Laserowa ablacja przednercza danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji nabłonka nerek

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie ukierunkowanej eksploracji komórek nerkowych w nerce embrionalnej danio pręgowanego, pro nephros, w celu zbadania regeneracji nabłonka nerek po ostrym uszkodzeniu nerek. Osiąga się to poprzez pierwsze mikrowstrzyknięcie zarodków danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego koniugatu dekstranu. Podczas nocnej inkubacji koniugaty są selektywnie wchłaniane przez nefrony proksymalne komórki jajowodów.

Następnego dnia komórki są badane pod wpływem epifluorescencji, a wybrane komórki są poddawane ablacji za pomocą pulsacyjnego systemu laserowego. Później zmiany morfologiczne i molekularne są oceniane za pomocą histologii, hybrydyzacji całego C 2 i chemii immunohistochemicznej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ostre uszkodzenie nerek przy użyciu nefrotoksycznego antybiotyku gentamycyny, jest to, że takie leczenie powoduje katastrofalne uszkodzenia i jest śmiertelne, co uniemożliwia analizę zdarzeń związanych z regeneracją nerek w czasie.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nerek, takie jak identyfikacja zdarzeń sygnalizacji molekularnej, które zachodzą podczas regeneracji nabłonka. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej techniki, gdy chcieliśmy opracować szczegółową analizę regeneracji nabłonka nerek na szalkach Petriego. Zebrać zapłodnione zarodki danio pręgowanego w zmodyfikowanym roztworze E 3 bez błękitu metylenowego.

Podnieś zapłodnione zarodki w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza, aż osiągną temperaturę od 48 do 55 godzin Po zapłodnieniu, gdy układ nerkowy zarodka zaczął funkcjonować przed rozpoczęciem wstrzyknięć, przygotuj drzewo iniekcyjne aros za pomocą formy z trójkątnymi wgłębieniami do trzymania zarodków. Następnie należy przygotować standardowe igły do mikroiniekcji i roztwór do wstrzykiwań, aby oznaczyć kanalik proksymalny. Rozpocznij eksperyment od przygotowania zarodków.

Najpierw usuń Corian z niewyklutych jaj za pomocą cienkich kleszczy. Następnie spłucz resztki Corianu, resztki z szalki Petriego i ponownie napełnij naczynie 30 mililitrami zmodyfikowanego roztworu E trzy. Po drugie, znieczul larwy pięcioma mililitrami trica.

Upewnij się, że larwy są całkowicie znieczulone, sprawdzając reakcję na dotyk. Jeśli nie są w pełni znieczulone, będą drgać podczas wstrzyknięcia. Po trzecie, za pomocą plastikowej pipety transferowej umieść larwy w formie.

Umieść zwierzęta z głowami w najgłębszej części zagłębienia, a ich trąbami wzdłuż boku studni. Teraz przystąp do mikrozastrzyków domięśniowych, ładując przygotowaną igłę dwoma do trzech mikrolitrów dekstranu, fluoryzuj w miejscu igły i wstrzyknij około jednego nanolitra roztworu do pnia, tak roztocza każdego zwierzęcia. Koniugaty dekstranu są łatwo endocytozowane przez kanaliki proksymalne nefronu, co umożliwia preferencyjne znakowanie tej populacji komórek nabłonkowych.

Celuj w górną część roztocza i unikaj przedłużenia woreczka żółtkowego, w przeciwnym razie kanaliki nefronowe zostaną przerwane, tak jak w przypadku tego niewłaściwie wstrzykniętego zwierzęcia. Po wstrzyknięciu larw przenieś je na czystą szalkę Petriego i przepłucz je trzykrotnie świeżą pożywką E trzy, aby usunąć wszelkie ślady trica. Teraz przykryj pokrywkę folią i inkubuj zwierzęta przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować pożywkę mobilizacyjną Im i przechowywać niektóre jej porcje do natychmiastowego użycia w temperaturze pokojowej, a pozostałe podwielokrotności przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania. Zacznij od znieczulenia larw danio pręgowanego pięcioma mililitrami trica w 30 mililitrach E trzy. Tak jak poprzednio, upewnij się, że ryby nie reagują na wrażenia dotykowe.

Teraz zbadaj wstrzyknięte zwierzęta pod wpływem fluorescencji, aby wybrać larwy z łatwymi do wizualizacji kanalikami proksymalnymi. Przenieś do 12 larw do nowej płytki zawierającej takie samo stężenie triki w złożonym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w filtr fitzy, oświetlenie jasnego pola i laser perform. Ablacja rozpoczyna się od przeniesienia i znieczulenia lawy do naczynia zawierającego pożywkę unieruchamiającą.

I odczekaj dwie minuty, a następnie przenieś lawę do szklanego szkiełka wklęsłego zawierającego kroplę pożywki unieruchamiającej. Delikatnie ustaw zwierzę grzbietową stroną do góry za pomocą cienkiej sondy i skup się na stronie grzbietowej. Teraz, za pomocą skalibrowanego pulsacyjnego systemu mikropunktowego lasera, abl jeden z nefronów, pozostawiając drugi nienaruszony jako kontrolę.

Zobaczysz rozproszenie fluorescencji, gdy komórki nabłonka nerkowego są ablowane. Następnie delikatnie przenieś zwierzę do studzienki naczynia z 12 światami i opłucz je trzy razy w pożywce E trzy, aby zmyć metylocelulozę. Kontynuuj ablację nefronów, aż pierwsze 12 naczyń świata zostanie napełniona.

Następnie znieczul kolejne 12 zwierząt i powtórz proces. Dextra Fitzy został wstrzyknięty w celu preferencyjnego oznakowania kanalika proksymalnego. Trzy dni po zapłodnieniu nefron każdego zwierzęcia został poddany ablacji laserowej.

Jeden dzień po ablacji. Regeneracja nie jest widoczna po czterech dniach od ablacji, jednak regeneracja nastąpiła po ablacji komórek in situ dwa. Hybrydyzację wykorzystano do analizy zmian w utrwalonych próbkach w pojedynczych punktach czasowych.

Zarodek ten nie został poddany ablacji. W przeciwieństwie do tego, ten zarodek miał usunięty duży odcinek nabłonka rurkowego, a ten zarodek miał krótki odstęp nabłonka kanalikowatego usunięty. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak hybrydyzacja hol mount situ, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak tożsamość zmian ekspresji genów w trakcie regeneracji nefronów.

Nie zapominaj, że praca z chemikaliami może być bardzo niebezpieczna. Podczas tej procedury zalecane są środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej, takich jak fartuch laboratoryjny i rękawice.