Name: Metoda aglutynacji cząstek do identyfikacji wirusa polio (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj metodę aglutynacji cząstek do szybkiej identyfikacji wirusa polio. Technika wykorzystuje żelatynowe cząstki pokryte chimerycznymi cząsteczkami, umożliwiając jednokrokową detekcję wszystkich serotypów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Junko Wada za doskonałą pomoc techniczną. Dziękujemy prof. Akio Nomoto za uprzejme udostępnienie wektora ekspresyjnego bakulowirusa dla PVR-IgG2a. Niniejsze badanie zostało częściowo sfinansowane z grantów Ministerstwa Zdrowia, Pracy i Opieki Społecznej w ramach programów wspierania eradykacji polio oraz badań nad nowymi i powracającymi chorobami zakaźnymi.

1. Przygotowanie pożywki utrzymującej (MM) i pożywki wzrostowej (GM)
W celu przygotowania MM i GM należy zapoznać się z podręcznikiem laboratoryjnym WHO dotyczącym polio 1. Jako zamienniki dla MM i GM można odpowiednio zastosować modyfikowane podłoże Eagle'a (DMEM) uzupełnione o 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS) oraz 10% FCS.
2. Przygotowanie przeciwciał anty-PV
<ol>
<li>Zrekonstytuować przeciwciała anty-PV (antywykostyk RIVM do typowania PV), dodając wodę (0,5 mL na fiolkę) do każdej fiolki z przeciwciałami anty-PV (typ 1, 2 lub 3). Dodać te zrekonstytuowane roztwory przeciwciał (po 0,5 mL każdego) do 4,5 mL MM w oddzielnych, oznakowanych probówkach. Uwaga: Niektóre serie przeciwciał anty-PV są dostarczane w formie zrekonstytuowanej (0,5 mL na fiolkę). W przypadku takich serii przeciwciał anty-PV dodawanie wody do rekonstytucji nie jest konieczne.</li>
<li>Zmieszać równe objętości zrekonstytuowanych przeciwciał anty-PV. Dla anty-PV1 +2, 2+3 lub 3+1: zmieszać 1,8 mL każdego zrekonstytuowanego przeciwciała (1,8 mL + 1,8 mL = 3,6 mL dla każdej mieszaniny). Dla anty-PV1 +2+3: zmieszać 1,2 mL każdego zrekonstytuowanego przeciwciała (1,2 mL + 1,2 mL + 1,2 mL = 3,6 mL). Uwaga: Próbki PV mogą zawierać mieszaninę różnych serotypów PV. Aby zidentyfikować pojedynczy serotyp PV w próbkach zawierających mieszaninę PV, konieczne jest użycie pul przeciwciał anty-PV (tj. 1+2, 2+3, 3+1, 1+2+3).</li>
<li>Dodać 1/5 objętości FCS (0,72 mL) do każdego przeciwciała anty-PV (1+2, 2+3, 3+1 lub 1+2+3) (po 3,6 mL każdego) (końcowe stężenie 18,2% FCS). Uwaga: Dodanie FCS służy zmniejszeniu nieswoistej aglutynacji cząsteczek żelatyny wywoływanej przez przeciwciała.</li>
<li>Przechowywać pule przeciwciał w temperaturze -20 °C do czasu użycia w teście PA.</li>
</ol>
3. Rekonstytucja uczulonych cząsteczek żelatyny
<ol>
<li>Do jednej fiolki z uczulonymi cząsteczkami żelatyny (dostarczonymi w formie proszku liofilizowanego) dodać 1,5 mL buforu do rekonstytucji dołączonego do zestawu.</li>
<li>Wymieszać dokładnie, delikatnie opukując fiolkę.</li>
<li>Rekonstytuowane cząsteczki uczulone przechowywać w temperaturze 4 °C. Rekonstytuowane cząsteczki żelatyny zachowują aktywność przez co najmniej 2 tygodnie w temperaturze 4 °C, jednak należy je przygotować bezpośrednio przed analizą.</li>
</ol>
Ważna uwaga: 
Nie należy mieszać cząsteczek żelatyny uczulonej z różnych partii, ponieważ obraz braku aglutynacji cząsteczek żelatyny uczulonej może różnić się w zależności od partii cząsteczek. Do każdego eksperymentu należy użyć pojedynczej partii cząsteczek żelatyny uczulonej.

