Name: Laserowa ablacja przednercza danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji nabłonka nerek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj technikę laserowej ablacji nabłonka nerkowego u Danio rerio w celu badania regeneracji po ostrym uszkodzeniu nerki. Ta metoda umożliwia analizę zmian molekularnych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Wingerta za pomocne dyskusje na temat biologii AKI oraz technik pracy z danio pręgowanym, a C. Diep za udostępnienie receptury na metylocelulozę. Autorzy pragną również wyrazić wdzięczność pracownikom Notre Dame Center for Zebrafish Research za zapewnienie doskonałej, stałej opieki hodowlanej nad naszą kolonią danio pręgowanego. Praca ta była finansowana z grantu NIH-NIDDK o numerze DK083512 oraz dzięki hojnemu wsparciu finansowemu na rozpoczęcie działalności laboratoryjnej z Uniwersytetu Notre Dame.

1. Procedura mikroiniekcji w celu znakowania nabłonka kanalika proksymalnegopronefrosu rybki danio prążkowanej
W tej procedurze wykorzystujemy system do mikroiniekcji (Harvard Appartus, PLI90), z powietrzem pod ciśnieniem dostarczanym przez kompresor (Jun-Air, Model 6-4), oraz zestaw mikromanipulatorów (części Narishege MN151, IP3 i GJI), które zostały zamontowane na stanowisku ze stereomikroskopem (Nikon, SMZ-Zoom 645) zgodnie z instrukcjami producenta. Konjugaty dekstranu są łatwo endocytowane przez cewkę bliższą nefronu, co umożliwia preferencyjne znakowanie tej populacji komórek nabłonkowych9.
<ol>
 <li>Ekspozycja na błękit metylenowy może nasilać autofluorescencję woreczka żółtkowego i utrudniać wizualizację kanalików nefronowych.</li>
 <li>Hoduj zapłodnione embriony w temperaturze 28,5°C do etapu rozwojowego między 48 a 5 godzinami po zapłodnieniu (hpf). Jest to idealny moment na wykonanie mikroiniekcji larw ze względu na łatwość przeprowadzenia mikroiniekcji domięśniowej oraz fakt, że w tym czasie rozpoczyna się funkcja nerek.</li> 
 <li>Usuń chorion z wszystkich nieodwylęgłych rybek danio przy użyciu precyzyjnej pęsety. Wypłucz szczątki chorionu z czarek Petriego i ponownie napełnij naczynie 30 mL zmodyfikowanego roztworu E3.</li>
 <li>Przygotuj tackę do iniekcji embrionów. Naszą preferowaną formą do iniekcji jest 1,5% agaroza/E3, w której wykonano trójkątne wgłębienia, umożliwiające umieszczenie embrionu w celu wykonania iniekcji. Aby przygotować formę, umieszczamy plastikowy szablon z klinowatymi wypustkami (opisany szczegółowo wcześniej1) na powierzchni 1,5% agarozy w czarce Petriego.</li>
 <li>Przygotuj szklane igły do mikroiniekcji, wyciągając rurki kapilarne za pomocą wyciągacza igieł, zgodnie z opisem w Zebrafish Book10. W skrócie: wyciągnij szklane rurki kapilarne, a następnie użyj precyzyjnej pęsety metalowej, aby odciąć końcówkę igły do mikroiniekcji w celu uzyskania ostrego wierzchołka, obserwując końcówkę pod stereomikroskopem. Przechowuj przycięte igły w przykrytej czarce Petriego, umieszczając je w plastelinie, aby chronić krawędź cięcia i zapobiec gromadzeniu się kurzu.</li>
 <li>Przygotuj roztwór do iniekcji w celu znakowania kanalika proksymalnego. Rozpuść koniugat dekstranu z fluoresceiną 40 kD (Invitrogen, D1845) w wodzie destylowanej do stężenia 1 mg/mL.</li> 
 <li>Aby znieczulić ryby, dodaj 5 mL 0,2% Tricaine pH 7,0 do czarki Petriego zawierającej larwy danio w 30 mL roztworu E3. Ryby są znieczulone, gdy przestają wykazywać reakcję na dotyk. Jest niezwykle ważne, aby ryby były całkowicie znieczulone, w przeciwnym razie będą drgać podczas próby iniekcji.</li>
 <li>Przenieś znieczulone ryby do tacki z formą do iniekcji za pomocą plastikowej pipety transferowej. Ustaw zwierzę głową w najgłębszej części trójkątnego wgłębienia, na boku, tak aby tułów spoczywał wzdłuż skośnej ścianki otworu.</li> 
 <li>Wykonaj mikroiniekcję domięśniową. Napełnij przyciętą igłę 2-3 μL dekstranu z fluoresceiną i wstrzyknij zwierzęciu w somity tułowia około 1 nL roztworu. Celuj w górną część somitu, unikając rozszerzenia woreczka żółtkowego. Zapewnia to, że kanaliki nefronowe nie zostaną mechanicznie uszkodzone w procesie mikroiniekcji.</li>
 <li>Przenieś iniekowane rybki danio do czystej czarki Petriego i dodaj zmodyfikowany roztwór E3. Wypłucz zwierzęta 3 razy świeżym roztworem E3, aby usunąć wszelkie ślady Tricaine. Przykryj pokrywkę czarki Petriego folią aluminiową w celu ochrony dekstranu przed światłem i zwróć zwierzęta do inkubatora w temperaturze 28°C na noc.</li>
</ol>
2. Celowana ablacja laserowa komórek kanalików proksymalnych
W tej procedurze wykorzystujemy stereomikroskop z epifluorescencją do oceny zwierząt z jasno oznakowanymi dekstranem fluoresceinowym cewkami proksymalnymi i ich wyboru do ablacji laserowej. Następnie, w celu przeprowadzenia ablacji komórek nefronu, stosujemy impulsowy system laserowy micropoint (Photonic Instruments, Inc) podłączony do mikroskopu złożonego (Nikon Eclipse 80i z przystawką epifluorescencyjną), skalibrowany zgodnie z instrukcjami producenta. Największą skuteczność w ablacji komórek osiągnięto przy użyciu filtra FITC, który umożliwia badaczowi obserwację fluorescencyjnych obszarów cewek przy oświetleniu w polu jasnym.
Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować medium do unieruchomienia do ablacji, rozpuszczając 1,5% metylocelulozy w 0,02% tricaine/E3. Alikwoty metylocelulozy przeznaczone do natychmiastowego użycia należy przechowywać w temperaturze pokojowej, a do dłuższego przechowywania w temperaturze 4°C.
<ol>
 <li>Zanurzyć 72-godzinne zarodki zebrafish w znieczuleniu, dodając 5 ml 0,2% Tricaine o pH 7,0 do szalki Petriego zawierającej larwy w 30 ml medium E3. Ryby uznaje się za znieczulone, gdy przestaną wykazywać reakcję na dotyk. Jest kluczowe, aby ryby były całkowicie znieczulone, w przeciwnym razie mogą gwałtownie drgnąć podczas próby wykonania ablacji laserowej.</li>
 <li>Zbadaj wstrzyknięte zwierzęta przy odpowiednich ustawieniach fluorescencji i wybierz osobniki, w których cewki bliższe są łatwo widoczne.</li>
 <li>Przenieś wybrane embriony do oddzielnego naczynia zawierającego tricain. Zwierzęta mogą pozostawać pod narkozą do 30 minut przed przeprowadzeniem ablacji komórek. Jeśli ocenisz &gt;15 zwierząt; należy przenieść je do oddzielnego naczynia zawierającego świeże zmodyfikowane podłoże E3 i pozostawić do czasu przeprowadzenia ablacji, ponieważ ablacja każdej komórki trwa kilka minut.</li>
 <li>Aby przeprowadzić ablację, przenieś jedną zestresowaną rybkę danio pręgowaną do małej szalki Petriego zawierającej 1,5% metylocelulozy/0,02% trikainy na 2 minuty, w celu przemycia zarodka w medium immobilizacyjnym.</li> 
 <li>Następnie przenieś embrion na szkiełko z zagłębieniem zawierające kroplę 1,5% metylocelulozy i 0,02% trikainy. Delikatnie ustaw zwierzę za pomocą cienkiej sondy tak, aby strona brzuszna przylegała do szkiełka, a strona grzbietowa była skierowana do góry.</li> 
 <li>Umieść preparat na stoliku mikroskopu złożonego i ustaw ostrość na stronie grzbietowej zwierzęcia. Przeprowadź ablację komórek nefronu znajdujących się w polu widzenia, naciskając pedał sterujący. W miarę ablacji komórek nabłonka nerek zaobserwujesz rozproszenie fluorescencji (Rysunek 1A).</li> 
 <li>Ostrożnie przenieś zwierzę po ablacji do dołka w płytce 12-dołkowej w celu dalszej hodowli. Przepłucz w medium E3 2–3 razy, aby usunąć metylocelulozę.</li>
 <li>Po wstrzyknięciu hodować zwierzę do pożądanego punktu czasowego i przeprowadzić odpowiednią analizę zgodnie z uznanymi technikami histologicznymi i molekularnymi dla młodych embrionów zebrafish (Rysunek 2).</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki: 
Dane przedstawione na Rysunku 1 wskazują przebieg czasowy ablacji. Po wstrzyknięciu domięśniowym koniugatów dekstranu dochodzi do preferencyjnego znakowania kanalików proksymalnych. W celu oznakowania nerki do ablacji laserowej zastosowano wstrzyknięcie dekstranu-FITC, a zwierzęta poddanym ablacji poddano ponownemu wstrzyknięciu dekstranu-rodaminy w jednym dodatkowym punkcie czasowym po ablacji, aby ponownie zobrazować populację kanalików proksymalnych. Techniki analizy ekspresji, takie jak hybrydyzacja in situ, mogą być wykorzystywane do analizy zmian w utrwalonych próbkach w pojedynczych punktach czasowych po ablacji komórek, co przedstawiono na Rysunku 2.
<img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig1.jpg" alt="Wyniki ablacji laserowej; schemat z mikroskopią fluorescencyjną pokazujący regenerację w ciągu 7 dni." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Po procedurze ablacji laserowej następuje szybka regeneracja nabłonka kanalików. (A-C) Przebieg czasowy zmian komórkowych podczas i po ablacji laserowej cewek bliższych larw danio pręgowanego w momencie ablacji (dzień 3, panel A) lub jeden lub trzy dni po ablacji (dzień 4, panel B; dzień 7, panel C). (Góra) schematy przedstawiają pozycję nefronu z dekstranem-FITC (zielony) i dekstranem-rodaminą (czerwony), a (dół) obrazy żywych nefronów kontrolnych oraz poddanych ablacji laserowej (LA). 
<img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig2.jpg" alt="Badanie ablacji embrionalnej nerki; kanalik kręty bliższy, ablacja rozległa/ogniskowa na obrazach mikroskopowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Analiza ekspresji genów po ablacji laserowej. Po ablacji laserowej w 3. dniu embriony utrwalono i poddano obróbce metodą całego preparatu (whole mount). in situ hybrydyzacja w celu wykrycia transkryptów dla slc20a1a, które wyznaczają odcinek proksymalnego kanalikja krętego nefronu. (A) Embrion kontrolny, który nie został poddany ablacji laserowej, (B) embrion, w którym dokonano ablacji dużego fragmentu nabłonka kanalikowego oraz (C) embrion, w którym dokonano ablacji krótkiego odcinka nabłonka kanalikowego. Czarna linia wskazuje zasięg kanalikja proksymalnego w panelu A w celu zapewnienia punktu odniesienia, niebieskie linie wskazują zakres ablacji laserowej w panelach B-C, a * oznacza kontrolny (niepoddany ablacji) nefron przeciwległy w panelach B-C.

