</td><td>AM8547</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-N+, Amersham</td><td>Materiały</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN82B</td><td></td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400</td><td>Sprzęt</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Węglan diethylopirokarbonianu</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>Odczynnik</td><td>Acros Organics</td><td>41121-0010</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 30% w wodzie</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2633-500</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd, 8% stopnia EM</td><td>Odczynnik</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0/710</td><td>Stosować ostrożnie zgodnie z instrukcjami producenta&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11096176001</td><td>Przygotować stężenie zapasowe 5% i przechowywać w -20&amp;#x00B0; C</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>3115852001</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>10109142001</td><td>Przygotować roztwór zapasowy 10 mg/ml i przechowywać w -20&amp;#x00B0; C.</td></tr><tr><td>RNaza T1</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>10109193001</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Formamide</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15515-026</td><td></td></tr><tr><td>Wodorochlorek lewamisolu</td><td>Odczynnik</td><td>ICN Biomedicals</td><td>155228</td><td></td></tr><tr><td>Kwas rybonukleowy z drożdży torula, typ VI</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6625</td><td>wielokrotnie ekstrahowany fenolem/chloroformem i wytrącony, resuspenderowany w DEPC-dH2O i przechowywany w -20&amp;#x00B0; C</td></tr><tr><td>Fragmenty Fab przeciwciał anty-digoksigenina-AP</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP Substrate, precypitujący. Roztwór gotowy do użycia.</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11 442 074 001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw wygodnych probówek do przechowywania 4ml, przeźroczyste, zamknięta góra</td><td>Materiały</td><td>National Scientific Company</td><td>B7800-2</td><td></td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji Shake N Bake</td><td>Sprzęt</td><td>Boekel Scientific</td><td>136400</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Sure-Tek</td><td>Materiały</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-200-402C</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus medium do zatapiania tkanek</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-021-400</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe plastikowe formy do zatapiania tkanek typu Peel-A-Way</td><td>Materiały</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18646A</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Colorfrost Plus</td><td>Materiały</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-17</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Fast Red</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8002</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Odczynnik</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8310-16</td><td></td></tr></tbody></table>

hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od e8.5 do e11.5

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Hybrydyzacja in situ w całych preparatach jest bardzo informacyjnym podejściem do określania wzorców ekspresji genów w embrionach. Procedury hybrydyzacji in situ są czasochłonne i wymagające technicznie, obejmując wiele istotnych etapów, które wspólnie wpływają na jakość końcowego wyniku. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje kilka kluczowych etapów kontroli jakości w celu optymalizacji znakowania i wydajności sondy. Ogólnie nasz protokół dostarcza szczegółowego opisu krytycznych kroków niezbędnych do powtarzalnego uzyskiwania wyników wysokiej jakości. Najpierw opisujemy generowanie sond RNA znakowanych digoksygeniną (DIG) poprzez transkrypcję in vitro matryc DNA uzyskanych metodą PCR. Opisujemy trzy krytyczne testy kontroli jakości służące do określenia ilości, integralności i aktywności specyficznej sond znakowanych DIG. Kroki te są istotne dla wytworzenia sondy o czułości wystarczającej do wykrycia endogennych mRNA w całym embrionie myszy. Dodatkowo opisujemy metody fiksacji i przechowywania embrionów myszy w dniach E8.5-E11.5 do hybrydyzacji in situ. Następnie opisujemy szczegółowe metody ograniczonego trawienia rehydratyzowanych embrionów proteinazą K, a następnie szczegóły dotyczące warunków hybrydyzacji, przemyć po hybrydyzacji oraz traktowania RNazą w celu usunięcia niespecyficznej hybrydyzacji sondy. Do wizualizacji znakowanej sondy i ujawnienia wzorca ekspresji endogennego transkryptu stosuje się przeciwciało sprzężone z AP. Przedstawiono reprezentatywne wyniki z udanych eksperymentów oraz typowe eksperymenty suboptymalne.

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization) jest bardzo informacyjną metodą określania wzorców ekspresji genów w embrionach. Procedury hybrydyzacji in situ...

