Name: Ukierunkowany trening wokalizacji ultradźwiękowych u szczurów w podeszłym wieku i z chorobą Parkinsona (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj metodę treningu wokalizacji ultradźwiękowych u szczurów z chorobą Parkinsona i w podeszłym wieku. Protokół łączy nagrywanie dźwięku, analizę akustyczną i wzmocnienie pozytywne w celu badania deficytów głosowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez National Institutes of Health (NIDCD, P30-DC010754, T32-DC009401).

1. Nagrania przed i po treningu
<ol>
<li>Rozpocznij monitorowanie ultradźwięków za pomocą programu Avisoft Recorder, stosując konfigurację przedstawioną na Rysunku 2.</li>
<li>Wokalizacje ultradźwiękowe można monitorować wizualnie, obserwując spektrogram w czasie rzeczywistym, lub słuchowo, korzystając ze słuchawek podłączonych do interfejsu rejestracji ultradźwięków.</li>
<li>Umieść samicę szczura w rui (podatną na kopulację) w klatce domowej badanego samca. Objawami rui są lordoza, drganie uszu oraz szybkie, gwałtowne ruchy. Samice w rui wywołują u samców więcej wokalizacji niż samice niepodatne na kopulację.</li>
<li>Gdy samiec wykaże zainteresowanie samicą (np. węszenie, gonitwa i/lub próby kopulacji), usuń samicę i rejestruj wokalizacje samca przez 1-2 minuty.</li>
<li>Jeśli samiec nie wyda dźwięków natychmiast, na krótko wprowadź samicę z powrotem do klatki domowej samca, aby stymulować wokalizację.</li>
</ol>
2.	Trening wokalny
<ol>
<li>Rozpocznij monitorowanie ultradźwiękowe za pomocą programu Avisoft Recorder, stosując konfigurację przedstawioną na Rysunku 2.</li>
<li>Umieść samca szczura w jego domowej klatce pod mikrofonem.</li>
<li>Wprowadź samicę szczura do klatki samca. Zgodnie z wcześniejszymi informacjami, samica powinna znajdować się w fazie rui, aby zmaksymalizować odpowiedź wokalną samca.</li>
<li>Gdy samiec wykaże zainteresowanie samicą, usuń samicę z klatki.</li>
<li>Natychmiast po tym, jak samiec wyda docelową wokalizację, nagrodź go jednocześnie kliknięciem długopisu oraz krótkim udostępnieniem butelki z wodą lub przysmaku. Na początku nagradzane jest każde wołanie z modulacją częstotliwości 50-kHz (Rysunek 5B). W miarę postępów w treningu wzmacniane są jedynie coraz bardziej złożone ciągi wołań, np. serie od 5 do 10 wołań następujących szybko po sobie.</li>
<li>Kontynuuj sesję treningową aż do podania 30 wzmocnień. Zazwyczaj trwa to od 5 do 10 minut.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do analizy akustycznej
<ol>
<li>Zawsze archiwizuj oryginalne pliki dźwiękowe i wykonuj edycje oraz pomiary na kopii roboczej, ponieważ analiza będzie wymagała filtrowania i usuwania szumów z każdego pliku.</li> 
<li>Używając trybu wsadowego w programie Avisoft SASLab Pro, zastosuj filtr górnoprzepustowy o częstotliwości 25 kHz dla wszystkich plików dźwiękowych przeznaczonych do analizy, aby usunąć niepożądany szum poniżej wokalizacji ultradźwiękowych.</li>
<li>Aby skorzystać z funkcji automatycznego wykrywania w SASLab Pro, należy najpierw określić próg szumu. W tym celu otwórz plik dźwiękowy i utwórz spektrogram, korzystając z ustawień przedstawionych na Rysunku 3.</li>
<li>Okno Automatycznych Pomiarów Parametrów (Automatic Parameter Measurements) należy skonfigurować zgodnie z ustawieniami pokazanymi na Rysunku 4.</li>
<li>Znajdź obszar spektrogramu, w którym nie występują żadne sygnały ani szumy; jest to szum tła.</li>
<li>Korzystając z opcji „automatic (single threshold)”, ustaw próg w sekcji Element separation okna dialogowego konfiguracji Automatycznych Pomiarów Parametrów nieco powyżej poziomu szumu tła, przesuwając czarną linię w oknie widma mocy nad spektrogramem. Na Rysunku 4 próg został ustawiony na -55 dB.</li>
<li>Na dole okna dialogowego ustaw wartość „Reject if peak amplitude is less than” na 1 dB poniżej progu wyznaczonego w poprzednim kroku. Te dwie wartości powinny być teraz stosowane dla wszystkich analizowanych plików dźwiękowych, pod warunkiem, że wszystkie ustawienia nagrywania były identyczne.</li>
</ol>
4.	Identyfikacja wokalizacji
<ol>
<li>Aby oznakować wokalizacje przy użyciu automatycznego progu ustawionego powyżej, należy najpierw utworzyć spektrogram z powyższymi ustawieniami.</li>
<li>Ręcznie usuń wszelkie szumy, które spełniają następujące kryteria: 1) zostały błędnie zidentyfikowane jako wokalizacja, 2) wpływają na rozróżnienie początku i/lub końca wokalizacji i/lub 3) zostały błędnie zidentyfikowane jako najwyższa lub najniższa częstotliwość w wokalizacji (wskazane odpowiednio przez górną i dolną czerwoną linię). Alternatywnie, czasy rozpoczęcia/zakończenia etykiet wokalizacji można dostosować ręcznie po utworzeniu trwałych etykiet w kroku 4.5 poniżej. Szumy wpływające na pomiary wysokich i niskich częstotliwości muszą jednak zostać usunięte ręcznie.</li>