<ol><li>Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure.</a> New Eng. J. Med. 334, 1448-1460 (1996).</li>
<li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiation+and+proliferation+of+surviving+epithelial+cells+in+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure.</a> J Am. Soc. Nephrol. 14, 55-61 (2003).</li>
<li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of kidney development.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 509-529 (2006).</li>
<li>Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li>
<li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+pronephros%3A+a+model+to+study+nephron+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney Int. 73, 1120-117 (2008).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervos, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure+in+zebrafish%3A+a+novel+system+to+study+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, 923-9229 (2005).</li>
<li>Cosentino, C. ianciolo, Roman, C., Drummond, B. L., A, I., Hukriede, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+Microinjections+of+Zebrafish+Larvae+to+Study+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury.</a> J Vis Exp. (42), e2079-e2079 (2010).</li>
<li>Drummond, I. A., Majumdar, A., Hentschel, H., Elger, M., Solnica-Krezel, L., Schier, A. F., Neuhauss, S. C. F., Stemple, D. L., Zwartkruis, F., Rangini, Z., Driever, W., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+the+zebrafish+pronephros+and+analysis+of+mutations+affecting+pronephric+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function.</a> Development. 125, 4655-4657 (1998).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 3rd ed, University of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394-e1394 (2009).</li>
<li>Humphreys, B. D., Valerius, M. T., Kobayashi, A., Mugford, J. W., Soeng, S., Duffield, J., McMahon, A. P., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+epithelial+cells+repair+the+kidney+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury.</a> Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).</li>
<li>Bussolati, B., Hauser, P. V., Carvalhosa, R., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+stem+cells+to+kidney+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Stem+Cell+Res.+Therapy%22%5BJournal%5D)">Contribution of stem cells to kidney repair.</a> Curr. Stem Cell Res. Therapy. 4, 2-8 (2009).</li>
<li>Devarajan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+mechanisms+of+ischemic+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Update on mechanisms of ischemic acute kidney injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 17, 1503-1520 (2006).</li>
<li>Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+mechanism+of+aminoglycoside+nephrotoxicity%3A+an+integrative+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Kid.+Int%22%5BJournal%5D)">New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view.</a> Kid. Int. , (2010).</li>
<li>Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Danio pręgowany jest powszechnie wykorzystywanym organizmem modelowym w wielu dziedzinach nauki, a zakres jego zastosowań stale rośnie6. Wykorzystanie systemu modelowego danio pręgowanego w badaniach nad chorobami nerek, takimi jak AKI, doprowadziło do istotnych obserwacji i system ten nadal będzie stanowił dobry model do badania uszkodzeń nerek7,8. Dzięki zsekwencjonowanemu genomowi oraz opracowaniu wielu protokołów molekularnych, przeprowadzanie zaawansowanych badań na danio pręgowanym z wykorzystaniem modeli transgenicznych, studiów nad wyciszaniem genów oraz nadekspresją stało się coraz łatwiejsze. Danio pręgowany charakteryzuje się krótkim cyklem życiowym, licznymi pokoleniami oraz dobrze zdefiniowanymi etapami rozwoju. Co więcej, stadia embrionalne i larwalne danio pręgowanego są w znacznym stopniu przezroczyste, co umożliwia prowadzenie badań obrazowych bez konieczności sekcji organizmu. W etapach embrionalnych i larwalnych danio pręgowany posiada nerkę pronefryczną składającą się z dwóch nefronów, które pozostają widoczne w tych punktach czasowych rozwoju. Nefrony pronefryczne danio pręgowanego są analogiczne pod względem struktury i funkcji do ich ssaczych odpowiedników, co czyni go dobrym modelem do badań nad ostrą niewydolnością nerek4,5.
Nerka ma kluczowe znaczenie dla przetrwania ludzi i innych kręgowców, pełniąc funkcję organu oczyszczającego organizm z ciekłych produktów przemiany materii. Ta funkcja oczyszczająca opiera się na zdolności nefronów nerkowych do filtrowania krwi, a następnie modyfikowania filtratu w celu zgromadzenia produktów przemiany azotowej do wydalenia przy jednoczesnym utrzymaniu równowagi płynowej i elektrolitowej. Nefrony składają się z filtra krwi, kanalików nabłonkowych i odprowadzają mocz do przewodu zbiorczego. Integralność strukturalna i funkcjonalna wszystkich trzech części jest niezbędna dla funkcjonowania nefronu. Różne uszkodzenia nerki, w tym ekspozycja na nefrotoksyny, niedokrwienie lub niedrożność dróg odprowadzających mocz, mogą prowadzić do AKI1. Patologia AKI jest często powiązana z ostrą martwicą kanalików1,2. Badania kliniczne wykazały, że następująca po niej niewydolność nerek wiąże się ze śmiertelnością, która może wynosić od 7 do 80% w zależności od przyczyny i kontekstu niewydolności nerek. Jednak szybka diagnoza i odwrócenie podstawowej przyczyny AKI są coraz częściej związane z powrotem do zdrowia poprzez regenerację martwiczych kanalików nefronowych. Niedawne badania mapowania losów komórek wykazały, że główną populacją komórkową, która repopuluje uszkodzone kanaliki nefronowe, są komórki nabłonkowe pochodzące z sąsiednich, nieuszkodzonych obszarów12. Wyniki te nie wykluczają możliwości, że w procesie tym mogą uczestniczyć nerkowe komórki macierzyste/progenitorowe, a niezależne doniesienia sugerują, że komórki pochodzące z szpiku kostnego mogą przyczyniać się do regeneracji nerek13. Jest oczywiste, że niezbędne są dalsze badania w celu lepszego określenia komórkowych źródeł regeneracji nabłonka nerkowego.