Ogólnym celem tej procedury jest zdefiniowanie wzorców ekspresji genów w całych embrionach myszy. Jest to realizowane poprzez zaprojektowanie i wytworzenie specyficznej sondy rybotropowej dla interesującego genu, a następnie pobranie embrionów i poddanie ich procesowi hybrydyzacji.Następnie znakowaną sondę hybrydyzuje się z embrionami. Ostatnim krokiem jest wizualizacja zhybrydyzowanej sondy za pomocą detekcji immunohistochemicznej. W efekcie można uzyskać wyniki ukazujące wzory ekspresji genów w całych embrionach lub w ich przekrojach.Po obrazowaniu za pomocą stereomikroskopu, mikroskopu sekcyjnego lub zwykłego mikroskopu w polu jasnym. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ procedury hybrydyzacji in situ są czasochłonne i wymagające technicznie, a istnieje wiele istotnych kroków, które wspólnie wpływają na jakość końcowego wyniku. W pierwszej kolejności należy przygotować matrycowy DNA poprzez amplifikację interesującej sekwencji przy użyciu specyficznych dla genu starterów PCR, zaprojektowanych z sekwencjami promotorów transkrypcji farge na końcach 5'. Następnie należy oczyścić produkt PCR i przeprowadzić etap trawienia proteinazą K zgodnie z opisany protokołem.Następnie przygotuj reakcję transkrypcji in vitro i inkubuj w optymalnej temperaturze przez dwie godziny. Po trawieniu matrycy DNA oczyść sondę rybonukleotydową za pomocą oczyszczania kolumnowego, a wydajność sondy oszacuj przy użyciu spektrofotometru NanoDrop lub czytnika absorpcji do mikropłytek. Następnie dostosuj stężenie sondy do 100 nanogramów na mikrolitr zgodnie z oszacowaną wydajnością.Następnie sprawdź jakość sondy za pomocą elektroforezy w żelu akrylamidowym w warunkach denaturujących, zgodnie z opisem w protokole pisemnym, oraz poprzez pomiar aktywności specyficznej sondy RIBA; prawidłowa sonda powinna utworzyć na żelu pojedynczy, wyraźny prążek z minimalnym rozmyciem. Aby zmierzyć aktywność specyficzną, wykonaj rozcieńczenia seryjne sondy ribo, aby uzyskać zakres rozcieńczeń od 10⁻² do 10⁻⁵. Następnie nanieś pipetą 1 µL każdego rozcieńczenia na fragment membrany high bond n+ o średnicy 82 mm, wraz z 1 µL nieznakowanej próbki DNA jako kontroli. Natychmiast poddaj filtr sieciowaniu w urządzeniu do sieciowania UV z dawką 125 mJ.Dodaj 10 mililitrów 1% reagentu blokującego w 1x buforze TN i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po zakończeniu blokowania usuń roztwór blokujący i myj filtr przez 15 minut w temperaturze pokojowej w 10 mililitrach 1x buforu TN, płukząc membranę. Po przemyciu przygotuj rozcieńczenie przeciwciała anty-doxygen w fragmencie FAB w stosunku 1:5 000 w 10 mililitrach 1x buforu TN.Inkubować membranę w tym roztworze przez 30 minut. Po inkubacji przemyć membranę dwukrotnie przez 15 minut każdorazowo w 10 mililitrach 1× buforu TN. Po ostatnim przemyciu odessać roztwór płuczący z szalki Petriego i zastąpić go pięcioma mililitrami substratu BM purple. Inkubować membranę w tym roztworze przez 30 minut.Po upływie 30 minut należy sprawdzić, czy na membranie pojawił się widoczny sygnał w plamce odpowiadającej rozcieńczeniu 10 do minus czwartej. Jeśli sygnał jest widoczny, należy zatrzymać reakcję barwną, płucząc membranę dwukrotnie pięciokrotnym buforem TE przez pięć minut każdego razu. Jeśli po 30 minutach sygnał nie jest widoczny, sondę należy odrzucić.Zebrać zarodki myszy do lodowatego roztworu PBST. Następnie posegregować zarodki według genotypu do probówek z zakrętką o pojemności czterech mililitrów zawierających PBST. Utrwalić zarodki w 4% PARALDEHYDE w PBST, chyba że wskazano inaczej.Wszystkie etapy inkubacji i przemywania przeprowadza się z użyciem roztworów wypełnionych do dolnej krawędzi szyjki probówki, co odpowiada objętości około czterech mililitrów. Po utrwaleniu pozostawić embriony na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać 4%paraldehyd w PBST za pomocą szklanej pipety Pasteura i zastąpić go PBST.Umieść probówkę na lodzie przez pięć minut w celu