<li>W niektórych przypadkach wokalizacja nie będzie mogła zostać oddzielona od otaczających szumów, takich jak dźwięk ściółki podczas poruszania się. W takich przypadkach sygnał nie może zostać dokładnie przeanalizowany i należy go usunąć.</li>
<li>Po zidentyfikowaniu wszystkich wokalizacji na stałe usuń usunięte sekcje spektrogramu z pliku dźwiękowego, wybierając opcję „Remove erased spectrogram sections from waveform…” z rozwijanego menu Tools. Jeśli ta komenda nie zostanie wykonana przed zamknięciem spektrogramu, wszystkie prace związane z usuwaniem zostaną utracone.</li>
<li>Utwórz trwałe etykiety w pliku dźwiękowym, klikając przycisk „edit” w sekcji Element Separation w oknie konfiguracji Automatic Parameter Measurements.</li>
<li>Wizualnie i słuchowo przejrzyj każdą oznakowaną wokalizację, aby określić jej kategorię: prosta, modulowana częstotliwościowo (FM) lub harmoniczna. Przypisz odpowiednią etykietę za pomocą zdefiniowanych modułów tekstowych. Przykłady każdej kategorii wokalizacji przedstawiono na Ryc. 5.</li>
<li>Zamknij spektrogram, zapisz plik dźwiękowy i przejdź do analizy kolejnego pliku dźwiękowego.</li>
</ol>
5. Pomiary akustyczne
<ol>
<li>Po zidentyfikowaniu wszystkich wokalizacji w plikach dźwiękowych, użyj narzędzia do przetwarzania wsadowego (Tools: Batch Processing), aby automatycznie zmierzyć parametry akustyczne wszystkich plików.</li>
<li>W oknie dialogowym przetwarzania wsadowego wybierz z menu rozwijanego opcję „Automatic Parameter Measurements”.</li>
<li>Zaznacz pole wyboru „process all files in the selected folder”, następnie kliknij przycisk „folder” i wybierz folder, w którym zapisano pliki dźwiękowe.</li>
<li>Kliknij „Start”, a każdy plik zostanie automatycznie przeanalizowany zgodnie z ustawieniami ostatnio zastosowanymi w oknie dialogowym konfiguracji Automatic Parameter Measurement.</li> 
<li>Pomiary zostaną zapisane w pliku tekstowym, który można zdefiniować za pomocą polecenia DDE Parameters/Log File Setting. Ten plik tekstowy można następnie zaimportować do programu do analizy statystycznej.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki: 
Wokalizacje ultradźwiękowe szczurów ulegają zmianom pod wpływem procesów fizjologicznych związanych ze starzeniem oraz w modelach choroby Parkinsona indukowanych 6-OHDA. 13 Typowo obserwuje się obniżenie jakości wokalizacji ultradźwiękowych, co objawia się redukcją następujących ilościowych parametrów akustycznych: szerokości pasma, częstotliwości szczytowej, czasu trwania oraz intensywności. Rycina 6 przedstawia wokalizacje z modulacją częstotliwości u szczura w modelu PD w trzech różnych punktach czasowych: w stanie wyjściowym, po indukcji PD oraz po treningu wokalizacji. W stanie PD sygnał wykazuje redukcję szerokości pasma, czasu trwania i intensywności. Dodatkowo modulacja częstotliwości stała się nieregularna.
Oprócz degradacji specyficznych parametrów akustycznych, obserwujemy również mniejszą ogólną złożoność rodzajów emitowanych wokalizacji u szczurów w starszym wieku oraz z parkinsonizmem. Na przykład, po indukowaniu PD szczur emituje większą liczbę prostych sygnałów i mniejszą liczbę sygnałów modulowanych częstotliwością. Po treningu wokalizacji wiele parametrów akustycznych, takich jak czas trwania i intensywność, zbliża się do poziomów bazowych, a liczba złożonych sygnałów wzrasta (Rycina 6). Szczury w starszym wieku wykazują podobną degradację parametrów akustycznych w swoich wokalizacjach ultradźwiękowych. Obecnie badamy efekty treningu wokalnego u szczurów w starszym wieku.
<img src="/files/ftp_upload/2835/2835fig1.jpg" alt="Analiza wzrostu wokalizacji; wykresy liniowe przedstawiające trendy w tygodniowych wokalizacjach i ich częstotliwości w czasie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Liczba wokalizacji na sesję (cel osiągnięty przez wszystkie szczury w każdym tygodniu) oraz częstotliwość wokalizacji (przedstawiono średnią i błąd standardowy) wzrastają w ciągu 6-tygodniowego okresu treningowego w grupie szczurów Fischer 344/Brown Norway F1 zarówno młodych (9 mo), jak i starych (32 mo).
<img src="/files/ftp_upload/2835/2835fig2.jpg" alt="Sonogram przedstawiający częstotliwość (kHz) w funkcji czasu (sec) dla analizy sygnału akustycznego; sekcje oznaczone jako A, B, C." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywne wokalizacje dla każdej z trzech kategorii wokalizacji 50 kHz; (A) proste, (B) modulowane częstotliwościowo i (C) harmoniczne.
<img src="/files/ftp_upload/2835/2835fig3.jpg" alt="Schemat analizy sonogramu, częstotliwość w funkcji czasu, przedstawiający wzorce dźwiękowe i pomiary szerokości pasma." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywne wokalizacje z modulacją częstotliwości u jednego szczura w stanie (A) bazowym, (B) po indukcji PD oraz (C) po treningu wokalizacji.