Zarówno regeneracja, jak i rozwój nefronów opierają się na zjawisku przełączania stanu komórkowego pomiędzy fenotypem mezenchymalnym a nabłonkowym. Podczas rozwoju nefronów mezenchymalne komórki progenitorowe różnicują się w fenotyp stacjonarny, przylegając do błony podstawnej w celu utworzenia nabłonka kanalikowego3. Przypuszczalne zjawisko migracji komórek nabłonkowych po ostrej niewydolności nerek wymaga dedyferencjacji do fenotypu mezenchymalnego. Co ciekawe, niedawne badania sugerują, że komórki mezenchymalne w uszkodzonych nerkach wykazują profil ekspresji podobny do komórek mezenchymalnych podczas rozwoju14. W różnych doniesieniach wykryto zmiany w cząsteczkach adhezyjnych komórek, białkach macierzy, cytokinach i chemokinach. Po proponowanym przejściu mezenchymalno-nabłonkowym komórki ponownie gromadzą się na błonie podstawnej i wznawiają aktywność nabłonka kanalikowego. Określanie genów istotnych w tym procesie pozostaje tematem badań w naszym laboratorium oraz innych ośrodkach. Wiele prac mających na celu wyjaśnienie kluczowych czynników w tym procesie wciąż pozostaje do wykonania, jednak znaczący postęp w tej dziedzinie zapoczątkowały badania nad skutkami działania gentamycyny.
Ostre uszkodzenie nerek (AKI) oraz niewydolność nerek wywołana przez gentamycynę są istotne w kontekście powszechności stosowania związków nefrotoksycznych w medycynie15. Stosowane w leczeniu zakażeń bakteriami gram-ujemnymi aminoglikozydy prowadzą do ostrego uszkodzenia w 10-25% przypadków. Lek ten wywołuje szereg negatywnych efektów komórkowych, które wspólnie prowadzą do apoptozy lub nekrozy w wielu komórkach cewkowych. Badania wykazały, że lek wiąże się preferencyjnie z kompleksem utworzonym przez megalinę i kubulinę, który bierze udział w endocytozie. Cząsteczki te występują w obfitości w komórkach nabłonkowych kanalików proksymalnych, choć ich ekspresja nie ogranicza się tylko do tych komórek. Poprzez sygnalizację komórkową prowadzącą do indukcji stresu oksydacyjnego, uwalniania czynników obkurczających naczynia, wyczerpania komórkowego ATP, hipoksji oraz inhibicji fosfolipaz, gentamycyna i podobne antybiotyki wywołują apoptozę i nekrozę w komórkach nabłonkowych. Ponadto antybiotyki wyzwalają skurcz kłębuszka w filtrze naczyniowym nefronu (kłębuszku nerkowym), co skutkuje spadkiem współczynnika filtracji kłębuszkowej i negatywnie wpływa na zdolność nerek do filtrowania krwi. Produkcja reaktywnych form tlenu, cząsteczek immunostymulujących oraz aktywacja fosfolipaz wywołują rozproszone efekty w nefronie, tworząc katastrofalną patologię prowadzącą do ostrej niewydolności nerek.
Choć badania z wykorzystaniem gentamycyny i podobnych antybiotyków były i nadal będą ważnymi narzędziami w badaniach nad regeneracją nerek, brakuje im precyzji, która mogłaby być przydatna przy rozwiązywaniu określonych problemów. Nasz system wykorzystujący rybkę danio w połączeniu z metodą ablacji laserowej opisaną w niniejszym protokole odpowiada na potrzebę posiadania tak precyzyjnego narzędzia badawczego. Ablacja laserowa pozwala badaczom na indukowanie destrukcji komórek w ogniskowych obszarach kanalika nerkowego, obejmując populacje od małych (2-3) do dużych (&gt;50-100), z niezrównaną precyzją. W tym protokole wykorzystujemy wcześniej opracowaną metodę ekspozycji na konjugaty dekstranu w celu preferencyjnego znakowania populacji nabłonkowych kanalików proksymalnych. Alternatywnie można zastosować transgeniczne linie rybek danio wykazujące ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego w jednym lub więcej obszarach kanalika. Na przykład transgeniczne rybki danio cadherin17:eGFP wykazują silną fluorescencję w obszarach kanalików dystalnych (choć słabą w populacjach proksymalnych) i mogą być wartościowe w badaniach nad regeneracją w innych segmentach kanalików16. Widoczność nefronu umożliwi rejestrację wideo w odstępach czasowych (time-lapse) zmian komórkowych w czasie. W połączeniu z badaniami ekspresji genów, takimi jak hybrydyzacja in situ w obrębie całego preparatu lub immunohistochemia, badacze mogą wykrywać zmiany molekularne w nefronie w czasie. Wspólnie strategie te mogą pozwolić na sformułowanie bardziej dynamicznego rozumienia zdarzeń, które zachodzą podczas niszczenia komórek nabłonkowych nerek.
Głównym zastrzeżeniem dotyczącym naszego modelu ablacji laserowej jest fakt, że może on odtwarzać jedynie częściowe aspekty warunków fizjologicznych występujących podczas ludzkiego AKI. Śmierć komórkowa wywołana natychmiastowym uszkodzeniem fizycznym różni się od kaskady zdarzeń prowadzących do nekrozy komórek, w związku z czym czynniki humoralne w tych różnych mikrośrodowiskach mogą nie być identyczne. Ponadto istnieją dowody na występowanie apoptozy indukowanej podczas uszkodzenia nerek i nie wiadomo, czy takie następstwa występują po uszkodzeniu laserem. Jednak tak jak hodowla komórkowa jest narzędziem, które lepiej pozwala odpowiedzieć na pytania wymagające ściśle kontrolowanego środowiska, tak ablacja laserowa będzie służyć jako ściśle kontrolowany model in vivo AKI. W związku z tym wnioski płynące z badań nad ablacją nabłonka nerkowego u rybek danio-ostrobramkowych prawdopodobnie przyczynią się do odkrycia fundamentalnych mechanizmów, które można zastosować w badaniach nad innymi uszkodzeniami nerek i potencjalnie wykorzystać do stworzenia lepszej diagnostyki u ludzi.

