Celowany trening wokalizacji ultradźwiękowych u starszych szczurów oraz szczurów z chorobą Parkinsona
8 sierpnia 2011
Zaburzenia głosu są uciążliwe w procesie starzenia się oraz w chorobie Parkinsona. Ultradźwiękowe wokalizacje szczurów, które również są dotknięte tymi schorzeniami, mogą być wykorzystane do badania tych zaburzeń głosu, ich podłoży neuronalnych oraz charakteru powrotu do sprawności funkcjonalnej w wyniku interwencji behawioralnej.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest nauczenie szczurów zwiększania liczby i złożoności ich wokalizacji ultradźwiękowych (USV). Jest to osiągane najpierw poprzez nagranie wokalizacji bazowych. Następnym krokiem jest trenowanie ukierunkowanych wokalizacji za pomocą wzmocnienia pozytywnego.
Po zakończeniu treningu rejestrowane są wokalizacje. Ostatnim krokiem procedury jest analiza akustyczna oraz porównanie wokalizacji wyjściowych z wokalizacjami po treningu. W końcowym etapie można uzyskać wyniki.
Wykazano, że trening zwiększa liczbę i złożoność wokalizacji ultradźwiękowych poprzez wzrost parametrów akustycznych, takich jak szerokość pasma, częstotliwość szczytowa i czas trwania. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie zaburzeń komunikacji, na przykład w kwestii tego, w jaki sposób ćwiczenia wokalne modulują podstawowe mechanizmy neuronalne. Ponadto metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat niedoborów czuciowo-ruchowych w obrębie czaszki związanych z chorobą Parkinsona i starzeniem się.
Metodę tę można zastosować również w innych modelach chorób i stanach, w których wokalizacje ultradźwiękowe służą jako wskaźnik behawioralny. Demonstrację treningu wokalizacji przeprowadzą Emerald Dahl i Jamie Shire, członkowie mojego laboratorium. Aby rozpocząć monitorowanie ultradźwiękowe, uruchom oprogramowanie Avis Soft Recorder i wybierz opcję „permanent unlimited” dla wyzwalacza (trigger), aby umożliwić ręczne uruchamianie i zatrzymywanie nagrań. Następnie określ w katalogu głównym miejsce zapisu przechwyconych plików audio.
Częstotliwość próbkowania musi wynosić co najmniej 200 000 herców, aby uchwycić najwyższą częstotliwość wokalizacji. Po ustawieniu tych parametrów należy zdjąć górę klatki domowej samca i umieścić ją bezpośrednio pod mikrofonem. Następnie należy zidentyfikować samicę szczura w rui, która jest podatna na kopulację, co objawia się lordozą, drganiami uszu i gwałtownymi ruchami.
Umieść samicę w okresie receptywności w klatce domowej samca szczura będącego obiektem badania. Gdy samiec wykaże zainteresowanie samicą poprzez węszenie, gonitwę lub próbę kopulacji, usuń samicę i nagraj wokalizacje samca przez jedną do dwóch minut. Monitoruj wokalizacje ultradźwiękowe wizualnie, obserwując spektrogram w czasie rzeczywistym.
Jeśli samiec nie wydaje dźwięków, należy bezzwłocznie i na krótko przenieść samicę szczura z powrotem do klatki domowej samca, aby pobudzić go do wokalizacji. Na początek należy wprowadzić jednego samca szczura do pomieszczenia treningowego. Wszystkie pozostałe samce powinny przebywać w sąsiednim pomieszczeniu do czasu rozpoczęcia ich sesji treningowej.
Szczur powinien mieć wcześniej ograniczony dostęp do wody, aby ułatwić wykorzystanie jej w charakterze nagrody. Podczas treningu skonfiguruj program Avis soft recorder zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami. Następnie umieść klatkę domową pod mikrofonem.
Gdy samiec znajdzie się w odpowiedniej pozycji, wprowadź do klatki reaktywną samicę szczura. Usuń samicę w momencie, gdy samiec wykaże zainteresowanie, a następnie monitoruj występowanie docelowych wokalizacji. Początkowo każda modulowana częstotliwością wołanie o częstotliwości 50 kHz jest nagradzana.