4. Analiza PA w celu identyfikacji PV
<ol>
<li>Przygotować płytkę mikrotytracyjną. Do identyfikacji jednej próbki wirusa wymagane są 5 dołków + co najmniej jedna kontrola negatywna (uczulone cząsteczki bez wirusa i przeciwciała, dołek nr 6 poniżej; patrz: Kontrola bez wirusa i przeciwciał w przykładzie). Całkowita liczba dołków wynosi 5 x liczba próbek + co najmniej jedna kontrola w teście. Ważna uwaga: 
Należy uwzględnić w teście co najmniej jedną kontrolę bez wirusa i przeciwciał. Jedna fiolka uczulonych cząsteczek wystarcza mniej więcej do identyfikacji 10 próbek wirusa.</li>
<li>Dodać 12 μL/dołek przeciwciał anty-PV lub GM do płytki mikrotytracyjnej. Układ płytki jest następujący (patrz również przykład poniżej). W próbkach bez przeciwciał (dołek nr 1 i 6) dodać 12 μL GM zamiast przeciwciał anty-PV. 
Ważna uwaga: 
Jeśli w teście ma być badanych wiele próbek PV, w tym kroku pomocne będzie użycie pipety wielokanałowej lub dozownika.
<table border="1">
	<tbody>
 	<tr>
 	<td>Dołek nr 1</td>
 <td>Dołek nr 2</td>
 <td>Dołek nr 3</td>
 <td>Dołek nr 4</td>
 <td>Dołek nr 5</td>
 <td>Dołek nr 6</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>GM</td>
 <td>anti-P1+2+3</td>
 <td>anti-P1+2</td>
 <td>anti-P2+3</td>
 <td>ani-P1+3</td>
 <td>GM</td>
 </tr>

 </tbody>
</table>
</li>
<li>Dodać 12 μL/dołek próbki wirusa. W jednej próbce bez wirusa (dołek nr 6) dodać 12 μL GM zamiast roztworu wirusa. Uwaga: Próbka wirusa to supernatant hodowli zainfekowanych komórek, zazwyczaj komórek L20B lub RD. 
Ważna uwaga: 
Jeśli w teście ma być badanych wiele próbek PV, w tym kroku pomocna będzie pipeta wielokanałowa.
<table border="1">
	<tbody>
 	<tr>
 	<td>Dołek nr 1</td>
 <td>Dołek nr 2</td>
 <td>Dołek nr 3</td>
 <td>Dołek nr 4</td>
 <td>Dołek nr 5</td>
 <td>Dołek nr 6</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>próbka wirusa</td>
 <td>próbka wirusa</td>
 <td>próbka wirusa</td>
 <td>próbka wirusa</td>
 <td>próbka wirusa</td>
 <td>GM</td>
 </tr>