<table><tbody><tr><td>Szalki do embrionów</td><td>Falcon BD</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>Pincety do sekcji</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>Igły do mikroiniekcji</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza ultrazczysta</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran-fluoresceina 40 kilodalton (kD)</td><td>Invitrogen</td><td>D1845</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta transferowa</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>204, 13-711-23</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0262</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta z wgłębieniem</td><td>Fisher Scientific</td><td>S175201</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 12-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr></tbody></table>

ablacja laserowa pronefry ryby danio w celu badania regeneracji nabłonka nerkowego

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Ostre uszkodzenie nerek (AKI) charakteryzuje się wysokim współczynnikiem śmiertelności wynikającym z pogorszenia funkcji nerek w ciągu kilku godzin lub dni, co prowadzi do niewydolności nerek1. AKI może być spowodowane szeregiem czynników, w tym niedokrwieniem, toksycznością lekową lub uszkodzeniem zatorowym1. Skutkuje to niezdolnością do utrzymania homeostazy płynów i elektrolitów. Mimo że AKI jest obserwowane od dziesięcioleci, skuteczne terapie kliniczne nie zostały jeszcze opracowane. Co interesujące, niektórzy pacjenci z AKI odzyskują funkcje nerek z czasem; jest to tajemnicze zjawisko, które zostało jedynie wstępnie scharakteryzowane1,2. Badania z wykorzystaniem modeli ssaków w AKI wykazały, że w nerkach uszkodzonych niedokrwiennie lub przez nefrotoksyny dochodzi do śmierci komórek nabłonkowych w kanalikach nefronów1,2, czyli jednostkach funkcjonalnych nerki, które składają się z serii wyspecjalizowanych obszarów (segmentów) typów komórek nabłonkowych3. W obrębie nefronów śmierć komórek nabłonkowych jest najwyższa w komórkach kanalików proksymalnych. Istnieją dowody sugerujące, że destrukcji komórek towarzyszy dedyferencjacja, proliferacja i migracja otaczających komórek nabłonkowych, co może prowadzić do całkowitej regeneracji nefronu1,2. Pozostaje jednak wiele nieodpowiednich pytań dotyczących mechanizmów regeneracji nabłonka nerek, począwszy od sygnałów modulujących te zdarzenia, aż po przyczyny szerokiej zmienności zdolności regeneracyjnych uszkodzonych nerek u ludzi.
Larwy zebrafish stanowią doskonały model do badania regeneracji nabłonka nerek, ponieważ ich nerka pronefryczna składa się z nefronów zachowanych u wyższych kręgowców, w tym u ssaków4,5. Nefrony larw zebrafish można wizualizować za pomocą technik fluorescencyjnych dzięki względnej przezroczystości młodych osobników6. Stwarza to wyjątkową możliwość obrazowania zmian komórkowych i molekularnych w czasie rzeczywistym, w przeciwieństwie do modeli ssaków, w których nefrony są niedostępne, ponieważ nerki stanowią strukturalnie złożone układy wewnętrzne zwierzęcia. W niedawnych badaniach w celu analizy AKI (ostrego uszkodzenia nerek) i następującej po nim niewydolności nerek wykorzystano aminoglikozyd gentamicynę: wykazano, że gentamicyna i inne antybiotyki wywołują AKI u ludzi, a badacze opracowali metody wykorzystania tego środka do indukowania uszkodzeń nerek u zebrafish7,8. Jednak skutki toksyczności aminoglikozydów u larw zebrafish są katastrofalne i śmiertelne, co stanowi trudność przy badaniu regeneracji i funkcji nabłonka w czasie. Nasza metoda przedstawia zastosowanie celowanej ablacji komórek jako nowego narzędzia do badania uszkodzeń nabłonka u zebrafish. Ablacja laserowa daje badaczom możliwość indukowania śmierci w ograniczonej populacji komórek. W zależności od lokalizacji morfologicznej, funkcji lub nawet ekspresji konkretnego fenotypu komórkowego można celować w różne obszary komórek. W związku z tym ablacja laserowa zwiększy specyficzność obszarów, które badacze mogą analizować, i może stanowić potężne nowe podejście do wyjaśnienia mechanizmów regeneracji nabłonka nerek. Protokół ten można szeroko zastosować do celowania w populacje komórek w innych narządach zarodka zebrafish, aby badać uszkodzenia i regenerację w wielu interesujących kontekstach.

Ostre uszkodzenie nerek (AKI) u ludzi jest częstym problemem klinicznym spowodowanym uszkodzeniem komórek nabłonkowych tworzących nefrony nerkowe, a AKI wiąże się z wysoką śmiertelnością na poziomie 50-70%1. Po zniszczeniu komórek nabłonkowych nefrony mają ograniczoną zdolność do regeneracji, choć mechanizmy i ograniczenia sterujące tym zjawiskiem pozostają słabo poznane. W niniejszym artykule wideo opisujemy naszą technikę celowanej ablacji laserowej komórek nefronu nerki w nerce zarodka ryby danio-ostrobramkowego, czyli w pronefrosie. Nasza nowa metoda może być stosowana jako uzupełnienie modeli AKI indukowanych nefrotoksycznością, aby uzyskać wysokorozdzielcze zrozumienie zmian komórkowych i molekularnych związanych z regeneracją nabłonka w nefronie nerkowym.

Ablacja laserowa pronefry ryby danio w celu badania regeneracji nabłonka nerkowego

