Name: Hybrydyzacja in situ zarodków myszy E8,5 do E11,5 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Poznaj hybrydyzację in situ całych zarodków myszy E8,5-E11,5 do wizualizacji ekspresji genów. Ta metoda pozwala badać wzorce ekspresji w biologii rozwoju z wysoką powtarzalnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty NIH R21MH082360 (BGC) i R01HD056315 (NRM) a także przez University of Georgia.

<ol><li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues%3A+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li>
<li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li>
<li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li>
<li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pax%5Bzf-a%5D%3A+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis%2FTWis+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li>
<li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li>
<li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li>
<li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo%3A+gene+expression+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li>
<li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis%2C+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Metody opisane w niniejszym protokole zostały zaadaptowane z kilku różnych źródeł i zoptymalizowane dla całych zarodków myszy w wieku od E8.5 do E11.5. Metody hybrydyzacji in situ w całych zarodkach kręgowców pojawiły się po raz pierwszy na początku lat 90. 2,5-12. Niniejszy protokół został opracowany głównie na podstawie metod stworzonych dla zarodków Xenopus 7,8, a także myszy 2,11. W naszym protokole położono duży nacisk na staranną ocenę jakości sondy. Przywiązanie uwagi do w...

<table><tbody><tr><td>Digoksigenina-11-urydyna-5&amp;rsquo;-trifosforan</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw rybonukleozydów trifosforanowych</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11277057001</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny do szybkiego wirowania do oczyszczania RNA znakowanego promieniotwórczo</td><td>Materiały</td><td>Roche Group</td><td>11274015001</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T7</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA SP6</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>10810274001</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T3</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11031163001</td><td></td></tr><tr><td>CTP, [&amp;#945;-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 &amp;mu;Ci</td><td>Odczynnik</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008X250UC</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana DNaza I, wolna od RNaz</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik, bezbarwne lub białe kryształy lub proszek krystaliczny</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP169-500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do nakładania żelu</td><td>Odczynnik</td><td>Ambion</td><td>AM8547</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-N+, Amersham</td><td>Materiały</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN82B</td><td></td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400</td><td>Sprzęt</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Węglan diethylopirokarbonianu</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>Odczynnik</td><td>Acros Organics</td><td>41121-0010</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 30% w wodzie</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2633-500</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd, 8% stopnia EM</td><td>Odczynnik</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0/710</td><td>Stosować ostrożnie zgodnie z instrukcjami producenta&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11096176001</td><td>Przygotować stężenie zapasowe 5% i przechowywać w -20&amp;#x00B0; C</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>3115852001</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>10109142001</td><td>Przygotować roztwór zapasowy 10 mg/ml i przechowywać w -20&amp;#x00B0; C.</td></tr><tr><td>RNaza T1</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>10109193001</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Formamide</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15515-026</td><td></td></tr><tr><td>Wodorochlorek lewamisolu</td><td>Odczynnik</td><td>ICN Biomedicals</td><td>155228</td><td></td></tr><tr><td>Kwas rybonukleowy z drożdży torula, typ VI</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6625</td><td>wielokrotnie ekstrahowany fenolem/chloroformem i wytrącony, resuspenderowany w DEPC-dH2O i przechowywany w -20&amp;#x00B0; C</td></tr><tr><td>Fragmenty Fab przeciwciał anty-digoksigenina-AP</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP Substrate, precypitujący. Roztwór gotowy do użycia.</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11 442 074 001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw wygodnych probówek do przechowywania 4ml, przeźroczyste, zamknięta góra</td><td>Materiały</td><td>National Scientific Company</td><td>B7800-2</td><td></td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji Shake N Bake</td><td>Sprzęt</td><td>Boekel Scientific</td><td>136400</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Sure-Tek</td><td>Materiały</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-200-402C</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus medium do zatapiania tkanek</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-021-400</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe plastikowe formy do zatapiania tkanek typu Peel-A-Way</td><td>Materiały</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18646A</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Colorfrost Plus</td><td>Materiały</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-17</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Fast Red</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8002</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Odczynnik</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8310-16</td><td></td></tr></tbody></table>

hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od e8.5 do e11.5

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Hybrydyzacja in situ w całych preparatach jest bardzo informacyjnym podejściem do określania wzorców ekspresji genów w embrionach. Procedury hybrydyzacji in situ są czasochłonne i wymagające technicznie, obejmując wiele istotnych etapów, które wspólnie wpływają na jakość końcowego wyniku. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje kilka kluczowych etapów kontroli jakości w celu optymalizacji znakowania i wydajności sondy. Ogólnie nasz protokół dostarcza szczegółowego opisu krytycznych kroków niezbędnych do powtarzalnego uzyskiwania wyników wysokiej jakości. Najpierw opisujemy generowanie sond RNA znakowanych digoksygeniną (DIG) poprzez transkrypcję in vitro matryc DNA uzyskanych metodą PCR. Opisujemy trzy krytyczne testy kontroli jakości służące do określenia ilości, integralności i aktywności specyficznej sond znakowanych DIG. Kroki te są istotne dla wytworzenia sondy o czułości wystarczającej do wykrycia endogennych mRNA w całym embrionie myszy. Dodatkowo opisujemy metody fiksacji i przechowywania embrionów myszy w dniach E8.5-E11.5 do hybrydyzacji in situ. Następnie opisujemy szczegółowe metody ograniczonego trawienia rehydratyzowanych embrionów proteinazą K, a następnie szczegóły dotyczące warunków hybrydyzacji, przemyć po hybrydyzacji oraz traktowania RNazą w celu usunięcia niespecyficznej hybrydyzacji sondy. Do wizualizacji znakowanej sondy i ujawnienia wzorca ekspresji endogennego transkryptu stosuje się przeciwciało sprzężone z AP. Przedstawiono reprezentatywne wyniki z udanych eksperymentów oraz typowe eksperymenty suboptymalne.