 </tbody>
</table> 
</li> 
<li>Przenieść zrekonstytuowany roztwór uczulonych cząsteczek z temperatury 4 °C do temperatury pokojowej i delikatnie opukać, aby całkowicie zawiesić cząsteczki. Ważna uwaga: Po całkowitym zawieszeniu cząsteczek poprzez delikatne opukanie, należy je niezwłocznie dodać do płytek, zanim zawieszone cząsteczki opadną i utworzą niejednorodny roztwór.</li>
<li>Dodać 25 μL/dołek uczulonych cząsteczek do wszystkich dołków. Ważna uwaga: Po dodaniu uczulonych cząsteczek płytka powinna zostać niezwłocznie poddana mieszaniu, aby rozpocząć jednoczesną reakcję próbek. Dlatego dodawanie uczulonych cząsteczek powinno być wykonywane za pomocą dozownika, aby zminimalizować różnice czasowe między próbkami na płytce.</li> 
<li>Umieścić płytkę mikrotytracyjną na mieszadle do płytek i mieszać przez 30 s.</li>
<li>Położyć płytkę mikrotytracyjną na białej kartce papieru (dla ułatwienia obserwacji wizualnej) na stole w temperaturze pokojowej (15˜30 °C) na 2 h. Ważna uwaga: 
Nie przesuwać płytki podczas i po reakcji w celu obserwacji wyników i wykonywania zdjęć. Powstała aglutynacja jest niestabilna i łatwo może zostać zakłócona przez przesuwanie płytek.</li>
<li>Wykonac zdjęcia płytki. 
Ważna uwaga: 
Zdjęcia przedstawiające jedynie fragmenty mogą nie dostarczyć wystarczających danych do późniejszej analizy i przeglądu wyników w celu ich interpretacji. Należy wykonać kilka zdjęć, aby objąć wszystkie dołki płytek, skupiając się na obrazie aglutynacji w dołkach.</li>
</ol>
5. Interpretacja wyników
<ol>
<li>Identyfikacja studni pozytywnych i negatywnych. Porównaj aglutynację w próbkach z kontrolą bez wirusa i przeciwciał (precypitacja cząsteczek żelatyny, brak aglutynacji) (Rycina 1 i 2). Obrazy aglutynacji, które wyraźnie odróżniają się od kontroli bez wirusa i bez przeciwciał (brak aglutynacji, kontrola negatywna), należy uznać za pozytywne, natomiast obrazy aglutynacji podobne do kontroli negatywnej należy uznać za negatywne. Próbki wykazujące wyraźną, ale tylko częściową aglutynację mogą zostać uznane za pozytywne, lecz należy je zapisać jako „Pozytywne (aglutynacja częściowa)”.</li> 
<li>Identyfikacja PV. Interpretuj wyniki na podstawie studni pozytywnych i negatywnych z przeciwciałami anty-PV w celu zidentyfikowania serotypów PV. Zasada interpretacji wyniku jest analogiczna do testu neutralizacji w systemie hodowli komórkowej (np. wynik pozytywny dla przeciwciała anty-P1+2 wskazuje, że próbka zawiera PV typu 3).</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Reprezentatywny wynik badania PA w celu identyfikacji PV przedstawiono na Rysunku 1. Wszystkie szczepy PV powodowały aglutynację uczulonych cząstek żelatyny (próbki bez przeciwciał). W obecności odpowiadających im przeciwciał anty-PV obserwowano opadanie cząstek żelatyny (brak aglutynacji), podobnie jak w kontroli bez wirusa i bez przeciwciał (kontrola negatywna) (np. PV1(Sabin) w obecności przeciwciał anty-P1+2 lub anty-P3+1). 
<img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig1.jpg" alt="Test neutralizacji wirusów wykazujący wpływ przeciwciał na różne typy poliwirusów Sabina w dołkach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Identyfikacja PV za pomocą analizy PA. roztwory wirusów PV1(Sabin), PV2(Sabin) i PV3(Sabin) (miana wirusów wynoszące 1,2 x 108 CCID50 / 12 μL, 8,2 x 107 CCID50 / 12 μL, oraz 3,5 x 107 CCID50 / 12 μLodpowiednio) wykorzystano do identyfikacji za pomocą testu aglutynacji cząstek (PA). W kontroli bez wirusa i bez przeciwciał nie stwierdzono precypitacji cząstek żelatyny (brak aglutynacji, kontrola negatywna).
<img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig2.jpg" alt="Wyniki testu aglutynacji wirusowej; schemat z serią rozcieńczeń do detekcji wirusa, kontrole pozytywna i negatywna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Interpretacja studni dodatnich i ujemnych. Roztwory wirusów PV1(Sabin), PV2(Sabin) i PV3(Sabin) (miana wirusów wynoszące 2,4 x 108 CCID50 / 25 μL, 1,7 x 108 CCID50 / 25 μL, oraz 7,3 x 107 CCID50 / 25 μL, odpowiednio) rozcieńczono w zakresie od 1/20 do 1/320, a następnie 25 μL rozcieńczone próbki zbadano za pomocą testu PA bez użycia przeciwciał anty-PV.

