Ablacja laserowa pronefry ryby danio w celu badania regeneracji nabłonka nerkowego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykonanie ukierunkowanego znakowania komórek nerkowych w embrionalnej nerce rybki danio-ostrego, czyli pronefrosie, w celu zbadania regeneracji nabłonka nerkowego po ostrym uszkodzeniu nerek. Osiąga się to poprzez mikroiniekcję embrionów rybki danio-ostrego koniugatem dekstranu z fluoresceiną. Podczas inkubacji przez noc koniugaty są selektywnie wchłaniane przez komórki cewki bliższej nefronu.

Następnego dnia komórki są badane pod mikroskopem z epifluorescencją, a wybrane z nich są ablacyjne przy użyciu impulsowego systemu laserowego. Następnie zmiany morfologiczne i molekularne są oceniane za pomocą histologii, hybrydyzacji in situ C two w preparatach całych oraz immunohistochemii. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wywoływanie ostrego uszkodzenia nerek przy użyciu nefrotoksycznego antybiotyku gentamycyny, jest fakt, że tego typu terapie wywołują katastrofalne uszkodzenia i są śmiertelne, co uniemożliwia analizę procesów regeneracji nerek w czasie.

Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań nad nerkami, takie jak identyfikacja zdarzeń sygnałowych na poziomie molekularnym, które występują podczas regeneracji nabłonka. Pomysł na tę technikę pojawił się, gdy chcieliśmy opracować szczegółową analizę regeneracji nabłonka nerkowego w szalkach Petriego. Należy zebrać zapłodnione embriony zebrafish w zmodyfikowanym roztworze E3 bez błękitu metylenowego.

Hoduj zapłodnione embriony w temperaturze 28,5 °C do momentu, aż osiągną wiek od 48 do 55 godzin po zapłodnieniu, kiedy układ nerkowy embrionu zaczyna funkcjonować. Przed rozpoczęciem wstrzykiwań przygotuj drzewko do iniekcji aros, wykorzystując formę z trójkątnymi wgłębieniami do unieruchomienia embrionów. Następnie przygotuj standardowe igły do mikrowstrzyknięć oraz roztwór do znakowania cewek proksymalnych. Rozpocznij eksperyment od przygotowania embrionów.

W pierwszej kolejności, używając precyzyjnej pincety, usuń Corian z nieułożonych jaj. Następnie wypłucz pozostałości Corianu oraz zanieczyszczenia z szalki Petriego i napełnij ją ponownie 30 mililitrami zmodyfikowanego roztworu E3. Po drugie, znieczul larwy za pomocą pięciu mililitrów trica.

Upewnij się, że larwy są całkowicie znieczulone, sprawdzając reakcję na dotyk. Jeśli nie zostaną w pełni znieczulone, będą drgać podczas wstrzykiwania. W trzecim kroku, za pomocą plastikowej pipety transferowej, umieść larwy w formie.

Ustaw zwierzęta tak, aby ich głowy znajdowały się w najgłębszej części wgłębienia, a tułowia wzdłuż krawędzi otworu. Następnie wykonaj mikroiniekcje domięśniowe, nabierając do przygotowanej igły od 2 do 3 µL dekstranu fluoresceiny; ustaw igłę i wstrzyknij około 1 nL roztworu w okolice tułowia każdego zwierzęcia. Konjugaty dekstranu są łatwo endocytowane przez cewki proksymalne nefronów, co umożliwia preferencyjne znakowanie tej populacji komórek nabłonkowych.

Celuj w górną część somitu i unikaj przedłużenia pęcherzyka żółtkowego, w przeciwnym razie kanaliki nefronowe zostaną uszkodzone, tak jak w przypadku tego nieprawidłowo wstrzykniętego zwierzęcia. Po wstrzyknięciu larw przenieś je do czystej szalki Petriego i wypłucz trzykrotnie świeżym medium E3, aby usunąć wszelkie ślady tricyna. Następnie przykryj pokrywkę folią i inkubuj zwierzęta przez noc w temperaturze 28 °C.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować medium do immobilizacji, zachowując niektóre alikwoty do natychmiastowego użycia w temperaturze pokojowej, a pozostałe alikwoty przechowując w temperaturze czterech stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania. Należy rozpocząć od znieczulenia larw danio przebrany przy użyciu pięciu mililitrów trica w 30 mililitrach E3. Podobnie jak poprzednio, należy upewnić się, że ryby nie reagują na bodźce dotykowe.

Następnie należy zbadać wstrzyknięte zwierzęta w świetle fluorescencyjnym, aby wybrać larwy z łatwo widocznymi cewkami bliższymi. Przenieś do 12 larw do nowej szalki zawierającej to samo stężenie trica, korzystając z fluorescencyjnego mikroskopu złożonego wyposażonego w filtr fitzy, oświetlenie w polu jasnym oraz laser. Ablację rozpoczyna się od przeniesienia i znieczulenia larw do szalki zawierającej medium immobilizujące.

Odczekać dwie minuty, a następnie przenieść larwę na szkiełko z wgłębieniem zawierające kroplę medium immobilizującego. Za pomocą cienkiej sondy delikatnie ułożyć zwierzę grzbietem do góry i ustawić ostrość na stronę grzbietową. Następnie, używając skalibrowanego impulsowego systemu laserowego z mikropunktem, przeprowadzić ablację jednego z nefronów, pozostawiając drugi nienaruszony jako kontrolę.

Obserwować będzie można rozproszenie fluorescencji w miarę ablacji komórek nabłonka nerkowego. Następnie należy ostrożnie przenieść zwierzę do dołka płytki 12-dołkowej i trzykrotnie przemyć je w medium E3, aby usunąć metylocelulozę. Kontynuować ablację nefronów do momentu wypełnienia pierwszej płytki 12-dołkowej.

Następnie znieczul kolejne 12 zwierząt i powtórz proces. Wstrzyknięto Dextra Fitzy, aby preferencyjnie oznakować kanaliki proksymalne. Trzy dni po zapłodnieniu dokonano ablacji laserowej nefronów każdego zwierzęcia.

Jeden dzień po ablacji. Regeneracja nie jest widoczna cztery dni po ablacji, jednakże regeneracja nastąpiła po ablacji komórek in situ dwa. Do analizy zmian w utrwalonych próbkach w pojedynczych punktach czasowych zastosowano hybrydyzację.

Ten embrion nie został poddany ablacji. W przeciwieństwie do niego, w tym embrionie dokonano ablacji dużego odcinka nabłonka cewkowego, a w tym embrionie ablacji krótkiego odcinka nabłonka cewkowego. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak hybrydyzacja in situ w preparacie całego organizmu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące zmian w ekspresji genów w przebiegu regeneracji nefronów.

Należy pamiętać, że praca z odczynnikami chemicznymi może być niezwykle niebezpieczna. Podczas tej procedury zaleca się stosowanie środków ostrożności, takich jak używanie osobistego sprzętu ochronnego, w tym fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.