Metoda aglutynacji cząstek do identyfikacji wirusa polio

Ogólnym celem poniższej procedury jest szybka identyfikacja izolatów wirusa polio przy użyciu prostego protokołu. Do tego testu używamy uczulonych cząstek żelatyny pokrytych chimerycznymi cząsteczkami zawierającymi domenę zewnątrzkomórkową ludzkiego receptora wirusa polio połączonego z IgG two fc. Ponieważ cząstki te mają jednakowe powinowactwo do wszystkich serotypów izolatów wirusa polio, aglutynacja cząstek następuje po inkubacji z próbkami zawierającymi jakiegokolwiek ludzkiego wirusa polio.

Jeśli jednak obecne są przeciwciała zdolne do rozpoznania specyficznego wirusa izolującego próbkę, następuje neutralizacja i zapobiega aglutynacji przy użyciu tego systemu eksperymentalnego, szybka identyfikacja izolatów wirusa polio może być przeprowadzona w reakcji jednoetapowej. Główną zaletą tej techniki istniejącego naczynia, podobnie jak konwencjonalnego testu neutralizacji, jest prostota procedury i interpretacji SIM, mająca na celu zmniejszenie nakładu pracy i przyspieszenie wymaganego oraz skrócenie czasu oczekiwania na wyniki. Aby rozpuścić przeciwciała anty PV jeden, PV dwa i PV trzy, dodaj 0,5 mililitra wody do każdej fiolki.

Następnie przenieś każdy roztwór przeciwciała do oddzielnych probówek zawierających 4,5 mililitra pożywki konserwującej. Niektóre partie przeciwciał anty PV są dostarczane w postaci odtworzonej dla takich partii przeciwciał anty PV. Dodawanie wody w celu rozpuszczenia nie jest konieczne.

Następnie przygotuj mieszanki jeden do jednego połączonego roztworu przeciwciał o końcowej objętości 3,6 mililitra w świeżo oznakowanych probówkach. Na przykład wymieszaj 1,8 mililitra anty PV jeden z 1,8 mililitra anty PV dwa. Aby przygotować kombinację anty PV jeden plus PV dwa, powtórz to dla każdej możliwej kombinacji par, a także przygotuj roztwór zawierający wszystkie trzy rodzaje przeciwciał, mieszając ze sobą 1,2 mililitra każdej surowicy anty-surowicy.

Po przygotowaniu czterech mieszanek w 720 mikrolitrach FCS do każdego roztworu przeciwciała. Pomoże to zmniejszyć nieswoistą aglutynację cząstek żelatyny przez przeciwciała podczas testu. Pule przeciwciał mogą być przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, dopóki nie zostaną wykorzystane w teście aglutynacji.

W tym teście używamy liofilizowanych cząstek żelatyny, które zostały pokryte zewnątrzkomórkowymi domenami ludzkiego receptora wirusa polio i domenami IgG two a mysi FC. Należy upewnić się, że w jednym eksperymencie użyto jednej partii cząstek, a nie różnych partii, aby zapewnić spójność obrazu aglutynacji w celu rozpuszczenia cząstek w 1,5 mililitra buforu do rekonstytucji na każdą fiolkę. Delikatnie stuknij, aby dobrze wymieszać.

Rozpuszczone cząstki można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dwóch tygodni. Najpierw zaprojektuj swój eksperyment na 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania. Dla każdej próbki, studnia numer jeden będzie zawierała samego wirusa.

Studzienki od drugiej do piątej będą zawierały wirusa oraz jeden z czterech mieszanych roztworów przeciwciał. Pamiętaj, aby zachować jedną studnię na kontrolę negatywną zawierającą tylko pożywkę bez wirusa lub przeciwciał. Po ustawieniu płytki dodaj 12 mikrolitrów odpowiedniego roztworu przeciwciał do każdej studzienki z rzędów od drugiego do pięciu i 12 mikrolitrów wzrostu.

Pożywka do samego wirusa, studzienki w rzędzie pierwszym, a do studzienki kontroli ujemnej w rzędzie szóstym. Następnie dodaj 12 mikrolitrów próbki wirusa w pierwszych pięciu rzędach i 12 mikrolitrów pożywki wzrostowej do studzienki kontroli ujemnej w rzędzie szóstym. Po posieciu przeciwciał i wirusa, resus, zawiesić rozpuszczone cząsteczki żelatyny, delikatnie je stukając i natychmiast dodać 25 mikrolitrów cząstek na studzienkę do wszystkich studzienek.

Ważne jest, aby nie dopuścić do osadzenia się cząstek przed przeniesieniem ich na płytkę, aby uzyskać równe ilości cząstek w każdej z nich. Dobrze umieść płytkę testową na mikserze płytkowym i mieszaj przez 30 sekund. Następnie umieść płytkę na arkuszu białego papieru i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, aby umożliwić aglutynację.

Ważne jest, aby w żadnym momencie nie przesuwać płytki w trakcie inkubacji ani po jej zakończeniu, ponieważ powstała aglutynacja jest niestabilna. Po zajściu reakcji należy zrobić kilka zdjęć płytki, na których można ocenić jakość aglutynacji w każdym dołku. W studzienkach, w których aglutynacja nie nastąpiła, jak pokazano tutaj po lewej stronie, kolorowe cząsteczki żelatyny wytrącą się na dnie studni w studzienkach, w których nastąpiła aglutynacja.

Ze względu na interakcję między wirusem a pvr, IgG dwiema cząsteczkami żelatyny pokrytymi A, widoczny jest rozproszony kolorowy wzór, jak pokazano w środku. W tym eksperymencie przetestowaliśmy zdolność roztworów wirusowych, PV jeden, dwa i trzeci do indukowania glu w obecności przeciwciała. Kombinacje wskazane, jak pokazano tutaj, przy braku wirusa lub przeciwciał, nie zachodzi aglutynacja, a cząsteczki żelatyny wytrącają się w przeciwieństwie do dobrze zawierającego wirusa, ale nie ma przeciwciał.

Aglutynacja nastąpiła w wyniku interakcji wirusa. Dzięki cząsteczkom żelatyny pokrytym PVR IgG two A w dołkach eksperymentalnych, zapobiega się nadmiarowi wirusów w każdej studzience zawierającej przeciwciała, które specyficznie neutralizują tego wirusa. Na przykład, nadmiarowi wirusa polio typu pierwszego zapobiega się w studzienkach zawierających przeciwciała anty PV jeden, ale nie w studzienkach zawierających tylko przeciwciała anty PV 2 i anty PV 3.

To samo dotyczy drugiego i trzeciego typu wirusa polio. Chociaż jest mistrzem, tę technikę można wykonać w ciągu zaledwie trzech godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.