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Polio+Laboratory+Manual+%284th+edition%29+WHO%2FIVB%2F04.10%22">Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10</a>. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).</li>
<li>Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+particle+agglutination+method+with+soluble+virus+receptor+for+identification+of+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).</li>
<li>Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+poliovirus+with+its+cell+surface+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Interaction of poliovirus with its cell surface binding site.</a> Virology. 201, 107-115 (1994).</li>
<li>Koike, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poliovirus+receptor+protein+is+produced+both+as+membrane-bound+and+secreted+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J.+9%22%5BJournal%5D)">The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms.</a> Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).</li>
<li>Mendelsohn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+a+human+poliovirus+receptor+gene+into+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).</li>
<li>Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+receptor+for+poliovirus%3A+molecular+cloning%2C+nucleotide+sequence%2C+and+expression+of+a+new+member+of+the+immunoglobulin+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily.</a> Cell. 56, 855-865 (1989).</li>
<li>Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+poliovirus+with+its+purified+receptor+and+conformational+alteration+in+the+virion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion.</a> J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).</li>
<li>McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+binding+affinities+of+poliovirus+for+its+cellular+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).</li>
<li>Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+L+cells+expressing+the+human+poliovirus+receptor+for+the+specific+detection+of+polioviruses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro.</a> J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).</li>
<li>Avoort, H. G. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+five+methods+for+intratypic+differentiation+of+polioviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).</li>
<li>Kilpatrick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+group-%2C+serotype-%2C+and+vaccine+strain-specific+identification+of+poliovirus+isolates+by+real-time+reverse+transcription-PCR+using+degenerate+primers+and+probes+containing+deoxyinosine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).</li>
</ol>

Souji Masujima jest pracownikiem Działu Projektowania Nowych Produktów w firmie Fujirebio Inc.

Wyjątkowym aspektem tego testu PA jest wykorzystanie cząsteczki PVR zamiast przeciwciał anty-PV do detekcji PV 2. Pozwala to na specyficzną interakcję uczulonych cząsteczek żelatyny z PV z jednolitym powinowactwem do wszystkich trzech serotypów PV 3-6. Do uczulenia cząsteczek żelatyny wykorzystaliśmy formę immunoadhezyny PVR (PVR-IgG2a), ponieważ formy monomerowe PVR wykazują jedynie umiarkowane powinowactwo do pojedynczego miejsca wiązania na wirionie (stała dysocjacji 10-7˜-8 M) 7, 8, i...

<table><tbody><tr><td>Cząsteczki żelatyny uwrażliwionej</td><td>Fujirebio Inc.</td><td></td><td>Zestaw testowy</td></tr><tr><td>Bufor do rekonstytucji</td><td>Fujirebio Inc.</td><td></td><td>Zestaw testowy</td></tr><tr><td>Płyta mikrotytracyjna</td><td>Fujirebio Inc.</td><td></td><td>Zestaw testowy</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-PV</td><td>RIVM</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metoda aglutynacji cząsteczek w identyfikacji poliwirusa

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

W ramach Globalnej Inicjatywy na rzecz Eradykacji Polio (Global Polio Eradication Initiative) diagnostyka laboratoryjna odgrywa kluczową rolę poprzez izolację i identyfikację PV z próbek kału pobranych od pacjentów z ostrym wiotkim porażeniem (AFP). W Globalnej Sieci Laboratoriów Polio Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) izolacja i identyfikacja PV są obecnie przeprowadzane odpowiednio z wykorzystaniem systemów hodowli komórkowych oraz metody real-time RT-PCR. W erze po eradykacji PV proste i szybkie procedury identyfikacji byłyby pomocne w szybkim potwierdzaniu przypadków polio w laboratoriach krajowych. W niniejszym badaniu przedstawimy procedurę nowej analizy PA opracowanej do identyfikacji PV. Analiza PA wykorzystuje interakcję cząsteczki receptora PV (PVR) z wirionem, która charakteryzuje się swoistym i jednolitym powinowactwem do wszystkich serotypów PV. Procedura jest prosta (jednoetapowa w płytkach reakcyjnych) i szybka (wyniki można uzyskać w ciągu 2 h reakcji), a efekt jest obserwowany wizualnie (obserwacja aglutynacji cząsteczek żelatyny).