<ol><li>Fox, C. M., Morrison, C. E., Ramig, L. O., Sapir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspectives+on+the+Lee+Silverman+Voice+Treatment+%28LSVT%29+for+individuals+with+idiopathic+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Speech+Lang+Pathol%22%5BJournal%5D)">Current perspectives on the Lee Silverman Voice Treatment (LSVT) for individuals with idiopathic Parkinson disease.</a> Am J Speech Lang Pathol. 11, 111-123 (2002).</li>
<li>Roy, N., Stemple, J., Merrill, R. M., Thomas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+voice+disorders+in+the+elderly%3A+preliminary+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of voice disorders in the elderly: preliminary findings.</a> Laryngoscope. 117, 628-633 (2007).</li>
<li>Ramig, L. O., Sapir, S., Fox, C., Countryman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+vocal+loudness+following+intensive+voice+treatment+%28LSVT%29+in+individuals+with+Parkinson%27s+disease%3A+a+comparison+with+untreated+patients+and+normal+age-matched+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Mov.+Disord%22%5BJournal%5D)">Changes in vocal loudness following intensive voice treatment (LSVT) in individuals with Parkinson's disease: a comparison with untreated patients and normal age-matched controls.</a> Mov. Disord. 16, 79-83 (2001).</li>
<li>Sapir, S., Ramig, L. O., Fox, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lee+Silverman+Voice+Treatment%C2%AE+for+voice%2C+speech+and+other+orofacial+disorders+in+patients+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Neurology%22%5BJournal%5D)">The Lee Silverman Voice Treatment® for voice, speech and other orofacial disorders in patients with Parkinson's disease.</a> Future Neurology. 1, 563-570 (2006).</li>
<li>Panksepp, J., Burgdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((50-kHz+chirping+%28laughter%3F%29+in+response+to+conditioned+and+unconditioned+tickle-induced+reward+in+rats%3A+effects+of+social+housing+and+genetic+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables.</a> Behav. Brain Res. 115, 25-38 (2000).</li>
<li>Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+repertoire+of+vocalizations+in+the+BTBR+T%2Btf%2FJ+mouse+model+of+autism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Unusual repertoire of vocalizations in the BTBR T+tf/J mouse model of autism.</a> PLoS One. 3, e3067-e3067 (2008).</li>
<li>Wohr, M., Houx, B., Schwarting, R. K., Spruijt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+experience+and+context+on+50-kHz+vocalizations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Effects of experience and context on 50-kHz vocalizations in rats.</a> Physiol. Behav. 93, 766-776 (2008).</li>
<li>Lahvis, G. P., Alleva, E., Scattoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+mouse+vocalizations%3A+prosody+and+frequency+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Translating mouse vocalizations: prosody and frequency modulation.</a> Genes Brain Behav. 10, 4-16 (2011).</li>
<li>Brudzynski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+of+adult+rats+by+ultrasonic+vocalization%3A+biological%2C+sociobiological%2C+and+neuroscience+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Communication of adult rats by ultrasonic vocalization: biological, sociobiological, and neuroscience approaches.</a> ILAR J. 50, 43-50 (2009).</li>
<li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Russell, J. A., Hammer, M. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic+output+from+the+excised+rat+larynx%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Acoust.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic output from the excised rat larynx.</a> J. Acoust. Soc. Am. 128, EL75-EL79 (2010).</li>
<li>Fulceri, F., Biagioni, F., Lenzi, P., Falleni, A., Gesi, M., Ruggieri, S., Fornai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nigrostriatal+damage+with+6-OHDA%3A+validation+of+routinely+applied+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Nigrostriatal damage with 6-OHDA: validation of routinely applied procedures.</a> Ann N Y Acad Sci. 1074, 344-348 (2006).</li>
<li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Commun.+Disord%22%5BJournal%5D)">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> J. Commun. Disord. 43, 319-326 (2010).</li>
<li>Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+dopamine+synaptic+activity%3A+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behav. Neurosci. 123, 328-336 (2009).</li>
<li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations%3A+effects+of+amphetamine+and+social+context%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology (Berl). 211, 1-13 (2010).</li>
<li>Burgdorf, J., Kroes, R. A., Beinfeld, M. C., Panksepp, J., Moskal, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+molecular+basis+of+positive+affect+using+rough-and-tumble+play+in+rats%3A+a+role+for+insulin-like+growth+factor+I%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Uncovering the molecular basis of positive affect using rough-and-tumble play in rats: a role for insulin-like growth factor I.</a> Neuroscience. 168, 769-777 (2010).</li>
<li>Wöhr, M., Schwarting, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic+communication+in+rats%3A+effects+of+morphine+and+naloxone+on+vocal+and+behavioral+responses+to+playback+of+50-kHz+vocalizations%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic communication in rats: effects of morphine and naloxone on vocal and behavioral responses to playback of 50-kHz vocalizations.</a> Pharmacol Biochem Behav. 94, 285-295 (2009).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi w Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals, przewodniku NIH dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz ustawie o dobrostanie zwierząt (Animal Welfare Act). Protokół wykorzystania zwierząt został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w School of Medicine and Public Health na Uniwersytecie Wisconsin-Madison.