Ostre uszkodzenie nerek (AKI) charakteryzuje się wysoką śmiertelnością wynikającą z pogorszenia funkcji nerek w ciągu kilku godzin lub dni, co kulminuje w...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykonanie ukierunkowanego znakowania komórek nerkowych w embrionalnej nerce rybki danio-ostrego, czyli pronefrosie, w celu zbadania regeneracji nabłonka nerkowego po ostrym uszkodzeniu nerek. Osiąga się to poprzez mikroiniekcję embrionów rybki danio-ostrego koniugatem dekstranu z fluoresceiną. Podczas inkubacji przez noc koniugaty są selektywnie wchłaniane przez komórki cewki bliższej nefronu.Następnego dnia komórki są badane pod mikroskopem z epifluorescencją, a wybrane z nich są ablacyjne przy użyciu impulsowego systemu laserowego. Następnie zmiany morfologiczne i molekularne są oceniane za pomocą histologii, hybrydyzacji in situ C two w preparatach całych oraz immunohistochemii. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wywoływanie ostrego uszkodzenia nerek przy użyciu nefrotoksycznego antybiotyku gentamycyny, jest fakt, że tego typu terapie wywołują katastrofalne uszkodzenia i są śmiertelne, co uniemożliwia analizę procesów regeneracji nerek w czasie.Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań nad nerkami, takie jak identyfikacja zdarzeń sygnałowych na poziomie molekularnym, które występują podczas regeneracji nabłonka. Pomysł na tę technikę pojawił się, gdy chcieliśmy opracować szczegółową analizę regeneracji nabłonka nerkowego w szalkach Petriego. Należy zebrać zapłodnione embriony zebrafish w zmodyfikowanym roztworze E3 bez błękitu metylenowego.Hoduj zapłodnione embriony w temperaturze 28,5 °C do momentu, aż osiągną wiek od 48 do 55 godzin po zapłodnieniu, kiedy układ nerkowy embrionu zaczyna funkcjonować. Przed rozpoczęciem wstrzykiwań przygotuj drzewko do iniekcji aros, wykorzystując formę z trójkątnymi wgłębieniami do unieruchomienia embrionów. Następnie przygotuj standardowe igły do mikrowstrzyknięć oraz roztwór do znakowania cewek proksymalnych. Rozpocznij eksperyment od przygotowania embrionów.W pierwszej kolejności, używając precyzyjnej pincety, usuń Corian z nieułożonych jaj. Następnie wypłucz pozostałości Corianu oraz zanieczyszczenia z szalki Petriego i napełnij ją ponownie 30 mililitrami zmodyfikowanego roztworu E3. Po drugie, znieczul larwy za pomocą pięciu mililitrów trica.Upewnij się, że larwy są całkowicie znieczulone, sprawdzając reakcję na dotyk. Jeśli nie zostaną w pełni znieczulone, będą drgać podczas wstrzykiwania. W trzecim kroku, za pomocą plastikowej pipety transferowej, umieść larwy w formie.Ustaw zwierzęta tak, aby ich głowy znajdowały się w najgłębszej części wgłębienia, a tułowia wzdłuż krawędzi otworu. Następnie wykonaj mikroiniekcje domięśniowe, nabierając do przygotowanej igły od 2 do 3 µL dekstranu fluoresceiny; ustaw igłę i wstrzyknij około 1 nL roztworu w okolice tułowia każdego zwierzęcia. Konjugaty dekstranu są łatwo endocytowane przez cewki proksymalne nefronów, co umożliwia preferencyjne znakowanie tej populacji komórek nabłonkowych.Celuj w górną część somitu i unikaj przedłużenia pęcherzyka żółtkowego, w przeciwnym razie kanaliki nefronowe zostaną uszkodzone, tak jak w przypadku tego nieprawidłowo wstrzykniętego zwierzęcia. Po wstrzyknięciu larw przenieś je do czystej szalki Petriego i wypłucz trzykrotnie świeżym medium E3, aby usunąć wszelkie ślady tricyna. Następnie przykryj pokrywkę folią i inkubuj zwierzęta przez noc w temperaturze 28 °C.Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować medium do immobilizacji, zachowując niektóre alikwoty do natychmiastowego użycia w temperaturze pokojowej, a pozostałe alikwoty przechowując w temperaturze czterech stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania. Należy rozpocząć od znieczulenia larw danio przebrany przy użyciu pięciu mililitrów trica w 30 mililitrach E3. Podobnie jak poprzednio, należy upewnić się, że ryby nie reagują na bodźce dotykowe.Następnie należy zbadać wstrzyknięte zwierzęta w świetle fluorescencyjnym, aby wybrać larwy z łatwo widocznymi cewkami bliższymi. Przenieś do 12 larw do nowej szalki zawierającej to samo stężenie trica, korzystając z fluorescencyjnego mikroskopu złożonego wyposażonego w filtr fitzy, oświetlenie w polu jasnym oraz laser. Ablację rozpoczyna się od przeniesienia i znieczulenia larw do szalki zawierającej medium immobilizujące.Odczekać dwie minuty, a następnie przenieść larwę na szkiełko z wgłębieniem zawierające kroplę medium immobilizującego. Za pomocą cienkiej sondy delikatnie ułożyć zwierzę grzbietem do góry i ustawić ostrość na stronę grzbietową. Następnie, używając skalibrowanego impulsowego systemu laserowego z mikropunktem, przeprowadzić ablację jednego z nefronów, pozostawiając drugi nienaruszony jako kontrolę.Obserwować będzie można rozproszenie fluorescencji w miarę ablacji komórek nabłonka nerkowego. Następnie należy ostrożnie przenieść zwierzę do dołka płytki 12-dołkowej i trzykrotnie przemyć je w medium E3, aby usunąć metylocelulozę. Kontynuować ablację nefronów do momentu wypełnienia pierwszej płytki 12-dołkowej.Następnie znieczul kolejne 12 zwierząt i powtórz proces. Wstrzyknięto Dextra Fitzy, aby preferencyjnie oznakować kanaliki proksymalne. Trzy dni po zapłodnieniu dokonano ablacji laserowej nefronów każdego zwierzęcia.Jeden dzień po ablacji. Regeneracja nie jest widoczna cztery dni po ablacji, jednakże regeneracja nastąpiła po ablacji komórek in situ dwa. Do analizy zmian w utrwalonych próbkach w pojedynczych punktach czasowych zastosowano hybrydyzację.Ten embrion nie został poddany ablacji. W przeciwieństwie do niego, w tym embrionie dokonano ablacji dużego odcinka nabłonka cewkowego, a w tym embrionie ablacji krótkiego odcinka nabłonka cewkowego. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak hybrydyzacja in situ w preparacie całego organizmu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące zmian w ekspresji genów w przebiegu regeneracji nefronów.Należy pamiętać, że praca z odczynnikami chemicznymi może być niezwykle niebezpieczna. Podczas tej procedury zaleca się stosowanie środków ostrożności, takich jak używanie osobistego sprzętu ochronnego, w tym fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.

laser-ablation-zebrafish-pronephros-to-study-renal-epithelial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Laserowe ablacja pronefrusu rybki labiryntowej w celu badania regeneracji nabłonka nerek

Opisujemy technikę mikroiniekcji aminoglikozydu, gentamyciny, do larw zebrafish w 2. dniu po zapłodnieniu (dpf) w celu wywołania ostrego uszkodzenia nerek (AKI). Opisujemy również metodę immunohistochemii całego preparatu, zatapiania w plastiku i sekcjonowania larw zebrafish w celu wizualizacji uszkodzeń wywołanych przez AKI.