Podaj nagrodę, jednocześnie klikając pisakiem i krótko prezentując butelkę z wodą lub pokarm. W miarę postępów w treningu wzmacniaj jedynie coraz bardziej złożone sekwencje wokalizacji, takie jak serie pięciu lub 10 sygnałów w szybkim następstwie. Kontynuuj trening, aż do momentu udzielenia 30 wzmocnień.
Analiza nagrań bazowych i po treningu zajmuje zazwyczaj od pięciu do 10 minut. Najpierw należy utworzyć kopię zapasową oryginalnego pliku dźwiękowego i wprowadzać edycje w kopii roboczej, aby usunąć częstotliwości szumów poniżej wokalizacji ultradźwiękowych. Należy użyć trybu wsadowego programu AVI Soft SaaS Lab Pro, aby zastosować filtr górnoprzepustowy dla plików dźwiękowych przy częstotliwości 25 kilohertz.
Aby określić próg szumu niezbędny do skorzystania z funkcji automatycznego wykrywania elementów w programie SaaS Lab Pro, otwórz plik dźwiękowy i utwórz spektrogram. Ustaw długość FFT na 512 przy rozmiarze ramki 75% i nakładce czasowej 93,75%. Włącz edycję przebiegu fali, aby szum usunięty ze spektrogramu mógł zostać usunięty z przebiegu fali. Skonfiguruj automatyczne pomiary parametrów zgodnie z instrukcją przedstawioną tutaj.
Trzema parametrami do pomiaru są czas trwania elementu, częstotliwość szczytowa oraz amplituda szczytowa. W sekcji lokalizacji pomiarów należy włączyć maksymalną amplitudę oraz minimalny i maksymalny parametr całego elementu. W sekcji separacji elementów należy wybrać automatyczny pojedynczy próg i wyświetlić próg.
Znajdź na spektrogramie obszar, w którym nie występują żadne sygnały ani szumy. Jest to szum tła. Ustaw próg tuż powyżej poziomu szumu tła.
Dostosowując czarną linię w oknie widma mocy nad spektrogramem, można tutaj odczytać poziom decybeli progu ustawionego w poprzednim kroku. Ustaw wartość odrzucania amplitury niższą o jeden decybel od poziomu progu. Te dwie wartości powinny być teraz stosowane dla wszystkich analizowanych plików dźwiękowych.
Zakładając, że wszystkie ustawienia rejestracji były takie same, aby oznaczyć wokalizacje, należy utworzyć spektrogram, korzystając z automatycznego progu ustawionego wcześniej oraz z tych samych parametrów, które zostały pokazane powyżej. Ręcznie usuń wszelkie szumy spełniające następujące kryteria: pierwszy, które zostały błędnie zidentyfikowane jako wokalizacja; drugi, które utrudniają rozróżnienie początku i/lub końca wokalizacji; trzeci, które zostały błędnie zidentyfikowane jako najwyższa lub najniższa częstotliwość w wokalizacji, co jest wskazywane odpowiednio przez górną i dolną czerwoną linię.
W niektórych przypadkach wokalizacji nie można oddzielić od szumu otoczenia, takiego jak dźwięk ściółki podczas poruszania się. Taki sygnał nie może zostać dokładnie przeanalizowany i powinien zostać usunięty po trwałe zidentyfikowaniu wszystkich wokalizacji poprzez trwałe usunięcie usuniętych sekcji spektrogramu z pliku dźwiękowego. Wybierając opcję „remove, erase spectrogram sections from waveform” z menu rozwijanego narzędzi, można utworzyć trwałe etykiety w pliku dźwiękowym.
Otwórz okno konfiguracji automatycznego pomiaru parametrów i kliknij przycisk edytuj w sekcji separacji elementów wizualnie i słuchowo. Przeanalizuj każdą opisaną wokalizację, aby określić jej kategorię i przypisać odpowiednią etykietę, korzystając z predefined text modules. Kategorie stosowane w naszej analizie to: częstotliwość prosta, modulowana oraz harmoniczna.
Zamknij spektrogram, zapisz plik dźwiękowy i przejdź do analizy kolejnego pliku. Po zidentyfikowaniu wokalizacji we wszystkich plikach dźwiękowych użyj narzędzia do przetwarzania wsadowego, aby automatycznie zmierzyć parametry akustyczne wszystkich plików. W oknie dialogowym przetwarzania wsadowego wybierz z menu rozwijanego opcję automatycznego pomiaru parametrów.