Wokalizacje ultradźwiękowe u szczurów wydają się być podatne na procesy starzenia oraz choroby, takie jak choroba Parkinsona. Wokalizacje te stanowią behawioralny model funkcji głosowej, obejmujący deficyty towarzyszące zmianom fizjologicznym wynikającym z choroby i starzenia się. Ponadto zmiany akustyczne w wokalizacjach ultradźwiękowych są łatwo mierzalne i mierzalne ilościowo. Co więcej, wokalizacje ultradźwiękowe mogą być modyfikowane poprzez interwencje behawioralne. W związku z tym wokalizacje ultradźwiękowe szczurów stanowią przydatny model do badania wpływu chorób, starzenia się oraz interwencji terapeutycznych zarówno na zachowanie, jak i na leżące u ich podstaw mechanizmy neurobiologiczne.
Nasza metoda treningu wokalnego wykorzystuje bodziec warunkowy (kliknięcie) powiązany z pozytywnym wzmocnieniem (nagrodą w postaci wody lub pokarmu). Kliknięcie, po którym następuje nagroda, służy do wzmacniania wokalizacji o rosnącym stopniu złożoności. Wokalizacje złożone definiujemy jako takie, które zawierają komponent „trela” (modulowany częstotliwościowo) (Rycina 5B), w przeciwieństwie do tych, które są „płaskie” i utrzymują pojedynczą częstotliwość (Rycina 5A). Ten komponent modulowany częstotliwościowo jest łatwo identyfikowalny dzięki swojemu sinusoidalnemu wyglądowi. Choć wokalizacje 50-kHz mogą być w pełni sinusoidalne (Rycina 5B), często spotyka się bardziej złożone wokalizacje 50-kHz, które składają się częściowo z tego komponentu modulowanego częstotliwościowo, a także z dużych skoków częstotliwości lub krótkiego komponentu płaskiego. Te bardziej złożone wokalizacje mogą mieć krótkie przerwy trwające mniej niż 10 ms między komponentami, lecz są uznawane za pojedynczą wokalizację. Chociaż możliwa jest dalsza szczegółowa subklasyfikacja tych wokalizacji w trybie offline,14 wszystkie wokalizacje 50-kHz zawierające komponent modulowany częstotliwościowo klasyfikujemy jako złożone, aby ograniczyć potrzebę subiektywnej klasyfikacji online oraz zmniejszyć zmienność wzmocnienia. W pracy we własnym laboratorium istotne jest wybranie sposobu klasyfikacji i analizy danych zgodnie z projektem badania, który jest odpowiedni dla celu prowadzonej pracy.
Podczas stosowania tego protokołu należy wziąć pod uwagę wiele czynników. Przede wszystkim, mimo jednorodności genetycznej i spójności proceduralnej, szczury wykazują zmienną reakcję na trening. Niektóre szczury naturalnie wokalizują częściej niż inne,5 lub są bardziej motywowane ekspozycją na samicę niż nagrodą w postaci pokarmu lub wody. Jednym ze sposobów uwzględnienia tej zmienności jest badanie zmian w parametrach akustycznych od wokalizacji bazowych poszczególnych szczurów do ich wokalizacji po wywołaniu zmiany (lesji) i po treningu. Chociaż nie jest to omawiane w niniejszym protokole, stosujemy również testy behawioralne w celu ilościowego określenia zainteresowania samicą, takie jak czas do momentu wejścia na samicę (latency to mount). Ponadto, w zależności od wieku i poziomu aktywności poszczególnych szczurów, podczas treningu na klatce domowej może być wymagana górna osłona z drutu, aby zapobiec ucieczce. Pomimo indywidualnej zmienności, z powodzeniem zastosowaliśmy ten protokół u różnych szczepów i w różnym wieku, aby poprawić wokalizacje w stosunku do poziomu bazowego każdego osobnika.
Szczury są wrażliwe na pozornie niewielkie zmiany w środowisku, takie jak zapachy, temperatura i obecność różnych osób. Należy starać się unikać stosowania pachnących produktów do pielęgnacji osobistej, takich jak balsamów, produktów do włosów i perfum. Przed przystąpieniem do szkolenia osoba przeprowadzająca badanie musi czuć się swobodnie w interakcji ze szczurami i podczas ich manipulacji. Co więcej, wszelkie niespójności w składzie personelu lub warunkach środowiskowych mogą wpłynąć na reakcję wokalną szczurów.
Ponieważ szczury są zwierzętami nocnymi, powinny być utrzymywane w odwróconym cyklu świetlnym, aby trening mógł odbywać się w ciemnej fazie ich cyklu, kiedy są one najbardziej aktywne. W pomieszczeniu treningowym stosujemy oświetlenie czerwonym światłem. Ponadto, jeśli w trakcie treningu stosowana jest nagroda w postaci wody, dostęp szczurów do wody powinien być ograniczony. Nasze szczury mają ograniczony dostęp do wody przez 21 godzin przed sesją treningową. Ustalono, że trzygodzinny dostęp do wody to najmniej restrykcyjny okres, który pozwala na wykorzystanie wody jako wzmocnienia w badaniach behawioralnych, nie powodując przy tym istotnego pogorszenia stanu zdrowia lub dobrostanu zwierząt, co zostało zatwierdzone przez naszą Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt. Szczury otrzymują dostęp do wody w losowych odstępach czasu (od 10 do 30 minut) po treningu, a następnie mają swobodny dostęp do wody przez trzy godziny w ciemnej fazie swojego cyklu świetlnego. Szczury należy codziennie sprawdzać pod kątem oznak odwodnienia oraz ważyć co drugi dzień, aby upewnić się, że nie nastąpiła znaczna utrata masy ciała (powyżej 10%). Ograniczenie dostępu do pokarmu nie jest konieczne w przypadku stosowania smakołyków jako nagrody. W sprzedaży dostępne są specjalistyczne przysmaki dla szczurów, jednak stwierdziliśmy, że niewielki kawałek słodkich płatków śniadaniowych stanowi skuteczną nagrodę.
Jak wspomniano powyżej, samice szczurów w okresie ruj wywołują silniejszą reakcję wokalną samców niż samice nieprzyjmujące seksualnie. Utrzymując w kolonii dużą liczbę samic, istnieje wysokie prawdopodobieństwo, że każdego dnia przynajmniej jedna samica będzie w okresie ruj. Jednak ruj u samic szczurów można również wywołać farmakologicznie poprzez podskórne wstrzyknięcie 10 μg β-estradiolu w 0,1 cc sterylnego oleju sezamowego na 48 h przed treningiem, a następnie 500 μg progesteronu w 0,1 cc sterylnego oleju sezamowego na 4 h przed treningiem. Ponadto samce szczurów, które nie miały wcześniej kontaktu z samicami, muszą zdobyć doświadczenie seksualne przed treningiem wokalnym. Osiąga się to poprzez umieszczenie w klatce samca samicy wykazującej oznaki przyjmowania seksualnego (gwałtowne ruchy, lordoza, drżenie uszu) aż do momentu, gdy samiec wejdzie na samicę i ejakuluje. Samce mogą nie wchodzić na samice podczas pierwszych kilku sesji; samicę można usunąć po tym, jak samiec wykaże zainteresowanie, węsząc i/lub goniąc samicę po klatce. Zdobywanie doświadczenia seksualnego przeprowadza się raz dziennie przez dwa tygodnie. Okres ten stanowi również okazję dla szczurów do habituacji do eksperymentatora(ów) oraz pomieszczenia nagraniowego.
Jednym z ograniczeń tej metody jest subiektywność określania typu wokalizacji. Dodatkowo czynnik ten ogranicza szybkość gromadzenia danych, ponieważ każde zawołanie musi zostać niezależnie zbadane i zaklasyfikowane ręcznie. Z tym wiąże się znaczenie posiadania doświadczonych oceniających, którzy przeszli spójne szkolenie w zakresie identyfikacji wokalizacji. W obrębie własnego laboratorium należy ocenić zarówno niezawodność wewnątrzoceniającą, jak i międzyoceniającą.
Podsumowując, wokalizacje ultradźwiękowe u gryzoni są wykorzystywane w wielu różnych modelach do badania zależności między mózgiem a zachowaniem, w tym stanów emocjonalnych, nagrody i uzależnień oraz stanów chorobowych, takich jak autyzm.6,14-16 Ta nowatorska metoda umożliwia badanie mechanizmów leżących u podstaw ukierunkowanego treningu wokalnego w leczeniu deficytów głosu w procesie starzenia oraz w chorobie Parkinsona. Metoda ta ma potencjał do zastosowania w innych modelach chorób wpływających na komunikację i głos.