Dożylne mikroiniekcje u larw rybiek zebra w celu badania ostrego uszkodzenia nerek

Transplantacja komórek jest kluczową techniką w badaniu regeneracji tkanek oraz w opracowywaniu terapii chorób opartych na komórkach. Przedstawiamy tutaj technikę mikrochirurgiczną, która umożliwia transplantację genetycznie znakowanych komórek bezpośrednio do nerki dorosłych ryb zebrafish.

Transplantacja komórek bezpośrednio do nerki dorosłych danio-ostroskrzelnych

Dorosła nerka danio pręgowanego jest doskonałym systemem do regeneracji nerek i badań nad chorobami.  Istotnym aspektem takich badań jest ocena struktury i funkcji nefronu. Protokół ten opisuje kilka metodologii, które można zastosować do oceny składu kanalików nefronowych i oceny wchłaniania zwrotnego przez nerki.

Analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy wiarygodną metodę badania regeneracji nerek u dorosłych poprzez wywoływanie ostrego uszkodzenia nerek przez wstrzyknięcie gentamycyny. Pokazujemy, że uraz jest zależny od dawki gentamycyny i temperatury otoczenia, stosując hybrydyzację in situ do znakowania lhx1a+, tworząc nowe nefrony.

Regeneracja nerek u dorosłego danio pręgowanego przez uraz wywołany gentamycyną

Opisana tutaj metoda pozwala na analizę poklatkową rozwoju narządów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, zdolnego do wykonywania sekcji optycznych i prostych strategii dostosowania w celu skorygowania dryfu ogniskowego i płaskiego.

Analiza rozwoju nerek danio pręgowanego z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w sekcję optyczną

Uszkodzenia nerek spowodowane nefrotoksynami, które obejmują różne leki, od antybiotyków po chemioterapeutyki, mogą powodować złożone zaburzenia, których patogeneza pozostaje nie do końca poznana. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób danio pręgowany może być wykorzystany do modelowania chorób tych stanów, co można zastosować do identyfikacji środków renoprotekcyjnych.

Mikroiniekcja nefrotoksyny u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek

Ta praca przedstawia nowy model in vivo segmentowego uszkodzenia nerek przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego GFP. Model pozwala na indukcję celowanej ablacji komórek nabłonka nerek w celu ukazania komórkowych mechanizmów uszkodzenia i naprawy nefronów.

Precyzyjne podejście do ablacji komórkowej do modelowania ostrego uszkodzenia nerek u rozwijającego się danio pręgowanego

Laserowa ablacja jest szeroko stosowaną technologią do badania regeneracji w systemach biologicznych. Prezentowany protokół opisuje zastosowanie standardowego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego do ablacji laserowej, a następnie obrazowania poklatkowego regenerujących się komórek międzynerwowych w linii bocznej danio pręgowanego.

Test ablacji i regeneracji laserowej oparty na mikroskopie konfokalnym w komórkach międzynerwowych danio pręgowanego

Danio pręgowany jest ważnym modelem do zrozumienia rozwoju nerek. W tym przypadku protokół hybrydyzacji in situ jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania ekspresji genów u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju mesonephros.

In Situ Hybrydyzacja u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju Mesonephros

Ten protokół opisuje metodologię genetycznej ablacji nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) przy użyciu transgenicznego modelu danio pręgowanego. Dostosowanie protokołu w celu włączenia modulacji szlaku sygnałowego za pomocą związków farmakologicznych jest bardzo szczegółowe. Opracowano platformę MATLAB do ilościowego określania regeneracji RPE na podstawie pigmentacji, która została zaprezentowana i omówiona.

Ablacja za pośrednictwem nitroreduktazy/metronidazolu oraz platforma MATLAB (RpEGEN) do badania regeneracji nabłonka barwnikowego siatkówki danio pręgowanego

Ten protokół opisuje dwufotonową ablację laserową przeprowadzaną na larwach danio pręgowanego, która służy jako model do badania regeneracji kości i efektów odpowiedzi immunologicznej na ablację.

Dwufotonowa, laserowa ablacja osteoblastów w rozwijających się larwach danio pręgowanego

Poznaj technikę laserowej ablacji nabłonka nerkowego u Danio rerio w celu badania regeneracji po ostrym uszkodzeniu nerki. Ta metoda umożliwia analizę zmian molekularnych w czasie rzeczywistym.

Ablacja laserowa pronefry ryby danio w celu badania regeneracji nabłonka nerkowego

Przeglądaj więcej filmów