przemycia. Powtórz ten proces, aby przemyć tkankę po raz drugi. Następnie odessaj PBST i odwodnij embriony etapowo, przeprowadzając je przez serię metanolu w PBST aż do 100% metanolu.Należy zwrócić uwagę, aby końcówka pipety znajdowała się po przeciwnej stronie fiolki, aby uniknąć uszkodzenia embrionów. W razie potrzeby embriony można przechowywać w temperaturze -20 °C w 100% metanolu przez okres do ośmiu miesięcy, a być może nawet dłużej, aż do momentu użycia. Przenieść embriony do naczynia, a następnie, gdy embriony wciąż znajdują się w metanolu, nakłuć serce i głowę embrionów w stadium E 10.5 i starszych za pomocą noża do mikrodyssekcji. Pozwala to na wniknięcie roztworów płuczących do komór mózgu i jam serca, co redukuje barwienie tła.Następnie rehydratyzuj embriony poprzez sukcesywne przemywanie w serii roztworów metanolu w PBST. Po zakończeniu dwóch przemyć, każde po pięć minut w 100% PBST, wybiel embriony, przygotowując roztwór składający się z czterech części PBST i jednej części 30% nadtlenku wodoru, a następnie inkubuj embriony w tym roztworze przez jedną godzinę na lodzie. Podczas inkubacji podgrzej świeżo przygotowany bufor do hybrydyzacji do 65°C w celu jego wstępnego ogrzania.Przemyj zarodki dwukrotnie w PBST po pięć minut każdego płukania. Podczas ostatniego przemywania przygotuj roztwór zapasowy proteinazy K o stężeniu 20 mg/ml w wodzie z DEPC. Następnie wykonaj rozcieńczenia kaskadowe roztworu zapasowego, aby uzyskać stężenie 10 µg/ml.Po przemyciu w PBST odessaj końcowy roztwór piorący i zastąp go jednym mililitrem roztworu proteinazy K o stężeniu 10 µg/mL. Umieść fiolkę pionowo w statywie do probówek w kąpieli wodnej o temperaturze 25°C i inkubuj przez 10 do 30 minut, w zależności od wielkości embrionów. Zapisz godzinę rozpoczęcia, aby zapewnić optymalność i powtarzalność procesu.Czas inkubacji jest kluczowy, aby umożliwić penetrację sondy ribo bez nadmiernego trawienia zarodka. Aby zatrzymać trawienie proteinazą K, odessaj roztwór proteinazy K na 30 sekund przed upływem czasu inkubacji. Następnie, po upływie czasu inkubacji, dodaj świeżo przygotowaną glicynę w stężeniu 2 mg/mL w PBST.Pozostawić na pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie przeprowadzić płukanie glicyną przez kolejne pięć minut. Po tym czasie wypłukać dwukrotnie w PBST po pięć minut każdego płukania.Następnie ponownie utrwalcie embriony traktowane proteinazą K, zanurzając je w 4% PARALDEHYDE w PBST z dodatkiem 0,2% glutaraldehydu na 20 minut. Następnie przemyjcie embriony w PBST trzy razy po pięć minut za każdym razem. Po ostatnim przemyciu odessijcie PBST i zastąpcie go jednym mililitrem podgrzanego buforu do hybrydyzacji.Gdy zarodki opadną na dno, odessać bufor do hybrydyzacji i zastąpić go jednym mililitrem świeżego, uprzednio podgrzanego buforu do hybrydyzacji. Inkubować probówki w pozycji pionowej w piecu o temperaturze 65 °C z platformą wytrząsową przez jedną godzinę. Przygotować bufor do hybrydyzacji zawierający 0,5 µg/mL znakowanego ribo.Sondy dla embrionów do etapu E 8.5 lub od 0,1 do 1 µg/ml sondy dla embrionów po etapie E 8.5. Po inkubacji zastąpić roztwór do przedhybrydyzacji 0,4 ml tego roztworu i przeprowadzić hybrydyzację przez noc w temperaturze 65 °C. Następnego dnia sprawdzić jakość embrionów.Jeśli embriony zostały poddane zbyt intensywnej obróbce proteinazą K, mogą one przykleić się do ścianek probówki, stać się wyjątkowo przezroczyste lub ulec rozpadowi. Embriony o takim wyglądzie należy odrzucić, ponieważ ich dalsze przetwarzanie nie dostarczy interpretowalnych danych. Zastąp bufor do hybrydyzacji czterema mililitrami roztworu.Jedną próbkę w temperaturze 70°C. Utrzymać tę temperaturę i powtórzyć czynność dwukrotnie po 30 minut dla embrionów w stadium E 8.5 lub trzykrotnie po 30 minut na każde płukanie. Dla embrionów w stadium E 9.5 i starszych, podczas ostatniego płukania, przygotować cztery mililitry 50% roztworu (po dwa 50% roztwory na każdą probówkę) i podgrzać do 