<table><tbody><tr><td>Kondensacyjny mikrofon ultradźwiękowy CM16/CMPA</td><td>Avisoft BioAcoustics</td><td>40011</td><td></td></tr><tr><td>UltraSoundGate 116Hb</td><td>Avisoft BioAcoustics</td><td>41161</td><td></td></tr><tr><td>Avisoft-RECORDER</td><td>Avisoft BioAcoustics</td><td>10201</td><td></td></tr><tr><td>Avisoft-SASLab Pro</td><td>Avisoft BioAcoustics</td><td>10101</td><td></td></tr></tbody></table>

celowany trening wokalizacji ultradźwiękowych u starszych szczurów oraz szczurów z chorobą parkinsona

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

Zaburzenia głosu są powszechną komplikacją zarówno choroby Parkinsona (PD), jak i starzenia się; mogą one znacząco obniżyć jakość życia poprzez wpływ na zdolności komunikacyjne. 1, 2 Celowany trening (terapia mowy/głosu) może poprawić konkretne deficyty głosu,3, 4 choć mechanizmy leżące u podstaw interwencji behawioralnych nie są dobrze poznane. Systematyczne badanie zaburzeń głosu i terapii powinno uwzględniać wiele czynników trudnych do kontrolowania u ludzi, takich jak wiek, środowisko domowe, czas od wystąpienia objawów choroby, stopień zaawansowania choroby oraz przyjmowane leki. Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu wykorzystuje zwierzęcy model wokalizacji, który umożliwia systematyczne badanie zmian w sensoromotorycznych mechanizmach sterujących głosem pod wpływem celowanego treningu. Procedury nagrywania i analizy ultradźwięków opisane w tym protokole mają zastosowanie w każdym badaniu ultradźwiękowych wokalizacji gryzoni.
Ultradźwiękowe wokalizacje gryzoni stają się cennym modelem do badania neuronalnych substratów zachowania.5-8 Zarówno wokalizacje gryzoni, jak i ludzi niosą wartość semiotyczną i są wytwarzane poprzez modyfikację wypływającego strumienia powietrza za pomocą zwężenia krtani.9, 10 Zatem wokalizacje gryzoni mogą być użytecznym modelem do badania deficytów głosu w kontekście sensoryczno-motorycznym. Ponadto modele szczurze pozwalają nam badać neurobiologiczne podstawy regeneracji po deficytach za pomocą ukierunkowanego treningu.
Aby zamodelować PD, wykorzystujemy szczury Long-Evans (Charles River Laboratories International, Inc.) i wywołujemy parkinsonizm poprzez jednostronną infuzję 7 μg 6-hydroksydopaminy (6-OHDA) do przyśrodkowego pęczka przedmózgowego, co powoduje umiarkowaną do ciężkiej degenerację presynaptycznych neuronów prążkowia (szczegóły patrz: Ciucci, 2010).11, 12 W naszym modelu starzenia wykorzystujemy szczury Fischer 344/Brown Norway F1 (National Institute on Aging).
Naszą główną metodą wywoływania wokalizacji jest eksponowanie samców szczurów z doświadczeniem seksualnym na samice szczurów w okresie receptywności seksualnej. Gdy samiec wykaże zainteresowanie samicą, zostaje ona usunięta, a samiec kontynuuje wokalizację. Poprzez nagradzanie złożonych wokalizacji pokarmem lub wodą, można zwiększyć zarówno liczbę złożonych wokalizacji, jak i częstotliwość wokalizacji (Rysunek 1).
Mikrofon ultradźwiękowy zamontowany nad klatką domową samca rejestruje wokalizacje. Nagrywanie rozpoczyna się po usunięciu samicy szczura, aby wyizolować wołania samca. Wokalizacje mogą być obserwowane w czasie rzeczywistym w celach treningowych lub nagrywane i analizowane offline. Poprzez nagrywanie i akustyczną analizę wokalizacji przed i po treningu wokalnym można ocenić skutki choroby oraz stopień przywrócenia prawidłowej funkcji dzięki treningowi. Model ten pozwala również powiązać zaobserwowane poprawy behawioralne (wokalne) ze zmianami w mózgu i układzie nerwowo-mięśniowym.