Niedawno opracowany nowoczesny test aglutynacji cząsteczek (PA) z wykorzystaniem cząsteczki receptora wirusowego umożliwił szybką i łatwą identyfikację poliwirusa (PV). W niniejszym artykule przedstawimy procedurę testu PA służącą do identyfikacji PV.

Metoda aglutynacji cząsteczek w identyfikacji poliwirusa

W ramach Globalnej Inicjatywy na rzecz Eradykacji Polio diagnostyka laboratoryjna odgrywa kluczową rolę poprzez izolację i identyfikację PV z próbek kału pobranych od pacjentów z ostrymi...

Ogólnym celem poniższej procedury jest szybka identyfikacja izolatów wirusa polio przy użyciu prostego protokołu. W tym badaniu wykorzystujemy uczulone cząsteczki żelatyny pokryte cząsteczkami chimerycznymi zawierającymi domenę zewnątrzkomórkową ludzkiego receptora poliwirusa połączoną z fragmentem Fc przeciwciała IgG2. Ponieważ cząsteczki te wykazują jednakową powinowactwo do wszystkich serotypów izolatów poliwirusa, aglutynacja cząsteczek zachodzi podczas inkubacji z próbkami zawierającymi dowolny ludzki poliwirus.Jednakże, jeśli obecne są przeciwciała zdolne do rozpoznania konkretnego wirusa izolowanego z próbki, dochodzi do neutralizacji, która zapobiega aglutynacji; wykorzystując ten system eksperymentalny, można przeprowadzić szybką identyfikację izolatów poliwirusa w reakcji jednokrokowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak konwencjonalny test neutralizacji, jest prostota procedury i interpretacji, co ma na celu zmniejszenie nakładu pracy oraz skrócenie czasu oczekiwania na wyniki. Aby zrekonstytuować przeciwciała anty-PV1, PV2 oraz PV3, należy dodać 0,5 ml wody do każdej fiolki.Następnie należy przenieść każdy roztwór przeciwciał do osobnych probówek zawierających 4,5 ml pożywki podtrzymującej. Niektóre partie przeciwciał anty-PV są dostarczane w formie zrekonstytuowanej; w przypadku takich partii przeciwciał anty-PV dodawanie wody w celu rekonstytucji nie jest konieczne.Następnie w nowych, oznakowanych probówkach przygotować mieszaniny połączonych roztworów przeciwciał w stosunku jeden do jednego, o końcowej objętości 3,6 milliliters. Na przykład zmieszać 1,8 milliliters przeciwciała anti PV one z 1,8 milliliters przeciwciała anti PV two. Aby przygotować kombinację anti PV one plus PV two, powtórzyć tę czynność dla każdej możliwej kombinacji parowej, a także przygotować roztwór zawierający wszystkie trzy rodzaje przeciwciał, mieszając ze sobą po 1,2 milliliters każdego antyserum.Po przygotowaniu czterech mieszanin, do każdego roztworu przeciwciał należy dodać 720 µL FCS. Pomoże to ograniczyć nieswoistą aglutynację cząsteczek żelatyny przez przeciwciała podczas analizy. Pule przeciwciał można przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu ich użycia w teście aglutynacyjnym.W tym teście wykorzystujemy liofilizowane cząsteczki żelatyny powlekane domenami zewnątrzkomórkowymi ludzkiego receptora poliwirusa oraz domenami FC mysiego IgG2. Aby zapewnić spójność obrazu aglutynacji, należy używać cząsteczek z jednej serii, a nie z różnych partii w ramach jednego eksperymentu. Cząsteczki należy zrekonstytuować, dodając do każdej fiolki 1,5 ml buforu do rekonstytucji. Delikatnie postukać, aby dokładnie wymieszać.Zrekonstytuowane cząsteczki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie dwa tygodnie. W pierwszej kolejności zaprojektuj eksperyment na 96-dołkowej płycie mikrotitracyjnej. W przypadku każdej próbki studzinka numer jeden będzie zawierać sam wirus.Do dołków od numeru dwa do pięciu należy wprowadzić wirusa