Zaznacz pole wyboru „przetwarzaj wszystkie pliki w wybranym folderze”. Następnie kliknij przycisk folderu i wybierz folder, w którym zapisane są pliki dźwiękowe. Kliknij „start”, a każdy plik zostanie automatycznie przeanalizowany zgodnie z ostatnio używanymi ustawieniami.
W oknie dialogowym konfiguracji automatycznego pomiaru parametrów pomiary zostaną zapisane w pliku tekstowym, który można zdefiniować za pomocą polecenia ustawień pliku dziennika parametrów DDE. Plik tekstowy ten można następnie zaimportować do programu do analizy statystycznej. Wykresy te pokazują, że zarówno liczba wokalizacji na sesję, jak i częstotliwość wokalizacji na minutę wzrastają w ciągu sześciotygodniowego okresu treningowego.
Tutaj przedstawiono reprezentatywne wokalizacje dla każdej z trzech kategorii wokalizacji o częstotliwości 50 kHz, których używamy, widoczne od lewej do prawej. Są to wokalizacje o stałej częstotliwości, modulowane oraz harmoniczne. W tym przykładzie wokalizacje z modulacją częstotliwości u tego samego szczura pokazano przed indukcją parkinsonizmu, po indukcji parkinsonizmu oraz po treningu wokalizacji.
W porównaniu do wokalizacji bazowej na panelu A, wokalizacja w stanie parkinsonizmu na panelu B wykazuje zmniejszenie szerokości pasma, czasu trwania i natężenia. Wokalizacja po treningu przedstawiona na panelu C pokazuje, w jaki sposób czas trwania, natężenie, szerokość pasma i modulacja częstotliwości powracają do poziomów bazowych po treningu wokalizacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak trenować, nagrywać i analizować ultradźwiękowe wokalizacje szczurów.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół treningu szczurów mający na celu zwiększenie liczby i złożoności ich wokalizacji ultradźwiękowych (USVs), zapewniając model do badania deficytów głosowych związanych z chorobą Parkinsona (PD) oraz starzeniem się. Metoda ta łączy trening behawioralny, rejestrację ultradźwiękową i analizę akustyczną, aby systematycznie badać mechanizmy sensoryczno-motoryczne leżące u podstaw wokalizacji oraz ich modulację poprzez ukierunkowane interwencje.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Nauki behawioralne
- Zaburzenia komunikacji
Wprowadzenie
- Deficyty głosu są powszechne w chorobie Parkinsona i w procesie starzenia, co wpływa na komunikację oraz jakość życia.
- Celowane treningi głosu mogą poprawić konkretne deficyty, jednak mechanizmy te pozostają niejasne.
- Ultradźwiękowe wokalizacje gryzoni służą jako model do badania neuronalnych podłoży zachowań wokalnych.
- Modele zwierzęce pozwalają na kontrolowaną analizę czynników, którymi trudno jest zarządzać w badaniach na ludziach.
Cel badania
- Opracowanie systematycznej metody trenowania i analizy ultradźwiękowych wokalizacji szczurów.
- Ocena wpływu celowanego treningu wokalnego na parametry wokalizacji w modelach choroby Parkinsona oraz starzenia się.
- Powiązanie poprawy zachowania z leżącymi u podstaw zmianami neuronowymi i nerwowo-mięśniowymi.
Zastosowane metody
- Indukcja parkinsonizmu u szczurów poprzez jednostronną infuzję 6-hydroksydopaminy (6-OHDA).
- Wykorzystanie modeli starzejących się szczurów (Fischer 344/Brown Norway F1).
- Trening behawioralny z wykorzystaniem wzmocnienia pozytywnego (nagrody w postaci jedzenia lub wody) w celu zwiększenia liczby złożonych USV.
- Rejestracja ultradźwięków za pomocą mikrofonów wysokiej częstotliwości i specjalistycznego oprogramowania (Avisoft Recorder, SASLab Pro).
- Analiza akustyczna wokalizacji pod kątem parametrów takich jak czas trwania, częstotliwość szczytowa, szerokość pasma i amplituda.