Zaburzenia głosu są uciążliwe w procesie starzenia się oraz w chorobie Parkinsona. Ultradźwiękowe wokalizacje szczurów, które również są dotknięte tymi schorzeniami, mogą być wykorzystane do badania tych zaburzeń głosu, ich podłoży neuronalnych oraz charakteru powrotu do sprawności funkcjonalnej w wyniku interwencji behawioralnej.

Celowany trening wokalizacji ultradźwiękowych u starszych szczurów oraz szczurów z chorobą Parkinsona

Deficyty głosu są częstym powikłaniem zarówno w chorobie Parkinsona (PD), jak i w procesie starzenia; mogą one znacząco obniżyć jakość życia, wpływając na...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest nauczenie szczurów zwiększania liczby i złożoności ich wokalizacji ultradźwiękowych (USV). Jest to osiągane najpierw poprzez nagranie wokalizacji bazowych. Następnym krokiem jest trenowanie ukierunkowanych wokalizacji za pomocą wzmocnienia pozytywnego.Po zakończeniu treningu rejestrowane są wokalizacje. Ostatnim krokiem procedury jest analiza akustyczna oraz porównanie wokalizacji wyjściowych z wokalizacjami po treningu. W końcowym etapie można uzyskać wyniki.Wykazano, że trening zwiększa liczbę i złożoność wokalizacji ultradźwiękowych poprzez wzrost parametrów akustycznych, takich jak szerokość pasma, częstotliwość szczytowa i czas trwania. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie zaburzeń komunikacji, na przykład w kwestii tego, w jaki sposób ćwiczenia wokalne modulują podstawowe mechanizmy neuronalne. Ponadto metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat niedoborów czuciowo-ruchowych w obrębie czaszki związanych z chorobą Parkinsona i starzeniem się.Metodę tę można zastosować również w innych modelach chorób i stanach, w których wokalizacje ultradźwiękowe służą jako wskaźnik behawioralny. Demonstrację treningu wokalizacji przeprowadzą Emerald Dahl i Jamie Shire, członkowie mojego laboratorium. Aby rozpocząć monitorowanie ultradźwiękowe, uruchom oprogramowanie Avis Soft Recorder i wybierz opcję „permanent unlimited” dla wyzwalacza (trigger), aby umożliwić ręczne uruchamianie i zatrzymywanie nagrań. Następnie określ w katalogu głównym miejsce zapisu przechwyconych plików audio.Częstotliwość próbkowania musi wynosić co najmniej 200 000 herców, aby uchwycić najwyższą częstotliwość wokalizacji. Po ustawieniu tych parametrów należy zdjąć górę klatki domowej samca i umieścić ją bezpośrednio pod mikrofonem. Następnie należy zidentyfikować samicę szczura w rui, która jest podatna na kopulację, co objawia się lordozą, drganiami uszu i gwałtownymi ruchami.Umieść samicę w okresie receptywności w klatce domowej samca szczura będącego obiektem badania. Gdy samiec wykaże zainteresowanie samicą poprzez węszenie, gonitwę lub próbę kopulacji, usuń samicę i nagraj wokalizacje samca przez jedną do dwóch minut. Monitoruj wokalizacje ultradźwiękowe wizualnie, obserwując spektrogram w czasie rzeczywistym.Jeśli samiec nie wydaje dźwięków, należy bezzwłocznie i na krótko przenieść samicę szczura z powrotem do klatki domowej samca, aby pobudzić go do wokalizacji. Na początek należy wprowadzić jednego samca szczura do pomieszczenia treningowego. Wszystkie pozostałe samce powinny przebywać w sąsiednim pomieszczeniu do czasu rozpoczęcia ich sesji treningowej.Szczur powinien mieć wcześniej ograniczony dostęp do wody, aby ułatwić wykorzystanie jej w charakterze nagrody. Podczas treningu skonfiguruj program Avis soft recorder zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami. Następnie umieść klatkę domową pod mikrofonem.Gdy samiec znajdzie się w odpowiedniej pozycji, wprowadź do klatki reaktywną samicę szczura. Usuń samicę w momencie, gdy samiec wykaże zainteresowanie, a następnie monitoruj występowanie docelowych wokalizacji. Początkowo każda modulowana częstotliwością wołanie o częstotliwości 50 kHz jest nagradzana.Podaj nagrodę, jednocześnie klikając pisakiem i krótko prezentując butelkę z wodą lub pokarm. W miarę postępów w treningu wzmacniaj jedynie coraz bardziej złożone sekwencje wokalizacji, takie jak serie pięciu lub 10 sygnałów w szybkim następstwie. Kontynuuj trening, aż do momentu udzielenia 30 wzmocnień.Analiza nagrań bazowych i po treningu zajmuje zazwyczaj od pięciu do 10 minut. Najpierw należy utworzyć kopię zapasową oryginalnego pliku dźwiękowego i wprowadzać edycje w kopii roboczej, aby usunąć częstotliwości szumów poniżej wokalizacji ultradźwiękowych. Należy użyć trybu wsadowego programu AVI Soft SaaS Lab Pro, aby zastosować filtr górnoprzepustowy dla plików dźwiękowych przy częstotliwości 25 kilohertz.Aby określić próg szumu niezbędny do