70°C po zakończeniu ostatniego płukania.Inkubuj zarodki w tym roztworze przez 10 minut, a następnie przemyj trzykrotnie, przez pięć minut każdego mycia, używając czterech mililitrów roztworu. Dwa z nich w temperaturze pokojowej z kołysaniem po przemyciu. Wymień roztwór na świeży.Dwie inkubacje w 37 °C przez 30 minut na każde mycie, przy użyciu roztworów zawierających 100 µg/mL RNA A oraz 100 U/mL RNA T. Następnie zastosowano roztwór do mycia trzy w 65 °C z wytrząsaniem przez 30 minut podczas każdego z dwóch myć dla E 8.5 oraz trzy razy po 30 minut dla E 9.5 i starszych. Na koniec wykonano trzy mycia przez 5 minut każde, stosując 1× TBST.Następnie przystąp do detekcji przeciwciał. Odessaj ostatnią porcję płukania TBST z probówki i zastąp ją 0,5 ml jednokrotnego TBST z dodatkiem 10% obrabianego termicznie surowicy owczej. Umieść probówkę pionowo na wytrząsacooraz inkubuj w temperaturze pokojowej przy przechylaniu przez co najmniej dwie i pół godziny, aby zablokować nieswoiste miejsca wiązania przeciwciał.Po upływie czasu inkubacji odessać roztwór blokujący i zastąpić go świeżym roztworem 1x TBST z dodatkiem 10% surowicy zawierającej przeciwciała w postaci fragmentów FAB sprzęgniętych z antygenem owczym i subtrahowaną fosfatazą alkaliczną w rozcieńczeniu od 1:2000 do 1:5000, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 4°C. Przemyć trzy razy po 5 minut każdy za pomocą 1x TBST. Następnie przemywać od pięciu do sześciu razy przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a na koniec przez noc w 4°C, aby usunąć nadmiar przeciwciał.Następnego dnia. Przemyć zarodki dwukrotnie przez 20 minut podczas każdego płukania, używając świeżo przygotowanego buforu do fosfatazy alkalicznej. Jest to istotna procedura w celu zredukowania tła.Ostatnie płukanie zastąp jednym mililitrem podgrzanego podłoża BM purple AP. Inkubuj w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, i okresowo obserwuj sygnał za pomocą mikroskopu dissectingowego. W przypadku obfitego mRNA.RNA powinno być widoczne w ciągu 15 minut. Gdy sygnał stanie się wyraźny lub gdy zacznie pojawiać się problem z barwieniem tła, należy przerwać reakcję, płukąc dwukrotnie przez pięć minut na każdym płukaniu w 1x PBST z dodatkiem 5 mM EDTA; następnie należy wykonać zdjęcia, aby udokumentować wzór barwienia całego zarodka. Po wykonaniu tej czynności zarodki należy przenieść do probówki z podłożem BM purple i inkubować od 16 do 24 godzin w temperaturze pokojowej, aż zewnętrzna powierzchnia zarodka stanie się ciemnoniebieska, aby umożliwić pełne przenikanie barwnika do wnętrza zarodka.Następnie przenieś embriony do 4% parmaldydehydu w PBST w celu ponownej fiksacji przez kilka godzin lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ten końcowy etap fiksacji jest kluczowy dla długotrwałego zachowania wzoru barwienia. Na koniec przystąp do parafnowania, osadzania i krojenia zgodnie z procedurami opisanymi w protokole pisemnym, aby uwidocznić to barwienie.Na tym obrazie przedstawiono pomyślną hybrydyzację in situ całego zarodka w stadium E 10.5 z wykorzystaniem sondy rybowej specyficznej dla gata3. Tutaj znajduje się obraz przedstawiający zarodek w stadium E 11.5, który został pomyślnie oznakowany sondą rybową specyficzną dla FoxG1. Ten obraz ukazuje wysokie tło i słaby sygnał z nieudanej hybrydyzacji in situ z zastosowaniem częściowo zdegradowanej sondy gata3, co ilustruje znaczenie rzetelnej kontroli jakości sond w celu zapewnienia wysokiej jakości wyników.Oto obraz innego nieudanego procesu. W tym przypadku procedura została przeprowadzona bez nakłucia głowy, co skutkowało wysokim poziomem barwienia tła w komorach mózgu, na co wskazują groty strzałek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wystarczającą wiedzę na temat przeprowadzania wysokiej jakości hybrydyzacji in situ w celu określenia wzorców ekspresji genów w embrionach myszy dla uzyskania szczegółów przestrzennych oraz porównań czasowych lub genotypowych.