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization) jest bardzo informacyjną metodą określania wzorców ekspresji genów w embrionach. Procedury hybrydyzacji in situ...

Ogólnym celem tej procedury jest zdefiniowanie wzorców ekspresji genów w całych embrionach myszy. Jest to realizowane poprzez zaprojektowanie i wytworzenie specyficznej sondy rybotropowej dla interesującego genu, a następnie pobranie embrionów i poddanie ich procesowi hybrydyzacji.Następnie znakowaną sondę hybrydyzuje się z embrionami. Ostatnim krokiem jest wizualizacja zhybrydyzowanej sondy za pomocą detekcji immunohistochemicznej. W efekcie można uzyskać wyniki ukazujące wzory ekspresji genów w całych embrionach lub w ich przekrojach.Po obrazowaniu za pomocą stereomikroskopu, mikroskopu sekcyjnego lub zwykłego mikroskopu w polu jasnym. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ procedury hybrydyzacji in situ są czasochłonne i wymagające technicznie, a istnieje wiele istotnych kroków, które wspólnie wpływają na jakość końcowego wyniku. W pierwszej kolejności należy przygotować matrycowy DNA poprzez amplifikację interesującej sekwencji przy użyciu specyficznych dla genu starterów PCR, zaprojektowanych z sekwencjami promotorów transkrypcji farge na końcach 5'. Następnie należy oczyścić produkt PCR i przeprowadzić etap trawienia proteinazą K zgodnie z

whole-mount-in-situ-hybridization-of-e85-to-e115-mouse-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Hybrydyzacja in Situ całych preparatów embrionów mysich od E8,5 do E11,5

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do identyfikacji oddziaływań czynników przy genach specyficznych tkankowo podczas lub po rozpoczęciu ekspresji genów specyficznych tkankowo w tkance embrionalnej myszy. Protokół ten powinien znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad aktywacją genów specyficznych tkankowo zachodzącą podczas prawidłowego rozwoju embrionalnego.

Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany protokół genotypu, barwienia i przygotowania płodów myszy do obrazowania obwodowych projekcji aksonów nocyceptora u całego zwierzęcia, jako skuteczną metodę oceny fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u genetycznie modyfikowanych myszy.

Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Demonstrujemy metodę szczepienia hodowanych komórek w określone miejsca wczesnych embrionów myszy, aby określić ich potencjał in vivo. Wprowadzamy również zoptymalizowaną metodę elektroporacji, która wykorzystuje szklane naczynia włosowate o znanej średnicy, co pozwala na precyzyjne dostarczenie egzogennego DNA do kilku komórek w zarodkach.

Metody precyzyjnie zlokalizowanego transferu komórek lub DNA do wczesnych zarodków myszy po implantacji

Opisujemy szczegółowy protokół wykorzystujący mikroskopię episkopową o wysokiej rozdzielczości do pozyskiwania trójwymiarowych (3D) obrazów embrionów myszy. Ten ulepszony protokół wykorzystuje zmodyfikowaną metodę przygotowania tkanek w celu zwiększenia penetracji barwnika fluorescencyjnego, umożliwiając w ten sposób analizę morfometryczną zarówno małych, jak i dużych próbek.

Szybka akwizycja obrazów 3D za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości

Węzeł i płytka struny grzbietowej są przejściowymi organizatorami sygnalizacji w rozwoju mysich embrionów, które można wizualizować za pomocą kilku technik. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak wykonać dwie techniki badania ich struktury i morfogenezy: 1) skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM); i 2) immunofluorescencja całej góry (WMIF).

Wizualizacja węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach myszy z gastrulacją za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i immunofluorescencji całej góry

Prezentujemy protokoły do badania rozwoju serca myszy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej na pełnych zarodkach myszy wypreparowanych z komorowych specyficznych dla komór MLC-2v-tdPomidorowych myszy reporterowych. Metoda ta pozwala nam bezpośrednio uwidocznić każdy etap powstawania komory podczas rozwoju serca myszy bez pracochłonnych metod histochemicznych.

Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry

Klasycznie, wsierdzie zarodka zarodka zastawki myszy zostało przeanalizowane za pomocą przekrojów poprzecznych, czołowych lub strzałkowych. Nasze nowatorskie podejście do dwuwymiarowego obrazowania wsierdzia en face w regionach walwugennych umożliwia analizę polaryzacji planarnej i rearanżacji komórek wsierdzia podczas rozwoju zastawki.

En Face Przygotowanie poduszki wsierdzia do planarnej analizy morfogenezy u zarodków myszy

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Poznaj hybrydyzację in situ całych zarodków myszy E8,5-E11,5 do wizualizacji ekspresji genów. Ta metoda pozwala badać wzorce ekspresji w biologii rozwoju z wysoką powtarzalnością.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

Przeglądaj więcej filmów