skorzystania z funkcji automatycznego wykrywania elementów w programie SaaS Lab Pro, otwórz plik dźwiękowy i utwórz spektrogram. Ustaw długość FFT na 512 przy rozmiarze ramki 75% i nakładce czasowej 93,75%. Włącz edycję przebiegu fali, aby szum usunięty ze spektrogramu mógł zostać usunięty z przebiegu fali. Skonfiguruj automatyczne pomiary parametrów zgodnie z instrukcją przedstawioną tutaj.Trzema parametrami do pomiaru są czas trwania elementu, częstotliwość szczytowa oraz amplituda szczytowa. W sekcji lokalizacji pomiarów należy włączyć maksymalną amplitudę oraz minimalny i maksymalny parametr całego elementu. W sekcji separacji elementów należy wybrać automatyczny pojedynczy próg i wyświetlić próg.Znajdź na spektrogramie obszar, w którym nie występują żadne sygnały ani szumy. Jest to szum tła. Ustaw próg tuż powyżej poziomu szumu tła.Dostosowując czarną linię w oknie widma mocy nad spektrogramem, można tutaj odczytać poziom decybeli progu ustawionego w poprzednim kroku. Ustaw wartość odrzucania amplitury niższą o jeden decybel od poziomu progu. Te dwie wartości powinny być teraz stosowane dla wszystkich analizowanych plików dźwiękowych.Zakładając, że wszystkie ustawienia rejestracji były takie same, aby oznaczyć wokalizacje, należy utworzyć spektrogram, korzystając z automatycznego progu ustawionego wcześniej oraz z tych samych parametrów, które zostały pokazane powyżej. Ręcznie usuń wszelkie szumy spełniające następujące kryteria: pierwszy, które zostały błędnie zidentyfikowane jako wokalizacja; drugi, które utrudniają rozróżnienie początku i/lub końca wokalizacji; trzeci, które zostały błędnie zidentyfikowane jako najwyższa lub najniższa częstotliwość w wokalizacji, co jest wskazywane odpowiednio przez górną i dolną czerwoną linię.W niektórych przypadkach wokalizacji nie można oddzielić od szumu otoczenia, takiego jak dźwięk ściółki podczas poruszania się. Taki sygnał nie może zostać dokładnie przeanalizowany i powinien zostać usunięty po trwałe zidentyfikowaniu wszystkich wokalizacji poprzez trwałe usunięcie usuniętych sekcji spektrogramu z pliku dźwiękowego. Wybierając opcję „remove, erase spectrogram sections from waveform” z menu rozwijanego narzędzi, można utworzyć trwałe etykiety w pliku dźwiękowym.Otwórz okno konfiguracji automatycznego pomiaru parametrów i kliknij przycisk edytuj w sekcji separacji elementów wizualnie i słuchowo. Przeanalizuj każdą opisaną wokalizację, aby określić jej kategorię i przypisać odpowiednią etykietę, korzystając z predefined text modules. Kategorie stosowane w naszej analizie to: częstotliwość prosta, modulowana oraz harmoniczna.Zamknij spektrogram, zapisz plik dźwiękowy i przejdź do analizy kolejnego pliku. Po zidentyfikowaniu wokalizacji we wszystkich plikach dźwiękowych użyj narzędzia do przetwarzania wsadowego, aby automatycznie zmierzyć parametry akustyczne wszystkich plików. W oknie dialogowym przetwarzania wsadowego wybierz z menu rozwijanego opcję automatycznego pomiaru parametrów.Zaznacz pole wyboru „przetwarzaj wszystkie pliki w wybranym folderze”. Następnie kliknij przycisk folderu i wybierz folder, w którym zapisane są pliki dźwiękowe. Kliknij „start”, a każdy plik zostanie automatycznie przeanalizowany zgodnie z ostatnio używanymi ustawieniami.W oknie dialogowym konfiguracji automatycznego pomiaru parametrów pomiary zostaną zapisane w pliku tekstowym, który można zdefiniować za pomocą polecenia ustawień pliku dziennika parametrów DDE. Plik tekstowy ten można następnie zaimportować do programu do analizy statystycznej. Wykresy te pokazują, że zarówno liczba wokalizacji na sesję, jak i częstotliwość wokalizacji na minutę wzrastają w ciągu sześciotygodniowego okresu treningowego.Tutaj przedstawiono reprezentatywne wokalizacje dla każdej z trzech kategorii wokalizacji o częstotliwości 50 kHz, których używamy, widoczne od lewej do prawej. Są to wokalizacje o stałej częstotliwości, modulowane oraz harmoniczne. W tym przykładzie wokalizacje z modulacją częstotliwości u tego samego szczura pokazano przed indukcją parkinsonizmu, po indukcji parkinsonizmu oraz po treningu wokalizacji.W porównaniu do wokalizacji bazowej na panelu A, wokalizacja w stanie parkinsonizmu na panelu B wykazuje zmniejszenie szerokości pasma, czasu trwania i natężenia. Wokalizacja po treningu przedstawiona na panelu C pokazuje, w jaki sposób czas trwania, natężenie, szerokość pasma i modulacja częstotliwości powracają do poziomów bazowych po treningu wokalizacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak trenować, nagrywać i analizować ultradźwiękowe wokalizacje szczurów.