- Ręczna i zautomatyzowana kategoryzacja oraz pomiar typów wokalizacji (proste, modulowane, harmoniczne).
Główne wyniki
- Trening zwiększa zarówno liczbę, jak i złożoność wokalizacji ultradźwiękowych u szczurów.
- Parametry akustyczne, takie jak szerokość pasma, częstotliwość szczytowa i czas trwania, ulegają poprawie po treningu.
- W modelach PD, po wywołaniu uszkodzenia, obserwuje się deficyty wokalizacyjne (zredukowaną szerokość pasma, czas trwania i intensywność).
- Celowany trening wokalny przywraca parametry wokalizacji do poziomów bazowych w modelach PD.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia systematyczne badanie deficytów i regeneracji wokalizacji w modelach gryzoni.
- Celowany trening może skutecznie poprawić złożoność i częstotliwość wokalizacji, nawet w modelach chorobowych.
- Podejście to dostarcza wiedzy na temat mechanizmów neuronalnych i sensoromotorycznych leżących u podstaw rehabilitacji wokalnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Systematyczny trening i analiza wokalizacji ultradźwiękowych u starszych szczurów oraz szczurów z chorobą Parkinsona stanowią solidny model przedkliniczny do badania deficytów sensoryczno-motorycznych istotnych dla zaburzeń komunikacji. Podejście to umożliwia kontrolowaną analizę mechanizmów neuronalnych i behawioralnych leżących u podstaw upośledzenia głosu oraz jego regeneracji, co zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych na wczesnym etapie. Ilościowe wyniki i powtarzalność tej metody sprawiają, że jest ona cennym narzędziem w badaniach translacyjnych oraz w selekcji projektów w ramach portfela badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez powiązanie wyników behawioralnych z podłożem neuronalnym w modelach istotnych dla danej choroby.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów dla interwencji nakierowanych na regenerację sensoryczno-motoryczną.
- Ułatwia opartą na hipotezach analizę mechanizmów terapeutycznych w kontekście choroby Parkinsona i starzenia się organizmu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowany, mierzalny test behawioralny do oceny potencjalnych interwencji.
- Dostarcza powtarzalnych parametrów akustycznych (czas trwania, częstotliwość, amplituda) do porównań między badaniami.
- Umożliwia skalowalną analizę partii próbek oraz zautomatyzowany pomiar, przygotowując do wysokoprzepustowego przesiewu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Usprawnia dopasowanie przedklinicznych punktów końcowych do translacyjnych biomarkerów funkcji głosowych i regeneracji neuronalnej.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną w modelach chorób neurodegeneracyjnych.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez modelowanie złożonych fenotypów behawioralnych istotnych dla deficytów komunikacyjnych u ludzi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od etapu odkrywania do fazy przedklinicznej, zapewniając ilościowy, istotny z punktu widzenia choroby odczyt behawioralny do walidacji celu oraz oceny interwencji.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw deficytów wokalnych i ich regeneracji.
- Przesiew: Zapewnia odtwarzalne, ilościowe wyniki do oceny skuteczności interwencji.
- Analityka: Pozwala na zautomatyzowany pomiar kluczowych parametrów akustycznych w celu przeprowadzenia rzetelnego porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki przedkliniczne z punktami końcowymi w badaniach nad zaburzeniami komunikacji.
- Ponowne zastosowanie w przedsiębiorstwie: Możliwość adaptacji do wielu modeli chorobowych i skalowalność w zastosowaniach obejmujących cały portfel badań.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanisticzną w badaniach neurobehawioralnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy behawioralne i umożliwia reprodukowalne, skalowalne generowanie danych.
- Wartość strategiczna: Stanowi podstawę do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową w pipeline'ach na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów dotyczących chorób neurodegeneracyjnych.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu neuronauki behawioralnej oraz analizy akustycznej.
- Wymaga specjalistycznej aparatury do rejestracji i analizy ultradźwięków.
- Wymaga standaryzacji protokołów szkolenia i pomiaru pomiędzy zespołami.
- Możliwość zastosowania w różnych modelach gryzoni, jednak w nowych kontekstach chorobowych może być wymagana optymalizacja protokołu.
- Powtarzalność wyników zależy od spójnej kontroli środowiskowej i eksperymentalnej.