wraz z jednym z czterech mieszanych roztworów przeciwciał. Należy pamiętać o zachowaniu jednego dołka jako kontroli negatywnej, zawierającej wyłącznie medium, bez wirusa i przeciwciał. Po przygotowaniu płytki należy dodać 12 µL odpowiedniego roztworu przeciwciał do każdego dołka w rzędach od drugiego do piątego oraz 12 µL pożywki.Pożywkę do samych wirusów, do studni w pierwszym rzędzie, oraz do studni kontroli negatywnej w szóstym rzędzie. Następnie dodaj 12 µL próbki wirusa do pierwszych pięciu rzędów oraz 12 µL pożywki do studni kontroli negatywnej w szóstym rzędzie. Po naniesieniu przeciwciał i wirusa, resuspenduj cząstki zrekonstytuowanej żelatyny, delikatnie opukując je, a następnie bezzwłocznie dodaj 25 µL cząstek do każdej z pozostałych studni.Aby uzyskać taką samą ilość cząsteczek w każdej studzience, należy nie dopuścić do ich osiadania przed przeniesieniem na płytkę. Umieść płytkę testową na mieszalniku do płytek i mieszaj przez 30 sekund. Następnie połóż płytkę na arkuszu białego papieru i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, aby umożliwić zajście aglutynacji.Ważne jest, aby nie przesuwać płytki w żadnym momencie podczas lub po inkubacji, ponieważ powstała aglutynacja jest niestabilna. Po zajściu reakcji należy wykonać kilka zdjęć płytki, na których będzie można ocenić jakość aglutynacji w każdej studni. W studniach, w których nie nastąpiła aglutynacja, jak pokazano tutaj po lewej stronie, kolorowe cząsteczki żelatyny opadną na dno studni, natomiast w studniach, w których wystąpiła aglutynacja.W wyniku oddziaływania między wirusem a pvr, cząsteczkami żelatyny pokrytymi IgG 2A, widoczny jest rozproszony, zabarwiony wzór, jak pokazano w centrum. W tym doświadczeniu badaliśmy zdolność roztworów wirusa, PV 1, 2 i 3, do indukowania aglutynacji w obecności przeciwciał. W kombinacjach wskazanych tutaj, w przypadku braku wirusa lub przeciwciał, nie dochodzi do aglutynacji i cząsteczki żelatyny osadzają się, co kontrastuje z dołkiem zawierającym wirusa, ale nie zawierającym przeciwciał.Doszło do aglutynacji w wyniku oddziaływania wirusa. W studzienkach doświadczalnych zawierających cząsteczki żelatyny pokryte PVR IgG dwa A, aglutynacja wirusów jest zapobiegana w każdej studzience zawierającej przeciwciała specyficznie neutralizujące dany wirus. Na przykład, aglutynacja poliovirusu typu jeden jest zapobiegana w studzienkach zawierających przeciwciała anty PV jeden, ale nie w studzienkach zawierających jedynie przeciwciała anty PV dwa i anty PV trzy.To samo dotyczy polowirusów typów dwa i trzy. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, może ona zająć zaledwie trzy godziny.

particle-agglutination-method-for-poliovirus-identification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metoda aglutynacji cząsteczkowej do identyfikacji poliowirusa

Genom wirusa grypy typu A składa się z ośmiu oddzielnych kompleksów RNA i białek, zwanych wirusowymi kompleksami rybonukleoproteinowymi (vRNP). Niniejsza praca opisuje oczyszczanie vRNP wirusa grypy A w gradiencie glicerolu oraz ich wizualizację za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy A

W niniejszym artykule przedstawiono prosty ilościowy test wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej. Jest to niezawodna technika oparta na oddziaływaniu między kulkami magnetycznymi a białkami z markerem (np. nanociałami) z jednej strony oraz na powinowactwie między białkiem z markerem a drugim, znakowanym białkiem (np. poliovirus) z drugiej strony.