whole-mount-in-situ-hybridization-of-e85-to-e115-mouse-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Hybrydyzacja in Situ całych preparatów embrionów mysich od E8,5 do E11,5

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do identyfikacji oddziaływań czynników przy genach specyficznych tkankowo podczas lub po rozpoczęciu ekspresji genów specyficznych tkankowo w tkance embrionalnej myszy. Protokół ten powinien znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad aktywacją genów specyficznych tkankowo zachodzącą podczas prawidłowego rozwoju embrionalnego.

Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany protokół genotypu, barwienia i przygotowania płodów myszy do obrazowania obwodowych projekcji aksonów nocyceptora u całego zwierzęcia, jako skuteczną metodę oceny fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u genetycznie modyfikowanych myszy.

Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Demonstrujemy metodę szczepienia hodowanych komórek w określone miejsca wczesnych embrionów myszy, aby określić ich potencjał in vivo. Wprowadzamy również zoptymalizowaną metodę elektroporacji, która wykorzystuje szklane naczynia włosowate o znanej średnicy, co pozwala na precyzyjne dostarczenie egzogennego DNA do kilku komórek w zarodkach.

Metody precyzyjnie zlokalizowanego transferu komórek lub DNA do wczesnych zarodków myszy po implantacji

Opisujemy szczegółowy protokół wykorzystujący mikroskopię episkopową o wysokiej rozdzielczości do pozyskiwania trójwymiarowych (3D) obrazów embrionów myszy. Ten ulepszony protokół wykorzystuje zmodyfikowaną metodę przygotowania tkanek w celu zwiększenia penetracji barwnika fluorescencyjnego, umożliwiając w ten sposób analizę morfometryczną zarówno małych, jak i dużych próbek.

Szybka akwizycja obrazów 3D za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości

Węzeł i płytka struny grzbietowej są przejściowymi organizatorami sygnalizacji w rozwoju mysich embrionów, które można wizualizować za pomocą kilku technik. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak wykonać dwie techniki badania ich struktury i morfogenezy: 1) skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM); i 2) immunofluorescencja całej góry (WMIF).

Wizualizacja węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach myszy z gastrulacją za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i immunofluorescencji całej góry

Prezentujemy protokoły do badania rozwoju serca myszy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej na pełnych zarodkach myszy wypreparowanych z komorowych specyficznych dla komór MLC-2v-tdPomidorowych myszy reporterowych. Metoda ta pozwala nam bezpośrednio uwidocznić każdy etap powstawania komory podczas rozwoju serca myszy bez pracochłonnych metod histochemicznych.

Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry

Klasycznie, wsierdzie zarodka zarodka zastawki myszy zostało przeanalizowane za pomocą przekrojów poprzecznych, czołowych lub strzałkowych. Nasze nowatorskie podejście do dwuwymiarowego obrazowania wsierdzia en face w regionach walwugennych umożliwia analizę polaryzacji planarnej i rearanżacji komórek wsierdzia podczas rozwoju zastawki.

En Face Przygotowanie poduszki wsierdzia do planarnej analizy morfogenezy u zarodków myszy

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Poznaj hybrydyzację in situ całych zarodków myszy E8,5-E11,5 do wizualizacji ekspresji genów. Ta metoda pozwala badać wzorce ekspresji w biologii rozwoju z wysoką powtarzalnością.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

Przeglądaj więcej filmów