targeted-training-ultrasonic-vocalizations-aged-parkinsonian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Skuteczne szkolenie ultradźwiękowych wokalizacji u starych i parkinsonowskich szczurów

Samopodawanie leku oraz wokalizacje ultradźwiękowe (USV) są wykorzystywane jako oceny behawioralne w badaniach na zwierzętach, lecz rzadko w połączeniu. Celem niniejszego artykułu jest opisanie zalet rejestrowania USV podczas procedur samopodawania leków w celu oceny odpowiedzi afektywnych na doświadczenie związane z przyjmowaniem substancji.

Ocena wokalizacji ultradźwiękowych podczas samopodawania leku u szczurów

Ultradźwiękowe wokalizacje (USV) u myszy różnią się w zależności od wieku, płci, stanu i tła genetycznego. Wykorzystując dwa emitery ultradźwiękowe nadające jednocześnie w różnych lokalizacjach, ten test dwukrotnego wyboru może ocenić rozpoznawanie myszy i reakcje preferencji na różne cechy USV.

Określanie preferencji wokalizacji ultradźwiękowej u myszy za pomocą testu odtwarzania dwóch wyborów

Tutaj prezentujemy protokół wywołujący u szczurów zachowania warunkowe oparte na podejściu Pawłowa. Procedura ta może być wykorzystana do pomiaru indywidualnych różnic w tendencji do zbliżania się i przypisywania istotności bodźców sygnałom związanym z nagrodą oraz badania podatności na uzależnienie.

Trening podejścia warunkowego Pawłowa u szczurów

Mysie ultradźwiękowe wokalizacje są używane jako proxy do modelowania genetycznych podstaw deficytów komunikacji głosowej w mysich modelach zaburzeń neuropsychiatrycznych. Niniejszy protokół opisuje trzy konteksty eksperymentalne, które niezawodnie wywołują ultradźwiękowe wokalizacje od szczeniąt (w trakcie rozwoju) i dorosłych myszy (interakcje tej samej płci, interakcje samca-samicy w rui).

Nagrywanie wokalizacji ultradźwiękowych myszy w celu oceny komunikacji społecznej

Myszy wytwarzają złożony, wielosylabowy repertuar wokalizacji ultradźwiękowych (USV). Te USV są szeroko stosowane jako odczyty zaburzeń neuropsychiatrycznych. Protokół ten opisuje niektóre z praktyk, których nauczyliśmy się i opracowaliśmy, aby konsekwentnie indukować, zbierać i analizować cechy akustyczne i składnię piosenek myszy.

Wywoływanie i analizowanie piosenek z wokalizacji ultradźwiękowej (USV) samców myszy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący zastosowanie neurotrofiny 4 (NTF4) systemowo i bezpośrednio do przebudowy starzejących się mięśni krtani u szczurów.

Podskórny wlew neurotrofiny 4 za pomocą pomp osmotycznych lub bezpośredniego wstrzyknięcia mięśniowego poprawia starzenie się mięśni krtani szczura

Ten protokół opisuje metody używane do przygotowania fałdów głosowych szczurów do histochemicznego badania nerwowo-mięśniowego.

Przygotowanie fałdu głosowego szczura do analiz nerwowo-mięśniowych

Ten protokół ma na celu zbadanie podstawowych zmian elektrofizjologicznych związanych z uczeniem się u osób z głęboką głuchotą po krótkim okresie szkolenia w zakresie audio-dotykowej substytucji sensorycznej poprzez zastosowanie techniki potencjału związanego ze zdarzeniem.

Ocena treningu audio-dotykowej substytucji sensorycznej u uczestników z głęboką głuchotą z wykorzystaniem techniki potencjału związanego ze zdarzeniem

Ultradźwiękowe wołania szczurów i myszy laboratoryjnych (USV) są przydatne do badania funkcji głosowych i nerwowych. Ten protokół opisuje paradygmat nagrody pokarmowej, który niezawodnie wywołuje wołania USV dotyczące pożądania bez zamieszań związanych z rozmnażaniem. Zawiera szczegóły dotyczące kondycjonowania zwierząt, prezentacji bodźców, nagrywania i analizy akustycznej, dostarczając metodę odtwarzalną do badania funkcji afektywno-motywacyjnych i czopowych czuciowo-ruchowych.

Elicytacja pokarmu przedwidziała wzmożenie apetytowych ultradźwiękowych wokalizacji u szczurów laboratoryjnych i myszy

Lokomocja jest często badana jako wynik behawioralny w różnych modelach chorób w dziedzinach takich jak neuronauka i ortopedia. Niniejszy artykuł wideo ma na celu opisanie metody pomiaru sił reakcji podłoża oraz kinematyki u szczurów podczas swobodnej lokomocji.

Wyznaczanie kinematyki i siły reakcji podłoża: demonstracja ilościowej oceny zdolności lokomocyjnych szczurów młodych, dorosłych w średnim wieku oraz geriatrycznych

Poznaj metodę treningu wokalizacji ultradźwiękowych u szczurów z chorobą Parkinsona i w podeszłym wieku. Protokół łączy nagrywanie dźwięku, analizę akustyczną i wzmocnienie pozytywne w celu badania deficytów głosowych.

Celowany trening wokalizacji ultradźwiękowych u starszych szczurów oraz szczurów z chorobą Parkinsona

Przeglądaj więcej filmów