Analiza wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej z użyciem kulek magnetycznych do badania oddziaływań białko-białko: przykład poliwirusa i nanoprzeciwciała

W tym filmie pokazujemy test immunoprecypitacyjny, zwany testem wychwytywania VLP, w celu wyizolowania z próbki cząstek wirusopodobnych wyświetlających antygen lub VLP. Antygen wiąże się ze specyficznymi przeciwciałami związanymi z kulkami magnetycznymi, tworząc unieruchomiony kompleks antygen-przeciwciało, który jest następnie oddzielany i przechowywany do dalszej analizy.

Test wychwytywania cząstek wirusopodobnych: metoda izolowania VLP wyświetlających antygen z próbki przy użyciu neutralizujących kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami

Ten film demonstruje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu do analizy relacji antygenowych między wirusami grypy A i B. Zapewnia ilościowy i wizualny sposób oceny skuteczności przeciwciał lub innych metod leczenia w zapobieganiu infekcji wirusowej.

Analiza związku antygenowego między wirusami przy użyciu testu mikroneutralizacji opartego na obrazie

Korzystając z mikroskopii sił atomowych w połączeniu z technologią biopanoramowania, stworzyliśmy negatywny i pozytywny system biopanowania, aby uzyskać przeciwciała przeciwko specyficznym dla choroby wariantom białek obecnym w dowolnym materiale biologicznym, nawet w niskich stężeniach.  Udało nam się uzyskać przeciwciała przeciwko wariantom białka TDP-43 zaangażowanym w stwardnienie zanikowe boczne.

Nowatorski biopanning oparty na mikroskopii sił atomowych do izolacji odczynników specyficznych dla morfologii przeciwko wariantom TDP-43 w stwardnieniu zanikowym bocznym

Oferujemy nowatorską strategię izolowania przedziałów replikacyjnych wirusa (RC) od komórek ludzkich zakażonych adenowirusem (Ad). Podejście to reprezentuje system bezkomórkowy, który może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych regulujących replikację i ekspresję genomu wirusa, a także regulację interakcji wirus-gospodarz ustalonych w RC.

Izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem

Korzystając z drukowanej strategii mikromacierzy glikanowej, konwencjonalny test na 96-dołkowej płytce został zminiaturyzowany do analizy awidności hemaglutyniny wirusa grypy A i swoistości dla receptorów zawierających kwas sjalowy.

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Tutaj opisujemy metodę mikroaspiracji pojedynczych komórek do separacji zainfekowanych ameb. W celu oddzielenia subpopulacji wirusów w Vermamoeba vermiformis zakażonych faustowirusami i nieznanymi gigantycznymi wirusami, opracowaliśmy protokół opisany poniżej i wykazaliśmy jego zdolność do oddzielania dwóch nowych wirusów gigantycznych o niskiej liczebności.

Mikroaspiracja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu separacji gigantycznych mieszanin wirusów

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach wirusopodobnych wyświetlających antygen (VLP). Immunoprecypitację VLP pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla glikoprotein otoczkowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. Przechwycone VLP są następnie poddawane analizie SDS-PAGE i Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia...

Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania

Kompleksowy protokół laboratoryjny i przepływ pracy analizy są opisane dla szybkiego, opłacalnego i prostego testu kolorymetrycznego opartego na komórkach do wykrywania elementów neutralizujących przeciwko AAV6.

Metoda krok po kroku do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko AAV za pomocą kolorymetrycznego testu komórkowego

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Poznaj metodę aglutynacji cząstek do szybkiej identyfikacji wirusa polio. Technika wykorzystuje żelatynowe cząstki pokryte chimerycznymi cząsteczkami, umożliwiając jednokrokową detekcję wszystkich serotypów.

Metoda aglutynacji cząsteczek w identyfikacji poliwirusa

Przeglądaj więcej filmów